KR920007204B1 - 비특이적 단백질 흡착이 낮은 활성화된 매질 - Google Patents

비특이적 단백질 흡착이 낮은 활성화된 매질 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
비특이적 단백질 흡착이 낮은 활성화된 매질
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 화합물의 고정, 전형적으로는 단백성특성이 있는 화합물외 고정방법 및 사용되는 재료와, 그러한 재료의 사용방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명을 생물학적 및/또는 단백성 재료의 제어된 공유결합에 유용한, 비특이적 단백질 친화성이 낮은 표면-변형된 다공성 폴리머 매질과 진단시험 밀 여과/분리 적용과 같이 이들 매질을 사용하는 방법에 관한 것이다.
자주 정성을 들인 과정과는 대조적으로 그리고 까다롭게도, 최근까지는 값비싼 장비가 임상진단에서와 생물학적 분리에 대해 때로 요구되었고, 의학연구에서의 진보는 보다 간단한 과정 및 장비 둘 다의 개량을 유도하였다.
앞서 사용되었던 기술은 다단계를 포함하고 어떤 경우에는, 과정과의 고도의 숙련도 및 친밀도 둘 다를 필요로 하였던 반면에 이제는 어떤 경우에는, 실험적 경험이 거의 또는 전혀없는 사람이 신속하고 정확하게 진단시험 또는 분리를 수행하는 것을 허용하는 키트 및 장치를 쉽게 구할 수 있다.
많은 시험기술 및 장치는 (1)분석하고자 하는 물질(분석시료)과 (2)검출시약 또는 일면의 시약과의 반응의 결과인 색변화같은, 양성시험의 육안으로 볼 수 있는 표식을 제공한다.
분석시료 및/또는 시험시약은 간단한 화학물질 또는 시편(specimen)에서 자수 발전되는 보다 복잡한 고분자 물질일 수 있다.
분석시료의 존재의 육안으로 볼 수 있는 표식은 용액에, 또는 클라스 튜브 또는 플라스틱 튜브의 내면, 스포트(spot) 또는 다중웰 플레이트의 벽과 같은 고체 표면상에, 또는 여과지 또는 막과 같은 다공성 재료상에 나타날 수 있다.
다공재료의 전형적인 화이트 백그라운드 때문에, 바람직한 것은 어떤 경우에 그러한 재료에 대해 존재하고 또한 단독으로 사용된 시험장치 또는 특이한 시험 키트에 다공성 막 또는 매트릭스의 형태로 함입되어있다.
많은 임상 및 진단시험에 이용되는 매질에 사용되는 시험시약은 제어된 방식으로 전형적으로 매질에 공유결합된다.
시험시약이 생물학적 성질이 있는 것일때에는 그것은 거의 항체 또는 항원과 같은 단백성 재료이고, 그것은 특별한 물질 또는 물질 종류에 독특한 친화성을 가진다. 그러한 진단 매질과 함께 분석 시료는, 만약 시험하고자 하는 유동액에 존재한다면 지지체에 결합된 시험 시약과 강력한 복합체를 형성하고, 효소적 방법에 의하여 또는 방사성표지를 사용하여, 전자기 스팩트럼의 특정부위에서의 흡수도의 변화 및 빛의 방출과 같은 적절한 방법에 의하여 분석시료의 존재 및 양을 알려주는 검출시약을 사용하여 검출된다.
이론적인 시험에서는, 단지 분석시료만이 진단매질에 결합된다. 다른 재료는, 그 자제가 때로 단백성인 검출 시약을 포함하여, 매질에 결합되지 않는다.
즉, 생물학적 시편의 실제 시험에서는 유동액이 천연상태로 발견되며 그것은 다수의 성분을 함유하고 많은 이들 성분, 특히 단백성 특성을 가지는 것들은 진단 매질 자체에 의하여 흡착된다.
그러므로, 그들 물질(분석시료)에 대해 결합된 시험시약이 특이적 친화성을 나타내는 것에 더불어, 예를들어 항체와 항원사이와 같은 생특이적(biospecific)복합체의 형성에 기인하여 시험 시약이 공유결합된 진단매질은 또한 비특이적 방식으로 분석시료이외의 단백성특성을 가지는 물질도 흡착한다.
그러한 흡착은 시험에서 높은 백그라운드 신호를 초래하고 많은 진단시험에 요구되는 만감도를 감소시키는 경향이 있다.
그러므로, 자동화된 및 수동의 임상진단 시험 둘 다에서는, 특히 저수준의 분석시료가 존재하는 경우, 매질에 의한 딘백성 재료의 비특이적 흡수는 수행되고 있는 시험에 지장을 초래하는 경향이 있다.
분석시료 이외의 단백질, 특히 검출시약 자체의 그러한 비특이적 흡착은 잘못된 신호, 즉, 소음을 일으킬수 있고 때로 "백그라운드"로 읽혀지기도 한다.
이 소음은 진단매질의 특징이고 시편에 존재하는 분석시료의 양에 관련되지는 않는다.
타당한 시험에서는, 분석시료로부터 생성되는 신호는 백그라운드보다는 커야 하고 그것과 구별가능해야만 한다. 소음에 관련된 신호가 크면 클수록, 시험의 부담도 커진다.
그러한 진단시험의 신뢰도는 그러므로 그의 "신호 대 소음"비율, 즉, 분석시료에 기인하는 신호 대 백그라운드 또는 소음의 비율의 견지에서 기술될 수 있다.
분석시료의 신호가 대우 낮은 분석시료 농도에서 믿을 수 있게 검출되기 위해서는 신호 대 소음 비율이 높아야만 한다.
수행되는 시험의 성질, 생물학적 샘플, 및 시험은 수행되는 조건에 좌우되므로, 그러한 백그라운드 흡착은 시험되는 분석시료가 샘플내에 존재하고 있을때라도 의미없는 시험결과를 유도할 수 있다.
높은 백그라운드 신호에 더불어, 선행기술 지지체는 부가의 결점을 가지고 있다.
많은 진단시의 적용에서, 분석시료 함유 유동액을 진단 매질을 통해 통과시키는 것이 필요하다.
그러한 적용이 특히 여과 과정에서, 단백성 재료를 함유하는 용액의 통과를 포함하는 경우, 매질을 통과하는 압력차는 사용도중 자주 증가하는데 왜냐하면 그러한 매질과 단백성 재료의 지속된 접촉이 비특이적으로 흡착된 단백성재료로 메워져있는 막의 친공을 유발하기 때문이다.
그러므로, 대부분의 경우 소정의 진단 또는 실험적 과정에 아주 적합할 수 있는 막은 제한된 가치의 것일 수 있거나 또는 어떤 경우에는, 단백성 재료의 바람직하지 못한 비특이적 흡착에 의하여 무용하게 될 수 있다.
분리 또는 분석적 적용에 사용된 활성화된 매질중 몇몇의 추가의 결점은 활성화된 부위의 가수분해에 대한 민감성이고, 그것은 그것들의 단백질과의 반응 및 결합능력을 파괴하고, 그러므로 시험에 대한 민감도를 감소시킨다. 많은 화학적으로 활성화된 진단 매질은 바람직한 반응을 진행시킬 수 있는 활성부위의 수를 적게 만드는 습기와 반응하려는 경향이 있다.
이것은 단백질과 공유 결합할 수 있는 이들 매질의 능력을 감소시킨다.
본 발명은 다공성 폴리머 매질, 바람직하게는 막형태이고 천연상태에서 미소다공성인 매질에 관한 것이다.
비특이적 방식으로 단백성 물질같은 펩티드 기 함유물질을 흡착하려는 경향 또는 낮은 친화성을 가지는 매질은 제어된 방식으로 수용체 분자와 반응할 수 있는 적어도 하나의 관능기를 포함하는 활성부위를 함유한다.
이 화학적으로 활성화된 매질은 적당한 수용체 분자, 전형적으로 생물학적 특성이 있는 단백질과 반응 및 공유 결합할 수 있고, 그런후에 그것은 친화성 크로마토그라피에 대한 매질로서, 또는 진단시험 매질로서 특이적 물질의 분리시에 분리 또는 여과 재료로서 사용될 수 있다.
그러므로, 수용체 분자가 결합되어 있는 다공성 폴리머매질은 용액으로부터 리간드를 제거하기 위하여 용액에 존재하는 리간드와 추가로 반응하여 생특이적 복합체를 형성할 수 있다.
리간드는 계속해서 정제형태로 리간드를 제공하기 위하여 매질로부터 이탈될 수 있다.
또는, 적당한 검출시약과 결합하여 사용되는 경우, 진단 시험은 수용체 분자가 시험시약이고 리간드가 분석시료일때 수행될 수 있다.
본 발명에 따르는 화학적으로 활성화된 매질은 혈액, 혈장, 혈청, 요등과 같은 체액에서 발견되는 항체 또는 항원과 같은 생물학적 물질에 특이적인 생물학적으로 활성화된 매질의 제조를 가능하게 하고, 그로써 그러한 생물학적 물리의 분리, 정제 및/또는 확인을 허용한다.
본 발명에 있어서 화학적으로 활성화된 매질을 제조하기 위하여 사용된 화학적으로 활성화된 매질 및 활성화되지 않은 매질 둘 다는 아래에서 보다 상세히 설명되는 "침지 단백질 결합측정"에 의하여 측정되는 바와같이 비특이적 방식으로 펩티드 기 함유 물질, 특히 단백성 재료를 흡착하는 경향이 낮다.
다공성 폴리머 매질로부터 형성되는 본 발명에 따르는 화학적 활성 매질은 다공성, 바람직하게는 미소 다공성 폴리머 기질(substrate)과 다공성 폴리머 기질의 표면 위에 형성되고 공유결합된 또는 피복된 표면 변형 폴리머 재료를 포함한다.
다공성 폴리어 매질은 단백성 재료와 같은 펩티드 기함유 재료에 대한 낮은 친화성 또는 낮은 흡착경향을 가지는 히드록실이 풍부한 표면을 제공한다.
다공성 폴리머 기질은 바람직하게는 미소다공정 및 친액성이고 가장 바람직하게는 친수성이다.
기질은 전형적으로 펩티드 기 함유 재료, 특히 단백성 재료에 대한 놈은 친화성 또는 흡성을 갖는다. 다공성 폴리머 기질의 표면은 펩티드 기 함유 재료에 대한 낮은 친화성을 제공하기 위하여 (1) 피복에 의해서나 또는 (2) 결합에 의해서, 바람직하게는 후자에 의해서 쉽게 이용할 수 있는 히드록실기가 풍부한 제2폴리머 재료를 거기에 함입시킴으로써 변형된다.
제1형태, 즉, 다공성 폴리머 기질위에 피복된 형태의 표면 형태 폴리머는 (a) 다수의 히드록실 부분을 가지는 폴리머와 (b) 폴리머상의 히드록실 부분과 반응할 수 있는 관능기 또는 부분을 가지는 교차결합체와의 반응, 전형적으로는 축합 반응으로부터 형성되는 교차결합된 폴리머이다. 바람직하게는 교차결합체 또한 폴리머이다.
폴리머 피복을 사용하는, 본 발명에 따르는 다공성 폴리머 매질은 다공성 폴리머 기질을 다수의 히드록실부분을 가지는 폴리머와 히드록실 부분과 반응, 바람직하게는 축합반응을 진행시킬 수 있는 부분을 가지는 교차 결합체와의 혼합물과 접촉시킴으로써 제조될 수 있다.
기질위에 혼합물의 피복이 형성된 후에, 혼합물-피복된 기질은 혼합물로부터 분리되고, 바람직하게는 가열에 의하여 소성된다.
폴러머 기질의 표면에 형성된 제 2 및 바람직한 형태의 표면 변형 폴리머는 펜던트 히드록실 부분을 가지는 폴리머 재료이다.
이 표면 변형폴리머는 결합과정에 의하여 기질의 표면에 형성되고 공유 결합된다.
그러한 과정은 폴리머 기질을 적당한 히드록실 함유, 중합가능한 불포화 모노머, 전형적으로는 적어도 하나의 히드록실기를 가지는 단일불포화 모노머 용액으로 처리하는 단계와, 그런후 처리된 기질을 이온화 방사선, 바람직하게는 감마 방사선에 노출시키는 단계를 포함한다. 모노머의 중합 및 폴리머 기질에의 결합은 그 결과로 히드록실기가 풍부한 표면을 내포하고 단백질에 대한 낮은 친화성을 가지는 폴리머 기질을 생성한다.
표면 변형 폴리머를 형성하기 위한 모노머로서 바람직한 것은 히드록시알킬 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 같은 히드록실 함유 비닐형 모노머이다.
이 기질은 그런 후 화학적으로 활성화된 다공성 폴리머 매질을 형성하기 위하여 다중관능 활성화제, 바람직하게는 다중관능 산 활로겐화물 또는 위할로겐화물과 반응된다. 이것은 진단시험 매질, 여과 재료, 또는 크로마토그라프 지지체로서 사용될 수 있는 매질을 형성하기 위하여 순차적으로 수용체 분자와 반응될 수 있다.
"생물학적으로 활성화된" 또는 "생물학적 활성"매질로도 불리우는, 수용체 분자를 함유하는 매질을 형성하기 위하여, 수용체 분자가 전형적으로 생물학적 재료이기 때문에, 화학적으로 활성화된 매질은 적당한 반응조건하에 수용체 분자와 반응된다. 매질이 진단 매질로서 의도된 경우, 수용체 분자는 시험시약을 구성한다. 진단시험을 수행하기 위해서 거기에 결합된 시험시약을 포함하는 진단 매질은 분석시료를 함유하는 것으로 추정되는 유동액과 접촉된다.
본 발명에 따르는 생물학적으로 활성화된 매질과 함께, 펩티드 기 함유 물질의 진단 매질에 의한 흡착은 활성화제가 계획적으로 결합된 곳(활성 부위)이외의 위치에서는 최소화된다. 그러므로, 진단 매질로서 사용되는 경우에는, 진단시험의 민감도가 일반적으로 증가된다. 더불어, 생물학적 활성 매질, 즉, 본 발명에 따르는 화학적 활성 매질로부터 형성된 여과, 크로마토그라피, 및 진단매질은 그것들이 그로부터 제조되는 미처리 폴리머 기질의 흐름특성과 아주 유사한 바람직한 흐름특성을 나타낸다. 그러나, 미처리 다공성 기질의 양태와 비교할 때 본 발명에 따르는 매질은 단백질 재료와 같은 펩티드 기 함유 재료의 매우 감소된 흡착때문에 연장된 시간동안 유동액 흐름특성을 유지한다.
나아가, 본 발명에 따르는 바람직한 화학적으로 활성화된 매질은 활성화제로서 탄산의 비스아졸라이드, 특히 N,N-카르보닐 디이미다졸을 사용하는 그들 매질에 의하여 예시된 바와 같이 높은 내 가수분해성을 입증한다. 이것은 습한 환경에 보관된 후 매질의 표면위의 두가지 화학적 및 생물학적 활성 부위의 고도의 보유를 유발한다.
화학적으로 활성화된 매질 자체뿐만 아니라, 본 발명에 따르는 화학적으로 활성화된 매질을 형성하기에 적당한 매질은 침지 단백질 결합 측정(IPBA)에 의하여 측정되는 바와 같이 비특이적 방식으로 단백질에 결합하는 경향이 낮다. 이 과정에 의하여 시험되는 경우, 약 3O㎍/㎠ 정도 흉수하는 물필이 본 발명에 따로는 목적에 대해서 단백성 개로와 같은 아미드 기 함유 재료에 대한 낮은 친화성을 가지는 것으로 고러된다. 바람직한 것-뜬 약 2O㎍/㎠ 정도 흡수하는 그런 매질들이다. 본 발명에 바람직한 매질은 다공성 폴리머 기질 또는 매트릭스를 포함하고, 펩티드 기 함유 재료와 특히 단백질 재료에 대한 낮은 친화성을 제공하기 위하여 펜던트 히드록실 기가 풍부한 제2폴리머 재료를 사용하여 그의 표면에서 변형된다. 그러한 재료에 대한 표면 변형된 폴리머 매질의 친화성은 그로부터 매질이 형성되는 폴리머 기질보다 전형적으로 매우 낮다. 또한 생특이적 복합체의 일원과 같은 수용체 분자는 표면 변형 폴리머 재료를 통해서 다공성 매질에 공유결합될 수 있고, 아마도 시험 시약은 전형적으로 생물학적 재료이다.
본원에 상용된 용어에 다음에 정의들이 적용된다.
용어 "단백성 재료"는 펩티드 연결을 함유하고 단백질과 폴리펩티드를 포함하는 화합물을 언급한다. 용어는 또한 우선적으로 단백질은 아니지만 입체적으로 접근이 쉬운 아미드 부분 또는 폴리펩티드 단편을 가지는 물질을 포함한다.
"표면", "폴리머 기질표면", "매질표면"등과 같은 용어는 단독으로 또는 복수로 사용되고, 본원에서는 큰 표면뿐만 아니라, 즉, 볼 수 있도록 노출되는 것들과 같은 외면뿐만이 아니라 내면 또는 폴리머 기질 또는 매질의 가공을 정의하는 그런 표면도 포함하는 것으로 의도되였다. 그러므로, 기질 또는 매질 표면은 사용중에 유동액, 특히 액체에 의해 접촉될 수 있는 폴리머 기질 또는 매질의 부분이다. 내면 및 외면 둘다의 영역을 언급하는 "폴리머 기질표면 영역"과 구별되는 것처럼 재료의 노출된 평면 차원의 영역은 본원에서는 폴리머 기질 영역으로서 언급된다.
용어 "분석시료"는 시험 또는 진단과정에 의해 측정하고자 하는 물질 또는 물질들을 언급한다. 분석시료는 간단한 화학적 화합물 또는 고분자 특성의 화합물일 수 있고, 생물학적 기원의 물질들일 수도 있다.
용어 "시험 시약" 또는 '"진단 시약"은 매질에 공유 결합되고 특이적으로 본석시료에 결합하는 물질 또는 재료를 언급한다. 분석 시료의 존재는 전형적으로 적절한 검출 및/또는 분석시료와 검출 시약 사이의 반응 또는 복합체 형성후 화학적 또는 물리적 특성의 측정에 의하여 표시된다. 색 변화, 방사능 및/또는 호소반응을 포함하는 특성들이 관찰될 수 있다. 용어 "시약"등의 용어물은 또한 분석시료와 직접 반응하는 물질뿐만 아니라 다른 물질 또는 분석시료의 어느 하나를 분석시료의 존재의 표식, 전형적으로는 광학적 표식을 제공하기에 적당한 물질로 전환시키기 위해 사용되는 물질 둘 다를 언급하기도 한다.
용어 "분석시료"처럼 이들 용어들은 원소 및 화합물을 포함하는 이온성 또는 분자성의 간단한 화화적 물질일 뿐만 아니라 단백성 재료와 같은 보다 복잡한 또는 고분자 구조를 포함하고 바이러스 및 전체 세포 뿐만 아니라 항원, 항체, 호소, 항체-효소 포함체, 합텐, 수용체, 렉틴, DNA 단편등과 같은 생물학적 특성의 물질을 포함한다.
분석시료는 또한 시약의 정의에 해당하는 하나 또는 그 이상의 물질일 수 있다. 항체의 경우에, 시험시약 및 분석시료는 각각 모노클로운 또는 폴리클로운 항체일 수 있다. 부가로, 분석시료는 약제, 펩티드, 세포 및 기능질을 포함할 수 있다. 시약은 부가로 완충액, 지시약 분자, 및 호소에 대한 기질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바 "항원물질"은 항원 및 합텐을 포함한다. 어떤 경우에, 수용체 분자로서나 또는 리간드로서의 역할을 하는 생물학적 활성 물질은 폴리펩티드, 알부민, 글로불린 및 아미노산을 포함할 수 있다.
용어 "생물학적 활성 물질", "생물학적 활성 재료"와 또한 "생물학적 활성 매질"등의 용어들은 본원에 사용된 바, 본 발명에 따라 수용체 분자 또는 리간드의 어느 하나로서 작용하고 다른 재료와 면역복합체 같은 생특이적 복합체를 형성할 수 있는 어떤 물질을 언급한다. 용어 "생특이적 복힙체"는 본원에 사용된 바, 수용체 분자와 리간자 사이에서와 같이 상호 특이적인 생물학적 활성 재료들 사이에 형성된 복합체를 의미한다. 그러므로 수용체 분자로서 작용하는 생물학적 활성물질, 예를들어 항체는 본원에 리간드로 언급된, 항체에 대응하는 항원같은, 순간의 실시예에서는 면역 복합체로도 언급될 수 있는 생특이적 복합체를 형성하기 위한 다른 생물학적 활성물질과 생특이적 복합체를 형성한다. 동일한 항체(생물학적 활성 물질)가 막에 결합되는 경우 생물학적 활성 막을 형성하고, 그 막안에서 항체는 그때에 생특이적 복합체를 형성하기 위해 동일한 항원(리간드)과 반응할 수 있는 수용체 분자로서 작용한다. 대부분의 경우, 생특이적 복합체의 어느 하나는 다른 하나가 리간드로서 작용하는 동안 수용체 분자로서 사용하기 위해 선택될 수 있음을 주지해야한다.
용어 "친액성"은 재료가 액체에 의해 습성이 될 수 있는 다공성 재료의 특성을 언급한다. 다공성구조, 예를들어 매질, 막등의 습윤성 또는 친액성은 그 구조의 표면에너지 및 적용된 액체의 표면장력의 작용이다. 만일 표면에너지가 적어도 액체익 표면장력만큼 높다면, 액체는 자연적으로 구조를 적신다. 72다인/cm 또는 보다 높은 표면 에너지를 가지는 다공성 구조는 72다인/cm의 표면장력을 가지는 물에 의하여 습성이 될것이다. 그러므로, 그러한 구조는 수용액을 자유롭게 통과하려는 경향이 있다. 즉, 막은 "친수성"이다. 액체에 의해 습성이 될 수 있는 다공성구조(막)의 능력은 액체 1방울을 다공성 구조위에 놓음으로써 측정될 수 있다. 접촉각은 습윤화의 정량 측정을 제공한다. 매우 높은 접촉각은 불량한 습윤화를 가리키고 "소성"재료를 특징짓기 위해 사용될 수 있고, 한편 접촉각 0은 완료된 또는 완전한 습윤화로 규정한다. 용어"소수성"은 물에 의한 불량한 습윤화 또는 물의 불량한 흡수를 가리킨다. 본 발명에 사용된 재료는 다공성폴리머 매질, 활성화된 매질, 및 생물학적으로 활성화된 매질을 포함하여, 바람직하게도 습성가능하거나 친액성이다. 즉, 그것들은 쉽게 또는 자연적으로 적용된 액체에 의해 습성이 되고 적용된 액체와의 낮은 접촉각을 갖는다.
용어 "활성화된 매질", "화학적으로 활성화된 매질", "화학적 활성 매질", "활성화된 막", "화학적으로 활성화된 막"등의 용어는 매질 또는 막과 활성화제와의 반응이 의해 형성된 생성물을 언급한다. 그중 활성화제는 저단백질, 표면 변형된 매질에 공유 결합되어 있다.
표면 결합된, 표면 변형 폴리머 매질에 관한 본 발명에 따르는 구체예에서의 사용에 직당하게 만드는 모노머의 반응기를 설명함에 있어서 본원에 사용된 바, "단일관능의", "관능기", "관능성"과 같은 용어는 중합 및 폴리머 기질과의 결합에 책임이 있는 것으로 믿어지는 관능기들을 언급한다. 다른 내용에서 사용될 때 용어 "관능기"등은 그것들의 통상적인 의미를 가진다.
용어 "산 위할로겐화물"은 그의 화학반응이 산 할로겐화물과 화학적으로 유사한 부분(또는 그러한 부분을 가지는 분자), 특히 치환 반응에서 반응 활성화제로서 작용하는 부분을 언급한다. 본 발명에 따라 사용된 산 위할로겐화물은 이중- 또는 다중-관능적이고 그의 화학적 양태에 있어서 다중관능 산 할로겐화물과 유사하다. 전형적으로, 본 발명에 따라 활성화 또는 결합화제로서 사용되는 산 위할로겐화물은 카로복실산 할로겐화물과 유사한 방식으로, 에스테르를 형성하기 위하여 다공성 폴리머 매질의 표면에 존재하는 히드록실기와 반응한다.
용어 "특이적 결합", "특이적 단백질 결합"등은 공유력 이외에 두가지 분자력을 내포하는 생특이적 복합체의 단백질 일원과 배치적으로 같은 면적의 크기의 보충하는 메이팅(mating)사이에 형성된 결합을 언급한다. 용어 "비특이적 결합", "비특이적 단백질 결합", "비특이적 방식의 결합"등은 펩티드 기 함유 재료, 바람직하게는 단백질 재료와 동일한 종류의 분자력을 내포하지만 특이적 결합에서 발견되는 배치상의 상호반응은 없는 다른 물질사이에 형성된 결합을 언급한다.
본 발명에 따르는 다공성 폴리머 매질은 일반적으로 펩티드 기 함유 재료, 특히 단백성 재료에 대해 낮은 친화성을 가지는 것을 특징으로 한다. 단백성 재료를 흡착하려는 경향은 아래에서 보다 상세히 논의되는 침지 단백질 결합 측정에 의하여 측정될 수 있다. 본 발명에 있어서 사용된 바람직한 다공성 폴리머 매질은 그의 표면에서 제2폴리머 또는 표면 변형 재료로 변형되어 그위에 피복 또는 결합되어 있고, 그의 표면에 고농도의 히드록실 기를 가지는 다공성 폴리머 기질 또는 매트릭스를 포함한다.
본 발명에 있어서 바람직한 매질은 제조시 사용에 적당한 다공성, 폴리머 기질 또는 매트릭스는 폴리머기질, 용매의 표면에서 제2 또는 표면변형 폴리머 재료를 형성하기 위하여 사용되는 화합물이나 또는 본 발명에 따르는 화학적으로 또는 생물학적으로 활성화된 매질의 제조시 사용되는 다른 시약과 불리하게 반응하지 않으며, 바람직하게도 진단시험 또는 분리의 수행시 사용되는 그런 재료와도 반응하지 않는다. 본 발명에 있어서 사용된 기질은 전형적으로 펩티드 기 함유 재료, 특히 단백성 재료에 대해 높은 친화성을 적당히 나타낸다. 기질은 미소다공성이고 막형태이며, 또한 외판이 없는 것이 바람직하다.
매질이 액체를 통과하도록 의도되는 경우 일반적으로 소정의 흐름특성을 나타내는 재료가 사용된다. 그러므로, 친핵성 기질이 바람직하고 수용액이 사용될 때에는 친수성 매질이 특히 바람직하다. 본 발명에 있어서 사용된 폴리머 기질의 소정의 흐름 특성중에 포함되는 것은 흐름에 대간 낮은 블럭케이지(blockage) 또는 저항으로, 전형적으로 0.05 내지 100미크론; 바람직하게는 0.1 내지 30미크론의 범위내에 있는 절대 기공 등급(기공 직경)으로 특징지어진다. 막이 기질로서 사용된 경우 바람직한 기공 직경범위는 미수다공성매질의 그것, 전형적으로는 0.05 내지 10미크론, 바람직하게는 0.1 내지 3미크론에 대응하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르는 다공성 폴리머 매질은 0.001 내지 0 050인치(0.025 내지 1.25mm)의 두께를 가지고, 여과 매질로서 사용되는 경우에는 적당하게 0.002 내지 0.020인치(0.05 내지 0.50mm), 전형적으로는 0.002 내지 0.010인치(0.05 내지 0.255mm)의 범위의 두께를 가진다. 일차적으로 여과 매질로서 의도된 재료의 보이드 부피(백분율 보이드)는 적당하게 30 내지 95%, 전형적으로는 50 내지 90%이다.
본 발명에 따르는 매질의, 매질을 통과하여 떨어지는 낮은 압력뿐만 아니라 높은 다공성 및 표면 영역은 과정이 유사한 적용에 다른 재료를 사용했을때보다 더 신속하고 효과적으로 수행되는 것을 허용한다.
제2폴리머 재료가 폴리머 기질의 표면에 결합된 그런 매질에서, 사용된 폴리머 기질은 이온화 방사선에 노출되었을 때 그 표면에서 라디칼 조각을 형성할 수 있다.
전형적으로 본 발명에 따라 사용되는 다공성 폴리머 기질중에는 용융방적 직물과, 그의 미세하고 균일한 기공 구조때문에 막이 사용된다. 후자가 바람직하다. 이들 기질은 일반적으로 펩티드 기 함유 재료, 특히 단백성 재료에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 그러한 재료의 실례로는 폴리아미드, 폴리술폰, 및 폴리아크릴로니트릴이 있다. 이들 재료중에서, 본 발명에 따르는 사용에 바람직한 폴리머는 나일론과 같은 폴리아미드이고, 그 중에서 바람직한 나일론으로는 폴리헥사메틸렌 아디프 아미드, 폴리-ε-카프로 락탐, 폴리메틸렌세바스아미드, 폴리-7-아미노헵타아미드, 또는 폴리헥사메틸렌 아젤레아미드이며 폴리헥사메틸렌 아디프 아미드(나일론 66)가 가장 바람직하다. 특히 바람직한 것은 외판이 없는, 실질적으로 알코올-불용성의 친수성 폴리아미드 막이다. 이들 막은 또한 5:1 내지 7.1의 범위내에서 메틸렌 CH2아미드 NHCO의 비율을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 단백성 재료에 대해 낮은 친화성을 나타내는 폴리머 기질을 사용할 수 있다. 그러한 재료의 실례로는 질산 셀룰로오스 같은 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 같은 폴리올레핀, 테레프탈산 폴리에틸렌 및 테레프탈산 폴리부틸렌 같은 폴리에스테르, 및 이불화 폴리비닐리덴 같은 플루오로 폴리머가 있을 수 있다.
본 발명에 따르는 다공성 폴리머 기질로서 바람직한 것은 폴리프로필렌, 테레프탈산 폴리에틸렌, 및 테레프탈산 폴리부틸렌으로 만들어지는 친수성 미소섬유 직물과 또한 폴 코오퍼레이션에 양도되고 본원에 참조문헌으로서 삽입된 미합중국 특허 제4,340,479에 기술된 막형태의 폴리머 기질이다. 기본적으로 미합중국 특허 제4,340,479에 기술된 친수성, 미소다공성, 폴리아미드 여과막은 메틸렌 대 아미드 비율이 5:1 내지 7:1의 범위에 있는 알코올 불용성 폴리아미드 수지로부터 제조된 막이다. 이 군의 막으로는 헥사메틸렌 디아민과 아디프산의 공중합체(나일론 66), 헥사메틸렌 디아민과 세바스산의 공중합체(나일론 610), 폴리-ε-카프로락탐의 단독 중합체(나일론 6) 및 헥사메틸렌 디아민과 아젤라인산의 공중합체(나일론 69)가 있다. 본 발명에 특히 유용한 이 설명의 막재료는 상표 ULTIPOR N66TM하에 폴 코오퍼레이션으로부터 쉽게 구할 수 있다.
다공성 폴리머 기질의 표면에 형성된 본 발명에 따로는 바람직한 다공성 폴리머 매질은 침지 단백질 결합측정에 의하여 측정된 바외 같이 펩티드 기 함유 재료에 대해 낮은 친화성을 가지는 제2폴리머 재료이다. 제2폴리머 재료는 다수의 (펜던트) 히드록실 기를 가지고, 폴리머 기질과 조합하며, 그것은 단백성 재료와 같은 펩티드 기 함유 재료에 대해 저 친화성을 제공하기 위하여 다공성 폴리머 매질의 표면을 변형시킨다. 제2 또는 표면 변형 폴리머 재료로서 바람직한 것은 폴리머 기질의 표면에 결합된 재료이다. 그러나, 본 발명에 따로는 바람직한 매질로는 또한 폴리머 기질의 표면위에 피복으로서 형성된 폴리머 재료가 있다.
어떤 특별한 이론을 확정하려고 원한 것은 아니지만 다공성 폴리머 매질의 표면에 존재하고, 표면에 관련하여 적당히 배향된 히드록실 부분이 매질에 대한 펩티드 기 함유 재료의 인력을 감소시키는 것으로 믿어진다. 그러한 인력은 그러한 목적을 의해 사용된 많은 것들의 그것보다 매우 적다.
낮은 단백질 흡착 표면을 제공하는 것에 더불어, 또한 매질의 표면에 존재하는 다수의 히드록실 기가 본 발명에서 두 가지 부가의 기능을 제공하는 것으로 믿어진다. 즉, 본 발명에 따라 사용된 결합 또는 활성화제는 폴리머 매질, 특히 표면 변형 폴리머 재료와의 공유결합을 형성하기 위하여 히드록실 기와 반응하는 것으로 여겨진다. 매질의 표면에서의 히드록실 기의 존재는 또는 소수성일 수 있는 그들 기질에 친수성을 제공한다.
본 발명에 따르는 바람직한 매질에서 표면 변형 폴리머 재료로서 가장 바람직한 재료는 폴리머 기질의 표면에서 중합되고 단백성 재료에 대한 감소된 친화성을 제공하기 위하여 거기에 결합된다. 표면 변형 폴리머재료는 펜던트 히드록실 기 또는 특히 제2폴리머 재료의 형성후 또는 형성시 히드록실 기를 형성하기 위해 반응할 수 있는 기가 많은 단일 기능의 불포화 모노머로부터 형성된 어떤 폴리머 재료일 수 있고, 그것은 이온화 방사선의 영향하에 중합 및/또는 기질에의 공유 결합을 진행시킬 수 있다. 어떤 특정 이론을 세우려고 한 것은 아니지만 이온화 방사선의 영향하에 모노머분자의 불포화 결합은 중합 및 다른 모노머와의 교차결합반응으로 도입되고 기질과의 결합을 형성하는 반응으로 도입된다. 특히 바람직한 것은 비닐 또는 에틸렌 불포화이다. 본 발명에 따라 사용에 적당한 모노머는 그러나 단일한 중합가능 관능기, 즉, 단일한 불포화단위를 가진다. 그러나, 본 발명에 바람직한 이들 모노머가 또한 단일 하드록실 기를 가지는 한편, 다수의 히드록실 기가 있는 화합물 또한 적당하다. 표면변형 폴리머 재료로서 적당한 것은 변형된 매질에 아래에서 보다 상세히 기술되는 침지 단백질 결합측정에 의하여 측정되는 바와 같이 단백성 재료의 낮은 흡착을 제공하는 그러한 재료들이다. 이 시험에 따라 약 30㎍/㎠ 이하의 단백성 재료를 흡착하는 폴리머가 본 발명의 목적에 대해 단백성 재료에 대한 낮은 친화성을 가지는 것으로 간주되고, 약 2O㎍/㎠ 이하를 흡착하는 재료가 바람직하다. 역으로, 본 발명의 목적에 대해 약 3O㎍/㎠ 이상의 단백질 재료를 흡착하는 폴리머는 단백질 재료에 대해 높은 친화성을 가지는 것으로 간주된다.
매질의 변형된 표면을 형성하는 바람직한 폴리머 재료는 에틸렌 또는 비닐 불포화 및 히드록실 기에 의해 특징지어지는 부분을 가지는 모노머로부터 유도된다. 그러나, 바람직한 화합물은 부가적으로 카르복실산염부분, 히드록실 또는 히드록실 형성치환된 아크릴레이트 에스테르 같은 다른 기를 포함할 수 있다. 모노머로서 특히 바람직한 것은 분자의 "알코올" 또는 히드록실 함유부가 있는 히드록시알킬 아크릴레이트 및 메타크릴레이트, 즉, 2 내지 5의 탄소원자, 바람직하게는 2 내지 3의 단수원자를 가지는 히드록실-치환된 저급 알킬 기로 구성되는 히드록실알킬 기이다. 바람직한 치환기는 히드록실 기이지만, 히드록실 기를 형성하기 위하여 반응할 수 있는 치환기도 존재할 수 있다. 또한 모노머의 혼합물이 사용될 수 있다. 가장 바람직한 것들로부터 형성된 히드록실 함유 모노머 및/또는 히드록실 함유 폴리머 재료는 히드록실 기가 단지 펜던트 히드록실 기로서만 존재하는 것들이다. "펜던트"가 의미하는 것에 의하면 기는 폴리머의 골격의 일부를 형성하는 탄소원자에는 부착되지 않지만 골격으로부터 예를 들면 가지를 형성하는 탄소원자로서 분리되는 탄소원자에 결합된다. 이것은 히드록실 부분이 펜던트 히드록실 기로서 존재할 뿐만 아니라 그러한 히드록실 기가 탄소원자 바로 옆에 또는 인접해서 위치하고 있는- 셀룰로오스 및 아가로오스 같은 천연기원의 재료와는 대조적이다.
바람직한 모노머의 실례는 2-히드록시에틸 아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트, 히드록시프로필 아크릴레이트, 및 히드록시프로필 메타크릴레이트 같은 그러한 화합물이다. 히드록시프로필 아크릴레이트 및 메타크릴레이트는 2-히드록시프로프-1-일과 1-히드록시프로프-2-일 에스테르의 이성체 혼합물로서 상업적으로 쉽게 구할 수 있다. 이들 화합물은 롬 앤드 하스 케미칼 컴패니로부터 상표 ROCRYL 하에 상업적으로 쉽게 구할 수 있고 각각 ROCRYL 410, 400, 430, 및 420으로 표시된다. 또는, 본 발명에 따라 사용에 적당한 이들 및 다른 화합물들은 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있거나 또는 유기화학자에 공지되어 있는 반응 및 기술에 의하여 제조될 수 있다.
상기 표시된 구조적 특징에 더불어 적당한 모노머는 나아가 유리 라디칼을 형성하기 위한 이온화 방사선과의 상호반응과 같은 그의 특성에 의해 특징지어질 수 있다. 적당한 모노머 화합물은 또한 실질적으로 사용된 용매 시스템에 완전히 가용성이어야 한다. 용매는 사용된 폴리머 기질이나 모노머에 불리한 영향을 미치지 않으면서 수용도를 최대화시켜야 하고 한편으로는 만족할 만한 중합을 허용해야 한다. 바람직한 용매로는 극성용매, 특히 물과 같은 히드록실화된 용매, 에탄올 같은 저급 지방족 알코올, 및 그의 혼합물이 있다.
모노머 화합물의 용액은 펩티드 기 함유 재료에 대한 낮은 친화성을 제공하고 매질의 기공을 차단함이 없을 정도의 충분한 양으로 사용된다. 전형적으로 본 발명에 따라 사용되는 양은 모노머의 농도가 용액의 충중량을 토대로 0.1 내지 5 .0중량%, 바람직하게는 0.2 내지 3.0중량%인 범위내에서이다. 그러므로, 제2 또는 표면 변형 폴리머 재료의 농도와 표면 변형 폴리머 재료를 형성하기 의하여 사용되는 모노머의 농도는 단백성 재료에 대해 실질적으로 낮은 친화성이 있는 다공성 폴리머 매질을 제공하기 위하여 선택된다. 그러나, 충분히 높은 농도는 기질의 "막힘"을 유발하여 매질의 흐름특성에 불리한 영향을 주므로 피해야 한다.
모노머의 중합 및 결합은 자외선 또는 코발트 60공급원, 바람직하게는 후자와 같은 그러한 공급원으로 이온화 방사선을 사용하여 이루어질 수 있다. 사용된 특별한 방법이 1987년 12월 11일에 출원한 한국특허출원 제87-14189호에 논의되였다. 기본적으로 한국특허출원 제87-14189호에 명시된 바와 같이 폴리머 기질의 표면에 형성된 표면 변형 폴리머 또는 제2폴리머 재료는 펜던트 히드록실 부분을 가지는 폴리머 재료이다. 그것은 형성되고 폴리머 기질을 적당한 히드록실 함유 모노머의 용액으로 처리한 후 처리된 기질을 이온화 방사선, 바람직하게는 감마 방사선에 노출시킴에 의하여 다공성 폴리머 기질에 공유 결합된다. 그 결과 모노머는 중합되고 폴리머 기질에 결합된다. 표면 변형 폴리머를 형성하기 위한 모노머로서 바람직한 것은 히드록실 함유 비닐형 모노머이다. 사용된 이온화 방사선으로는 단파장 자외선 방사선 또는 감마 방사선이 있다.
본 발명에 따라 생성된 친수성 다공성 폴리머 매질은 높은 유동액 투과성을 입증한다. 그러나, 보다 상당하게, 실시예가 보여주는 바와 같이 이들 매질은 침지 단백질 결합 측정에 의하여 측정되는 바 미처리된 기질의 50% 내지 1%, 전형적으로는 20% 내지 1.5%의 단백질 흡착 수준을 갖는다.
폴리머 기질의 표면이 형성되고 펩티드 기 함유 재료, 특히 단백성 재료에 대해 낮은 친화성을 가지는 폴리머 피복은 아래에서 보다 상세히 논의되는 침지 단백질 결합 측정에 의하여 측정되는 바, 단백성 재료같은 펩티드 기 함유 재료의 낮은 흡착을 입증하는 어떤 폴리머일 수 있다.
표면 결합된, 표면 변형 폴리머 재료와 같이 피복된 표면 변형 폴리머 재료는 히드록실 기 또는 특히 폴리머 피복의 형성후에 또는 형성시 히드록실 기를 형성하기 위해 반응할 수 있는 기가 풍부하다. 전형적으로, 그러한 낮은 친화성 폴리머는 히드록실 기가 풍부한 교차 결합된 폴리머이고 바람직하게는 친액성이며 특히 바람직한 것은 친수성인 폴리머이다. 폴리머 피복은 바람직하게는 축합 반응에 의하여, 그리고 바람직하게는 다수의 히드록실 부분을 함유하는 폴리머와 교차 결합제의 반응에 의하여 형성된다. 가장 바람직한 히드록실 부분 함유 폴리머는 히드 록실 기가 펜던트인 것들이다. "펜던트"가 의미하는 것에 의하면 기는 폴리머의 골격의 일부를 형성하는 탄소원자에는 부착되지 않지만 예를 들면 가지를 형성하는 탄소원자로서 골격으로부터 분리되는 탄소원자에 결합된다.
히드록실 부분함유 유기폴리머는 히드록실 부분과 반응할 수 있는 부분을 함유하는 교차 결합제와 반응한다. 교차 결합을 이루기 위해서 히드록실 부분 함유 폴리머는 그 자체가 히드록실 부분과 반응할 수 있는 적어도 두 부분을 함유하는 교차 결합제상의 부분과 반응할 수 있는 적어도 두개의 히드록실 기를 포함한다. 폴리머 피복을 형성하기 위해 사용되는 교차 결합제는 모노머이거나 폴리머일 수 있고 바람직한 것은 후자이다. 교차결합제 및 히드록실 부분 함유 폴리머 둘다는 바람직하게는 사용되는 용매에 실질적으로 가용성이다. 전형적으로, 사용된 농도에서, 사용된 히드록실 부분 함유 폴리머의 중량을 토대로 약 1% 히드록실 부분 함유 폴리머 정도가 용해되지 않은 채로 남아 있을 것이다. 마찬가지로, 용해되지 않은 교차결합제는 사용된 교차결합제의 중량을 토대로 전형적으로 약 1%를 넘지 않을 것이다. 더불어, 히드록실 부분 함유폴리머는 과다한 고분자량을 가지지 않아야 한다. 전형적으로, 히드록실 부분 함유 폴리머는 약 500,000정도의, 바람직하게는 약 10,000 보다는 큰 중량평균 분자량을 가진다. 적당한 히드록실 부분 함유 폴리머의실례로는 셀룰로오스 아세테이트 및 다른 셀룰로오스의 알킬 에스테르 같은 셀룰로오스 유도체, 및 히드록시프로필 셀룰로오스 및 히드록시메틸 셀룰로오스같은 셀룰로오스의 히드록시알킬 에스테르, 폴리히드록시메틸 메타크릴레이트같은 아크릴산 및 메타크릴산의 히드록시알킬 에스테르; 폴리비닐 알코올 및 변형된 전분이 있다. 바람직한 것은 가장 바람직한 히드록시프로필 셀룰로오스와 함께 셀룰로오스의 히드록시알킬에스테르이다.
동일하거나 상이한 적어도 두 부분, 또는 적어도 두 부분을 형성할 수 있는 교차결합제는 유기화학자에 공지된 반응을 따라 반응 조건하에 히드록실 부분함유 폴리머의 히드록실 부분과 반응할 것이다. 실례로는 카로복실산기 및 페놀기 같은 산성부분을 가지는 화합물, 히드록실 기를 함유하는 다른 화합물과 특히 메틸롤 화합물 같은 CH2OH 기를 함유하는 것들 및 특히 히드록실 포함 탄소가 질소원자에 결합되어 있는것들; 레졸; 아미드 기; 및 포름알데히드와 글루타르디알데히드같은 알데히드가 있다. 상기 표시된 바와 같이, 교차결합제는 반응중에 히드록실 기와 반응할 수 있는 적어도 두개의 그러한 부분을 함유하거나 형성한다. 교차결합제가 폴리머인 경우, 히드록실 부분함유 유기화합물과 반응할 수 있는 바람직한 폴리머의 실례로는 아크릴산과 아크릴아미드의 공중합체, 아크릴산과 N- 메틸롤 아크릴아미드 및 폴리 아크릴산의 공중합체가 있다.
전형적으로는, 그리고 바람직하게, 히드록실 부분함유 폴리머가 셀룰로오스-유도된 폴리머에서 발견되는 바와 같이 많은 수의 히드록실 기를 함유하는 경우에, 교차 결합제와의 반응 후에, 단백성 재료에 대해 낮은 친화성을 가지는 폴리머 피복에는 과잉의 미처리된 히드록실 부분이 있을 것이다.
히드록실 부분 함유 유기 폴리머와 교차 결합제와의 혼합물을 기질에 적용시키는 과정, 건조 및 소성처리가 1987년 12월 23일에 출원된 한국특허출원 제87-14810호에 기술되어 있다. 기본적으로, 한국특허출원 제87-14810호에 명시된 바와 같이, 다공성, 폴리머 기질은 다수의 히드록실 부분을 가지는 폴리머와 히드록실 부분과 반응, 바람직하게는 축합 반응을 진행사킬 수 있는 부분을 가지는 교차 결합제와의 혼합물과 접촉된다. 혼합물의 피복이 기질상에 형성된 후에 피복된 기질은 혼합물로부터 분리되고, 바람직하게는 가열에 의하여 소성된다.
본 발명에 있어서, 전형적으로 막의 형태연 활성화된 매질은 IPBA에 의하여 측정되는 바, 비특이적 방식으로 단백성 재료와 같은 펩티드 기 함유 재료를 흡착하는 경향이 낮다. 바람직한 매질은 폴리머기질과 수용체 분자와 쉽게 반응할 수 있는 부분이 있는 활성화제의 잔기가 매질에 결합되어 있는 표면 변형 폴리머 재료를 포함한다. 전형적으로, 수용체 분자는 시험시약과 같은 생물학적 재료이고, 바람직하게는 단백성 재료이다.
활성화제와 상술된, 바람직하게는 막의 형태인 저단백질 결합 다공성 폴리머 매질과의 반응은 매질에 공유결합된 활성화제 잔기를 가지는 활성화된 또는 화학적으로 활성화된 매질의 형성을 유발하고 그것은 리간드, 또한 바람직하게는 생물학적 및 단백성 재료에 대해 활성인 또는 함께 반응할 수 있는 기 또는 부분을 포함한다.
활화성된 매질의 형성에 사용되는 특별한 과정은 많은 부분이 사용될 활성화제의 선택에 따라 좌우될 것이다.
본 발명에 있어서 사용된 적당한 활성화 또는 결합제는 아래에서 논의하고 그의 사용에 대한 특별한 과정은 과학 잡지에 적당히 기술되어 있다.
일반적으로, 본 발명에 따르는 활성화된 매질을 제조하기 위하여, 매질은 선택된 활성화제 용액과 활성화 또는 결합제 및 매질재료의 표면상의 관능기와 활성화제와의 사이에 일어나는 반응에 필요한 어떤 다른 시약을 용해 하기에 적당한 적절한 용매와 접촉하는 적당한 콘테이너에 배치된다.
안정한 활성화된 매질은 매질과 활성화제와의 반응에 의하여 형성된 생성물이다. 활성화제의 잔기가 매질에 공유 결합되어 있는 이 활성화된 매질은 수용체 분자가 본 발명에 따르는 생물학적 활성 매질을 형성하기 위하여 공유결합에 의하여 막에 고정되거나 결합하는 것을 허용한다. 적당한 활성화제는 적어도 2개의 관능기를 포함하는 물질로 이루어지고, 하나의 관능기는 매질의 표면에서 표면변형 폴리머 재료 위의 히드록실 부분과 같은 반응부분과 생물학적 활성 재료와 같은, 그의 표면에 화학적으로 반응적인 관능기를 가지는, 수용체 분자가 있는 막을 형성하기 위하여 반응할 수 있다.
이들 관능기는 적어도 하나의 잔류 관능기를 가지는 공유결합된 활성화제의 잔기로부터 유발된다.
매질의 표면에서 반응적 부분과 반응하는 활성화제의 제1관능기는 하나 또는 그 이상의 잔류 관능기를 함유하는 막에 결합된 활성화제의 라디칼 또는 잔기를 남긴다.
예를들면, 활성화제로서 T-s-T(트리클로로-s-트리아진)을 사용하는 활성화된 매질의 경우, s-트리아진은 여전히 각 s-트리아진 라디칼 또는 잔기에 결합된 반응적 염소원자를 포함하고, 그 잔기는 막에 공유결합되어 있다.
이들 s-트리아진 결합된 염소원자의 각각은 수용체 분자와 반응할 수 있어서, 후자는 s-트리아진 잔기를 통해서 막에 공유결합하게 된다.
이 종류의 활성화제는 그러므로 제1반응에서 막을 활성화하기 위해 작용하고 제2반응에서 활성화제의 잔기를 통해 수용체 분자와 막을 커플링함으로써 결합제로서 작용한다.
본 발명에 있어서 활성화제로서 사용되는 적당한 재료는 동일한 또는 유사한 목적으로 기술분야에 일반적으로 공지되고 사용된 재료중 어느 하나이다.
이들은 적어도 2개의 관능기를 가지는 화합물을 포함하고, 그중 적어도 하나는 단백성 재료와 같은 펩티드기 함유재료의 비특이적 결합에 대해 작은 경향을 가지는 본 발명에 따로는 매질의 표면에 존재하는 것과 같은 그러한 히드록실기와 반응할 수 있다.
히드록실기는 본 발명에 있어서 바람직한 다공성 폴리머 매질의 표면 변형 폴리머 재료에 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 활성화제로서의 사용에 바람직한 재료의 실례로는 트리클로로-s-트리아진(T-s-T)및 치환된 디클로로-s-트리아진; 염화아디필 및 염화 테레프탈로일 같은 이중 할로겐화 디카르복실산; 염화 피리딘-2,5-디카르보닐, 디카르복실산의 디아지드, 피리딘-2,5 -디카르복실산 비스이미다졸라이드, 테레프탈산 비스이미다졸라이드, 및 세바스산 비스이미다졸라이드 같은 디카르복실산 비스이미다졸라이드를 포함하는 디카로복실산 유도체; 염화 벤젠디술포닐 같은 이중할로겐화 술폰산; 포스겐, N,N'-디프탈이미도 탄산염, N,N'-디숙신이미딜탄산염, 디-2-피리딜탈산염, N,N'-카로보닐디-1,2,4-트리아졸, N,N'-카로보닐디-1,2,3-트리아졸, 및 N,N'-카로보닐디이미다졸 같은 탄산 유도체가 있지만 시아누린 산할로겐화물에 한정되지는 않는다.
활성화제로저 바람직한 것으로는 특이적 방식으로 많은 수의 수용체 분자에 결합하는 경향을 보일뿐만 아니라 활성화제 잔기상에 남아있는 관능기의 내 가수분해성을 입증하는 잔기를 활성화된 매질에 제공하는 것들이다.
그러한 활성화제는 또한 생물학적 활성매질의 높은 내 가수분해성을 나타낸다.
높은 내 가수분해성은 아래에 설명하는 "촉진 습기 노출시험"(AMET)에서 높은 값에 의하여 표시된다.
예를들면, N,N'-카르보닐디이미다졸과 함께 제조된 막은 약 80%의 공유결합 능력의 보유를 입증하였다.
단백질 같은 수용체 분자에 특이적 방식으로 결합하는 높은 능력과 높은 내 가수분해성을 입증하는 활성화제로서 바람직한 것으로는 탄산의 비스아졸라이드가 있고 바람직하게는 N,N'-카로보닐디-1,2,4-트리아졸, N,N'-카로보닐디-1,2,3-트리아졸, 및 N,N'-카로보닐디이미다졸이 있고 마지막 언급된 화합물이 가장 바람직하다.
습기의 존재하에 가수분해되는 경향이 있는 다른 활성화제를 사용하는 활성화된 매질은 수용체 분자에 결합하는 활성부위의 수를 적게 한다.
대조적으로, N,N'-카로보닐디이미다졸 및 탄산의 비스아졸라이드를 사용하는 활성화된 매질은 높은 내가수분해성을 입증하고, 그러므로, 장기간 보존될 수 있다.
전형적으로 막 형태연 활성화된 매질의 형성에 대해서 막은 활성화 또는 결합제를 함유하고, 임의로 3차 아민 및 아실화 촉매를 함유하는 용액과 접촉된다. 전형적으로, 막은 결합제, 염기, 및 촉매에 자연적으로 노출된다.
결합제가 다중관능 산 할로겐화물인 경우, 염기가 용액내에 존재하는 것이 바람직하다.
결합제가 아졸라이드 또는 이미다졸라이드인 경우, 용액은 염기를 함유하지 않는 것이 바람직하다.
전형적으로, 사용되었을 때의 결합제 및 염기 둘 다의 농도는 약 0.01몰부터 만족할만한 결과를 제공하는 사용된 특별한 용매에서의 용해도의 한계까지이다.
각각의 농도는 0.05몰 내지 0.20몰이고 염기 및 결합제는 동몰량으로 존재하는 것이 바람직하다.
매질표면과의 반응을 효과적으로 하기 위해서 막은 일반적으로 환경온도에서, 활성화제와 막표면의 관능기 사이의 실질적인 반응을 효과적으로 하기에 충분한 주기동안 반응용액에 침지되어 보관되거나 또는, 반응용액이 막을 통과한다.
막 표면에 형성된 화학적 활성부위의 수는 직접적으로 활성화제 및 염기의 농도뿐만 아니라 표면변황된 매질과 활성화제 사이의 반응시간의 결과에 따라 다양하다.
반응 주기는 전형적으로 5분 내지 2시간이고, 바람직하게는, 침지기술이 사용된 경우, 5분 내지 1시간이다.
또한, 침지기술이 이용된 경우, 반응용액과 막 재료사이의 활성화 단계동안 적당한 접촉을 확실히 하기위하여 교반이 사용되는 것이 바람직하다.
반응용액은 그런후 침지된 막으로부터 버려지고, 그것은 나아가 미반응 시약을 제거하기 위하여 세척될 수 있다.
바람직한 세척 매질은 일반적으로 반응용액에 대한 용매 또는 매질로서 사용되는 액체이고, 또는 다른 적당한 용매일 수 있다.
일반적으로, 활성화된 막은 그후에 건조되고 그런후 아래에 기술되는 생물학적으로 활성화된 지지체를 형성하기 위해 사용될 수 있다.
활성화 반응에 사용하기에 적당한 용매로는 유기염기 및 결합체 둘다를 용해시킬수 있는 것들로, 염화메틸렌, 디옥산, 테트라 히드로푸란, 아세톤 등이 있다.
용이한 제거를 허용하는 높은 휘발성과 부가적으로 그의 낮은 연소성때문에 염화 메틸렌이 특히 바람직하다.
사용에 적당한 유기염기로는 디이소프로필 에틸아민, 트리에틸 아민, 디이소프로필메탈아민을 포함하는 3차아민, 디메틸 아닐린, 및 피리딘이 바람직하다.
쉽게 구할수 있는 것과 저렴한 비용때문에 트리에틸 아민이 유기염기로서 특히 바람직하다.
어떤 경우에, 결합제 용액은 또한 아실화 촉매를 포함할 수 있다.
적당한 촉매로 피리딘, 트리에틸아민, 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)이 있지만 거기에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따르는 생물학적으로 활성화된 매질은 상술된 바의 같이, 반응을 효과적으로 하기에 적당한 조건하에, 수용체 분자로서 수용체 분자가 결합 또는 활성화제의 잔기를 통과하여 다공성 폴리머 매질에 공유결합되기 위하여 본 발명에 따르는 화학적으로 활성화된 매질과의 반응에 의하여 유도된다.
막표면상의 활성화제의 잔기중 하나 또는 그 이상의 잔류 관능기가 수용체 분자의 관능기 사이에 형성된 공유 결합으로부터 고정화가 유발된다.
수용체 분자와 활성화제의 잔기 사이의 공유결합은 매질로부터의 수용체 분자의 축출 또는 침출을 방지한다.
수용체 분자는 전형적으로, 그리고 어떤 경우에는 바람직하게 생물학적 특성을 가지므로 생물학적 활성매질이 유발된다.
매질은 "생물학적 활성매질"의 견지에서 본원에 기술되고 수용체 분자로서 고분자 및 생물학적 활성 재료를 포함하는 것이 바람직한 한편, "보다 간단한" 화학적 화합물 또는 비생물학적 특성을 가지는 시험시약 및 분석시료가 또한 어떤 경우에 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 상술된 바와같이 전형적으로는 생물학적 활성 재료를 사이에서와 같은 수용체 분자와 리간드사이에 형성된 생특이적 복합체에 광범위한 적용을 할것으로 기대된다.
본 발명에 따르는 생특이적 복합체의 적어도 일원을 형성하는 물질은 빈번히 고분자이고 가장 바람직하고, 빈번하게는 단백질을 포함한다.
생물학적 활성 수용체 분자로서 작용할 수 있는 물질의 대응하는 리간드로서 작용하는 그러한 물질들이 표1에 리스트되어 있다.
[표 1]
[생특이적 복합체]
Figure kpo00001
본 발명에 있어서 특히 막 형태의 생물학적 활성 매질을 형성하기 위하여 미합중국 특허 제 4,693,985에 데겐등에 의해 기술된 방법이 다음과 같다.
생물학적 활성 매질에 잔류하는 화학적으로 활성화된 부위의 수(즉, 미처리된 관능부분이 있는 활성화제의 잔기에 의하여 차지된 부위)는 사용자에 의해 이용되는 적용 및 수용체 분자에 따라 달라질 수 있다.
예를들어, 어떤 모노클로운 항체들은 아주 값비싸고, 적당한 시험결과를 얻기위해 활성화제를 통하여 매질에 공유결합되는 데에는 단지 소량만이 필요하기 때문에 화학적으로 활성화된 부위의 총수보다 적은 수가 거기에 결합된 항체를 가지기 위해 필요하다.
그러나, 잠재적으로 분석시료를 함유하는 시험샘플이 매질에, 접촉하는 경우와 같이 부가의 단백성 재료가 첨가되는 경우 활성화된 부위가 남아있다면, 잔류의 활성화 부위는 특이적 및 비특이적 단백질 둘 다를 결합할 것이다.
이것은 잠재적으로 시험결과에 불리한 효과를 미칠 수 있다.
적용되는 매질 및 화학적 활성 부위의 수에 따라 좌우되므로 어떤 경우에는 부가의 단백질과의 반응을 방지하기 위해 잔류의 화학적 횔성 부위를 탈활성화 또는 차단하는 것이 바람직하게 된다.
이것은 약간의 화학적 활싱부위를 함유하는 생물학적 활성 매질을 차단제 또는 탈활성화제로 처리함으로써 이루어질 수 있다.
차단제는 전형적으로 단백성 특성이 있는 화합물이거나 또는 어떤 경우에는, 화학적 또는 물리적 상화반응의 어느 하나에 의해서 매질에 결합할 수 있는 세정제이다. 전형적으로 전자 유형의 상호반응은 화학적 활성부위에서 일어나고 후자는 낮은 단백질 결합특성을 부여하는 표면 변형이 거의 또는 전혀 없는 곳에서 일어난다.
그러한 차단제의 실례로는 카제인, 우혈청 알부민, 젤라틴 및 트리톤 X-100 및 트윈 20같은 세정제 또는 계면화성제가 있다.
탈화성화 또는 "캡핑(capping)"제는 활성부위에서 관능기와 화학적으로 반응하는 그런 재료들이다.
그러한 화합물의 실례로는 에탄올아민 및 디에탄올아민 같은 아민, 글리신 및 다가의 라이신같은 아미노산이 있다.
항원, 합텐, 항체등과 같은 리간드의, 특히 막형태의 생물학적 활성 매질에의 생특이적 흡착 또는 부착은 적합한 리간드의 용액을 생물학적 활성막을 통하여 접촉 또는 통과시킴으로써 이루어질 수 있다.
적당한 방법이 미합중국 특허 제 4,693,985에서 발견된다. 이 출원은 또한 분석 시료 검출의 적당한 장치를 기술하고 있다.
[실시예]
[실시예 I(a)]
표면-결합된 표면-변형 폴리머 재료를 가지는 디공성 폴리머 매질의 제조 :
3-히드록시프로필 아크릴레이트(HPA)(Rohm ＆ Haas로부터의 Rocryl
Figure kpo00002
430)의 수용액을 탈이온화된 물96 부피부와 3차 부틸 알코올 2부피부를 함유하고 있는 용매 시스템에 HPA 2 부피부를 첨가함으로써 제조하였다.
용액을 균일하게 혼합될 때까지 교반하였고 2%농도(부피)의 HPA를 얻였다.
미소다공성 나일론 66(ULTIPOR
Figure kpo00003
N66
Figure kpo00004
, 폴 코오퍼레이션으로부터 구할 수 있다)의 200피트(61.0 미터)길이×10인치(25.4cm.)너비 로울을 히드록시프로필 아크릴레이트의 2.0부피% 용액과 접촉시켰다.
로울형태에 미소 다공성 나일론 기절을 모노머 용액에 침지하여서 완전히 포화되도록 하였다.
로울로부터 잉여 용액을 제거하기 위하여 아무런 시도도 하지 않았다. 포화된 로울을 방사선 챔버, 구체적으로는 0.030인치(0.08cm.)의 벽두께를 가지는 스텐레스강 용기에 옮겨서 밀봉하였다.
로울을 감마 방사선에 총투사량 1.5메가리드에 대해 총 60시간동안 25,000라드/시간의 투사율로 노출시켰다.
그런후 로울을 용기로부터 꺼내어서 24시간동안 탈이온화된 물이 로울 주위를 순환하게 함으로써 잔류의 모노머 및 미결합된 폴리머를 제거하기 위해 세척하였다. 매질의 작은 단면을 로울로부터 떼어내서 부목으로 고정시키고, 연속적인 시험을 위해 15분동안 100℃에서 건조시켰다.
[실시예 I(b)]
피복된 표면-변형폴리머 재료를 가지는 다공성 폴리머 매질의 제조 :
단백성 재료에 대한 저 친화성을 가지는 폴리머 피복을 형성하기 위하여 사용되는 용액을 40g의 CARB0SET 531(25%고체를 함유하는 아크릴 산과 N-메틸롤아크릴아미드의 열경화 공중합체)을 50g의 3차 부틸 알코올을 함유하는 탈이온화된 물 1.910g의 교반된 용액에 첨가함으로써 제조하였다.
CARBOSET 531이 완전히 용해되는 시간인 혼합의 대략 10분후에, 20g의 클루셀 LF(히드록시프로필 셀룰로오스, 헤르쿨레스로부터 쉽게 구할 수 있다)를 계속 교반하면서 첨가하였다.
계속 교반하면서 대략 3시간이 지난 후, 클로셀은 완전히 용해되었고 용액은 잔류의 고체 재료를 제거하기 위하여 0.1 미크론의 절대 제거 등급을 가지는 ULTIPOR N66
Figure kpo00005
(폴 코오퍼레이션으로 부터 쉽게 구할 수 있는 미소 다공성, 친수성 나일론 66필터 매질에 대한 등록상표)의 필터 막을 통해 여과시켰다.
피복용액은 히드록시프로필 셀룰로오스 용액의 충중량을 토대로 약 0. 1중량%, 및 약 0.5중량%의 아크릴산/N-메틸롤 아크릴아미드 공중합체를 함유하였다.
미소다공성 친수성 나일론 66 멤브레인(폴 코오퍼레이션으로 부터 쉽게 구할 수 있는, 0.2미크론 절대 기공등급을 가지는 ULTIPOR N66
Figure kpo00006
)의 9인치(22.9cm.)×9인치(22.9cm.)시트 부분을 약 5초의 주기동안 모노머 피복용액과 접촉시켰다.
피복용액으로부터 막을 분리하고 과잉 유동액을 그의 표면으로부터 압지따위로 빨아들여 제거하였다.
부목에 고정시켜서 막을 150℃온도의 재순환하는 공기 오븐에 30분의 주기동안 넣어두였다.
[실시예 Ⅱ]
염화 테레프탈로일로 활성화된 다공성 폴리머 매질의 제조 :
활성화제의 용액을 염화 테레프탈로일 1.8g을 교반하면서 염화 메틸렌 125m1에 첨가함으로써 제조하였다.
0℃가까이로 냉각한 후, 2㎖의 트리에틸아민을 첨가하고 이어서 0.11g의 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하였다.
혼합물을 #42 훠트만 여과지를 통해 여과하였다. 용액의 온도를 25℃로 올리고 1.2미크론의 구멍크기를 가지는 실시예 I(a)를 따라 제조된 막의 6제곱인치(38.7㎠)부분을 활성화제의 용액에 침지하였다.
막을 1시간의 주기동안 용액에서 부드럽게 교반한 후, 용액을 제거하고 막을 5분동안 각각 100㎖부씩의 염화 메틸렌으로 연속적으로 교반함으로써 세척하였다.
활성화된 막을 60℃의 공기 오븐에서 2분동안 건조시키고 그런 후 앞으로의 사용을 위해 건조기에 보관하였다.
[실시예 Ⅲ]
염화 2,5-피리딘 디카로보닐로 활성화된 다공성 폴러머 매질의 제조 :
활성화제의 용액을 1.8g의 염화 2,5-피리딘 디카로보닐을 교반하면서 125㎖의 염화 메틸렌에 첨가함으로써 제조하였다.
혼합물을 넘버 42 훠트만 여과지를 통해 여과하여 0℃가까이로 냉각하였다. 2㎖의 트리에틸아민을 첨가하였고 이어서 0.11g의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하였다.
용액의 온도를 25℃로 올리고 1.2미크론의 구멍크기를 가지는 실시예 I(a)에 따라 제조된 막의 6제곱인치(38.7㎠)부분을 활성화제의 용액에 침지하였다.
막을 t시간의 수기동안 용액에서 부드럽게 교반한 극 , 용액을 제거하고 막을 5분동안 각각 100㎖부씩의 염화메틸렌으로 4회 연속적으로 교반함으로써 세척하였다. 활성화된 막을 60℃의 공기오븐에서 2분동안 건조시킨후 앞으로의 사용을 위하여 건조기에 보관하였다.
[실시예 IV]
N,N'-카르보닐디이미다졸로 활성화된 다공성 폴리머 매질의 제조 :
활성화제의 용액을 0.49g의 N,N'-카르보닐디이미다졸을 45㎖의 염화메틸렌에 용해시킴으로서 제조하였다. 실시예I에서 제조된 재료의 3제곱인치(194㎠)부 분을 15분동안 환경온도에서 활성화제의 용액에 침지하였다. 막으로부터 용액을 제거한 후에, 각 5분의 주기동안 40㎖부의 염화메틸렌으로 4회 막을 교반함으로써 세척하였다.
막을 60℃온도의 공기오븐에서 3분동안 건조시킨 후 앞으로의 사용을 위하여 건조기에 보관하였다.
[실시예 V(a)]
N,N'-카르보닐디이미다졸로 활성화된 다공성 폴리머 매질의 제조 :
실시예 IV에서 설명한 방법 및 재료를 활성화된 막의 제조에 사용하였다.
그러나, 실시예 IV에서 사용한 시약에 더불어 0.11g의 DMAP를 첨가하였다.
[실시예 V(b)]
N,N'-카르보닐디이미다졸로 활성화된 다공성 폴리머 매질의 제조 :
실시예V(a)에서 사용한 동일한 재료를 다음의 양 N,N'-카르보닐디이미다졸 0.54g, DMAP 0.12g, 및 염화메틸렌 45㎖로 사용하였고 실시예 I(a)를 따라 제조된 표면-결합된, 표면-변형 폴리머 재료의 1.5인치(3.8cm.)×2인치(5.1cm.)스트립을 활성화제의 용액에 침지하였다. 침지는 때때로 교반하면서, 실시예V(a)에서처럼 15분 주기보다는 2시간동안 환경온도에서 수행하였다. 그런후 막 재료를 4O㎖부의 새로운 염화 메틸렌으로 4회 세척하여 막 재료가 각 부에 대해 5분동안 세척물에 남아있도록 하였다. 막재료를 60℃의 오븐에서 3분동안 건조시켰다.
[실시예 VI]
트리클로로-s-트리아진으로 활성화된 다공성 폴리머 매질의 제조 :
활성화제의 용액을 0.01lg의 DMAP 및 5㎖의 디메틸 포름아미드를 그 오다로 염화메틸렌 45㎖중의 트리클로로-s-트리아진 2.5g 및 트리에틸아민 2.5㎖의 용액에 첨가함으로써 제조하였다. 로프로딘
Figure kpo00007
(폴 코오퍼레이션의 상표, 실시예Ⅰ을 따라 제조된 재료)의 3제곱인치(19.4㎠) 부분을 45분의 주기동안 환경온도에서 활성화제의 용액에 첨가하였다. 그런 후 막을 세척하고 건조시켜서 실시예IV에서 기술된 바와 같이 앞으로의 사용을 위하여 보관하였다.
[실시예 Ⅶ]
단백질 결합의 측정 :
실시예 I(a) 및 Ⅱ 내지 Ⅵ을 따라 제조된 활성화된 막에 대해 아래에 설명하는 단백질 결합을 측정하기 위한 일반적인 방법에 따라 단백질 염소 면역글로불린 G(염소 IgG)에 공유 결합하는 그들의 능력을 시험하였다.
침지 단백질 결합 측정 :
시험하고자하는 막의 13mm직경 디스크를 200㎍/㎖의 염소 IgG(시그마 케미칼 컴패니 생성물 RA-5256)와 분당 121,0000카운트의125I-표지된 염소 IgG(뉴 잉글랜드 뉴클리어 생성물 NEX-155)를 인산염 완충된 식염 수용액(PBS)중에 결합시킴으로써 제조된 용액을 함유하는 표지된 단백질의 2㎖용액에 침지하였다. PBS중의 생물학적 단백질 재료를 0.15몰/ℓ의 염화나트륨 및 모노-, 디-, 및 트리- ㅣㄴ산 나트륨의 혼합물의 0.02몰/ℓ를 함유하는 용액으로 pH를 7.0으로 조정하였다. 하나이상의 막이 동시에 시험되는 그런 상황에서도, 모든 막을 같은 부의 용액에 침지하였고, 총용액의 부피는 13mm디스크당 용액 2㎖을 제공하도록 조정하였다.
디스크를 용액에서 1시간의 주기동안 교반한 후, IgG용액을 버리고 잔류의 액체를 피펫을 사용하여 침지 용기로부터 제거하였다. PBS용액을 앞서 사용한 생물학적 재료함유 용액과 동일한 양으로(2㎖/디스크) 침지용기에 첨가하고 막을 세척 및 잔류 단백질을 제거하기 위하여 5분동안 용액중에서 교반하였다. 세척용액은 버리고, 매번 새로운 PBS 용액을 사용하여 세척 과정을 2회 반복하여 총 세척을 3회 시행하였다. 그런후 막 디스크를 제거하고 흡수지 사이에서 부드럽게 블로트하여 잔류의 활성을 LKB 월락 미니 감마선 카운터, 모델번호 1275를 사용하여 카운트하였다. 디스크상의 방사성 재료의 양은 디스크에 결합된 총단백질, 즉, 공유결합된 단백질 및 강력한 비특이적 흡착때문에 존재하는 단백질 둘 다의 척도이다. 이 단백질을 "PBS후 단백질"로 언급한다.
막에 공유결합된 단백질의 양을 측정하기 위해서, 2몰/ℓ의 요소 및 1중량%의 황산 도데실 나트륨(SDS)을 함유하는 수용액으로 각각 15분동안 2회 세척하였다. PBS을 사용한 것과 같은 방식으로 디스크당 2㎖용액을 사용하여 세척을 계속하였다. 세척후, 디스크를 흡수지 사이에서 건조상태로 블로트하고 잔류의 방사능을 감마선 카운터를 사용하여 카운트하였다. 이때에 디스크 상에서 측정된 단백질의 양을 "SDS후 단백질"로 언급하고, 그것은 막 기질에 공유결합 또는 그렇지 않으면 영구한 형태로 결합될 수 있는 단백질의 양의 척도이다. PBS후 단백질 의 양과 SDS후 단백질의 양의 차이, 즉, SDS세척에 의하여 제거되는 단백질의 양은 매질에 비특이적으로 결합된 단백질의 척도이다.
표Ⅱ는 거기에 공유결합된 고수준의 단백질을 가지는 막(실시예Ⅱ 내지 Ⅵ)에 대해서뿐만 아니라 활성화 되지 않은 다공성 폴리머 매질(실시예I(a)) 둘 다에 대한 정보를 나타낸다. SDS후 처리 데이타는 본 발명에 따르는 화학적 활성화과정이 본래 저 단백질 결합 다공성 폴리머 매질(실시예I에 의해 설명된 종류의)과 많은양의 어느 소정 단백질과의 영구 결합(실시예Ⅱ 내지 VI와 같이)을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 이 효과는 활성화 비율이 의해 명백히 설명되는데, 그것은 동일한 활성화되지 않는 다공성 폴리머 매질에 의해 결합된 단백질의 양에 대한 본 발명에 따르는 막에 의해 결합된 단백질의 양의 비율이다.
또한 본 발명에 따르는 화학적 활성 매질 실시예Ⅱ 내지 Ⅵ) 활성화된 부위에서 거의 완전히 단백질과 결합하고 이들 매질이 만들어지는 활성화되지 않은 다공성 폴리머 배지위의 단백질에 대한 비특이적 친화성에서 거의 증가를 나타내지 않는다는 것을 표Ⅱ로부터 알 수 있다.
고수준의 공유 단백질 결합과 관련하여 낮은 비특이적 결합의 유용성은 "신호 대 소음 비율"(S/N)로 언급된 것에 의하여 설명하였다. 이 비율은 비특이적으로 흡착된 단백질(즉, 매질에 흡착된 잠재적으로 바람직하지 못한 재료이고 그것은 진단시험에서 잘못된 신호-소음을 유도할 수 있다)의 양에 대한 공유결합된 단백질(즉, 의도적으로 매질에 결합되고 진단 시험에서 양성신호를 유발할 수 있는 단백질)의 양의 비율이다. 그러므로 신호 대 소음 비율은 본 발명에 있어서 매질로부터 만들어진 장치를 사용하여 수행된 진단시험 또는 생화학적 측정의 잠재적 민감도의 표식이다. 신호 대 소음 비율이 높을수록 시험의 잠재적 민감도는 커진다.
[표 Ⅱ]
Figure kpo00008
* (DMAP첨가)
** (즉, 비특이적으로 결합된 단백질에 대한 공유결합된 단백질의 비율)
실시예Ⅶ로서 표시된, 대조표준으로서 사용된 재료는, 폴 코오퍼레이션으로부터 쉽게 구할 수 있는 재료인 이뮤노다인
Figure kpo00009
이고 미합중국 특허 제4,693,985에 기술되어 있다. 이 막은 그의 표면에 결합된 T-s-T잔기를 가지지만 막에 낮은 비특이적 단백질 결합 특성을 부여하기위한 나일론 상의 표면 변형 폴리머는 가지고 있지 않은 나일론 66막을 사용한다.
표Ⅱ의 단백질 결합 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르는 매질은 활성화되지 않은 다공성 폴리머 매질에 의해 흡착되는 단백질의 양의 거의 40배 되는 단백질을 영구적 형태로 결합할 수 있다.
본 발명에 따르는 모든 생물학적으로 활성화된 막은 일반적으로 단백성 특성이 있는 수용체 분자와 선택적으로 결합할 수 있는 능력을 나타내는 한편, 활성부위이외의 매질 표면상의 부위에서는 펩티드 기 함유 재료를 상대적으로 거의 흡착하지 않음으로써 매질의 높은 선택성 및 민감도를 유발한다. 그러나, 본 발명에 따르는 가장 바람직한 매질은 바람직한 활성화제로서 위할로겐화물을 사용하는 것들이고, 특히 N,N'-카르보닐 디이미다졸과 함께 탄산의 비스아졸라이드가 특히 바람직하다. 이들 활성화제로 제조된 활성화된 매질은 전술한 바람직한 특징을 제공할 뿐 아니라 부가로 수용체 분자, 특히 단백질에 공유결합하는 그들의 능력을 보유하고, 그렇게 제조된 생물학적으로 활성화된 매질은 또한 그들의 증가된 민감도를 보유한다. 대조적으로, 다른 활성화제로 제조된 화학적으로 활성화된 매질은 특징적으로 습기유리 조건하에 보관되지 않는다면 단백질에 공유결합하는 그들의 능력을 잃게 된다. 본 발명에 따르는 바람직한 활성화된 매질의 내가 수분해성은 습기유리 환경에서 매질을 유지하기 위한 치밀한 사전주의를 취해야 할 필요를 예방한다.
촉진 습기 노출 시험 :
보관도중 습기에의 과다노출을 촉진하기 위하여, 단백질과 공유결합할 수 있는 높은 능력 및 비특이적 방식으로 단백질과 결합하는 낮은 능력을 가지는 미소다공성 막을 실시예 V(a)에 기술된 방법을 따라 제조하였다. 재료로부터 잘라낸 여러개의 13mm디스크를 100㎖증류수에 환경온도에서 침지하고 액중에서 자기교반기를 사용하여 부드럽게 교반하였다. 물중에서 3.5시간후, 거기에서 디스크를 분리해 내어 단백질과 결합하는 능력을 IPBA에 의하여 측정하였다. 마찬가지로, 대조표준(실시예Ⅶ)의 l3mm디스크들을 대조표준으로서 3.5시간 증류수중에서 교반하고 단백질 결합에 대한 일반적 방법을 따라 시험하였다. 디스크를 증류수에 노출시키지 않은 것들과 비교하였다. 이들 시험의 결과를 표Ⅲ에 나타내었다.
[표 Ⅲ]
[활성화된 막의 가수분해적 용해도]
Figure kpo00010
표Ⅲ에 표시된 데이타는 탄산의 비스아졸라이드 및 특히 N,N′-카로보닐디이미다졸 같은 그의 잔기가 촉진 습기 노출 시험이 높은 내가수분해성을 나타내고, 습한 환경에서 보관의 촉진시험을 나타내는 조건에 노출후 단백질과 공유 결합하는 그의 본래의 능력을 유사하게 보유하는 활성화제로 제조된, 본 발명에 따르는 바람직한 매질을 나타낸다.
S/N비율 컬럼에서 알 수 있는 바와같이 선행기술매질(실시예 Ⅶ)은 0.4의 S/N비율을 제공하고 그것은 가수분해된 활성화된 부위에 기인하는 증가된 비특이적 단백질 흡착을 반영한다. 분명히 대조적으로, 본 발명에 따르는 바람직한 막은 2.7의 S/N비율, 즉, 민감도에서 거의 7배의 증가를 제공한다.

Claims (65)

  1. 침지 단백질 결합축정에 의하여 측정되는 바 펩티드 기 함유 재료에 대해 낮은 친화성을 가지고, 수용체분자와 반응할 수 있는 활성화제의 잔기와 공유결합되어 있는 다공성 폴리머 매질로 이루어지는 펩티드 기 함유 재료에 대해 낮은 비특이적 친화성을 가지는 가동성의 화학적으로 활성화된 매질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 매질은 펜던트 히드록실 기가 풍부한 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  3. 제2항에 있어서, 다공성 폴리머 매질은 (a) 다공성 폴리머 기질, 및 (b) 상기 다공성 폴리머 기질의 표면에 형성되고 공유결합된, 펩티드 기 함유 재료에 대해 낮은 친화성을 가지는 표면 변형 폴리머 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리머 기질은 이온화 방사선의 영향하에 라디칼을 형성할 수 있는 C-H결합을 가지는 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  5. 제3항에 있어서, 상기 표면 변형 공유 결합된 폴리머 재료는 적어도 하나의 히드록실기를 가지는 모노머로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  6. 제5항에 있어서, 그것으로부터 상기 공유 결합된 표면 변형 폴리머 재료가 형성되는 상기 모노머는 에틸렌형 불포화 화합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  7. 제3항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 기질은 폴리아미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 66인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  9. 제3항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 기질은 친수성 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  10. 제3항에 있어서, 상기 폴리머 기질은 미소다공성인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  11. 제l항에 있어서, 상기 펩티드 기 함유 재료는 단백성 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  12. 제1항에 있어서, 상기 매질은 침지 단백질 결합 측정에 의하여 측정되는 바 제곱 센티미터당 30㎍정도의 단백성 재료를 흡착하는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  13. 제5항에 있여서, 그것으로부터 상기 표면 변형 공유 결합된 폴리머 재료가 형성되는 상기 모노머는 히드록시알킬 아크릴레이트는 메타크릴레이트로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화화적으로 활성화된 매질.
  14. 제5항에 있어서, 그것으로부터 상기 표면 변형 공유 결합된 폴리머 재료가 형성되는 상기 모노머는 2-히드록시 에틸 아크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 히드록시프로필 아크릴레이트, 및 히드록시프로필 메타크릴레이트인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  15. 제5항에 있어서, 상기 모노머는 2-히드록시프로프-1-일 아크릴레이트, 1-히드록시프로프-2-일아크릴레이트 또는 그의 혼합물인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  16. 제l항에 있어서, 상기 활성화제는 비스아졸라이드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  17. 제l항에 있어서, 상기 활성화제는 탄산의 비스아졸라이드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화화적으로 활성화된 매질.
  18. 제1항에 있어서, 상기 활성화제는 N,N'-카르보닐디이미다졸로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  19. 제3항에 있이서, 상기 다공성 폴리머 기질은 나일론 66으로 이루어지고, 그로부터 상기 표면 변형공유결합된 폴리머 재료가 형성되는 모노머는 히드록시프로필 아크릴레이트이고 그으이 잔기가 다공성 폴리머 매질에 결합되어 있는 활성화제는 N,N'-카르보닐디이미다졸인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  20. 제2항에 있어서, 다공성 폴리머 매질은(a) 다공성 폴리머 기질, 및 (b) 펩티드 기 함유 재료에 대해 낮은 친화성을 기지는 상기 다공성 폴리머 기질의 표면에 형성된 폴리머 피복으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 기질은 폴리아미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화화적으로 활성화된 매질.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 66인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  23. 제20항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 기질은 친수성 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  24. 제20항에 있어서, 상기 폴리머 피복은 다수의 히드록실 기를 가지는 폴리머 및 히드륵실 기와 반응하는 관능기를 가지는 교차 결합제로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 교차 결합제는 폴리머 물질인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  26. 제20항에 있어서, 상기 폴리머 기질은 미소다공성인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  27. 제24항에 있어서, 상기 히드록실 기 함유 폴리머는 히드록시프로필 셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  28. 제24항에 있어서, 상기 교차 결합제는 아크릴산 및 N-메틸롤 아크릴아미드의 공중합체인 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  29. 제20항에 있어서, 상기 활성화제는 N,N'-카르보닐디이미다졸로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  30. 제20항에 있어서, 상기 기질은 미소다공성 친수성 나일론 66으로 이루어지고 상기 폴리머 피복은 히드록시프로필 셀룰로오스와 아크릴산 및 N-메틸롤 아크릴아미드의 공중합체와의 반응으로부터 형성된 생성물이며, 활성화제의 잔기는 N,N'-카르보닐디이미다졸의 잔기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질.
  31. 침지 단백질 결합 측정에 의하여 측정되는 바, 펩티드 기 함유 재료에 대해 낮은 친화성을 가지는 다공성 폴리머 매질을 화학적으로 활성화된 매질을 형성하기 위하여 활성화제와 반응시키는 것으로 이루어지는 화학적으로 활성화된 매질의 제조방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 매질은 : 다공성 폴리머 기질, 및 펩티드 기 함유 재료에 대한 친화성이 낮은, 상기 다공성 폴리머 기질의 표면에 형성되고 공유결합된 표면 변형 폴리머 재료를 포함하여 팬던트 히드록실 기가 풍부한 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화학적으로 활성화된 매질의 제조방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 폴리머 기질은 이온화 방사선의 양향하에 라디칼을 형성할 수 있는 C-H결합을 가지고 있는 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다공성의 화학적으로 활성화된 매질의 제조방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 기질은 폴리아미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다공성의 화학적으로 활성화된 매질의 제조방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 66인 것을 특징으로 하는 다공성의 화학적으로 활성화된 매질의 제조방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 모노머는 에틸렌형 불포화 화합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다공성의 화학적으로 활성화된 매질의 제조방법.
  37. 제32항에 있어서, 상기 폴리머 기질 및 상기 화학적으로 활성화된 매질은 미소다공성인 것을 특징으로 하는 다공성의 화학적으로 활성화된 매질의 제조방법.
  38. 침지 단백질 결합 측정에 의하여 측정되는 바 펩티드 기 함유 재료에 대한 친화성이 낮은 다공성 폴리머 매질과, 활성화제의 잔기를 통하여 다공성 폴리머 매질에 공유결합된 수용체 분자로 이루어지는 펩티드 기 함유 재료에 대한 비특이적 친화성이 낮은 다공성 생물학적 활성 매질.
  39. 제38항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 매질은 팬던트 히드록실 기가 풍부한 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  40. 제38항에 있어서, 다공성 폴리머 매질은 : 다공성 폴리머 기질, 및 펩티드 기 함유 재료에 대한 낮은 친화성을 가지는, 상기 다공성 폴리머 기질의 표면에 형성되고 공유결합된 표면 변형 폴리머 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  41. 제39항에 있어서, 상기 수용체 분자는 상기 공유 결합된 폴리머 재료에 결합된 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  42. 제38항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 기질은 폴리아미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  43. 제38항에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 66인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  44. 제40항에 있어서, 상기 생물학적 활성 매질은 미소다공성이고 친수성인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  45. 제40항에 있어서, 상기 수용체 분자는 단백성 재료인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  46. 제39항에 있어서, 상기 수용체 분자는 모노클로운 항체, 폴리클로운 항체, 항원물질, 당단백질, 단백질 A, 렉틴, 탄수화물, 효소기질, 조인자, 억제제, 호르몬, IgG류 면역글로불린, 담체 단백질, 수용체, 헤파린, 응집인자, 및 히스톤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  47. 제39항에 있어서, 상기 펩티드 기 함유 재료는 단백성 재료로 이루어지고 상기 다공성 폴리머 매질은 침지 단백질 결합측정에 의하여 측정되는 바 제곱센티미터당 30㎍정도의 단백성 재료를 흡착하는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  48. 제40항에 있어서, 그로부터 상기 공유결합된 표면 변형 폴리머 재료가 형성되는 상기 모노머는 2-히드록시에틸 아크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 히드록시프로필 아크릴레이트, 히드록시프로필 메타크릴레이트 및 그의 이성적 혼합물인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  49. 제39항에 있어서, 상기 활성화제의 잔기는 비스아졸라이드의 잔기인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  50. 제39항에 있어서, 상기 활성화제의 잔기는 탄산의 비스아졸라이드의 잔기인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  51. 제39항에 있어서, 상기 활성화제의 잔기는 N,N'-카르보닐디이미다졸의 잔기인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  52. 제39항에 있어서, 다공성 폴리머 매질은 다공성 폴리머 기질, 및 상기 다공성 폴리머 기질의 표면에 형성된, 펩티드 기 함유 재료에 대한 친화성이 낮은 폴리머 피복으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  53. 제52항에 있어서, 상기 생물학적 활성재료는 상기 다공성 폴리머 기질에 결합되는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  54. 제52항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 기질은 폴리아미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물학적활성 매질.
  55. 제52항에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 66인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  56. 제52항에 있어서, 상기 폴리머 피복은 다수의 히드록실 기를 가지는 폴리머와 히드록실기와 반응하는 관능기를 가지는 교차결합제로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  57. 제52항에 있어서, 상기 생물학적 활성 매질은 미소다공성이고 친수성인 것을 특징으로 하는 생물학적활성 매질.
  58. 제56항에 있어서, 상기 히드록실기 함유 폴리머는 히드록시프로필 셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  59. 제56항에 있어서, 상기 교차 결합제는 아크릴산과 N-메틸롤 아크릴아미드의 공중합체인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  60. 제52항에 있어서, 상기 활성화제의 잔기는 비스아졸라이드의 잔기인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  61. 제52항에 있어서, 상기 활성화제의 잔기는 탄산의 비스아졸라이드의 잔기인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  62. 제52항에 있어서, 상기 활성화제의 잔기는 N,N'-카르보닐디이미다졸의 잔기인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  63. 제52항에 있어서, 상기 기질은 미소다공성, 친수성 나일론 66으로 이루어지고, 상기 폴리머 피복은 히드록시프로필 셀룰로오스와 아크릴산 및 N-메틸롤 아크릴아미드의 공중합체와의 반응으로부터 형성된 생성물이며 상기 활성제는 N,N'-카르보닐디이미다졸인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  64. 제52항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료는 단백성 재료인 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
  65. 제52항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료는 모노클로운 항체, 폴리클로운 항체, 항원물질, 당단백질, 단백질 A, 렉틴, 탄수화물, 효소기질, 조인자, 억제제, 호르몬, IgG류 면역글로불린, 담체단백질, 수용체, 헤파린, 응집인자, 및 히스톤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 매질.
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