JPS63179255A

JPS63179255A - アルブミン吸着用担体

Info

Publication number: JPS63179255A
Application number: JP1102687A
Authority: JP
Inventors: Michio Kuge; 久下　倫生; Yasuo Oe; 大江　泰雄
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1987-01-19
Filing date: 1987-01-19
Publication date: 1988-07-23
Anticipated expiration: 2010-02-22
Also published as: JPH0715472B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、例えば試料中に含まれる蛋白質の測定に好適
に使用できる蛋白吸着用担体、特にアルブミンを選択的
に吸着させることができる吸肴狙体に関する。

従来の技術及びその問題点直径数ミリの粒状物表面に抗体（もしくは抗原）を結合
させた同相化抗体（もしくは抗原）を用いて、該抗体に
対する試料中の抗原をエンザイムイムノアッセイ（Ｅ　
ＩＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等により測定
する方法は知られている（例えば特公昭６１−４６７８
４号公報参照）。

この方法は、担体とする上記粒状物の表面に、捕捉せん
とする目的物の特異抗体を同相化しておいて、免疫学的
な抗原−抗体反応を利用して目的物を捕捉するものでお
り、例えば血清等の複雑な組成の蛋白複合体からアルブ
ミンを特異的に捕えるには、抗アルブミン抗体、例えば
ＩＣＩＧを同相化した担体を用い、これにアルブミンを
結合捕捉させるのが一般的であった。

しかしながら、上記のような抗アルブミン抗体を用いる
場合、担体に同相化される抗アルブミン抗体自体の量も
それほど多くない上に、該抗体に特異的に結合するアル
ブミンの量にも制約があり、該同相化担体によって捕え
得るアルブミンの量が少量に過ぎ、血清中のアルブミン
を測定する目的には十分満足し得るものではなかった。

一方、アルブミン、特に血清中のアルブミンは、生体内
に投与された薬物の体内における運搬等の体内動態に深
く関与し、薬効の発現に大きな係わりを有することが知
られている。従って医薬等の開発や病理学の研究等にお
いて、該アルブミンの測定は大きな意義を持つ。例えば
血清中のアルブミンと他の成分との比率とか、更には全
アルブミン中におけるアルブミン−薬物複合体の含有比
率を測定することは有意義である。しかしながら、前述
の抗アルブミン抗体を同相化した担体は、上記目的に使
用するにはアルブミン吸着能が十分ではなく、これに代
る新しい担体の開発が斯界で要望されている。

問題点を解決するための手段本発明の目的は、上記斯界の要望に合致する新しい蛋白
吸着用担体であって、殊に特異的アルブミン吸着能に優
れ、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等によるアルブミンの測定に有
用で、しかもその測定操作等を簡便とし、更に試料中の
他の成分からのアルブミン分離ないし捕捉や、アルブミ
ン中のより細分化された成分の測定にも有効に使用し得
る蛋白吸着用担体を提供することにある。

問題引を解決するための手段上記目的は、粒子状樹脂成型物表面に、シバクロンブル
ーが結合されてなる蛋白吸着用担体により達成される。

本発明の蛋白吸着用担体構成する樹脂成型物は、粒子状
形態を有する限り、その形状は任意であり、例えば球状
が一般的であるが、柱状や筒状でおってもよく、また表
面積を増やすためにその表面に凹凸が付された形態でも
よい。また上記粒子の大きさは、通常その直径が約１〜
２０ｍｍ程度であるのが実用的である。

上記樹脂成型物は、種々の成型手段により作成でき、特
に射出成型法によるのが好適である。

また上記成型物を構成する樹脂は、水に不溶性であり、
樹脂自体がシバクロンブルーと結合し得る官能基、例え
ばアミノ基、水酸基、カルボキシル基等を有するか、又
は成型物となされた後、該成型物表面に上記官能基を生
じさせ得る種類から適宜選択される。好適な具体例とし
ては例えばポリメチルメタクリレート、アクリロニトリ
ル−ブタジエン−スチレン共重合体、スチレン−無水マ
レイン酸共重合体、酢酸セルロース等を例示できる。

２等樹脂はその表面に上記官能基を有することが重要で
ある。この官能基は既に樹脂自体に含まれている場合が
あり、この場合上記樹脂成型物は、之等の官能基を有す
る樹脂を粒子状に成型することにより得られる。また上
記官能基を有しないか該官能基の不足する樹脂の場合、
該、樹脂への上記官能基の導入乃至樹脂表面への官能基
の生成は、公知の化学的方法により行なうことができ、
予め粒子状に成型した樹脂成型物に対して行なうのが好
ましい。該樹脂成型物表面に水酸基やカルボキシル基を
生成させるには、例えば該樹脂成型物を塩酸又は苛性ソ
ーダを含む水溶液中に浸漬し、約４０〜８０℃で数時間
放置し、その表面を加水分解すればよく、これにより上
記官能基を生成させ得る。この方法は重合体分子中にア
クリル酸エステル、無水マレイン酸、アクリロニトリル
等のモノマーを含有する合成樹脂や酢酸セルロース等の
セルロース系樹脂を主成分とする樹脂成型物に対し有効
である。樹脂成型物にアミノ基を導入するには、例えば
特公昭６１−４６７８４号公報に開示されているように
、前記の如くして表面を加水分解した樹脂成型物を数％
のアセトンを含む水中に分散させ、これにエチレンイミ
ンを滴下する方法やアミノ化試薬としてエチレンジアミ
ン等を用いる公知の化学的手法を広く採用し得る。

本発明で用いられるシバクロンブルー（Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂ　Ｉｕｅ）とは、トリアジン系
染料の１種であり、下記一般式（Ｉ）〔式中Ａは水素原子又は１価の全屈を示す。〕で表わさ
れる化合物を包含する。その具体例としては、例えば市
販品として入手可能なＣ１ｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ　Ｆ３
ＧＡ　（チバガイギー社）やＣ１ｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ
　３ＧＡ　（フル力社）等を例示できる。

本発明の蛋白吸着用担体は、前記粒子状樹脂成型物表面
に、上記シバクロンブルーが結合されてなるものである
が、この結合は成型物表面に存在するアミノ基、水酸基
、カルボキシル基等の官能基を介して行なうのが一般的
である。この官能基を介する結香反応は、例えば上記官
能基を有する樹脂成型物とシバクロンブルーの水性溶液
とを混合し、Ｉ）Ｈ調製や、必要に応じて加熱を行ない
、数時間ないし数日間両者を接触させて、シバクロンブ
ルー中のアミノ基、クロル基等と前記官能基とを反応さ
せることにより行ない得る。より詳しくは、例えば表面
にアミノ基を有する樹脂成型物にシバクロンブルーを結
合させるには、シバクロンブルーの水溶液と成型物粒子
の水性分散液とを混合し、この混合物に苛性ソーダ等の
アルカリ性物質を加えて反応系をアルカリ性となし、こ
の状態を数時澗ないし数十時間維持し、その後成型物粒
子を分離して取出し、洗浄により未反応のシバクロンブ
ルーを除去すればよい。

上記結合反応におけるシバクロンブルーの使用量は、樹
脂の種類、反応条件等に応じて適宜決定され特に限定さ
れるものではないが、通常樹脂中の官能基に対してシバ
クロンブルーの反応基が少なくとも当量となるものとす
るのがよく、一般には、大過剰量のシバクロンブルーが
用いられる。

かくして、本発明の蛋白吸着用担体を収得でき、これは
効果的にアルブミンを吸着するのに充分量の上記チバク
ロンブルーを結合されており、アルブミン分析等に有効
に利用できる。

尚、上記方法においては、成型物粒子の水性分散液中に
、樹脂に対する溶剤ないしは膨潤剤の少量を加えて成型
物表面を僅かに膨潤させたり、反応液中に少量の食塩等
の電解質物質を加えて、シバクロンブルーの成型物表面
への析出を促進させたりすることもでき、之等は上記結
合反応の促進や結合量の増加に有効である。

Ｒ−皿一五一皇−１本発明の″蛋白吸着用担体は、粒子状樹脂成型物表面に
シバクロンブルーが結合されてなり、蛋白質、特にアル
ブミンに対して高い特異吸着性を有し、しかも該アルブ
ミン吸着能は量的にも時間的にも優れたものである。従
ってこれは生体試料、例えば血清中のアルブミンを他の
成分と分離するのに有効に利用でき、該試料中のアルブ
ミン量の測定等に有用である。また、本発明担体は、こ
れを利用して吸着されたアルブミン中に含まれる更に細
分化された特定種類のアルブミン、例えばグリコジル化
アルブミン等をＥＩＡやＲＩＡ法等の手法により測定し
、全アルブミン中の特定種アルブミンの含有量を知り、
医薬や病理学の研究や臨床検査に役立てることも可能で
ある。

実　　施　　　例以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

実施例１スチレン−無水マレイン酸共重合体く無水マレイン酸含
有量約２４モル％）を、射出成型法により直径６．３５
ｍｍのビーズ状形態に成型した。

上記ビーズを１Ｎ　　ＮａＯＨ水溶液に浸漬し、６０℃
で５時間加水分解反応させ、次いでアセトン５％を含む
水中に移し、これに過剰量のエチレンイミンを滴下し、
常温で約３時間反応させ、その後、ビーズを取出して洗
浄し、かくしてアミノ基が表面に導入されたスチレン−
無水マレイン酸共重合体ビーズを得た。

次いで、シバクロンブルー（Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂ１ｕ
ｅ３ＧＡ、フル力社製）１．０ｇを蒸留水に溶解して調
製した溶液１００脱を１Ｑ容の容器中に入れ、該容器に
、上記で作成したビーズ６００個を蒸留水３００ｎ１２
とテトラヒドロ７ラン５０１Ｔｌｆｌ？との混合液に混
合、分散させた液を加え、５分間緩かに撹拌した。その
後、容器にＮａＣ［ｌＯにＪの蒸留水溶液５０１１１１
１？を添加して、３０分間撹拌後、５ＮＮａＯＨ２，５
ｍ１２を添加し、更に３日間撹拌して反応させた。反応
終了後、容器から反応液を除き、ビーズを蒸留水、ＩＭ
　　ＮａＣＱ水溶液、５Ｍ尿素水溶液及び蒸留水で順次
充分に洗浄して、本発明の蛋白吸着用ビーズを調製した
。

〈蛋白吸着性試験〉ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ、ベーリンガー社製）の２
０〜３０μｇ蛋白量／脱クエン酸緩衝液ｌＨ５，５＞溶
液を調製し、これに実施例１で得た本発明蛋白吸着用ビ
ーズを加えて、３０分間室温でインキュベートし、上記
溶液から減少した蛋白量を測定し、その減少量よりビー
ズに吸着した蛋白量を算出した。

その結果、本発明ビーズ１個当たりの蛋白吸着層ハ平均
１．９５μＣ１ｌ白量（Ｃ，Ｖ、＝４．９％、ｎ＝２０
）であり、各ビーズ間の蛋白吸＠量には、殆んどバラツ
キがなかった。

また、上記において、Ｈ３Ａ溶液の代りに正常ヒト血清
を使用して、同様にして本発明ビーズの上記血清中蛋白
の吸着量を求めると共に、ＲＩＡ法により上記血清中１
−Ｉ　Ｓ　Ａの吸着量を求めた。

その結果、本発明ビーズに吸着された蛋白の９２．５％
（平均）がＨ３Ａであることが確認された。

なお、比較のため、抗ヒト血清アルブミン抗体（ベーリ
ンガー社製）を、ポリスチレンビーズに吸着させた担体
（２０μＣｌ／ＩＴｌｆ２の抗体溶液に上記ビーズを一
夜含浸させた後、０．１５％ゲラチンによりブロックし
て作成したもの〉を用いて、１２５Ｉ−Ｈ３Ａを用いた
スキチャープロット解析により、上記担体へのＨ８Ａ＠
＠量を求めた結果、平均１１００ｎビーズでおった。

〈グルコシル化蛋白の測定試験〉スタンダードとして、Ｈ３Ａとグルコースとの非酵素的
結合反応物を還元処理して得た還元型グルコシル化Ｈ３
Ａ　（ＧＩＣ−Ｈ８Ａ）を、アフィゲルブルーカラムを
用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製し
て利用した。尚、該Ｇ１ｃｍＨ３Ａは、アミノ酸分析の
結果から６０．６％のりジン残基がグルコシル化されて
いると認められ、また免疫反応に関与するＱＩＣ−ＬＶ
Ｓ残基は、以下の方法により得られた還元型グルコシル
化リジン誘導体を基準として全リジン残基の２８．６％
であると認められた。　　　　　ゝ（還元型グルコシル化リジン誘導体の１造）Ｎ−２−（
Ｎ−ベンゾイルグリシル）−１−リジン（蛋白質研究奨
励金＞２００ｍｐ及びＤ−グルコース１２９ｍＱを、水
及びジオキサン（１：１）混液１０ｆｌｌｆ２に溶解さ
せ、これにＮａＢＣＮＨ３１００ｍＯを加え、室温で３
〜４日間保持した。次いで反応系内に酢酸を加えて反応
を停止させ、蒸留後、メタノールを加えて蒸留した。こ
れを、ＴＳＫ１２ＯＴカラム（東洋曹達社製）を用いた
カラムクロマトグラフィー〔溶ＩＡ：９０％アセトニト
リル、内部標準５０ｍＭ　　ＴＦＡ、溶＊Ｂ；５％アセ
トニトリル、グラジェントＡＩＯ％十Ｂ９０％→Ａ６０
％＋８４０％〕により精製して、リテンションタイム９
．９３分（２ｍＧ／分）にＮ２−（Ｎ−ベンゾイルグリ
シル）−Ｎ６−Ｄ−グルシド−ルーＬ−リジンを得た。

収率５８．２％。

６Ｎ−塩酸を用いた加水分解（１２０℃、２０時間）後
のアミノ酸アナライザー（日立８３５）によるアミノ酸
分析の結果、グリシン及びグルシトールリジンがほぼ等
モル量確認された。

上記Ｇｌｃ−Ｈ５Ａのスタンダードの希釈系列［０＝ブ
ランク、０．３９．０．７８．１．５６．３．１２２５
．６．２５．１２．５．２５．５０ピコモル（免疫反応
に関与するＧ１ｃｍＬｙｓ残基換算量］を２０μＱづつ
チューブにサンプリングし、各チューブに３０ｍＭセミ
カルバジドの１０ｍＭアニリン水溶液（ｐＨ５＞２００
μＱづつを加えて、軽く振盪した。

実施例１で調製した蛋白吸着用ビーズ１個を上記チュー
ブに加え、３０分間、室温（２０〜３０℃）でインキュ
ベーションした。その後、反応液をアスピレータ−で吸
引濾過し、生理食塩水１〜２ｍ１２を入れ、ビーズを洗
浄し、洗液を完全に除去した。この操作を２回繰返した
。

一方、ＮａＢＨａ　ｏ、３Ｑを０．０１Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液３−に加えて溶解させ、この０．５ｍ１２を
よく冷部した０、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐｌ−１８，
２＞２５ｍＧに加えて軽く撹拌シテ、還元用溶液を調製
した。この２５０μＱづつを上記チューブに分注し、３
０分間、室温で放置し、その後、反応液をアスピレータ
−で吸引濾過し、すべてのチューブに生理食塩水１〜２
−を入れてビーズを洗浄し、洗液を除去した。この操作
を２回繰返した後、ビーズを別のチューブに移しかえた
。

上記ビーズの洗浄後、以下の方法により調製した１２５
Ｔ標識抗体溶液２００μＱづつをチューブに加え、室温
で２時間インキュベーションを行なった後、反応液をア
スピレータ−で吸引除去し、すべてのチューブに生理食
塩水溶液１〜２戒を入れ、ビーズを洗浄後、洗液を除去
した。この操作を２回繰返した後、ビーズを別のチュー
ブに移しかえ、放射能を測定した。

（１２５，標識抗体の調製）抗体として、以下の方法により得られた還元型グルコシ
ル化蛋白を認識する抗体を用いた。即ち、還元型グルコ
シル化蛋白で免疫された哺乳動物の免疫細胞と同浦乳動
物の形質細胞腫細胞とのハイブリドーマであるＯＡＬ−
Ｍ−１０（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ９２９７）の１Ｘ１０６
個を、ＲＰＭＩ−１６４０培地０．５ｍＱに懸濁させ、
Ｂａ１ｂ　／ｃ。

系マウスに腹腔内投与し、２〜３週間後、蓄積した腹水
を採取し、目的抗体を含む腹水２〜５ｍｌ／マウスを得
た。この抗体の濃度は約０．２〜１ｍｇ／Ｉｎ１２であ
った。この腹水５１ＴＩＩ２にＰＢＳ５鵬及び飽和硫安
１０ｒｒｆＪを加え、Ｏ″Ｃ下に緩かに撹拌した。

遠心分離（１００００ｒｐｍ　ｘ３０分、４℃）して得
た沈渣を、０．０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，６＞で平衡
化したセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社
製）のゲルか過に付した。ボイドポリウム付近に溶出さ
れた分画を同上緩衝液で平衡化したプロティンＡ−セフ
ァロース０Ｌ−４８（ファルマシア社製）に付し、Ｉｑ
Ｇ分画を吸着させた後、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
５，５＞で充分洗浄後、酢酸緩衝液（ｐＨ４，３＞でＩ
ｑＧ２ａを溶出させて、目的の精製抗体を得た。

上記精製抗体の０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）に
Ｎａ１２５■（ＮＥＮ社製）を加え、この混合物を予め
ヨードゲン（ピース社製）のジクロルメタン溶液を入れ
窒素ガス気流下に溶媒をとばして乾燥したガラス試験管
内で、０℃下に５分間ゆっくり撹拌しながら反応させ、
反応後、ゲル濾過して放射活性ピークに一致するアルブ
ミン分画として目的の１２５Ｉ−標識抗体を得た。

上記グルコシル化蛋白の測定試験により得られた標準曲
線を第１図に示す。第１図中、横軸はスタンダードの濃
度（免疫反応に関与するＧｌｃ−Ｌｙｓ残基換算量／チ
ューブ）を、縦軸はビーズの放射能（ＣＩ）Ｉｌｌ）　
（ブランク値を引いた値）を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明蛋白吸着用担体を用いて行なったグル
コシル化蛋白の測定試験にお【プる標準曲線を示す。（以　上）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）粒子状樹脂成型物表面にシバクロンブルーが結合
されてなる蛋白吸着用担体。
（２）樹脂成型物の直径が約１〜２０ｍｍである特許請
求の範囲第１項記載の担体。
（３）樹脂成型物が球状体である特許請求の範囲第１項
記載の担体。
（４）樹脂成型物が射出成型法により作成されたもので
ある特許請求の範囲第１項記載の担体。
（５）樹脂成型物がポリメチルメタクリレート、アクリ
ロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、スチレン
−無水マレイン酸共重合体及び酢酸セルロースから選択
される樹脂の成型物である特許請求の範囲第１項記載の
担体。
（６）樹脂成型物表面へのシバクロンブルーの結合が、
該成型物表面に存在する官能基を介してなされたもので
ある特許請求の範囲第１項記載の担体。
（７）官能基がアミノ基、水酸基及びカルボキシル基か
ら選択されたものである特許請求の範囲第１項記載の担
体。