JPH087213B2 - 固相への蛋白質固定化法、分析測定法及び固相 - Google Patents

固相への蛋白質固定化法、分析測定法及び固相

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JPH087213B2
JPH087213B2 JP1327506A JP32750689A JPH087213B2 JP H087213 B2 JPH087213 B2 JP H087213B2 JP 1327506 A JP1327506 A JP 1327506A JP 32750689 A JP32750689 A JP 32750689A JP H087213 B2 JPH087213 B2 JP H087213B2
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ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は固相への蛋白質固定化法、こうして製造され
た蛋白質を支持する固相及びその使用に関する。
従来の技術 固相に固定化された蛋白質は種々の技術分野において
重要な意義を有する。その例としては固定化された蛋白
質のバイオテクノロジー例えばバイオリアクターへの又
は例えばアフィニティークロマトグラフィー用の生化学
的生成物への使用を挙げることができる。
分析学用の固定化蛋白質は特に重要である。特に血
液、血漿、血清、尿、唾液、髄液等のような体液中の治
療診断に適切なパラメータを検出する場合、生物学内に
親和性の反応すなわち特定の物質を特異的にある種の蛋
白質に結合させる反応は重要である。この種の生物学的
親和性反応を行う公知の物質／蛋白質対は一般には例え
ば抗原／抗体、炭水化物／レクチン、ビオチン／アビジ
ン等である。蛋白質が固相に固定されている場合、この
蛋白質と特異的に結合可能の、試料中の存在する相応す
る物質をこれに結合させ、試料から取り出し、定量的及
び／又は定性的に測定することができる。
例えば抗原／抗体対の一方のパートナーを検出するた
めに異種免疫検定法が開発された。その多くの変法は当
業者に公知である。抗原／抗体対の一方のパートナーを
固相に結合すること及びこの固定化パートナーで相応す
る結合パートナーの少なくとも１部を残りの試料から単
離することはすべての方法に共通している。単離された
結合パートナーの量又は、単離されずに試料中に残って
いる結合パートナーの１部を固相でか又は残りの試料中
で確認する。
蛋白質を固相に固定化することは公知の技術水準から
一連の方法が公知である。すなわち固相への蛋白質の固
定は化学的又は物理的な力によって行うことができる。
固体支持材料とこれに結合すべき蛋白質との間に共有結
合を得る方法は以前から公知である。例えば欧州特許出
願公開第0 274 911号明細書には、蛋白質を直接共有結
合で連結することのできる化学的に反応可能なプラスチ
ック膜を使用することが記載されている。しかし蛋白質
を支持する固相を製造するこの方法は、化学反応を完結
させるために、膜と被結合蛋白質とを長時間接触保持し
なければならない。更に蛋白質で飽和されていない活性
位置を次の第２工程において不活性蛋白質で被覆するこ
とにより、蛋白質を負荷された固相の以後の使用にマイ
ナスの作用を及ぼす可能性のある露出された膜活性位置
がもはや存在しないように処理する必要がある。
固相の反応基を二官能性リンカーと連結させ、次いで
残りの遊離官能基に固定すべき蛋白質を共有結合させる
公知方法は、一層多くの時間と、多くの方法工程を必要
とする。しかし各方法工程でミスチャージ（Fehlcharg
e）が生じる危険性は増しまた製造コストは上昇する。
固相に蛋白質を非共有結合的に固定化する際の１つの
問題点はその弱い結合力にある。すなわち溶液から固相
に吸着された蛋白質は比較的容易に再びこれから単離さ
れる可能性がある。この問題点を解決するための提案は
いくつか公知である。西ドイツ国特許出願公開第34 46
636号明細書には例えば多孔質支持体材料上に免疫反応
性物質を固定化する方法が記載されている。この場合支
持体材料への付着強度に関する問題点を回避するため
に、免疫反応の両パートナー間で、従って抗体と抗原又
はハプテンとの間で免疫反応を起こさせることによって
固定化を行う。こうして被結合蛋白質（抗体又は抗原）
を含みまた固相に結合する免疫複合体網が形成される。
この固定化法の欠点は、結合すべき蛋白質の他に別の高
価な挿入物質（抗体又は抗原）が必要なことである。更
に固相への最良の結合を得るためには添加物の導入を極
めて正確に実施しなければならない。
英国特許出願公開第1 505 400号明細書には、免疫学
的に有用な蛋白質を架橋させ、次いでポリスチロール−
ラテックス粒子に吸着させることが提案されている。こ
の吸着はラテックスエマルジョン中で実施する。ラテッ
クス粒子に蛋白質の１部を結合させた後、これを遠心分
離し、数回洗浄する。蛋白質を支持するポリスチロール
粒子は緩衝された水溶液中に懸濁液として保存し、単離
反応に使用する。
欧州特許出願公開第0 122 209号明細書には、固定化
すべき巨大分子を重合させ、疎水性支持体材料例えばポ
リスチロールと一緒に数時間室温保持し、重合した巨大
分子の１部を支持体材料に結合した後、これを使用又は
貯蔵前に数回洗浄することよりなる、固相への生物巨大
分子の結合法が記載されている。
上記の２つの方法は蛋白質、特に特異的に結合可能の
すなわち生物学的親和性の物質を支持体に十分に付着さ
せることはできない。更に蛋白質を支持体上に固定させ
るには、時間がかかりまた煩雑である定温保持工程及び
洗浄工程が必要である。欧州特許出願公開第0 269 092
号明細書は、上記の２方法においてその付着力を改良す
る方法に関する。このため固定化すべき蛋白質を共有結
合的に疎水性支持体蛋白質に結合させ、この複合体を疎
水性固相に吸着させる。この場合固相と支持体蛋白質と
の間の疎水性相互作用を利用することによって改良され
た有利な固定が達成される。
最後に記載した３つのすべての文献は蛋白質を非共有
結合的に固定化するためにもっぱら疎水性の支持体材料
を使用する点で共通している。これは支持体材料の選択
を著しく制限する。特に蛋白質を支持する固相を水溶液
中で使用する場合（これは生物学的液体のすべてがそう
である）、親水性の材料がその良好な湿潤可能性の故に
しばしば好んで選ばれる。
発明が解決しようとする課題 本発明は公知技術水準から出発し、液体試料からなる
特異的に結合可能の物質を結合しまた場合によっては単
離する際に使用する広範囲の使用可能性を提供すること
ができる蛋白質支持固相を得るために、工業的規模で簡
単かつ迅速な方法により蛋白質を実際に水に不溶性の支
持体材料に固く結合することを根本課題とする。
課題を解決するための手段 この課題は特許請求の範囲の欄の各請求項に記載した
発明によって解決される。すなわち本発明による固相へ
の蛋白質固定化法は、固定化すべき蛋白質を凝集させ、
液状で親水性固相と接触させ、この凝集蛋白質は液中で
可溶でありかつ固相に吸着されており、かつ、接触後固
相を乾燥することによって特徴づけられる。
本発明方法によれば、化学的又は物理的に集合させて
一層高い分子量にすることのできるすべての蛋白質を基
本的に固定化することが可能である。この場合化学的凝
集とは、化学的試薬により達成させるすべての分子量増
大を意味する。すなわち蛋白質を、例えばカルボジイミ
ドを添加することによってホモ重合することができる。
しかし蛋白質は例えば多官能性分子、いわゆるリンカー
によっても互いに結合又は架橋することができる。化学
的リンカーのパレットは、例えば蛋白質と特異的に結合
可能の物質に対する特定の蛋白質部分、すなわちエピト
ープの相補性に関して又は固相への蛋白質凝集体の付着
可能性に関して、凝集体が高度に変化する可能性を提示
する。蛋白質をリンカーにより架橋する方法は、当業者
にとって公知技術水準から公知である。例えばこの種の
方法は英国特許出願公開第1 505 400号明細書、欧州特
許出願公開第0 122 209号及び同第0 269 092号明細書に
記載されている。本発明方法では例えばジスクシニジル
−スベレート、Ｓ−アセチル−メルカプト−無水コハク
酸又はマレインイミド−ヘキサノイル−ヒドロキシスク
シンイミドのようなリンカーが有利である。人アルブミ
ンを凝集させるジスクシニジル−スベレートは本発明用
として特に適している。
物理的凝集とは化学的試薬を用いることなく達成され
るすべての分子量増大を意味する。例えばアルブミンの
ような蛋白質は熱的に凝集し得ることまたこうして分子
量を高め得ることは公知である。熱的に凝集されたアル
ブミンは本発明において特に良好に固定することのでき
る蛋白質である。
製造された蛋白質凝集体を固相に施す前に例えば貯蔵
のために凍結乾燥したい場合には、場合に応じて蛋白質
溶液の凍結乾燥に際してしばしば行われるように、凍結
乾燥前にこれに安定剤を加えることが好ましく、これは
凍結乾燥された蛋白質凝集体の貯蔵安定性及び、水又は
緩衝剤での再構成時におけるその可溶性を高める。この
物質の種類及び量はその都度の蛋白質の種類に依存す
る。一般に場合によっては蛋白質凝集体溶液に添加され
る物質は固定化法特に固相への蛋白質凝集体の結合可能
性にマイナスの影響を及ぼすものであってはならない。
適当な物質は例えばサッカロース、トレハロース、マン
ノース、デキストラン及び同様の炭水化物であるが、ク
ロテイン・シー（Crotein C）、コラーゲン又は牛血清
アルブミンのような蛋白質であってもよい。サッカロー
スは、特にジスクシニジル−スベレートで架橋された人
アルブミンの場合に特に有利である。凍結乾燥すべき蛋
白質凝集体溶液に場合によっては添加される安定剤及び
／又は溶解助剤の代表的な濃度範囲は２〜20重量％であ
る。ジスクシニジル−スベレートで架橋された人アルブ
ミンの溶液にサッカロースを添加する場合、その有利な
濃度は４〜10重量％である。凍結乾燥すべき蛋白質凝集
体溶液に安定剤及び／又は溶解助剤を添加する場合、再
構成された凍結乾燥物を本発明で固相に負荷するために
使用するに当たって安定剤及び／又は溶解助剤の濃度
が、固相への蛋白質凝集体の結合可能性にマイナスに作
用するような高さであってはならない点に注意すべきで
ある。例えばジスクシニジル−スベレートで架橋された
人アルブミンを固定化する場合、蛋白質凝集体溶液中の
サッカロースの濃度は２重量％より少なくなければなら
ない。
蛋白質としては天然産の蛋白質及び天然に由来するも
のから分離された蛋白質のみでなく、人工的に製造され
た蛋白質も本発明方法により固定化することができる。
本発明により特に良好に固定化することのできる蛋白質
の例はアルブミン、免疫グロブリン、トランスフェリン
及びコラーゲンである。同様に本発明によれば非蛋白質
成分例えばビチオン又は炭水化物を結合含有する蛋白質
も固相に固定することができる。この方法では非蛋白質
も本発明により固相に固定化することができるが、この
場合には非蛋白質成分に対して固相へのアンカーとして
作用することのできる蛋白質に予め非蛋白質を結合す
る。
もちろん同様にして蛋白質を固相へのアンカーとして
作用する他の蛋白質に結合することも可能である。
本発明による固相への蛋白質の固定化強度は種々のフ
ァクター、すなわちその都度固定化すべき蛋白質及び支
持体材料の種類に関係する。蛋白質に関しては固相への
付着力は分子量が増すにつれて強くなることを示す。一
定の結合強度を得るために通常必要とされる最小の大き
さは示すことができない。これはその都度結合すべき蛋
白質の種類に依存し、当業者にとっては容易に確認可能
である。アルブミンに関しては例えば４〜５個のアルブ
ミン単位からなる凝集体がすでに本発明により良好に固
定化することができること示し、少なくとも10個のアル
ブミン単位からなる凝集体が特に有利である。
本発明において好ましい固相は、固定化すべき凝集蛋
白質に比べて一層親水性である、実際に水に不溶性のす
べての材料である。適当な材料は例えばポリエステル、
亜硫酸セルロース、ステープルファイバー、リンター、
ニトロセルロース、酢酸セルロース、又はナイロンをベ
ースとする固相である。これらは任意の形で例えば粉
末、微粒子、繊維、フリース又は箔のような形で存在し
ていてもよい。本発明において固相として特に好ましい
のはセルロースをベースとするフリースである。
本発明方法によれば凝集蛋白質は液体で固相と接触す
る。この場合凝集蛋白質は溶解した形で、有利には水性
液体例えば緩衝液中に存在する。固相としてフリースを
使用する場合、これを凝集蛋白質の溶液で含浸させるこ
とが特に有利であり、そのためこれを液体に浸漬し、溶
液で飽和させる。
この場合緩衝液としては、その都度の蛋白質及びその
生物学的活性を損なわないものとして当業者に公知のす
べての緩衝液を使用することができる。例えば人アルブ
ミンに対してはpH−値約６〜約９、有利には約７〜約８
の燐酸塩−又はHEPES−緩衝液が、溶剤として特に適し
ている。
凝集蛋白質を固相に良好に付着させるには、蛋白質凝
集体を固相と接触させた後、蛋白質を支持する固相を乾
燥することが重要である。この場合乾燥とは、液体をで
きる限り多く除去することのできるすべての特定法を意
味する。一般に20℃で７％より低い残湿分及び相対湿度
50％の親水性固相は本発明における乾燥状態にあるとい
える。乾燥といえる残湿分は特定の場合選択した固相と
関連する。すなわち例えばセルロース−フリースは７％
よりも少ない残湿分で乾燥とみなされるが、重量比50:5
0のセルロース及びポリエステル繊維からなる混合フリ
ースは５％よりも少ない残湿分で初めて乾燥とみなされ
る。親水性固相でこの種の乾燥度を経済的に許容可能の
乾燥時間で得るには、一般に熱を加える必要がある。す
なわち本発明方法によれば蛋白質を支持するフリースの
乾燥は有利には30〜80℃の温度で実施する。乾燥時間が
方法の選択に当たって決定的な要因とならない場合に
は、乾燥は例えば空気流中で室温で実施することもでき
る。
驚くべきことには、蛋白質を支持する固相にこの種の
僅少な残湿分を得ることは、蛋白質を支持体に十分に付
着させるための決定的な要因であることが判明した。一
層高い残湿分は固相への蛋白質の固定力を弱める。
本発明方法の優れた利点はその簡明性にある。親水性
支持体材料等に親水性フリースを液体で飽和させるに
は、これを固定化すべき凝集蛋白質の溶液中に浸漬する
だけで十分である。含浸処理後支持体材料を蛋白質溶液
から取り出し、乾燥する。乾燥後蛋白質凝集体は固相に
固く結合する。こうして、固相の蛋白質での均一な負荷
密度を得ることができ、その際固定化された蛋白質の量
は正確に知られている。
こうして固相に結合することのできる蛋白質量は、吸
着によって得ることのできるものよりも著しく多い。す
なわち本発明方法を実施することにより乾燥処理した場
合付加的な洗浄工程によって蛋白質が固相から溶離する
ことはないが、乾燥しない場合すなわち蛋白質凝集体を
固相に単に吸着処理しただけの場合には、吸着された蛋
白質の大部分は洗浄によって再び溶離される。従って本
発明方法によれば、全蛋白質が乾燥後に固定化されるよ
うに蛋白質溶液の濃度を選択した場合、洗浄工程を省略
することができる。この蛋白質濃度はその都度の支持体
材料の種類に依存する。完全に固定化される限界濃度
は、簡単な実験によって容易に確認することができる。
本発明方法の他の利点は、固定化すべき蛋白質の結合
特性にマイナスの影響を及ぼすことなく、含浸溶液の組
成を広範囲に自由に選択し得ることである。すなわち例
えば緩衝液の種類及び濃度、pH、イオン濃度及び場合に
よっては添加すべき安定剤及び／又は溶解助剤は主とし
て、単にその都度溶解した蛋白質凝集体の特性に関連す
る諸観点から選択することができる。この選択が固定化
された蛋白質凝集体の結合強度に影響することはない。
本発明方法で製造された固相は、固定化された蛋白質
と特異的に結合可能な物質を結合するのにまた場合によ
ってはこれを液体から除去するのに極めて適している。
例えばビオリアクター中の固定化された蛋白質の支持体
として生化学的生産分野又は特異的に結合可能の物質を
富化及び／又は分離するアフィニティークロマトグラフ
ィー分野等、種々の使用分野が考えられる。
本発明により製造された蛋白質支持固相は液体試料中
の含有物質を分析測定するのに特に有利に使用すること
がきる。特にこの固相は先に記載した例えば血液、血
漿、血清、尿、髄液、唾液等のような体液中の含有物質
の生物学的親和性測定に適している。本発明による蛋白
質支持固相は異種免疫検定用として有利に使用可能であ
り、特に例えは試験片上に全体的に支持結合された免疫
検定を実施するのに適している。
実施例 以下に本発明を若干の実施例に基づき詳述する。
例 １ ジスクシニジル−スベレート（DSS）を用いての人血
清−アルブミン（HSA）の架橋によるポリ−人血清−ア
ルブミン（pHSA）の製造 HSA1.5gを燐酸カリウム緩衝液30ml（200mM、pH8.0）に
配置し、２時間以内にジオキサン1ml当たりDSS50mgから
なる溶液2.5mlを加える。架橋反応の経過後500倍容量の
燐酸カリウム緩衝液（20mM、pH7.2）に対して透析す
る。650,000ダルトンを越える分子量の高分子分画（pHS
A）をスーペロース6R（Superose 6R）（Pharmacia社
製、西ドイツ国Freiburg在）でゲル濾過を介して分離
し、蛋白質1mg当たりサッカロース6mgを加えた後凍結乾
燥する。
例 ２ 人血清−アルブミンの本発明による固定化及び、こう
して固定化された蛋白質と吸着蛋白質との付着強度の比
較 ポリエステル50％／リンター50％からなる大きさ６×
6mm2及び厚さ0.5mmのフリース片を、燐酸ナトリウム−
緩衝液10mM（pH7.5）中の例１からのpHSA250mg/の溶
液15μで含浸させ、 ａ） 50℃で30分間乾燥し、その都度燐酸ナトリウム緩
衝液25μ（10mM、pH7.5）で３回遠心分離機で洗浄
し、引続き遠心分離するか、又は ｂ） 10分後遠心分離機で遠心分離し、その都度燐酸ナ
トリウム−緩衝液25μ（10mM、pH7.5）で２回洗浄す
る。
ａ）及びｂ）の洗浄遠心分離物をその都度合し、アン
チ−HSA−IgG−β−ガラクトシダーゼ複合体300mU（160
μ）を加え、10分間振る。次いでその壁面にHSAを塗
布した微量滴定板の各孔にそれぞれ200μを移入す
る。１時間定温保持した後、燐酸塩で緩衝された生理食
塩溶液を用いて洗浄し、ｏ−ニトロフェニルガラクトシ
ドで展開し、10分後405nmでの吸光度を測定する。フリ
ースから溶離されたpHSAの定量測定は較正曲線を介して
行う。
各フリース片が接触したpHSA量は3.75μｇであった。
溶離後次の量が合した洗浄遠心分離物中に認められた：方法 溶離液中のpHSA 含浸液に対する溶離液 ａ） 0.012μｇ 0.3％ ｂ） 2.64 μｇ 71 ％ 本発明により固定化された蛋白質は乾燥処理したこと
から、大部分が再び固相から洗浄除去される可能性のあ
る単なる吸着蛋白質に比べて、著しく強固に固相に結合
されている。
例 ３ ａ） 家ウサギ−IgG−T3−複合体の製造及び架橋家ウ
サギ−IgG3gを燐酸カリウム緩衝液300ml（100mM、pH8.
5）に溶かし、ジオキサン30ml中のＮ−tert−ブチルオ
キシカルボニル−トリヨードチロニン−Ｎ′−ヒドロキ
シスクシンイミド−エステル（BOC−T3−Ｎ′−ヒドロ
キシスクシンイミド−エステル）58mgからなる溶液を加
える。
２時間の反応時間後この蛋白質溶液を200倍容量の20m
M燐酸カリウム緩衝液（pH7.8）に対して透析し、限外濾
過［アミコン（Amicon）YM100R−膜］を介して濃度50mg
/mlに調整する。
架橋のためバッチに徐々にジスクシニジル−スベレー
ト（濃度：ジオキサン1ml当たりジスクシニシジル−ス
ベレート10mg）35mlを加える。架橋反応の終了後500倍
容量の燐酸カリウム緩衝液（50mM、pH7.2）に対して透
析し、排除容量中のスーペロース6Rで溶離された分画を
分離し、サッカロース（濃度:IgG1mg当たりサッカロー
ス6mg）で安定化し、凍結乾燥する。
ｂ） トリヨードチロニン（T3）−試験 亜硫酸セルロース60％及びリンター40％からなるフリ
ースを、例3a）からの架橋された家ウサギ−IgG−T3−
複合体で燐酸カリウム緩衝液50mM（pH7.2）中の濃度250
μg/mlで含浸させ、完全に飽和させた後50℃で60分間に
わたって環境棚中で乾燥する。羊−アンチ−T3−IgG−
β−ガラクトシダーゼ−複合体（“J.Immunoassay"、４
（1983）、第209頁〜第327頁に記載されている方法と同
様にして製造）50μ（燐酸塩で緩衝された生理食塩溶
液中120mU、牛血清−アルブミン5g/）をT3−標準材料
50μで５分間定温保持し、引続きT3−マトリックスの
予め製造したフリース片（８×8mm、厚さ0.5mm）にピベ
ットで供給する。定温保持時間５分後にフリース片を遠
心分離し、濾液のβ−ガラクトシダーゼ活性をクロルフ
ェノールロートガラクトシド溶液（欧州特許出願公開第
0 146 866号明細書により製造）を用いて578nmで測定す
る。
第１図に示した標準曲線が得られ、これは未知のT3−
含有量を有する溶液を検査するのに使用することができ
る。
例 ４ 家ウサギ−IgG−ジゴキシゲニン−複合体の製造及び架
橋 ａ） 家ウサギ−IgG3gを燐酸カリウム−緩衝液300ml
（100mM、pH8.5）に溶かし、ジオキサン30ml中のジゴキ
シゲニン−（３−スクシニジル）−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド58mgからなる溶液を加える。２時間の反応時
間後、蛋白質溶液を200倍容量の20mM燐酸カリウム緩衝
液（pH7.0）に対して透析し、限外濾過（アミコンYM100
R−膜）を介して濃度50mg/mlに調整する。
架橋のためバッチに徐々にジスクシニジル−スベレー
ト溶液（濃度：ジオキサン1ml当たりジスクシニジル−
スベレート10mg）35mlを加える。架橋反応の終了後、50
0倍容量の燐酸カリウム緩衝液（50mM、pH7.2）に対して
透析し、排除容量中のスーペロース6Rで溶離された分画
を分離し、サッカロース（濃度:IgG1mg当たりサッカロ
ース6mg）で安定化し、凍結乾燥する。
ｂ） ジゴキシン−試験 亜硫酸−セルロース60％及びリンター40％からなるフ
リースを例4a）からの架橋された家ウサギ−IgG−ジゴ
キシゲニン−複合体50mM（燐酸カリウム緩衝液（pH7.
2）中の250μg/ml）で飽和状態になるまで含浸させ、50
℃で60分間環境棚中で乾燥する。
その都度羊−アンチ−ジゴキシン−IgG−β−ガラク
トシダーゼ−複合体（J.Immunoassay、４（1983）、第2
09頁〜第327頁に記載されている方法と同様にして製
造）50μ（燐酸塩で緩衝された生理食塩溶液中の120m
U、牛血清−アルブミン5g/）を５分間ジゴキシン−標
準材料50μで定温保持し、引続きジゴキシン−マトリ
ックスの予め製造したフリース片（８×8mm、厚さ0.5m
m）上にピペットで供給する。５分間の定温保持時間
後、フリース片をその都度遠心分離機で遠心分離し、遠
心分離物のβ−ガラクトシダーゼ活性をクロルフェノー
ルロールガラクトシド−溶液（欧州特許出願公開第0 14
6 866号明細書により製造）40mMを用いて578nmで測定す
る。
第２図で示した標準曲線が得られ、これにより溶液中
の未知のジゴキシン含有量を測定することができる。
例 ５ 加熱架橋された牛血清アルブミン−ストレプトアビジ
ン−複合体（t BSA−SA）での紙の含浸及び脱着量の測
定 １ 含浸 8mm×8mmの大きさの正方形状の紙（繊維に対してポリ
エステル80％／セルロース20％／エタジュリン（Etadur
in）20％）を、燐酸カリウム緩衝液（pH7.0）50mモル／
中のtBSA−SA（Boehringer Mannheim GmbH社製、西ド
イツ国Mannheim在）0.5μg/mlの溶液42μで含浸す
る。引続き70℃で30分間乾燥する。
２ 脱着量の測定 上記１で製造したフリースを50mM燐酸カリウム緩衝液
（pH7.0）1ml中で15分間移動させる。残分を、1:1のtBS
A−ビチオン（Boehringer Mannheim GmbH社製、西ドイ
ツ国Mannheim在）１μ/mlで内部を被覆した1ml酵素−
プラスチック管に移し、１時間定温保持する。水で２回
洗浄した後ペルオキシダーゼ−ビオチン複合体溶液（20
0mU/ml、Boelinger Mannheim社製、西ドイツ国Mannheim
在）1mlを管に加え、30分間定温保持する。水で２回洗
浄した後、2,2′−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチ
アゾリンスルホネート（６）］を管に加え、反応溶液を
405nmで測定した。この系を公知のtBSA−SA濃度の溶液
の標準材料で培養する。
１により製造した含浸された紙を使用した場合tBSA−
SA18ng（これは0.09％に相当）が脱着する。１による含
浸法で乾燥工程を省略した場合、tBSA−SA560ng（これ
は2.7％である）が脱着する。このことから本発明によ
り固定化された蛋白質はその乾燥工程により、単に吸着
された蛋白質よりも強固に固相に結合されていることが
明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図は未知のT3−含有量を有する溶液を検査するのに
使用する標準曲線を示す図、第２図は溶液中の未知ジゴ
キシン含有量を測定することのできる標準曲線を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ライナー・シユリプフエンバツヒヤー ドイツ連邦共和国ランパートハイム・ベー ト‐フエンシユトラーセ ９ (56)参考文献 特開 昭58−75063（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−41422（ＪＰ，Ａ) 特公 昭53−41204（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】固定化すべき蛋白質を凝集させ、液状で親
    水性固相と接触させ、この際凝集蛋白質は液中で可溶で
    ありかつ固相に吸着されており、かつ接触後固相を乾燥
    することを特徴とする、固相への蛋白質固定化法。
  2. 【請求項２】請求項１記載の方法により製造された蛋白
    質を結合含有する固相を使用することを特徴とする、分
    析測定法。
  3. 【請求項３】請求項１記載の方法により製造された、蛋
    白質を非共有結合状態で含むことを特徴とする固相。
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