JPH0731205B2 - 担持材料及びその製法 - Google Patents
担持材料及びその製法Info
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- JPH0731205B2 JPH0731205B2 JP62295432A JP29543287A JPH0731205B2 JP H0731205 B2 JPH0731205 B2 JP H0731205B2 JP 62295432 A JP62295432 A JP 62295432A JP 29543287 A JP29543287 A JP 29543287A JP H0731205 B2 JPH0731205 B2 JP H0731205B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、特異的結合性の蛋白質物質をイムノアツセイ
の原理により測定するための、相互に特異的に結合性の
物質対の一方の成分が固相に結合している担持材料を製
造する方法並びにこれに好適な担持材料に関する。
の原理により測定するための、相互に特異的に結合性の
物質対の一方の成分が固相に結合している担持材料を製
造する方法並びにこれに好適な担持材料に関する。
従来の技術 特異的結合性の物質を測定するにはしばしばイムノアツ
セイ原理による方法が有用である。その際に、特異的に
相互に結合性である物質対の一方の成分が、それに対し
て特異的な、公知方法で標識したレセプターと反応す
る。この両方の物質からの複合体は、この複合体に又は
この複合体の一方の成分に特異的であるレセプターと反
応し得る。この免疫学的方法に関しては多数の別法があ
る。その際に、レセプターの１つが固相に結合している
と有利である。これは、結合した反応部分と結合しなか
つた反応成分の分離を簡便にする。特異的結合性の物質
を測定するに当り、固相に結合させた標識反応成分の量
を測定するか又は溶液中に存在する標識反応成分の量を
測定し、かつこの量を測定すべき反応成分の量に公知方
法で換算する。
セイ原理による方法が有用である。その際に、特異的に
相互に結合性である物質対の一方の成分が、それに対し
て特異的な、公知方法で標識したレセプターと反応す
る。この両方の物質からの複合体は、この複合体に又は
この複合体の一方の成分に特異的であるレセプターと反
応し得る。この免疫学的方法に関しては多数の別法があ
る。その際に、レセプターの１つが固相に結合している
と有利である。これは、結合した反応部分と結合しなか
つた反応成分の分離を簡便にする。特異的結合性の物質
を測定するに当り、固相に結合させた標識反応成分の量
を測定するか又は溶液中に存在する標識反応成分の量を
測定し、かつこの量を測定すべき反応成分の量に公知方
法で換算する。
固相としては、免疫学的方法で常用である内面に反応成
分が固定されているプラスチツク小管又は微量滴定プレ
ートあるいは外面に反応成分が固定されている球体を使
用する。一般に、これらのプラスチック小管、微量滴定
プレート又は球体は比較的不活性なプラスチツク材料よ
り成り、それ故反応成分の結合は困難を伴なう。更に、
その都度特異的な反応成分を表面に結合させる際に、そ
の成分がそれに対して特異的に結合性である物質に対し
て特異的に結合する能力を失なわないように行なうべき
である。このような理由から、反応成分の固相への結合
はたいていの場合吸着により行なう。それ故、固相への
反応成分の固定は結合を補助する結合剤を介して行なう
ことが既に提案されている。その場合にも該結合剤への
反応成分の結合がその反応成分分子の特異的反応領域を
破壊しないようにもしくは反応成分の反応部位が固相か
ら遠く離れて結合成分の側に向いて結合するように注意
しなければならない。更に西ドイツ国特許公開第253370
1号明細書には、より良好な結合を達成するために、個
々の免疫学的に有効な蛋白質を架橋し、その後でポリス
チレン球体に吸着させることが提案されている。該文献
に他の可能性として、免疫学的特性を有する蛋白質と同
時に不活性蛋白質を架橋させて、不活性蛋白質と活性蛋
白質とからの架橋生成物を生成し、これをポリスチレン
球体に吸着させることが記載されている。しかしながら
このような架橋法は選択した反応条件に応じて、種々の
再現不可能な架橋をもたらし、その際に架橋されなかつ
た蛋白質並びに不溶性になつた蛋白質の割合が変動す
る。架橋度が異なるために、異なる結合特性を有する生
成物が生じる。類似方法がヨーロツパ公開特許第122209
号明細書に記載され、同じ欠点を有している。それ故、
これらのすべての公知方法は十分に満足すべきものでは
なく、特異的に結合性の物質の最適な付着をもたらさず
かつ塗布された固相の再現可能な製造にあまり好適では
ない。
分が固定されているプラスチツク小管又は微量滴定プレ
ートあるいは外面に反応成分が固定されている球体を使
用する。一般に、これらのプラスチック小管、微量滴定
プレート又は球体は比較的不活性なプラスチツク材料よ
り成り、それ故反応成分の結合は困難を伴なう。更に、
その都度特異的な反応成分を表面に結合させる際に、そ
の成分がそれに対して特異的に結合性である物質に対し
て特異的に結合する能力を失なわないように行なうべき
である。このような理由から、反応成分の固相への結合
はたいていの場合吸着により行なう。それ故、固相への
反応成分の固定は結合を補助する結合剤を介して行なう
ことが既に提案されている。その場合にも該結合剤への
反応成分の結合がその反応成分分子の特異的反応領域を
破壊しないようにもしくは反応成分の反応部位が固相か
ら遠く離れて結合成分の側に向いて結合するように注意
しなければならない。更に西ドイツ国特許公開第253370
1号明細書には、より良好な結合を達成するために、個
々の免疫学的に有効な蛋白質を架橋し、その後でポリス
チレン球体に吸着させることが提案されている。該文献
に他の可能性として、免疫学的特性を有する蛋白質と同
時に不活性蛋白質を架橋させて、不活性蛋白質と活性蛋
白質とからの架橋生成物を生成し、これをポリスチレン
球体に吸着させることが記載されている。しかしながら
このような架橋法は選択した反応条件に応じて、種々の
再現不可能な架橋をもたらし、その際に架橋されなかつ
た蛋白質並びに不溶性になつた蛋白質の割合が変動す
る。架橋度が異なるために、異なる結合特性を有する生
成物が生じる。類似方法がヨーロツパ公開特許第122209
号明細書に記載され、同じ欠点を有している。それ故、
これらのすべての公知方法は十分に満足すべきものでは
なく、特異的に結合性の物質の最適な付着をもたらさず
かつ塗布された固相の再現可能な製造にあまり好適では
ない。
発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の目的は、特異的に結合性である物質の
固相への付着性を再現可能であるように改良しかつこの
ために好適な担持材料を提供する方法を開示することで
あつた。更に、多くの免疫学的方法では混濁を回避する
ために界面活性剤の添加下に作業するので、界面活性剤
の存在でも結合させた、特異的結合性の物質が分離しな
いように付着性を改良するということが本発明の目的で
ある。
固相への付着性を再現可能であるように改良しかつこの
ために好適な担持材料を提供する方法を開示することで
あつた。更に、多くの免疫学的方法では混濁を回避する
ために界面活性剤の添加下に作業するので、界面活性剤
の存在でも結合させた、特異的結合性の物質が分離しな
いように付着性を改良するということが本発明の目的で
ある。
問題点を解決するための手段 この目的は、イムノアツセイの原理により特に異種分析
法で使用するための、特異的結合性の蛋白質をカツプリ
ングさせた不溶性の担持材料の製法により達成され、約
500000を上廻る分子量を有しかつ特異的結合性の蛋白質
よりも疎水性である可溶性蛋白質を特異的に結合性の該
物質とカツプリングさせ、その後反応成分と蛋白質とか
らのこの複合体を疎水性固相に吸着させることを特徴と
する。
法で使用するための、特異的結合性の蛋白質をカツプリ
ングさせた不溶性の担持材料の製法により達成され、約
500000を上廻る分子量を有しかつ特異的結合性の蛋白質
よりも疎水性である可溶性蛋白質を特異的に結合性の該
物質とカツプリングさせ、その後反応成分と蛋白質とか
らのこの複合体を疎水性固相に吸着させることを特徴と
する。
このように固相に固定した特異的結合性物質は改良され
た付着性を示す。この結合は界面活性剤に対しても安定
である。多くの免疫学的方法で評価するのに必要である
検量曲線の作成では、本発明により固相に結合させた特
異的結合性物質により急勾配の検量曲線が得られ、これ
は精度を高める。
た付着性を示す。この結合は界面活性剤に対しても安定
である。多くの免疫学的方法で評価するのに必要である
検量曲線の作成では、本発明により固相に結合させた特
異的結合性物質により急勾配の検量曲線が得られ、これ
は精度を高める。
本発明方法の他の利点としては、結合した量を正確に制
御することが可能なことである。この付着は従来公知の
方法よりも著しく良好であるので、使用される特異的蛋
白質の量は僅かである。
御することが可能なことである。この付着は従来公知の
方法よりも著しく良好であるので、使用される特異的蛋
白質の量は僅かである。
本発明に好適な可溶性蛋白質の選択に当つては、その分
子量及び疎水性は特異的結合性物質の相応する数値と比
較して確定しなければならない。分子量は当業者に公知
の方法により測定する。
子量及び疎水性は特異的結合性物質の相応する数値と比
較して確定しなければならない。分子量は当業者に公知
の方法により測定する。
可溶性蛋白質及び特異的結合性物質との間の疎水性の比
較も当業者に常用の方法により行なうことができる。例
えば好適な方法は次の通りである： −色素に結合後のけい光消失の比較〔“Biochem.Biophy
s.Acta"、624巻、13〜20頁（1980年）〕 −疎水性クロマトグラフイでの溶離挙動の比較〔“Bioc
hem.BiophysActa"、576巻、269〜279頁（1979年）〕 −表面張力の比較〔“Biochem.Biophys.Acta"、670巻、
64〜73頁（1981年）〕 −疎水性相互作用クロマトグラフイ（HIC）の保持時間
の比較〔“Angew.Chemie"、98巻、530〜548頁（1986
年）、“J.Chromat."296巻、107〜114頁（1984年）、
“Anal.Biochem."、137巻、464〜472頁（1984年）〕。
較も当業者に常用の方法により行なうことができる。例
えば好適な方法は次の通りである： −色素に結合後のけい光消失の比較〔“Biochem.Biophy
s.Acta"、624巻、13〜20頁（1980年）〕 −疎水性クロマトグラフイでの溶離挙動の比較〔“Bioc
hem.BiophysActa"、576巻、269〜279頁（1979年）〕 −表面張力の比較〔“Biochem.Biophys.Acta"、670巻、
64〜73頁（1981年）〕 −疎水性相互作用クロマトグラフイ（HIC）の保持時間
の比較〔“Angew.Chemie"、98巻、530〜548頁（1986
年）、“J.Chromat."296巻、107〜114頁（1984年）、
“Anal.Biochem."、137巻、464〜472頁（1984年）〕。
本発明に好適な物質の疎水性の比較は、“Sep.Sci.Tech
nol."、14巻、305〜317頁（1979年）に記載されてい
る。それによれば疎水性は例えば次の順序で上昇する： α２−マクログロブリン（分子量820000） 牛血清アルブミン／セト血清アルブミン（分子量〜7000
0） 卵アルブミン α2HS−糖蛋白質（分子量〜49000） βIIC／βIA−グロブリン 免疫グロブリン（分子量〜150000） トランスフエリン（分子量〜90000） 特異的結合性物質としてイムノグロブリンを使用する場
合、例えばヒト血清アルブミン又はα2HS−糖蛋白質は
可溶性蛋白質として前処理せずには本発明に好適ではな
い。
nol."、14巻、305〜317頁（1979年）に記載されてい
る。それによれば疎水性は例えば次の順序で上昇する： α２−マクログロブリン（分子量820000） 牛血清アルブミン／セト血清アルブミン（分子量〜7000
0） 卵アルブミン α2HS−糖蛋白質（分子量〜49000） βIIC／βIA−グロブリン 免疫グロブリン（分子量〜150000） トランスフエリン（分子量〜90000） 特異的結合性物質としてイムノグロブリンを使用する場
合、例えばヒト血清アルブミン又はα2HS−糖蛋白質は
可溶性蛋白質として前処理せずには本発明に好適ではな
い。
両方の蛋白質は疎水化処理及び分子量の増加処理にもた
らさなければならない。トランスフエリンでは架橋が、
α−マクログロブリンでは疎水化が十分である。
らさなければならない。トランスフエリンでは架橋が、
α−マクログロブリンでは疎水化が十分である。
特異的結合性の物質としてのイムノグロブリンとのカツ
プリングに前処理せずに好適である蛋白質は、例えばβ
−リポ蛋白質（分子量約3200000）又はα２−リポ蛋白
質（分子量約５〜20000000）である。
プリングに前処理せずに好適である蛋白質は、例えばβ
−リポ蛋白質（分子量約3200000）又はα２−リポ蛋白
質（分子量約５〜20000000）である。
例えば、疎水化は熱の適用、酸、変性剤及び／又はカオ
トロピツクイオンによる処理及び／又は疎水性化合物と
の化学的カツプリングにより行なうことができる。
トロピツクイオンによる処理及び／又は疎水性化合物と
の化学的カツプリングにより行なうことができる。
例えば、分子量の増加は熱の適用、酸、変性剤及び／又
はカオトロピツクイオンによる処理及び／又は二官能性
又は多官能性蛋白質との架橋により行なうことができ
る。
はカオトロピツクイオンによる処理及び／又は二官能性
又は多官能性蛋白質との架橋により行なうことができ
る。
処理は、分子量500000又はそれ以上の蛋白質重合体が得
られるまで実施する。分子量500000〜20000000の蛋白質
重合体を使用すると特に優れている。
られるまで実施する。分子量500000〜20000000の蛋白質
重合体を使用すると特に優れている。
架橋も行なう場合、疎水化は架橋の前、その間又はその
後で行なうが、特異的結合性物質の存在においては行な
わない。
後で行なうが、特異的結合性物質の存在においては行な
わない。
加熱により疎水化するに当つては、一般に温度40〜95℃
を１分間〜10時間適用し、これは例えば“バイオキミカ
・バイオフイジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Act
a）”、624巻、13〜20頁（1980年）に記載されている。
を１分間〜10時間適用し、これは例えば“バイオキミカ
・バイオフイジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Act
a）”、624巻、13〜20頁（1980年）に記載されている。
例えば、酸としては酢酸、プロピオン酸、乳酸又は塩酸
を適用する。常用の濃度は１〜100ミリモル／、作用
時間は10分間〜16時間である。
を適用する。常用の濃度は１〜100ミリモル／、作用
時間は10分間〜16時間である。
例えば、好適なカオトロピツクイオンはチオシアナー
ト、ヨジド、フルオリド、ブロミド、ペルクロラート及
びスルフアートである。例えば好適な変性剤はグアニジ
ンヒドロクロリド又は尿素である。一般にその濃度は10
ミリモル／〜６モル／である。
ト、ヨジド、フルオリド、ブロミド、ペルクロラート及
びスルフアートである。例えば好適な変性剤はグアニジ
ンヒドロクロリド又は尿素である。一般にその濃度は10
ミリモル／〜６モル／である。
疎水性化合物による誘導体合成には、可溶性脂肪酸、リ
ポイドを低分子又は高分子の形で並びに合成重合体、例
えばポリプロピレングリコール又はポリスチレンの可溶
性共重合体を使用する。誘導体合成は当業者の常用の方
法で行なう。
ポイドを低分子又は高分子の形で並びに合成重合体、例
えばポリプロピレングリコール又はポリスチレンの可溶
性共重合体を使用する。誘導体合成は当業者の常用の方
法で行なう。
二官能性又は多官能性化合物による架橋は公知の蛋白質
結合試薬で行なう。これは同じか又は異なつていてよい
少なくとも２つの官能基を有しかつこれらの官能基を介
して蛋白質の官能基と反応し得る化合物である。末端位
にスクシンイミド基、マレインイミド基及び／又はアル
デヒド基が存在するアルキル鎖より成る化合物を使用す
ると優れている。
結合試薬で行なう。これは同じか又は異なつていてよい
少なくとも２つの官能基を有しかつこれらの官能基を介
して蛋白質の官能基と反応し得る化合物である。末端位
にスクシンイミド基、マレインイミド基及び／又はアル
デヒド基が存在するアルキル鎖より成る化合物を使用す
ると優れている。
蛋白質を二官能性又は多官能性の化合物を用いて、可溶
性蛋白質と二官能性又は多官能性の化合物とを反応させ
るという公知の方法で架橋させる。
性蛋白質と二官能性又は多官能性の化合物とを反応させ
るという公知の方法で架橋させる。
疎水化及び／又は架橋に当つては分子量10000〜700000
を有する蛋白質を使用すると優れている。牛血清アルブ
ミン、リパーゼ又は免疫γ−グロブリンが特に優れてい
る。
を有する蛋白質を使用すると優れている。牛血清アルブ
ミン、リパーゼ又は免疫γ−グロブリンが特に優れてい
る。
該蛋白質に公知方法で特異的接合性の蛋白質物質をカツ
プリングさせる。例えば、好適なカツプリング法はイシ
カワ著、“J.Immunoassay"、４巻、209〜327頁（1983
年）に記載されている。特異的結合性物質としては、例
えば抗体、抗体フラグメント、抗原又はハプテンのよう
な蛋白質が好適である。
プリングさせる。例えば、好適なカツプリング法はイシ
カワ著、“J.Immunoassay"、４巻、209〜327頁（1983
年）に記載されている。特異的結合性物質としては、例
えば抗体、抗体フラグメント、抗原又はハプテンのよう
な蛋白質が好適である。
このようにして得られた特異的結合性蛋白質物質と蛋白
質とからの複合体を固相として有用なプラスチツク表面
に吸着させる。固相への吸着結合は種々の強さの相互作
用、疎水力、双極子−双極子−又はイオン−双極子相互
作用を介して行なわれる。疎水性固相としては、疎水性
の可溶性蛋白質の表面張力よりも小さい表面張力を有す
る担持材料が好適である。表面張力＜40erg/cm2の担持
材料を使用すると優れている。ポリスチレン、ポリメタ
クリレート、テフロン、ポリアミド、スチレンとアクリ
ルニトリルとからの共重合体、ガラス及びセルロース生
成物が特に好適である。それらは任意の形状で、例えば
フイルム、プレート、粉末、粒子又は繊維フリース、殊
にガラス繊維フリース又はセルロース−／セルロースエ
ステル繊維及び重合体繊維からのフリースとして存在し
ていてよい。
質とからの複合体を固相として有用なプラスチツク表面
に吸着させる。固相への吸着結合は種々の強さの相互作
用、疎水力、双極子−双極子−又はイオン−双極子相互
作用を介して行なわれる。疎水性固相としては、疎水性
の可溶性蛋白質の表面張力よりも小さい表面張力を有す
る担持材料が好適である。表面張力＜40erg/cm2の担持
材料を使用すると優れている。ポリスチレン、ポリメタ
クリレート、テフロン、ポリアミド、スチレンとアクリ
ルニトリルとからの共重合体、ガラス及びセルロース生
成物が特に好適である。それらは任意の形状で、例えば
フイルム、プレート、粉末、粒子又は繊維フリース、殊
にガラス繊維フリース又はセルロース−／セルロースエ
ステル繊維及び重合体繊維からのフリースとして存在し
ていてよい。
疎水性蛋白質は特に良好な吸着結合を呈する。恐らく、
疎水化により蛋白質の分子内架橋結合が開裂して、この
蛋白質の疎水性部分が表面対し、かつそこの部分で、非
疎水性蛋白質で表面に見出される疎水性部分よりも良好
に疎水性プラスチツク表面に付着する。
疎水化により蛋白質の分子内架橋結合が開裂して、この
蛋白質の疎水性部分が表面対し、かつそこの部分で、非
疎水性蛋白質で表面に見出される疎水性部分よりも良好
に疎水性プラスチツク表面に付着する。
本発明方法は特異的結合性物質の測定に好適である。例
えば、一方の反応成分が固相に結合して存在する物質対
としては、抗原−抗体、ハプテン−抗体及び特異的に相
互に結合性の他の蛋白質、例えば特にストレプタビジン
もしくはアビジンとビオチンの系が好適である。
えば、一方の反応成分が固相に結合して存在する物質対
としては、抗原−抗体、ハプテン−抗体及び特異的に相
互に結合性の他の蛋白質、例えば特にストレプタビジン
もしくはアビジンとビオチンの系が好適である。
蛋白質と特異的結合性物質とからの複合体を疎水性固相
に吸着させる前に、固相を物理的に又は化学的に前処理
することもできる。例えば、プラスチック表面を前膨潤
させるかあるいは公知方法で活性化することができる。
に吸着させる前に、固相を物理的に又は化学的に前処理
することもできる。例えば、プラスチック表面を前膨潤
させるかあるいは公知方法で活性化することができる。
固相イムノアツセイで使用するための本発明による担持
材料は、特異的結合性物質が結合していて、約500000を
上廻る分子量を有する蛋白質の吸着している疎水性固相
より成つていることを特徴とする。
材料は、特異的結合性物質が結合していて、約500000を
上廻る分子量を有する蛋白質の吸着している疎水性固相
より成つていることを特徴とする。
この担持材料は固相イムノアツセイに使うのに好適であ
る。それというのも特異的結合性物質が非常に良好に付
着しかつ界面活性剤の添加でも脱着しないからである。
る。それというのも特異的結合性物質が非常に良好に付
着しかつ界面活性剤の添加でも脱着しないからである。
例えば、担持材料は小管、微量滴定プレート又は球体の
形で存在し、これらは特異的結合性物質が結合している
架橋された蛋白質で被覆されている。
形で存在し、これらは特異的結合性物質が結合している
架橋された蛋白質で被覆されている。
固相には、架橋させた蛋白質及び特異的結合性物質から
成る複合体が吸着している。蛋白質は前記のように架橋
された牛血清アルブミン、リパーゼ又は免疫−γ−グロ
ブリンであると優れている。
成る複合体が吸着している。蛋白質は前記のように架橋
された牛血清アルブミン、リパーゼ又は免疫−γ−グロ
ブリンであると優れている。
本発明により、特異的結合性物質を良好な付着性をもつ
て持続的に疎水性固相に固定させるための方法及び担持
材料が得られる。付着性は改良されて界面活性剤の添加
でも物質の分離をもたらさない。本発明方法は簡単に実
施することができる。
て持続的に疎水性固相に固定させるための方法及び担持
材料が得られる。付着性は改良されて界面活性剤の添加
でも物質の分離をもたらさない。本発明方法は簡単に実
施することができる。
実施例 次に本発明を添付図面に基いて実施例により詳説する。
例１ TSHに対するモノクロナール抗体のFab−フラグメントを
ポリスチレン小管に結合 （ａ） Fab−フラグメント（Fab＜TSH＞）の製造 モノクロナール抗体（MAK＜TSH＞）をガルフレ（Galfr
e）及びミルスタイン（Millstain）により記載された方
法〔“Meth.in Enzymology"、73巻（1981年）〕により
取得する。更に精製するために腹水を硫酸アンモニア沈
殿にもたらしかつDEAE−セルロースを介して通過させ
る。
ポリスチレン小管に結合 （ａ） Fab−フラグメント（Fab＜TSH＞）の製造 モノクロナール抗体（MAK＜TSH＞）をガルフレ（Galfr
e）及びミルスタイン（Millstain）により記載された方
法〔“Meth.in Enzymology"、73巻（1981年）〕により
取得する。更に精製するために腹水を硫酸アンモニア沈
殿にもたらしかつDEAE−セルロースを介して通過させ
る。
引続いて、パパイン分解を行なう〔“Biochem.Y."、73
巻、119〜126頁（1959年）〕。その際に精製するFab−
フラグメントを未消化のIgG−分子及びFc−フラグメン
トからセフアデクス（Sephadex）G100を介して行なうゲ
ル濾過及びDEAE−セルロースを介して行なうイオン交換
体クロマトグラフイにより分離する〔“Meth.in Enzymo
logy"、73巻、418〜459頁（1981年）〕。
巻、119〜126頁（1959年）〕。その際に精製するFab−
フラグメントを未消化のIgG−分子及びFc−フラグメン
トからセフアデクス（Sephadex）G100を介して行なうゲ
ル濾過及びDEAE−セルロースを介して行なうイオン交換
体クロマトグラフイにより分離する〔“Meth.in Enzymo
logy"、73巻、418〜459頁（1981年）〕。
（ｂ） 蛋白質を添加しないFab−フラグメントの架橋
（比較） Fab−フラグメント50mgを0.05モル／−リン酸カリウ
ム緩衝腋（pH7.5）2ml中に溶かし、かつジオキサン中に
溶かした（7.4mg/ml）ジスクシンイミジルスベラート0.
4ml（製造者Pierce）を撹拌下に加える。25℃で２時間
恒温保持した後で、0.1モル／−リシンヒドロクロリ
ド0.2mlの添加により反応を中断する。反応バツチをリ
ン酸カリウム緩衝液（上記参照）0.2mlで稀釈しかつ遠
心分離する。上澄みをウルトロゲル（Ultrogel）AcA202
−カラム（LKB社、Grfeling/西ドイツ国在）を介して
脱塩し、その際に蛋白質45mgを含有する11.3mlが得られ
る。この調製物の１部をスペローゼ（Superose ）−６
−カラム（Deutsche Pharmacia GmbH社製）を用いて0.0
5モル／−リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）中の流速0.
5ml/分で分画しかつ分子量約500000〜5000000の画分を
更に使用する。
（比較） Fab−フラグメント50mgを0.05モル／−リン酸カリウ
ム緩衝腋（pH7.5）2ml中に溶かし、かつジオキサン中に
溶かした（7.4mg/ml）ジスクシンイミジルスベラート0.
4ml（製造者Pierce）を撹拌下に加える。25℃で２時間
恒温保持した後で、0.1モル／−リシンヒドロクロリ
ド0.2mlの添加により反応を中断する。反応バツチをリ
ン酸カリウム緩衝液（上記参照）0.2mlで稀釈しかつ遠
心分離する。上澄みをウルトロゲル（Ultrogel）AcA202
−カラム（LKB社、Grfeling/西ドイツ国在）を介して
脱塩し、その際に蛋白質45mgを含有する11.3mlが得られ
る。この調製物の１部をスペローゼ（Superose ）−６
−カラム（Deutsche Pharmacia GmbH社製）を用いて0.0
5モル／−リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）中の流速0.
5ml/分で分画しかつ分子量約500000〜5000000の画分を
更に使用する。
（ｃ） 未処理のγ−グロブリンによるFab−フラグメ
ントの架橋（比較） Fab−フラグメントと牛からのγ−グロブリン（Serva
社、ハイデルベルク／西ドイツ国在）とを量比1:1で混
合する。架橋をｂ）に記載したように実施する。
ントの架橋（比較） Fab−フラグメントと牛からのγ−グロブリン（Serva
社、ハイデルベルク／西ドイツ国在）とを量比1:1で混
合する。架橋をｂ）に記載したように実施する。
（ｄ） 前架橋したγ−グロブリンへのFab−フラグメ
ントの結合（本発明） γ−グロブリン1.25gを0.05モル／−リン酸カリウム
緩衝液（pH7.8）10ml中に溶かし、かつゾルバル（Sorva
ll）冷却遠心機中で10分間5000rpmで澄明になるまで遠
心する。この溶液にジスクシンイミジルスベラート1.75
mlを添加しかつ水2.5mlで稀釈する。25℃で４時間撹拌
後、0.1モル／−リシン10mlを添加しかつpH値を6.8に
調節しかつ遠心分離する。上澄み調製ゲル濾過カラム
（TSK3000、LKB社、Grfeling/西ドイツ国在）で分離
し、限外濾過を介して濃縮しかつ４℃で保存する。
ントの結合（本発明） γ−グロブリン1.25gを0.05モル／−リン酸カリウム
緩衝液（pH7.8）10ml中に溶かし、かつゾルバル（Sorva
ll）冷却遠心機中で10分間5000rpmで澄明になるまで遠
心する。この溶液にジスクシンイミジルスベラート1.75
mlを添加しかつ水2.5mlで稀釈する。25℃で４時間撹拌
後、0.1モル／−リシン10mlを添加しかつpH値を6.8に
調節しかつ遠心分離する。上澄み調製ゲル濾過カラム
（TSK3000、LKB社、Grfeling/西ドイツ国在）で分離
し、限外濾過を介して濃縮しかつ４℃で保存する。
この架橋したγ−グロブリン50mgを0.05モル／−リン
酸カリウム緩衝液5ml中に溶かしかつpH値を固体炭酸ナ
トリウムの添加により9.5に調節する。その後、Ｎ−ア
セチルホモシステインチオラクトン（Serva社、ハイデ
ルベルク／西ドイツ国在）50mgを加えかつ窒素ガスを送
り込みながら25℃で５時間撹拌する。引続いて、このバ
ツチを0.1モル／−リン酸カリウム（pH7.0）、0.001
モル／塩化マグネシウム及び塩化ナトリウム0.05モル
／からの緩衝液中でウルトロゲル AcA202−カラムを
介して脱塩する。
酸カリウム緩衝液5ml中に溶かしかつpH値を固体炭酸ナ
トリウムの添加により9.5に調節する。その後、Ｎ−ア
セチルホモシステインチオラクトン（Serva社、ハイデ
ルベルク／西ドイツ国在）50mgを加えかつ窒素ガスを送
り込みながら25℃で５時間撹拌する。引続いて、このバ
ツチを0.1モル／−リン酸カリウム（pH7.0）、0.001
モル／塩化マグネシウム及び塩化ナトリウム0.05モル
／からの緩衝液中でウルトロゲル AcA202−カラムを
介して脱塩する。
ａ）により製造したFab−フラグメント（0.01モル／
−リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）1ml中10mg）をDMSO
（33mg/ml）中のマレインイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer Mannhei
m GmbH社）0.002mlにより25℃で２時間活性化し、引続
いて遠心分離しかつAcA202−カラムを介して脱塩する。
−リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）1ml中10mg）をDMSO
（33mg/ml）中のマレインイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer Mannhei
m GmbH社）0.002mlにより25℃で２時間活性化し、引続
いて遠心分離しかつAcA202−カラムを介して脱塩する。
次いで、このフラグメントをγ−グロブリンと合つし
（蛋白質の量比1:1）かつ25℃及びpH7.0で１時間恒温保
持する。引続いて、脱塩水に対して４℃及び蛋白質濃度
25mg/mlで一晩にわたつて透析する。
（蛋白質の量比1:1）かつ25℃及びpH7.0で１時間恒温保
持する。引続いて、脱塩水に対して４℃及び蛋白質濃度
25mg/mlで一晩にわたつて透析する。
この複合体を直接固相への吸着に使用することができ
る。
る。
（ｅ） テルモ（Thermo）−RSA（牛血清アルブミン）
にカツプリングさせたFab−フラグメントの製造（本発
明） テルモ−RSA（牛血清アルブミン）の製造： RSA−I1gを50ミリモル／−リン酸カリウム（pH7.0）1
00ml中に溶かし、70℃に加熱しかつこの温度で軽く撹拌
しながら４時間保持する。この溶液を冷却し、濾過しか
つ限外濾過セル（排除限界30000ダルトン）中で濃度50m
g/mlに調節する。引続いて、30倍容量の再蒸留水に対し
て透析し、次いで凍結乾燥する。生成物は分子量約7000
00を有する。
にカツプリングさせたFab−フラグメントの製造（本発
明） テルモ−RSA（牛血清アルブミン）の製造： RSA−I1gを50ミリモル／−リン酸カリウム（pH7.0）1
00ml中に溶かし、70℃に加熱しかつこの温度で軽く撹拌
しながら４時間保持する。この溶液を冷却し、濾過しか
つ限外濾過セル（排除限界30000ダルトン）中で濃度50m
g/mlに調節する。引続いて、30倍容量の再蒸留水に対し
て透析し、次いで凍結乾燥する。生成物は分子量約7000
00を有する。
Fab−フラグメントへのカツプリングの前に、テルモ−R
SAを活性化する。このために、テルモ−RSA68mgを0.1モ
ル／−リン酸カリウム（pH7.8）2ml中に溶かしかつＳ
−アセチルメルカプトコハク酸アンヒドリド（SAMBA）
3.8mgの溶液を加える。３時間の反応後に、50ミリモル
／−リン酸カリウム（pH6.5）２に対して４℃で透
析する。このテルモ−RSAをｄ）により活性化したFab−
フラグメントと量比1:1で25℃及びpH7.0で１時間恒温保
持し、引続いて脱塩水に対して４℃及び蛋白質濃度2.5m
g/mlで１晩透析する。
SAを活性化する。このために、テルモ−RSA68mgを0.1モ
ル／−リン酸カリウム（pH7.8）2ml中に溶かしかつＳ
−アセチルメルカプトコハク酸アンヒドリド（SAMBA）
3.8mgの溶液を加える。３時間の反応後に、50ミリモル
／−リン酸カリウム（pH6.5）２に対して４℃で透
析する。このテルモ−RSAをｄ）により活性化したFab−
フラグメントと量比1:1で25℃及びpH7.0で１時間恒温保
持し、引続いて脱塩水に対して４℃及び蛋白質濃度2.5m
g/mlで１晩透析する。
この生成物を直接被覆に使用する。
ｆ） β−ガラクトシダーゼにカップリングさせたFab
−フラグメントの製造（本発明） Fab−フラグメントをｄ）に記載したように活性化しか
つβ−ガラクトシダーゼのSH−基に“J.Immunoassay"、
４巻、209〜327頁（1983年）によりカツプリングさせ
る。使用したβ−ガラクトシダーゼは分子量500000〜20
00000を有する。
−フラグメントの製造（本発明） Fab−フラグメントをｄ）に記載したように活性化しか
つβ−ガラクトシダーゼのSH−基に“J.Immunoassay"、
４巻、209〜327頁（1983年）によりカツプリングさせ
る。使用したβ−ガラクトシダーゼは分子量500000〜20
00000を有する。
他の実験では架橋β−ガラクトシダーゼ（分子量〜5000
000）を使用した。
000）を使用した。
ｇ） ポリスチレン小管をFab−フラグメントもしくは
その複合体で負荷 Fab−フラグメントもしくはその複合体50mgを再蒸留水1
0ml中に溶かす。この溶液1mlをリン酸二水素ナトリウム
5.25g/及びアジ化ナトリウム1g/からの負荷緩衝液1
000ml中で稀釈しかつ室温で30分間撹拌する。
その複合体で負荷 Fab−フラグメントもしくはその複合体50mgを再蒸留水1
0ml中に溶かす。この溶液1mlをリン酸二水素ナトリウム
5.25g/及びアジ化ナトリウム1g/からの負荷緩衝液1
000ml中で稀釈しかつ室温で30分間撹拌する。
それぞれのポリスチレンもしくはルーラン（Luran 、
製造者BASF）製の小管中に前記の溶液1.5mlを充填しか
つ一晩（約22時間）負荷する。その後、小管を完全に空
にし、かつ下記の機能試験を行なう。
製造者BASF）製の小管中に前記の溶液1.5mlを充填しか
つ一晩（約22時間）負荷する。その後、小管を完全に空
にし、かつ下記の機能試験を行なう。
ｈ） TSH−測定に関する機能試験 ｇ）により塗布したポリスチレン−もしくはルーラン
−小管をTSH−エンチムン（Enzymun −試験（Boehring
er Mannheim GmbH社製、注文No.736082）と同様にTSH−
測定試薬で使用し、かつ検量曲線を試験処方に相応して
測定する。その際に、表１もしくは第１図中に記載の測
定値が得られる。
−小管をTSH−エンチムン（Enzymun −試験（Boehring
er Mannheim GmbH社製、注文No.736082）と同様にTSH−
測定試薬で使用し、かつ検量曲線を試験処方に相応して
測定する。その際に、表１もしくは第１図中に記載の測
定値が得られる。
第１図からは、蛋白質を添加せずに固定したFab−フラ
グメントでは非常にフラツトな検量曲線が得られること
が明らかである（曲線１及び２）。500000を下廻る分子
量及び低い疎水性の蛋白質へのカツプリングにより検量
曲線の勾配は高くなる（曲線３）。しかしながら満足す
べき結果は達成されていない。これに対して、本発明に
より製造した複合体を用いると十分に高い勾配の検量曲
線が得られる（曲線４）。
グメントでは非常にフラツトな検量曲線が得られること
が明らかである（曲線１及び２）。500000を下廻る分子
量及び低い疎水性の蛋白質へのカツプリングにより検量
曲線の勾配は高くなる（曲線３）。しかしながら満足す
べき結果は達成されていない。これに対して、本発明に
より製造した複合体を用いると十分に高い勾配の検量曲
線が得られる（曲線４）。
１） 測定曲線の最低値（可能な限り低い方がよい） ２） 測定曲線の最高値（可能な限り高い方がよい） 例２ ストレプタビジンの固定化 ａ） 架橋したストレプタビジンの製造 ストレプタビジン（製造者:Boehringer Mannheim Gmb
H）は例1b）と同様に架橋する） ｂ） RSAもしくはβ−ガラクトシダーゼに結合したス
トレプタビジンの製造 未架橋のRSAもしくはβ−ガラクトシダーゼへの結合は
例1fと同様に行なう。
H）は例1b）と同様に架橋する） ｂ） RSAもしくはβ−ガラクトシダーゼに結合したス
トレプタビジンの製造 未架橋のRSAもしくはβ−ガラクトシダーゼへの結合は
例1fと同様に行なう。
ｃ） テルモ−RSAにカツプリングしたストレプタビジ
ンの製造 ストレプタビジンの活性化： ストレプタビジン60mgを50ミリモル／−リン酸カリウ
ム/100ミリモル／−塩化ナトリウム（pH7.0）6ml中に
溶解しかつ４℃で放置する。マレインイミドヘキサノイ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル6.16mgをジ
オキサン620μｌ中に溶かしかつストレプタビジン溶液
中に撹拌装入する。４℃で２時間反応させた後で、２回
50ミリモル／−リン酸カリウム/100ミリモル／−塩
化ナトリウム（pH5）１に対して４℃で透析する。
ンの製造 ストレプタビジンの活性化： ストレプタビジン60mgを50ミリモル／−リン酸カリウ
ム/100ミリモル／−塩化ナトリウム（pH7.0）6ml中に
溶解しかつ４℃で放置する。マレインイミドヘキサノイ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル6.16mgをジ
オキサン620μｌ中に溶かしかつストレプタビジン溶液
中に撹拌装入する。４℃で２時間反応させた後で、２回
50ミリモル／−リン酸カリウム/100ミリモル／−塩
化ナトリウム（pH5）１に対して４℃で透析する。
ストレプタビジン及びテルモ−RSAからの複合体の製
造： ストレプタビジン66mgを50ミリモル／−リン酸カリウ
ム（pH5.0）及び塩化ナトリウム100ミリモル／10ml中
に溶かしかつ50ミリモル／−リン酸カリウム/100ミリ
モル／−塩化ナトリウム（pH6.5）5ml中の活性テルモ
−RSA−SAMBA（例1e）により製造）72mgを添加する。混
合後、反応を停止させるために１モル／−ヒドロキシ
アミン（pH7.0）５μｌを加える。３時間後に、反応生
成物をゲルクロマトグラフイ（Superose ６、50ミリモ
ル／−リン酸カリウム/100ミリモル／−塩化ナトリ
ウムpH7.5）を介して精製する。分子量1000000〜500000
0の複合体が得られる。
造： ストレプタビジン66mgを50ミリモル／−リン酸カリウ
ム（pH5.0）及び塩化ナトリウム100ミリモル／10ml中
に溶かしかつ50ミリモル／−リン酸カリウム/100ミリ
モル／−塩化ナトリウム（pH6.5）5ml中の活性テルモ
−RSA−SAMBA（例1e）により製造）72mgを添加する。混
合後、反応を停止させるために１モル／−ヒドロキシ
アミン（pH7.0）５μｌを加える。３時間後に、反応生
成物をゲルクロマトグラフイ（Superose ６、50ミリモ
ル／−リン酸カリウム/100ミリモル／−塩化ナトリ
ウムpH7.5）を介して精製する。分子量1000000〜500000
0の複合体が得られる。
ｄ） ポリスチレン−もしくはルーラン −小管をスト
レプタビジンもしくはストレプタビジン複合体で負荷 負荷を例1g）に記載したように行なう。
レプタビジンもしくはストレプタビジン複合体で負荷 負荷を例1g）に記載したように行なう。
ｅ） TSH−測定に関する標準値の測定 ｄ）により負荷した小管をTSH−エンチムン −試験試
薬（４倍の複合体活性）中で使用する。記載されている
処方とは異なり固定化抗体の代りにビオチニル化MAK＜T
SH＞を使用する。このビオチニル化MAKの製造は“JAC
S"、100巻、3585〜3590頁（1978年）により行なう。抗
体は該試験において他の試薬と共に試験小管１本当り濃
度400mgで使用する。結果は第２図に示す。図からは、
増加する分子量及び上昇する疎水性と共に検量曲線の勾
配とそれ故達成可能な精度は上昇することが明らかであ
る。
薬（４倍の複合体活性）中で使用する。記載されている
処方とは異なり固定化抗体の代りにビオチニル化MAK＜T
SH＞を使用する。このビオチニル化MAKの製造は“JAC
S"、100巻、3585〜3590頁（1978年）により行なう。抗
体は該試験において他の試薬と共に試験小管１本当り濃
度400mgで使用する。結果は第２図に示す。図からは、
増加する分子量及び上昇する疎水性と共に検量曲線の勾
配とそれ故達成可能な精度は上昇することが明らかであ
る。
例３ 本発明により負荷した小管を用いてT3−試験を行なつ
た。そのために、試料もしくは標準溶液200μｌをPODで
標識したポリクロナール抗体複合体500μｌと一緒に、
テルモ−RSAにカツプリングしたストレプタビジンで塗
布した小管中で予め恒温保持した。５分後に、公知方法
でビオチニル化した重合T3400ngを緩衝液500μｌ中で30
分間恒温保持した。緩衝液としては、RSK0.20％及び８
−アニソノ−１−ナフタリンスルホン酸（ANS）0.04％
を含有するpH8.65のリン酸水素ナトリウムの溶液を使用
した。この恒温保持後に、３回洗浄し、引続いてABTS−
基質溶液1mlを添加した。更に30分間恒温保持した後
で、405nmで光度計を用いて測定した。測定値は第３図
の曲線から明らかである。
た。そのために、試料もしくは標準溶液200μｌをPODで
標識したポリクロナール抗体複合体500μｌと一緒に、
テルモ−RSAにカツプリングしたストレプタビジンで塗
布した小管中で予め恒温保持した。５分後に、公知方法
でビオチニル化した重合T3400ngを緩衝液500μｌ中で30
分間恒温保持した。緩衝液としては、RSK0.20％及び８
−アニソノ−１−ナフタリンスルホン酸（ANS）0.04％
を含有するpH8.65のリン酸水素ナトリウムの溶液を使用
した。この恒温保持後に、３回洗浄し、引続いてABTS−
基質溶液1mlを添加した。更に30分間恒温保持した後
で、405nmで光度計を用いて測定した。測定値は第３図
の曲線から明らかである。
例４ 本発明により塗布した小管を用いてHBsAg−試験を実施
した。そのために、例1g）により塗布した小管中に、HB
s−抗原に対するビオチニル化モノクロナール抗体400ng
及びPODで標識した同じ抗体50ミリＵを同時に、例３と
同じ組成の緩衝液1ml中に溶かして、標準溶液200μｌと
一緒に装入した。標準溶液として、１つとしては精製HB
sAgサブタイプay及び１つとしては精製したHBsAgサブタ
イプadを加えた。その後、室温で４時間恒温保持した。
小管を３回洗浄した後で、ABTS−基質溶液1mlを添加し
た。20分後に反応はほぼ終結しかつ吸光度を405nmで光
度計を用いて測定した。測定値は第４図から明らかであ
り、実線の曲線はHBsAgサブタイプadについてでありか
つ点線の曲線はHBsAgサブタイプayにつてである。
した。そのために、例1g）により塗布した小管中に、HB
s−抗原に対するビオチニル化モノクロナール抗体400ng
及びPODで標識した同じ抗体50ミリＵを同時に、例３と
同じ組成の緩衝液1ml中に溶かして、標準溶液200μｌと
一緒に装入した。標準溶液として、１つとしては精製HB
sAgサブタイプay及び１つとしては精製したHBsAgサブタ
イプadを加えた。その後、室温で４時間恒温保持した。
小管を３回洗浄した後で、ABTS−基質溶液1mlを添加し
た。20分後に反応はほぼ終結しかつ吸光度を405nmで光
度計を用いて測定した。測定値は第４図から明らかであ
り、実線の曲線はHBsAgサブタイプadについてでありか
つ点線の曲線はHBsAgサブタイプayにつてである。
例５ 本発明により塗布した小管と公知方法により塗布した小
管の分離とを比較した。そのために一方の小管を40ミリ
モル−リン酸水素ナトリウム（pH7.4）中のストレプタ
ビジン−テルモ−RSA−溶液（４μg/ml）1.5mlを用いて
20℃で18〜24時間負荷した。小管を空にした後で、塩化
ナトリウム0.9％及びRSA0.3％を含有する２％−サツカ
ロース溶液1.8mlにより後負荷を行なつた。この後負荷
は20℃で30分間行なつた。引続いて、小管を20℃及び相
対湿度40％で24時間乾燥させた。この小管は試験の実施
に使うことができる。更に、小管を公知方法で純粋なス
トレプタビジンで負荷した。これらの小管を用いて、界
面活性剤の作用による分離挙動を試験した。結果は次の
表から明らかである。
管の分離とを比較した。そのために一方の小管を40ミリ
モル−リン酸水素ナトリウム（pH7.4）中のストレプタ
ビジン−テルモ−RSA−溶液（４μg/ml）1.5mlを用いて
20℃で18〜24時間負荷した。小管を空にした後で、塩化
ナトリウム0.9％及びRSA0.3％を含有する２％−サツカ
ロース溶液1.8mlにより後負荷を行なつた。この後負荷
は20℃で30分間行なつた。引続いて、小管を20℃及び相
対湿度40％で24時間乾燥させた。この小管は試験の実施
に使うことができる。更に、小管を公知方法で純粋なス
トレプタビジンで負荷した。これらの小管を用いて、界
面活性剤の作用による分離挙動を試験した。結果は次の
表から明らかである。
分離率の測定は当業者に常用の方法で、例えばストレプ
タビジン及びストレプタビジル−テルモ−RSKの125I−
標識又は酵素的測定を介して行なう。
タビジン及びストレプタビジル−テルモ−RSKの125I−
標識又は酵素的測定を介して行なう。
分離率の酵素的測定に当つては、塗布した小管を、表２
による界面活性剤を添加した50ミリモル／−リン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）と共に表２による条件で恒温保
持する。
による界面活性剤を添加した50ミリモル／−リン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）と共に表２による条件で恒温保
持する。
引続いて室温で１時間恒温保持し、前記の緩衝液で洗
い、ビオチン−POD（POD活性200mU/ml）からの複合体と
室温で１時間恒温保持し、洗浄しかつABTS −溶液（例
７）2mlを添加する。１時間の基質反応後に、405nmで吸
光度を測定しかつその測定からストレプタビジンもしく
はストレプタビジン−テルモ−RSAの分離率を標準検量
曲線を介して測定する。
い、ビオチン−POD（POD活性200mU/ml）からの複合体と
室温で１時間恒温保持し、洗浄しかつABTS −溶液（例
７）2mlを添加する。１時間の基質反応後に、405nmで吸
光度を測定しかつその測定からストレプタビジンもしく
はストレプタビジン−テルモ−RSAの分離率を標準検量
曲線を介して測定する。
例６ 疎水相互作用クロマトグラフイ（HIC）による蛋白質の
疎水性の測定 種々の化合物の疎水性は液体クロマトグラフイ（Hewlet
t Packard 1090 LUSI）により試験した。予備カラムはB
ioRad−Biogel TSK−フエニル−5PW（長さ5mm×内径4.
6mm）、カラムはBioRad−Biogel TSK−フエニル−5PW
（長さ75mm×内径7.5mm、10μｍ、1000Å）であつた。
検出器としては日立F1.000−フルオリメータを使用し
た。
疎水性の測定 種々の化合物の疎水性は液体クロマトグラフイ（Hewlet
t Packard 1090 LUSI）により試験した。予備カラムはB
ioRad−Biogel TSK−フエニル−5PW（長さ5mm×内径4.
6mm）、カラムはBioRad−Biogel TSK−フエニル−5PW
（長さ75mm×内径7.5mm、10μｍ、1000Å）であつた。
検出器としては日立F1.000−フルオリメータを使用し
た。
溶離剤／グラジエント（表３） ａ） 1/100モル１−KH2PO4−緩衝液（pH6.8）中の1.
5モル／−（NH4）2SO4−溶液 ｂ） 1/100モル／−KH2PO4−緩衝液、pH6.8 表 ３ Ａ ％ Ｂ ％ t/分 100 0 0 100 0 5 0 100 30フロー＝0.5分 0 100 5 100 0 5 100 0 5 作業温度：冷却室、＋７℃ 試料準備：試料は未稀釈で使用した。
5モル／−（NH4）2SO4−溶液 ｂ） 1/100モル／−KH2PO4−緩衝液、pH6.8 表 ３ Ａ ％ Ｂ ％ t/分 100 0 0 100 0 5 0 100 30フロー＝0.5分 0 100 5 100 0 5 100 0 5 作業温度：冷却室、＋７℃ 試料準備：試料は未稀釈で使用した。
試料の容量は10μｌであつた。
試験化合物は濃度0.2〜1.4mg/mlで10ミリモル／−リ
ン酸カリウム（pH6.8）中に溶解した。
ン酸カリウム（pH6.8）中に溶解した。
表４に、種々の蛋白質もしくは特異的結合性物質の保持
時間を掲載する。保持時間が長い程、 疎水性は高い。
時間を掲載する。保持時間が長い程、 疎水性は高い。
表 ４ 蛋白質 保持時間tp（分） Fab TSH 41.5 RSA 23.2 γ−グロブリン 32.0 β−ガラクトシダーゼ 39.6 β−ガラクトシダーゼ 架橋した 40.2 ストレプタビジン 38.3 テルモ−RSA（例1e） 溶離不可 γ−グロブリン 架橋 溶離不可 （例1a） これらの条件下で溶離不可能な蛋白質が特に好適であ
る。テルモ−RSAが特に優れている。
る。テルモ−RSAが特に優れている。
例７ テルモ−RSA−ストレプタビジンのガラス繊維フリース
への吸着 ガラス繊維フリース（６×6mm）を吸引容量（約30μ
ｌ）で50ミリモル／−リン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）中の30μg/ml−テルモ−RSA−ストレプタビジン（例
2c）により製造）の溶液で含浸しかつ循環空気箱中50℃
で乾燥させる。
への吸着 ガラス繊維フリース（６×6mm）を吸引容量（約30μ
ｌ）で50ミリモル／−リン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）中の30μg/ml−テルモ−RSA−ストレプタビジン（例
2c）により製造）の溶液で含浸しかつ循環空気箱中50℃
で乾燥させる。
ビオチン結合能の測定に当り、ペルオキシダーゼ（PO
D）及びPOD活性50mU/mlのビオチンからの複合体から成
り、ビオチン濃度0.5,10,20,30,40,50,100,200,1000mg/
mlのビオチン標準の試薬30μｌでストリツプを含浸しか
つ２分間恒温保持する。引続いて、ツイーン20 ２‰を
含む50ミリモル／−リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
の過剰量で洗いかつABTS溶液2ml 100ミリモル／−クエン酸塩緩衝液pH4.4 3.2ミリモル/l−過硼素酸塩 1.9モル／−ABTS （2,2′−アジノ−ジ〔３−エチル
−ベンズチアゾリンスルホン酸（６）〕ジアンモニウム
塩 中に装入しかつ15分間動かす。１時間の基質反応後に40
5nmで吸光度を測定して、ビオチン結合能は半最大値の
シグナルの低下を介して測定される。
D）及びPOD活性50mU/mlのビオチンからの複合体から成
り、ビオチン濃度0.5,10,20,30,40,50,100,200,1000mg/
mlのビオチン標準の試薬30μｌでストリツプを含浸しか
つ２分間恒温保持する。引続いて、ツイーン20 ２‰を
含む50ミリモル／−リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
の過剰量で洗いかつABTS溶液2ml 100ミリモル／−クエン酸塩緩衝液pH4.4 3.2ミリモル/l−過硼素酸塩 1.9モル／−ABTS （2,2′−アジノ−ジ〔３−エチル
−ベンズチアゾリンスルホン酸（６）〕ジアンモニウム
塩 中に装入しかつ15分間動かす。１時間の基質反応後に40
5nmで吸光度を測定して、ビオチン結合能は半最大値の
シグナルの低下を介して測定される。
例８（比較） 米国特許第4572901号明細書中に記載されたようにメチ
ル化牛血清アルブミンを製造した。引き続き、メチル化
牛血清アルブミンを例1eと同様にしてＳ−アセチルメル
カプトコハク酸アンヒドリドと活性化のために（蛋白質
への結合の準備）混合する。このように活性化したメチ
ル化牛血清アルブミンが析出する。例1eに記載したよう
にストレプタビジン（Fab−フラグメントの代わり）を
添加し、これによりメチル化牛血清アルブミンへのスト
レプタビジンの結合が行なわれる（比RSA:ストレプタビ
ジン＝2:1）。引き続き、例1gと同様にして、ポリスチ
レン小管をこの複合体で被覆する。担体への複合体結合
は全く観察されない。複合体の不溶性によるものと思わ
れる。
ル化牛血清アルブミンを製造した。引き続き、メチル化
牛血清アルブミンを例1eと同様にしてＳ−アセチルメル
カプトコハク酸アンヒドリドと活性化のために（蛋白質
への結合の準備）混合する。このように活性化したメチ
ル化牛血清アルブミンが析出する。例1eに記載したよう
にストレプタビジン（Fab−フラグメントの代わり）を
添加し、これによりメチル化牛血清アルブミンへのスト
レプタビジンの結合が行なわれる（比RSA:ストレプタビ
ジン＝2:1）。引き続き、例1gと同様にして、ポリスチ
レン小管をこの複合体で被覆する。担体への複合体結合
は全く観察されない。複合体の不溶性によるものと思わ
れる。
例９（比較） 吸着的結合力が界面活性剤含有緩衝溶液での脱着をスト
レプタビジン、疎水性ストレプタビジン及びテルモ−RS
Aに結合したストレプタビジン（例2c）に関して比較し
た。結合能の測定は例７と同様に行なうが、この際ガラ
ス繊維フリースの代わりにルーラン −小管を使用し
た。分離の測定は例５により行なう。結果を表５に示
す。
レプタビジン、疎水性ストレプタビジン及びテルモ−RS
Aに結合したストレプタビジン（例2c）に関して比較し
た。結合能の測定は例７と同様に行なうが、この際ガラ
ス繊維フリースの代わりにルーラン −小管を使用し
た。分離の測定は例５により行なう。結果を表５に示
す。
ストレプタビジンの疎水化 疎水化のために、ストレプタビジンを（２−ナフトキ
シ）酢酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（NE
HS）で架橋する。
シ）酢酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（NE
HS）で架橋する。
このためには、ストレプタビジン600mgを50mmol/燐酸
カリウム塩、100mmol/NaCl、pH7.6 50ml中に溶か
し、かつゆっくりと攪拌下にジオキサン5ml中に溶解さ
れたNEHS30mgで架橋する。反応時間２時間後に100倍容
量に対して３回透析し、かつ引き続き凍結乾燥する。
カリウム塩、100mmol/NaCl、pH7.6 50ml中に溶か
し、かつゆっくりと攪拌下にジオキサン5ml中に溶解さ
れたNEHS30mgで架橋する。反応時間２時間後に100倍容
量に対して３回透析し、かつ引き続き凍結乾燥する。
ルーラン −小管のNEHS−ストレプトアジビンでの被覆
は50mmol/燐酸カリウム緩衝液、pH7.2で10μg/mlの濃
度に希釈し、ポリスチレン小管（充填容量1.5ml）中で2
0時間恒温保持する。溶液を吸引濾過した後、0.9％NaC
l、0.3％牛血清アルブミン、２％蔗糖からなる溶液で後
積層し、吸引濾過後40％相対湿度、25℃で20時間乾燥さ
せる。
は50mmol/燐酸カリウム緩衝液、pH7.2で10μg/mlの濃
度に希釈し、ポリスチレン小管（充填容量1.5ml）中で2
0時間恒温保持する。溶液を吸引濾過した後、0.9％NaC
l、0.3％牛血清アルブミン、２％蔗糖からなる溶液で後
積層し、吸引濾過後40％相対湿度、25℃で20時間乾燥さ
せる。
第１図はTSH測定用検量曲線を表わし、曲線１は未架橋
のFab＜TSH＞、曲線２は架橋したFab＜TSH＞、曲線３は
Fab＜TSH＞／β−Gal−複合体、曲線４はFab＜TSH＞／
テルモ−RSA−複合体を使用して、ルーラン −小管中
で得られたものであり、第２図は固定化ストレプタビジ
ン及びビオチニル化AK＜TSH＞の使用下に得られたTSH測
定用検量曲線であり、曲線１は未架橋のストレプタビジ
ン、曲線２は架橋したストレプタビジン、曲線３はスト
レプタビジン／β−Gal−複合体、曲線４はストレプタ
ビジン/RSA−複合体、曲線５はストレプタビジン−テル
モ−RSA−複合体を使つて固相としてのルーラン −小
管中で得られ、曲線６は固相としてのポリスチレン小管
中でストレプタビジン／テルモ−RSA−複合体の使用下
に得られものであり、第３図はT3試験用検量曲線、第４
図はHBsAgサブタイプad/ay−試験用検量曲線である。
のFab＜TSH＞、曲線２は架橋したFab＜TSH＞、曲線３は
Fab＜TSH＞／β−Gal−複合体、曲線４はFab＜TSH＞／
テルモ−RSA−複合体を使用して、ルーラン −小管中
で得られたものであり、第２図は固定化ストレプタビジ
ン及びビオチニル化AK＜TSH＞の使用下に得られたTSH測
定用検量曲線であり、曲線１は未架橋のストレプタビジ
ン、曲線２は架橋したストレプタビジン、曲線３はスト
レプタビジン／β−Gal−複合体、曲線４はストレプタ
ビジン/RSA−複合体、曲線５はストレプタビジン−テル
モ−RSA−複合体を使つて固相としてのルーラン −小
管中で得られ、曲線６は固相としてのポリスチレン小管
中でストレプタビジン／テルモ−RSA−複合体の使用下
に得られものであり、第３図はT3試験用検量曲線、第４
図はHBsAgサブタイプad/ay−試験用検量曲線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロルフ・デーク ドイツ連邦共和国ベルンリート・ヒルテン シユトラーセ ７ (56)参考文献 特開 昭58−61466（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−29923（ＪＰ，Ａ)
Claims (14)
- 【請求項１】固相イムノアッセイで使用するための担持
材料において、該材料が特異的結合性の蛋白質物質より
も疎水性である、約500000を上廻る分子量を有する可溶
蛋白質及び特異的結合性の蛋白質物質からの複合体を吸
着させた疎水性固相より成ることを特徴とする担持材
料。 - 【請求項２】疎水性固相がポリスチレン、ポリメタクレ
ート、ポリアミド、テフロンまたはスチレンとアクリル
ニトリルとからの共重合体より成る特許請求の範囲第１
項記載の材料。 - 【請求項３】蛋白質が疎水化された牛血清アルブミン、
疎水化されたリパーゼ又は疎水化された免疫−γ−グロ
ブリンである特許請求の範囲第１項または第２項記載の
材料。 - 【請求項４】特異的結合性物質が抗原又は抗体である特
許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載
の材料。 - 【請求項５】特異的結合性物質がストレプタビジン又は
アジビンである特許請求の範囲第１項から第３項までの
いずれか１項記載の材料。 - 【請求項６】担体がガラス繊維フリース又はセルロース
−／セルロースエステル繊維及び重合体繊維からのフリ
ースである特許請求の範囲第１項から第３項までのいず
れか１項記載の材料。 - 【請求項７】イムノアッセイ原理により使用する、特異
的結合性の蛋白質物質が結合している不溶性担持材料を
製造する方法において、特異的結合性の蛋白質物質より
も疎水性である、約500000を上廻る分子量を有する可溶
性蛋白質をこの特異的結合性物質にカップリングさせ、
かつ反応成分と蛋白質とからのこの複合体を疎水性固相
に吸着させることを特徴とする担持材料の製法。 - 【請求項８】可溶性蛋白質として分子量500000〜200000
00の蛋白質を使用する特許請求の範囲第７項記載の製
法。 - 【請求項９】可溶性蛋白質は、分子量10000〜700000の
蛋白質から500000〜20000000を上廻る分子量に高めるこ
とにより製造する特許請求の範囲第８項記載の製法。 - 【請求項１０】蛋白質をカップリング前に二官能性又は
多官能性の蛋白質試薬により所望の分子量が達成される
まで架橋する特許請求の範囲第７項から第９項までのい
ずれか１項記載の製法。 - 【請求項１１】疎水化された蛋白質を使用する特許請求
の範囲第７項から第10項までのいずれか１項記載の製
法。 - 【請求項１２】蛋白質をカップリング前に、熱の適用、
酸、変性剤又はカオトロピックイオンによる処理及び／
又は疎水性化合物との化学的カップリングにより疎水化
する特許請求の範囲第11項記載の製法。 - 【請求項１３】二官能性化合物としてジスクシンイミジ
ルスベラートを使用する特許請求の範囲第10項記載の製
法。 - 【請求項１４】蛋白質として牛血清アルブミン、リパー
ゼ及び／又は免疫−γ−ブロブリンを使用する特許請求
の範囲第９項から第13項までのいずれか１項記載の製
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863640412 DE3640412A1 (de) | 1986-11-26 | 1986-11-26 | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| DE3640412.8 | 1986-11-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63142268A JPS63142268A (ja) | 1988-06-14 |
| JPH0731205B2 true JPH0731205B2 (ja) | 1995-04-10 |
Family
ID=6314821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62295432A Expired - Lifetime JPH0731205B2 (ja) | 1986-11-26 | 1987-11-25 | 担持材料及びその製法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5061640A (ja) |
| EP (1) | EP0269092B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0731205B2 (ja) |
| KR (1) | KR910002543B1 (ja) |
| CN (1) | CN1032164C (ja) |
| AT (1) | ATE86743T1 (ja) |
| AU (1) | AU592910B2 (ja) |
| CA (1) | CA1302245C (ja) |
| DD (1) | DD279741A5 (ja) |
| DE (2) | DE3640412A1 (ja) |
| ES (1) | ES2054648T3 (ja) |
| GR (1) | GR3007910T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA878824B (ja) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3725504A1 (de) * | 1987-07-31 | 1989-02-09 | Thraenhart Olaf Priv Doz Dr | Verfahren und vorrichtung zum nachweis von antikoerpern und antigenen |
| DE3806431A1 (de) * | 1988-02-29 | 1989-09-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung einer festphasenmatrix |
| US5268306A (en) * | 1988-02-29 | 1993-12-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Preparation of a solid phase matrix containing a bound specific binding pair |
| US5362624A (en) * | 1988-05-25 | 1994-11-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable reaction vessel therefor |
| IE64286B1 (en) * | 1988-05-25 | 1995-07-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable vessel therefor |
| DE3901638C2 (de) * | 1988-05-25 | 1999-03-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch nachweisbaren Substanz und dazu geeignetes Reaktionsgefäß |
| US5888728A (en) * | 1988-10-17 | 1999-03-30 | Molecular Devices Corporation | Hapten derivatized capture membrane and diagnostic assays using such membrane |
| DE3842700A1 (de) * | 1988-12-19 | 1990-06-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur proteinimmobilisierung an einer festphase, so hergestellte protein tragende festphase sowie deren verwendung |
| US6333397B1 (en) | 1989-04-25 | 2001-12-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Monoclonal antibodies to troponin T and their production |
| DE3922873A1 (de) * | 1989-04-25 | 1990-10-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | Spezifische antikoerper gegen troponin t, ihre herstellung und verwendung in einem reagenz zur bestimmung von hermuskelnekrosen |
| DE3915135A1 (de) * | 1989-05-09 | 1990-11-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis spezifisch bindefaehiger substanzen in koerperfluessigkeiten |
| US5270193A (en) * | 1989-10-27 | 1993-12-14 | E. I. Dupont De Nemours And Company | Immobilization of biomolecules on perfluorocarbon surfaces |
| GB8927230D0 (en) * | 1989-12-01 | 1990-01-31 | Unilever Plc | Reagents |
| DE3942999C2 (de) * | 1989-12-27 | 1997-12-18 | Progen Biotechnik Gmbh | Verfahren zum Nachweis von malignen Erkrankungen |
| DE4024544A1 (de) * | 1990-08-02 | 1992-02-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Analyseelement und verfahren zu seiner herstellung |
| DE4025726A1 (de) | 1990-08-14 | 1992-02-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Bestimmung von biogenen aminen |
| WO1992003732A2 (en) * | 1990-08-28 | 1992-03-05 | Bioprobe International, Inc. | Compositions and methods for enhanced binding in biological assays |
| JPH04363659A (ja) * | 1991-06-10 | 1992-12-16 | Smithkline Beckman Corp | ビタミンｂ１２の分析 |
| WO1992022816A1 (en) * | 1991-06-11 | 1992-12-23 | Csl Limited | Solid phase immunoassay |
| DE4209215A1 (de) | 1991-07-04 | 1993-01-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv |
| DE4202850A1 (de) * | 1992-01-31 | 1993-08-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Analysenelement fuer immunoassays |
| DE4240980A1 (de) * | 1992-08-07 | 1994-02-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV |
| DE4312399A1 (de) * | 1993-04-16 | 1994-10-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Bindung eines Transkriptionsfaktors an eine Nukleinsäure |
| DE4313975A1 (de) * | 1993-04-28 | 1994-11-03 | Cytech Biomedical Inc | Immunisierungsmittel und Affinitätschromatographie-Trägermaterial |
| DE4343480A1 (de) * | 1993-12-21 | 1995-07-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Acylierte Proteinaggregate und deren Verwendung zur Signalsteigerung in einem Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern |
| DE4343479A1 (de) * | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Acylierte Proteinaggregate und deren Verwendung zur Entstörung von Immunoassays |
| DE19637718A1 (de) | 1996-04-01 | 1997-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten |
| DE19724787A1 (de) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | Biotez Berlin Buch Gmbh Bioche | Streptavidin/Avidin beschichtete Oberflächen |
| US6033918A (en) * | 1997-11-10 | 2000-03-07 | Bayer Corporation | Method and device for the detection of analyte in a fluid sample |
| DE19924643B4 (de) * | 1999-05-28 | 2017-02-23 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Protein-beladenen Mikropartikeln |
| EP1419386B1 (de) * | 2001-08-10 | 2006-07-12 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur herstellung von protein-beladenen mikropartikeln |
| DK2318838T3 (da) * | 2008-07-16 | 2013-10-14 | Radiometer Medical Aps | Fast fase med høj kapacitet |
| GB201105828D0 (en) | 2011-04-06 | 2011-05-18 | Vivacta Ltd | A device for detecting an analyte |
| GB201121269D0 (en) | 2011-12-12 | 2012-01-25 | Vivacta Ltd | A method forblood measurement |
| JP5717658B2 (ja) * | 2012-01-13 | 2015-05-13 | シスメックス株式会社 | 副腎皮質刺激ホルモンの検出方法および吸着剤 |
| TR201904903T4 (tr) | 2015-03-25 | 2019-05-21 | Alexion Pharma Inc | Alternatif tamamlama yolağının C3 ve C5 konvertazının proteaz aktivitesinin ölçülmesine yönelik bir yöntem. |
| WO2016151558A1 (en) | 2015-03-25 | 2016-09-29 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | A method for measuring the protease activity of factor d of the alternative complement pathway |
| JP7044721B2 (ja) | 2016-05-31 | 2022-03-30 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | Ｈｃｖコア抗原の迅速な検出のための前処理法 |
| KR102165623B1 (ko) | 2016-05-31 | 2020-10-15 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 바이러스 항원의 혈청학적 탐지 방법 |
| ES2865511T3 (es) | 2017-02-02 | 2021-10-15 | Hoffmann La Roche | Inmunoanálisis que usa al menos dos agentes de unión específica a analito pegilado |
| BR112019027491A2 (pt) | 2017-07-27 | 2020-07-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | proteína de fusão multiepítopo, método de produção de uma proteína, uso de uma proteína, método para detectar o antígeno e kit |
| CN113030456A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-06-25 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条、检测卡及试剂盒 |
Family Cites Families (13)
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| US3966580A (en) * | 1974-09-16 | 1976-06-29 | The University Of Utah | Novel protein-immobilizing hydrophobic polymeric membrane, process for producing same and apparatus employing same |
| US4069352A (en) * | 1976-07-02 | 1978-01-17 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Immunoadsorbent polymeric material and method of making same |
| US4210418A (en) * | 1976-08-30 | 1980-07-01 | Mallinckrodt, Inc. | Container for immunochemical and enzymatical determinations or procedures |
| AU533026B2 (en) * | 1979-10-26 | 1983-10-27 | Dynasciences Corp. | Passively adsorbing immuno-reactive haptens to solid phases |
| SE8003732L (sv) * | 1980-05-19 | 1981-11-20 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner |
| DE3116491A1 (de) * | 1981-04-25 | 1982-11-11 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | "thermoplastische formmassen" |
| JPS5861466A (ja) * | 1981-10-08 | 1983-04-12 | Yatoron:Kk | 血清学的凝集反応による測定方法 |
| US4606855A (en) * | 1982-07-26 | 1986-08-19 | Mex Research Associates C/O Leon Reimer | Monoclonal antibody to digoxin |
| US4572901A (en) * | 1983-06-23 | 1986-02-25 | Children's Hospital Medical Center Of Northern California | Method and composition for protein immobilization |
| EP0142192A1 (en) * | 1983-10-22 | 1985-05-22 | Akzo N.V. | Preparation of immunogens consisting of antigenic determinates bound to glycoside-containing carriers |
| JPS62132172A (ja) * | 1985-12-04 | 1987-06-15 | Shionogi & Co Ltd | 固相化抗体およびその製造方法 |
| US4808530A (en) * | 1986-09-05 | 1989-02-28 | The Ohio State University | Protein immobilization by adsorption of a hydrophobic amidine protein derivative to a hydrophobic surface |
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