JPH02191544A - 固定化抗体カラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、優れた簡便性、定量性を有する新規なプロス
タグランジン類、トロンボキサン類又はロイコトリエン
類（以下ＰＧｓと略称）と蛋白との結合物を第１動物に
投与して得られる第１抗体を担体に固定化させたカラム
用充填剤、その使用物、その使用方法及びそれを使用し
た定量法に関する。

（従来の技術） （１）微量で強力な生理活性を有するＰ　Ｇ　ｓは、種
々の病態と関連しているといわれており、これらの生体
中の定量分析法は多数報告されているが、それらは大き
くクロマトグラフィー法と免疫測定法に分けられる。

（２）かかるクロマトグラフィー法は更にＴＬＣｌＨＰ
ＬＣ，ＧＣ，ＧＣ−ＭＳ法に分類できるが、これらは分
離分析法であるため、構造類似化合物に対してもある程
度、信頼性の高い結果を得ることができる。

しかしながら、測定感度が最も優れているＧＣ−邪法で
も血漿中濃度として１０　ｐｇ／ｍｌを定量することは
かなり困難であり、臨床的に応用するためには、生体試
料中より抽出し、測定に適した誘導体に変換するなど煩
雑かつ高度な技術を要する前処理が必須である。

このため多量の試料を必要とし、また−度に測定できる
試料数に限りがある。更に分析に必要な設備が高価であ
り、−船釣とは言えない。

（３）一方、免疫測定法にはラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）及びエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法があ
り、用いる抗体や、標識体の組み合わせを工夫すること
により１　ｐｇ／ｍｌの血漿中濃度を有する化合物を検
出することが可能である。

しかし、免疫測定法は分離分析法ではないため、交差反
応性を有し、抗原抗体反応を阻害するような物質が共存
すると得られる結果は大きな誤差を生じるものである。

（４）以上のことから、従来、分離分析法で精製、前処
理を行った後、免疫測定法で測定する方法が使用されて
いた。

かかる前処理法としてはオクタデシル基で修飾したシリ
カゲルを充填したオープンカラムを用いるポウエル［Ｗ
、Ｓ、Ｐｏｗｅｌｌ、　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ
。

２０、９４７　（１９８０）］の方法が知られており、
又。

溶媒抽出、ＴＬＣ及び／又はＨＰＬＣを単独あるいは組
み合わせて用いる方法も多数開発されている。

しかし、この中で簡便な方法は概して選択性に乏しく、
上記の交差反応性等の問題を解決することができず、又
、選択性の向上を目標とする方法は一般に煩雑でかつ回
収率及び再現性が低いもので、多数の検体を効率良く選
択的に前処理し、信頼性の高い定量結果を与える精製法
は全く開発されていない。

（５）又、ＲＩＡ法においては、放射性同位元素を用い
ることから特定の管理施設で有資格者が取り扱う必要が
あり、更に放射性標識試薬の質が時間的経過に伴って変
化することから安定した測定系の維持が困難であるとい
う欠点がある。

（６）一方、従来、血小板凝集促進作用等を有するトロ
ンボキサンＡ２の量を測定するマーカーとして、安定代
謝物といわれるトロンボキサンＢ２゜（以下、ＴＸＢ２
と略称）が使用されていたが、このＴＸＢ２は、静脈中
へ注射針をさすことにより、血液の流出速度と逆比例し
て高い値を示してしまうものであり、採血時の人工産物
生成に左右されない代謝物の測定をする必要があった。

（７）更に、種々のＰＧｓの中で、プライマリ−ＰＧと
呼ばれているＰＧＥ２は広範な生理活性を有する重要な
化合物であり、生体内量の測定が病態の治療等において
重要な指針となっているが、安定性に劣るため、前処理
操作中に分解してしまい、正確な定量が困難であった。

そこで、分解を最小限に押え、正確な定量を行なうべく
、簡便な前処理及び測定法の開発が望まれていた。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者等は、微量で強力な生理活性を有するＰＧｓの
分離定量法について、永年に亘り鋭意研究を行なった結
果、特異性の高い抗体を固定化したカラム用充填剤及び
かかる充填剤を充填・しだカラムを用いる方法によって
、血漿中に存在する交差反応性を示す夾雑物や抗原抗体
反応を阻害する化合物をほぼ完全に除去することが可能
であること、そしてその操作が簡便であること等、効率
良く選択的に前処理が行えることを見出し、又、かかる
前処理をＥ工Ａと組み合わせることにより、合理的、簡
便及び高感度にＰＧｓの定量が行なえることを見出し、
本発明を完成した。

［構成］ 本発明は、新規な固定化抗体カラム用充填剤、その使用
物、その使用方法及びそれを使用した定量法に関し、 （１）ＰＧｓと蛋白との結合物を第１動物に投与して得
られる第１抗体を担体に固定化させたカラム用充填剤。

（２）上記（１）項記載のカラム用充填剤を充填したカ
ラム。

（３）上記（２）項記載のカラムを用いて、相当するＰ
Ｇｓを精製する方法。

（４）上記（２）項記載のカラムを用いて、相当するＰ
Ｇｓを精製し、精製物の量を酵素免疫測定法により測定
する方法。

（５）少なくとも、 （Ａ）上記（２）項記載のカラム、 （Ｂ）相当するＰＧｓと蛋白との結合物を第１動物に投
与して得られる第１抗体 （Ｃ）酵素標識きれた適当なＰＧｓからなる抗原及び（
Ｄ）第１動物の血清若しくはγ−グロブリンを第２動物
に投与して得られる第２抗体又はその固相担体結合物 からなる相当するＰＧｓ定量用組成物 より構成される。

本発明のプロスタグランジン類とは、プロスタグランジ
ン骨格を有するブロスタン酸の誘導体であって、それが
有する官能基（例えば、カルボキシル基又は水酸基）と
蛋白とを結合させたものを動物に投与した場合に抗体を
形成するようなプロスタグランジン類であれば何でもよ
く、いわゆるアラキドン酸カスケードを構成するもので
あって安定な形で存在しうるちのであれば特に限定され
ない。そのようなプロスタグランジン類としては、具体
的には、ＰＧＡＩ、　ＰＧＡ２．　ＰＧＡ３．　ＰＧＢ
ｔ、　ＰＧＥ２゜ＰＧＥ３　、　ＰＧＣｔ、　ＰＧＣｚ
、　ＰＧＣ３，ＰＧＤＩ、　ＰＧＤ２．　ＰＧＤ３゜Ｐ
ＧＥＩ、　ＰＧＥ２．　ＰＧＥ３．　ＰＧＦＩα、　Ｐ
ＧＦ２．α、　ＰＧＦ３α。

ＰＧＩ２．　ＰＧＩ３又はそれらの生体中での代謝物、
例えばＰＧＦ−ＭＬＩＭ　（ＰＧＦ２αの主要尿中代謝
物）、ＰＧＥ−Ｍ聞（ＰＧＥ２の主要尿中代謝物）、６
−ケトＰＧＦ□α（ＰＧＩ２の代謝物）を挙げることが
できる。

本発明のトロンボキサン類とは、トロンボキサン骨格を
有する誘導体であって、それが有する官能基（例えば、
カルボキシル基又は水酸基）と蛋白とを結合させたもの
を動物に投与した場合に抗体を形成するようなトロンボ
キサン類であれば何でもよく、いわゆるアラキドン酸カ
スケードを構成するものであって安定な形で存在しうる
ものであれば特に限定されない。そのようなトロンボキ
サン類としては、具体的には、ＴＸＢＩ、　ＴＸＢ２．
　ＴＸＢ３又はそれらの生体中での代謝物、例えば、１
１−デヒドロＴＸＢ２　（ＴＸＢ２の代謝物）を挙げる
ことができる。

本発明のロイコトリエン類とは、ロイコトリエン骨格を
有する誘導体であって、それが有する官能基（例えば、
カルボキシル基又は水酸基）と蛋白とを結合させたもの
を動物に投与した場合に抗体を形成するようなロイコト
リエン類であれば何でもよく、いわゆるアラキドン酸カ
スケードを構成するものであって安定な形で存在しうる
ちのであれば特に限定されない。そのようなロイコトリ
エン類としては、具体的には、ＬＴＡ３．　ＬＴＡ４．
　ＬＴＡ５゜ＬＴＢ３．　ＬＴＢ４．　ＬＴＢＳ、　Ｌ
ＴＣ３，ＬＴＣ４，ＬＴＣｒ、、　ＬＴＤ３゜ＬＴＤ４
．　ＬＴＤＳ、　ＬＴＥ３．　ＬＴＥ４．　ＬＴＥＳ又
はそれらの生体中での代謝物を挙げることができる。

ここで例示された化合物は、いずれも生体内物質及びそ
れらの代謝物と考えられているものであるが、本発明に
含まれるＰＧｓとしては、更に上記化合物に修飾を行な
った、化学的に合成された誘導体及びそ九らの代謝物を
も含みうるちのである。

本発明に包含されるＰＧｓのうち、好ましいものとして
はＰＧＤ２．　ＰＧＥ２．　ＰＧＦ２ｃｒ、、　ＴＸＢ
ｌ、　ＴＸＢ２．　ＴＸＢ３゜しＴＢ４．　ＬＴＣ４，
ＬＴＤ４及びそれらの生体中での代謝物、例えばＰＧＦ
−Ｍ聞、　ＰＧＥ−ＭＵＭ、　１１−デヒドロＴＸＢ２
及び２．３−ジノル−ＴＸＢ２が挙げられる。

本発明の第１抗体は、ＰＧｓのカルボキシ基又は水酸基
或いは新たに導入した特性基と蛋白の特性基、例えばア
ミノ基、メルカプト基、水酸基等を結合する反応に付し
、得られた結合物を適当なアジュバントと懸濁混合した
後、第１動物に投与、感作し、その血清を採取、処理す
ることにより調製される。

適当な蛋白としてはアルブミン、グロブリン、サイログ
ロブリン、ヘモシアニン、エデスチン等が挙げられるが
、好ましくはアルブミンである。

ＰＧｓと蛋白を結合する反応は公知であり、例えば、適
当な溶媒（例えば、リン酸緩衝液）中、蛋白と直接結合
できる場合には、活性エステル化法、カルボジイミド法
、酸無水物法等により達成され、好しくは、シクロへキ
シルカルボジイミド、■−エチルー３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド、　１，１’−オキザ
リルジイミダゾール、２，２′−ジピリジルジサルファ
イド、Ｎ、Ｎ’−ジサクシンイミジルカーボネート、Ｎ
、Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホ
スフィニッククロライド、Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミ
ダゾール ミジルオキザレート（ＤＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−シフタルイ
ミドオキザレート（ＤＰＯ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ノルボ
ルネニルサクシンイミジル）オキザレート（ＢＮＯ）、
■，１′−ビス（ベンゾトリアゾリル）オキザレート（
ＢＢＴＯ）、１。

１′−ビス（６−クロロベンゾトリアゾリル）オキザレ
ート（ＢＣＴＯ）又は１，１′−ビス（６−ドリフルオ
ロメチルベンゾトリアゾリル）オキザレート（ＢＴＢＯ
）を縮合剤として用いる方法により達成される。又、蛋
白と直接に結合できない場合には、この分野で公知の架
橋剤、例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼンを用いる方法等を用いて行なわれる。

反応後、目的物はカラムクロマトグラフィー又は透析に
かけて単離精製される。

アジュバントはこの分野で公知のものなら何でもよいが
、例えばプロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全又は不完全
アジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン、百日
ぜき死菌体及びこれらの混合体が挙げられる。又、追加
免疫時に不完全フロイント・アジュバントを用いると好
ましい場合がある。

感作方法もまた公知であり、上記結合体を上記アジュバ
ントとの懸濁液とし、適当な動物（例えば、ラット、マ
ウス、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ
等）に適当な投与間隔を設けて、数ケ月間にわたって投
与して感作する。感作後感作動物の血清を採取して、公
知の処理を行なうことにより、目的とする抗体が得られ
る。

実際には、検体中に測定しようとする化合物以外に多数
の構造類似体が存在する場合が多い。従って測定しよう
とする化合物に対して特異性の高い抗体を得ることが最
も好ましい。

モノクローナル抗体の調製は、岩崎等「単クローン抗体
　ハイブリドーマとＥＬＩＳＡＪ　　３０〜１０３頁、
（講談社すイエンティフィク）記載の方法に準じて実施
される。

免疫する動物を選ぶ時に、その動物種及び抗原に対する
免疫応答能力が重要になるが、一般に、用いる肺細胞と
ミエローマが同じ動物種の場合には安定な抗体産生ハイ
ブリドーマが効率よく形成されることが多い。特にＢＡ
ＬＢ／ｃマウスを使用するのが好適である。

ミエローマ細胞種としては、好適には、Ｐ３・Ｘ６３・
Ａｇ８　（Ｘ６３）、Ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４・１
（ＮＳ−１）、ＳＰ２１０・Ａｇ１４　（ＳＰ−２）及
びＦＯを挙げることができる。

クローニング法としては、限界希釈法、軟寒天法、フィ
ブリンゲル法及び蛍光励起セルソーター法を挙げること
ができ、好適には限界希釈法又は軟寒天法である。

本発明において使用される担体及び担体への結合法（固
定化法）は以下の通りである。

担体は、常圧又は加圧カラムにおいて、一般に担体とし
て使用されるものであれば、特に限定はないが、担体の
選択は固定化する抗体の性質によることはもちろんであ
るが、担体の、粒子の大きさ、三次元網目構造による表
面積の広さ、親水性部位と疎水性部位の比率、化学組成
、圧力に対する強度等について検討する必要がある。

担体としてよく用いられるのは、セルロース、デキスト
ラン、アガロースのような多糖類誘導体、ポリアクリル
アミドゲル、ポリスチレン樹脂のような合成高分子、多
孔性ガラス、金属酸化物のような無機物質等を挙げるこ
とができる。

固定化法として、物理的吸着法、即ち、水不溶性担体に
抗体を物理的に吸着させて固定化する方法を使用する場
合には、担体として更に好適には、活性炭、多孔性ガラ
ス、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリ
カゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸
カルシウム、金属酸化物、セラミックのような無機物質
、デンプン、グルテンのような天然高分子又は多孔性の
合成樹脂を挙げることができる。尚、疎水基をもつブチ
ル−或いはヘキシル−セファデックスのような担体に抗
体を疎水的に吸着固定化する方法も知られている。

固定化法として、イオン結合法、即ち、イオン交換基を
有する水不溶性の担体に抗体をイオン的に結合させて固
定化する方法を使用する場合には、用いる担体として特
に好適には、ＤＥＡＥ−セファデックスのようなイオン
交換基を有する多糖類又はイオン交換樹脂のような合成
高分子誘導体を挙げることができる。

固定化法として、共有結合法、即ち、水不溶性の担体と
抗体を共有結合によって結合させて固定化する方法を使
用する場合には、担体として特に好適には、ジアゾニウ
ム塩、酸アンド、イソシアナート、活性型ハロゲン化ア
ルキルと反応する官能基であるアミノ基、カルボキシ基
、スルフヒドリル基、水酸基、イミダゾール基、フェノ
ール基を有する担体を挙げることができる。

固定化法として、担体架橋法を使用する場合には、特に
好適な担体としては、ＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セ
ルロース、部分的に脱アシル化したキチン、アミノアル
キル化多孔性ガラスのようなアミノ基をもった水不溶性
の担体を拳げることかでき、これと抗体のアミノ基をグ
ルタルアルデヒドのような架橋試薬を用いて、互いに共
有結合させて固定化する。

固定化法として、架橋法、即ち、２個以上の官能基をも
つ試薬を用いて、抗体同士を架橋することにより固定化
する方法を使用する場合には、特に担体は不要であり、
好適には、架橋試薬とし−Ｃ、シップ塩基をつくるグル
タルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導
体、Ｎ、Ｎ’−エチレンビスマレイミド、ジアゾカップ
リングをするビスジアゾベンジジン、アルキル化するＮ
、Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミドを用いる
ことによって行なわれる。但し、これら各種架橋反応に
関与する抗体の官能基として、Ｎ末端のアミノ基、フェ
ノール基又はスルフヒドリル基、イミダゾール基等が必
要である。

固定化法として、包括法（高分子ゲルの細かい格子の中
に抗体を取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によ
って抗体を被覆するマイクロカプセル型に分けられる）
を使用する場合には、格子型の場合には、担体として好
適には、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコー
ル、光硬化性樹脂のような合成高分子物質及びデンプン
、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギーナン
のような天然高分子物質等の高分子化合物を挙げること
ができる。又、マイクロカプセル型の場合には、界面重
合法、即ち、親水性の七ツマ−と疎水性の七ツマ−とが
、その界面で重合するという原理を応用して抗体を被覆
する方法によるときは、担体として好適には、ヘキサメ
チレンジアミンとセバコイルクロリドを使うナイロン皮
膜を挙げることができる。液中乾燥法、即ち、有機溶媒
に溶かした高分子化合物中に抗体溶液を乳化分散させ、
これを水溶液に移して乾燥させることによって抗体を被
覆する方法によるときは、担体として好適には、エチル
セルロース、ポリスチレンのような高分子物質を挙げる
ことができる。相分離法、即ち、水と混和しない有機溶
媒中に高分子化合物を溶かし、この溶液中に抗体を乳化
分散させ、次に相分離を起こす非溶媒を攪拌しながら徐
々に加えて行くと、高分子化合物の濃厚溶液が抗体液滴
の周囲を包み、続いて高分子化合物が析出し、皮膜を形
成して抗体を被覆する方法によるときは、上記高分子化
合物を挙げることができる。

更に、具体的には、ＡＦ−エポキシトヨパール６５０Ｍ
、ＡＦ−アミノトヨパール６５０１（、、ＡＦ−ホルミ
ルトヨパール６５０Ｍ、ＡＦ−カルボキシトヨパール６
５０Ｍ　（以上、東洋曹達工業株式会社製）、ＲＥＡＣ
ＴＩ−ＧＥＬ　（６Ｘ、２５ＤＦ、ＨＷ−６５Ｆ及びＧ
Ｆ−２０００）、ＣＰＧ／ＣＤＩ−ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ
ＧＬＹＣＯＰＨＡＳＥ並びニＨＹＤＲＡＺＩＤＥ　ＢＥ
ＡＤＳ、　ＡＬＫＹＬＡＭＩＮＥＢＥＡＤＳ、　５ＡＮ
ＧＥＲＲＥＡＧＥＮＴ　ＢＥＡＤＳ（以上、ピアース社
製）、ＭＩＮＩ　ＬＥＡＫ（以上、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅ
ｃ社製）、オイパーギットＣ（３ＯＮ、２５０Ｌ及びＩ
Ｚ）（以上、ローム・ファーマ社製）、ＡＣＴＩＧＥＬ
（Ａ、Ａ−５ｔＪＰＥＲＦＬＯＷ、　Ｂ、　Ｈ及びＴ）
、ＡＭＩＮＯＧＥＬ（Ａ、　Ｂ）、ＣＡＲＢＯＸＹＧＥ
Ｌ、　ＴＨＩＯ−ＧＥＬ並びにＤＩＡＺＯ−ＧＥＬ　（
以上、ステロジーン社製）、アフィゲル（１０，１５，
１０２，２０２，４０１，５０１，６０１及び７３１）
、アフィプレップ（１０）、アミノエチルバイオゲル（
Ｐ−２及びＰ−１００）並びにＣＭバイオゲルＡ（以上
、バイオラッド社製）、ＣＮＢｒ−活性化セファローズ
４Ｂ、トレシル活性化セファローズ４Ｂ、　ＣＨ−セフ
ァローズ４Ｂ、　ＡＨ−セファローズ４Ｂ、活性化ＣＨ
−セファローズ４Ｂ、エポキシ−活性化セファローズ６
Ｂ、活性化チオール−セファローズ４Ｂ、　ＣＮＢｒ−
活性化セファローズ６ＭＢ（以上、ファルマシア社製）
のような市販の担体を挙げることができるが、これらに
限定されるものではない。

実際的な実験方法としては、福井等［酵素工学、１６４
頁〜２４３頁（１９８１年）、東京化学同人］の方法に
従って行なわれる。

カラム用充填剤を充填したカラムとは、上記カラム用充
填剤を、例えば、ガラス、プラスチックのような、通常
カラム管として使用される管に充填したものをいい、好
ましくは、充填容量５　ｍｌ程度のプラスチック製で、
市販品としては、例えばセパコールミニＰＰ（生化学工
業社製）、エコツカラム（バイオラット社製）、ディス
ポーザルポリスチレンカラム（ピアース社製）、マイク
ロカラム（ホエール社製）等を挙げることができる。又
、パスツールピペットにグラスウールのストッパーを充
填したカラムも用いることができる。

カラムを用いて精製する方法としては、例えば、次の工
程を含むアフィニティークロマトグラフィー法で行なわ
れる。

（１）抗体を固定化した担体を上記のカラムに充填する
。

（２）被験試料中のＰＧｓが、固定化された抗体によっ
て保持されるように、被験試料を固定化抗体と接触させ
る。

（３）後に行なう測定に際し、妨害となる物質をカラム
から洗い流す。

（４）固定化抗体からＰＧｓを溶離させるための溶離剤
を担体に加える。

尚、この溶離剤は、メチルアルコール、アセトニトリル
、アセトン等に代表される極性有機溶媒を１囲以上の濃
度で含有する水溶液である（１００％でも可）。

ＥＩＡは、公知の方法に準じて達成されるが、−射的に
は、ヘテロジニアスなＥＩＡである。従って、抗体結合
抗原及び／又は抗体結合酵素標識抗原をフリーの抗原及
び／又はフリーの酵素標識抗原から分離する必要がある
。例えば、第２抗体を用い、酵素標識抗原が抗体と結合
したもの（Ｂ型）と結合していないもの（Ｆ型）とを分
離する方法は、一般に知られる二抗体法（Ｄｏｕｂｌｅ
　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｔｈｏｄ）又は第一抗体固相
法（Ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅ
ｔｈｏｄ）により行なうことができる［石川栄治、河合
忠、宮井潔編、「酵素免疫測定法」　第３版、医学書院
（１，９８７）参照］。

酵素標識抗原は、ＰＧｓを酵素で標識することによって
調製される。

用いられるＰＧｓは測定しようとするＰＧｓでもよいし
、そのほかの任意のＰＧｓであってもよく、最も感度の
点等において好適な「適当なＪ　ＰＧｓを使用すること
ができる。

使用される酵素としては、一般にＥＩＡで用いられる酵
素であれば何でもよく、例えばマレ−１へデヒドロゲナ
ーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコース
酸化酵素、ペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコアミラーゼ、リ
ゾチーム、β−Ｄ−ガラク［〜、シダーゼ等が挙げられ
、好ましくはペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼである。

ＰＧｓと酵素の場合は、前記した第１抗体の調製方法中
、ＰＧｓと蛋白を結合する反応と同様にして行なわれる
。好ましくは、活性エステル化法、イソブチルクロロホ
ルメート等を用いる混合酸無水物法又は４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸　Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミドエステルを架橋剤として用い
る方法が挙げられる。

この際、酵素標識ＰＧｓの特異性を高めるため、第１抗
体の調製方法で述べたような工夫を行なうことができる
。

また必要に応じて酵素と結合するＰＧｓの量を変えるこ
とによって測定感度を上げることができる。

第２抗体は、第１抗体を調製する際に用いた感作動物と
同種の動物の血清あるいはγ−グロブリンを一般に知ら
れた方法で、別種の動物に投与、感作して調整すること
ができるが、異種動物の血清に対する抗体は市販されて
いるのでそれを利用してもよい。

二抗体法は、第２抗体を単独［二抗体液相法（Ｄｏｕｂ
ｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　１ｉｑｕｉｄ　ｐｈａｓｅ　
ｍｅｔｈｏｄ）］で、又は固相担体結合物［二抗体固相
法（Ｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｏＨ，ｄ　ｐｈ
ａｓｅ　ｔｎｅｔｈｏｄ）］として使用することができ
る。

第１抗体又は第２抗体と固相との結合は、前記物理的吸
着や化学的結合が用いられる。固相の材質は、一般のＥ
ＩＡに用いられるものであれば何でもよいが、例えばア
ガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類、ポリ
スチレン等の合成樹脂、ガラス、あるいはポリアクリル
アミド等が挙げられる。その形状は分離が容易であれば
どのような形のものでもよいが、例えば小球、小試験管
、チューブ、繊維状のもの、マイクロプレートがよい。

好ましくはポリスチレンボール又はガラスピーズである
［詳細については千畑一部編、「固定化酵素」　講談社
（１９７５年）参照］。

更に、本発明は、本発明の試薬組成物を用いるＰＧｓの
測定方法をも含有するものである。

測定方法は次のようにして行なわれる。

即ち、二抗体法では、 （１）第１抗体及び酵素標識抗原及びＰＧｓを含有する
被検体を混合し、競合的に抗原抗体反応を行った（第１
反応とする）後、第２抗体単独（二抗体液相法）又は第
２抗体を固相に結合させたもの（二抗体固相法）を加え
て、第１抗体を結合させ（第２反応とする）、次に結合
した酵素標識抗原の酵素活性を測定するか、或いは （２）先に第１抗体と被検体中のＰＧｓとを抗原抗体反
応に付しく第１反応とする）、得られた抗原抗体結合物
に、第２抗体単独（二抗体液相法）又は第２抗体を固相
に結合させたもの（二抗体固相法）を加えて、第１抗体
を結合させた（第２反応とする）後、酵素標識抗原を加
えて結合させ（第３反応とする）、結合した酵素標識抗
原の酵素活性を測定すること により行なわれる。

いずれの方法も好ましく、被測定物質の種類によって、
いずれかの方法を選択する必要がある。

（１）法の第１反応及び（２）法の第１反応及び第２反
応は、４〜５０℃、１〜４時間で行なわれる。この範囲
の反応温度と時間においては、測定感度が左右されない
安定した測定が可能である。（１）法の第２反応と（２
）法の第３反応は４℃で一夜かけて行なわれる。

（３）第−抗体同相法では、同相化された第１抗体に酵
素標識抗原とＰＧｓを含有する被検体を加え、競合的に
抗原抗体反応を行った（第１反応とする）後、結合しな
いものを除去し、残存する酵素標識抗原の酵素活性を測
定することにより行なわれる。

この第１反応は、４〜５０℃、１〜２４時間で行なわれ
る。

酵素標識抗原の酵素活性測定は、公知の方法［石川栄治
、河合忠、宮井潔編、「酵素免疫測定法」　第３版、２
１頁、医学書院（１９８７）］により行なわれる。

尚、本発明の定量用組成物は、少なくとも、（Ａ）ＰＧ
ｓと蛋白との結合物を第１動物に投与して得られる第１
抗体を担体に固定化したカラム用充填剤を充填したカラ
ム （Ｂ）相当するＰＧｓと蛋白との結合物を第１動物に投
与して得られる第１抗体、及び （Ｃ）ｌ素標識された相当するＰＧｓからなる抗原、所
望により、 （Ｄ）第１動物の血清若しくはγ−グロブリンを第２動
物に投与して得られる第２抗体又はその固相担体結合物 を構成要件とするものであるが、これ以外に必要に応じ
て、検量線作成用の標準ＰＧｓ、標識酵素の活性を測定
するのに必要な試薬−式（例えば、基質、基質溶解液、
酵素反応停止液等）、緩衝化剤等を含んでいてもよく、
これらは全て公知の方法により調製することができる。

［本発明の効果］ 本発明により、主として、次のような効果を得た。

（１）本発明の固定化抗体カラムによる前処理及びＰＧ
ｓの酵素免疫測定法を用いることにより、検体中濃度と
して１〜５００ｐｇ／ｍｌの範囲でＰＧｓの簡便な測定
が可能となった。

（２）選択的な前処理法を用いることにより、交差反応
性を示す乃至は抗原抗体反応を阻害する物質の効率的な
除去が可能となった。

（３）前処理に溶媒抽出やＨＰＬＣ法等の熟練を必要と
する工程が含まれておらず、容易であり自動化が可能で
ある。

（４）用いた固定化抗体カラムを極性有機溶媒で洗浄す
ることにより再利用が可能である。

（５）本発明による酵素免疫測定法はマイクロタイター
プレー１−を用いることにより酵素活性の自動測定も可
能である。

（６）　ＧＣ−邪法に比べ前処理が簡単であり、−度に
多数の測定が可能である。

（７）　ＲＩＡ法のような特定の管理施設で有資格者が
取扱う必要がなく、標識試薬も長期に亘り安定である。

以下に、実施例を挙げて本発明の構成、効果等を更に詳
細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定
されるものではない。

実施准駐 血　　１１−デヒドロトロンボキサン８２１ｌ−ｄｈＴ
ＸＢ２の測定 １、１−ｄｈＴＸｆ３２は下記の構造式を有し、水溶液
中ではそのｐＨにより酸性側ではラクトン構造を、アル
カリ性側では開環体として存在する。

ｎ目 Ｈ １１−ｄｈＴＸＢ２のラクトン体１５　ｍｇをアセトニ
トリル０．４．５　ｍｌに溶解し、これにＮ、Ｎ’−ジ
スクシンイミジル　カーボネート１１．４　ｍｇとトリ
エチルアミン６．２μｍを加え、室温にて１０分間混合
した。適量の酢酸エチルエステルを加えた後、飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液、ついで食塩水で洗浄後、無水硫
酸ナトリウムを加えて脱水した。溶媒を留去して得られ
た１ｌ−ｄｈＴＸＢ２のＮ−サクシンイミジルエステル
の７．７５　ｍｇをピリジン０．７８　ｍｌに溶解し、
牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）３７　ｍｇを０．０５
Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ７，３、以下ＰＢ）０．７８　
ｍｌに溶解したものと混合し、４℃で２４時間攪拌した
。得られた反応液に５０％ジメチルホルムアミド水溶液
を加えて総量を３　ｍｌとした後、５０％ジメチルホル
ムアミド水溶液で２４時間、次いで生理的食塩水で４８
時間、ともに４℃にて透析を行った。得られた人工抗原
３６　ｍｇに生理的食塩水を１８ｍ１加え、−２０℃に
て保存した。

１ｌ−ｄｈＴＸＢ２のＢＳＡに対する結合率は、３Ｈ１
ｌ−ｄｈＴＸＢ２を反応系に添加することにより算出し
た。その結果、１２ｍｏｌ　１ｌ−ｄｈＴＸＢ２／ｍｏ
ｌ　ＢＳＡであった。

農と箇月Ｍ相４冊４汰 得られた人工抗原の生理的食塩水溶液０．５　ｍｌにフ
ロイントの完全アジュバント０．５　ｍｌを加えて懸濁
した後、白色雄家兎の背部及び足跡部に皮下注射して免
疫した。２回目からは隔週に背部のみに皮下注射を行い
計７回免疫を行った。最後の感作後１００回目、あらか
じめインドメタシン１％、炭酸水素ナトリウム０．３ｘ
を含む水溶液１　ｍｌを静脈内注射し、次いで心臓より
採血し、室温で５時間放置した後、遠心分離により血清
を集め第１抗体を得た。

血清中の抗体の交差反応性（％）は、表１に示した通り
である。

［表１］ １ｌ−ｄｈＴＸＢ２（ａｃｉｄ　ｆｏｒｍ）　　　　　
　　　　１００ＴＸＢ、　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．０１ＰＧＤ２　　　　　　　　　　　　　
　　　　０・０５ＰＧＥＩ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜０．
０１ＰＧＥ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜０．０１ＰＧ
ＦＩα　　　　　　　　　　　　　　　　＜０．０１Ｐ
ＧＦ２α　　　　　　　　　　　　　　　　＜０．０１
６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ　１　ａ　　　　　　　　　　　
　　＜０　、０１６−ｋｅｆ、ｏ−ＰＧＦ２．ａ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＜０．０１３　　　　　カラム 第１抗体を有する血清２０　ｍｌから、硫酸アンモニウ
ム分画を得、ＤＥ−５２カラムクロマトグラフイーによ
り、文献公知の方法［続生化学実験講座（５）、免疫生
化学研究法、１１〜２４頁、日本生化学会編集、東京化
学同人（１９８６）］に準じて、ＩｇＧ画分を調製した
。得られたＩｇＧ画分２００　ｍｇ（蛋白量）を透析膜
に封入後、ポリエチレングリコール２０００を用いて濃
縮し、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）で、４℃に
て２４時間透析した。固定化は公知の方法（上記文献、
２９〜３１頁）により、以下の様に行った。即ち、４０
ｇのセファロース４Ｂに水７０ｍ１を加え。水冷下、細
かく砕いた臭化シアン４．５ｇをｐｉｉｉｉ、ｏ〜１１
．５に保ちながら、添加し混合した。ｐＨが降下しなく
なった時点でセファロース４Ｂを２０倍容の０．１Ｍ炭
酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）で洗浄し、臭化シアン活性化
セファロース４Ｂを得た。これに透析後のＩｇＧ画分を
加え、４℃にて２４時間攪拌した。０．１Ｍ　トリス塩
酸塩緩衝液（ＰＨ８，０）にて洗浄後、等張燐酸緩衝液
（以下、ＰＢＳ）　（ＰＨ７，４）に置換し、４℃で保
存した。

４　　　　　　カラムによる−　理法 固定化抗体をポリプロピレン製カラム（セパコールミニ
ＰＰ、生化学工業）にゲル容量として０．５　ｍｌ充填
した。水、アセトニトリルで洗浄後、ＰＢＳに置換した
。血漿検体あるいは種々の濃度の標準１１　ｄｈＴＸＢ
２及び血漿検体に標準１ｌ−ｄｈＴＸＢ２を加えた溶液
１〜４　ｍｌをカラムに負荷した。カラムを水（５ｍｌ
、３回）、５ｘアセ１ヘニトリル水溶液（５ｍｌ、３回
）で洗浄後、アセトニトリル５　ｍｌにて溶出し、蒸発
乾固後、酵素免疫測定用の検体とした。

固定化抗体カラムを使用した回収率を第１図に示す。縦
軸は、回収率（ぶ）を示し、横軸は負荷量を示す。０．
１乃至１００　ｎｇの範囲で、１ｌ−ｄｈＴＸＢ２は良
い回収率を示した。

ジオキサン０．４　ｍｌに溶解した１ｌ−ｄｈＴＸＢ２
Ｎ−サクシンイミジルエステル１．４４　ｍｇとＰＢ　
０．８　ｍｌに溶解したｆ（ＲＰ４　ｍｇを、水冷下に
て混合し、４℃にて４時間攪拌した。これしこＰＢ　２
．８　ｍｌ、を加えたのちＰＢで４℃にて４８時間透析
した。透析された溶液にゼラチン０．１％、塩化ナトリ
ウム０．９％を含むＰＢを加え、ＨＲＰ濃度を５００　
Ｐｇ／ｍｌとし４℃にて保存した。

キットは以下の各試薬より構成される。

（ａ）緩衝液：１００　ｍｌ ０．１フゼラチン及び０．９％塩化ナトリウムを含む５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９，２，以下Ａ緩衝液）、（
ｂ）標準１ｌ−ｄｈＴＸＢｚ： １ｌ−ｄｈＴＸＢｚのラクトン体０．１ｍｇをアセトニ
トリル１　ｍｌに溶解したもの。

希釈はＡ緩衝液にて行う。

（ｃ）第１抗体：１０　ｍｌ 前記（２）で得られた抗血清をＡ緩衝液で２万倍に希釈
したもの、 （ｄ］（ＲＰ標識１ｌ−ｄｈＴＸＢｚ：１０　ｍｌ前記
（５）で調製したものを０．５石の正常家兎血清（第１
ラジオアイソトープ研究所）を含むＡ緩衝液で２０　ｎ
ｇ／ｍｌに希釈したもの、（ｅ）第２抗体：１０　ｍｌ 山羊抗家兎γ−グロブリン抗血清（第１ラジオアイソト
ープ研究所）を０．３ｘのＥＤＴＡを含むＡ緩衝液で３
０倍に希釈したもの、 （ｆ）酵素基質： ０．０１％の３，３’、５，５’−テトラメチルベンチ
ジンを３ぶのジメチルスルホキシドを含む、５０ｍＭ酢
酸−クエン酸緩衝液（ｐ）１５．５）に溶解したもの、
１８０　ｍｌ及び０．０２％過酸化水素水溶液、２０　
ｍｌ。

（ｇ）酵素反応停止液：２００　ｍ１ ０．５Ｍ硫酸、 （ｈ）免疫沈降物洗浄用緩衝液：３００　ｍ１ＰＢＳ、 （ｉ）第１抗体を担体に固定化させたカラム用充填剤を
充填したカラム、１００本。

或いは第１抗体を担体に固定化させたカラム用充填剤及
びカラム用外筒、１００本。

７　血ル　の１１　ｄｈＴＸＢｚの゛ （４）で調製した検体をＡ緩衝液０．１　ｍｌに溶解し
、（６）で調製した第１抗体０．１　ｍｌ及びＨＲＰ標
識１ｌ−ｄｈＴＸＢｚｏ、１　ｍｌを加え、混合し、４
℃にて４時間反応させた。この反応液に（６）で調製し
た第２抗体０．１ｍｌを加え、混合後、４℃にて１６時
間反応させた。

反応終了後、ＰＢ３１．５　ｍｌを加え、混合後遠心分
離を行い、上清を吸引除去した。これに再びＰＢ５１．
５ｍｌを加え同様の操作を行った。次いで酵素活性を測
定するため、上清を除去した試験管に（６）で調製した
３、３’　、５，５’−テトラメチルベンチジン溶液１
．８　ｍｌと過酸化水素水０．２ｍｌを加え、混合後、
３７℃にて３０分間反応させた。反応は（６）で調製し
た酵素反応停止液２　ｍｌを加えて停止した。

本溶液の４５０　ｎｍの吸光度を測定して第２図に示す
検量線を得た。

縦軸は、Ｂ／Ｂｏ　（％）を示し、横軸は、１ｌ−ｄｈ
ＴＸＢｚの使用量を示す。

尚、Ｂは、横軸で示される１ｌ−ｄｈＴＸＢｚの量を使
用した場合の酵素活性を示し、Ｂｏは、１ｌ−ｄｈＴＸ
Ｂｚを使用しない場合の酵素活性を示す。

実施例２ １１−ｄｈＴＸＢ２３００　μｇとウシ血清７／Ｌ／ブ
ミン（ＢＳＡ）３　ｍｇとをＮ−サクシンイミジルエス
テル法で反応させ、結合物を６〜８週令のＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に、毎回の蛋白量として１．００　Ｐｇ
を投与した。２週間毎に４回免疫を行い、最終免疫後３
日目にマウスの肺臓を取り出し、牌リンパ球とミエロー
マ細胞（ＳＰＹ）をポリエチレングリコール法で細胞融
合させて、ＨＡＴ培地でハイブリドーマを選出した。

２　　　　生　　のスクリーニング 抗体産生能のスクリーニングに必要な標識抗原は、１１
”ｄｈＴＸＢｚを３Ｈ−ヨウ化メチルでエステル化した
ものを用いた。反応生成物の３Ｈ−メチル−１１−ｄｈ
ＴＸＢｚは、逆相ＨＰＬＣを用いて３Ｈ−ヨウ化メチル
及び未反応の１ｌ−ｄｈＴＸＢｚと分離した。カラムは
μｍボンダパックＣ工θ、溶媒はアセトニトリル／水／
酢酸（３５：６５：０．１．　ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を
アンモニア水でｐＨ６，５に調製したものを用いた。

無血清培地（Ｕｉｔｒｏｓｅｒ　Ｇ、　ＩＢＦ）を用い
てスクリニングを行なったところ、抗体産生能が１５個
に１個のウェルの割合で検出された。

！汐」に≦＝乙グ 目的の抗体産生細胞を寒天培地にごく少数まく軟寒天法
で行った。

４　千ツクローン　　の ハイブリドーマをマウス腹腔内で増殖させて、腹水を集
め、硫安分画とプロティンＡセファロ−抗原の交差反応
性（％）は、表２に示した通りである。

［表２１ １１−ｄｈＴＸＢ２（ａｃｉｄ　ｆｏｒｍ）　　　　　
　　　　　　１００ＴＸＢ２　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０　、０３１５−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ２　ａ
　　　　　　　　　　　　　　０．０５２．３−ｄｉｎ
ｏｒ−ＴＸＢ２　　　　　　　　　　　　　＜０．０２
ＰＧＢ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜０．
０２ＰＧＩｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜
０．０２ＰＧＥ２　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＜０−０２ＰＧＦ２α　　　　　　　　　　　　　　
　　＜０．０２６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦｌ　ａ　　　　　
　　　　　　　　　＜０．０２ＰＧＥ２−ＭＰＭ　　　
　　　　　　　　　　　　　＜０．０２ＰＧＦ２α−Ｍ
ＰＭ　　　　　　　　　　　　　　　＜０．０２５　モ
ノクローン　　固　　カラムの 実施例１（３）に示した方法で調整した臭化シアン活性
化セファロース４Ｂ、５．７ｇを、２０ｍ１の０．１Ｍ
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）に懸濁させた後、１００　
ｍｇの抗１ｌ−ｄｈＴＸＢ２モノクローン抗体ＩｇＧを
加え、４℃にて１６時間反応させた。０．１Ｍトリス塩
酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）にて洗浄後、ＰＢＳ　（ｐＨ
７，４，）に置換した。これに、未処理のセファロース
４Ｂを７０　ｇ加え、ゲル１　ｍｌ当たり３７５μｇの
ＩｇＧ濃度の固定化抗体を調製し、４℃にて保存した。

この固定化抗体をポリプロピレン製カラム（セパコール
ミニＰＰ、生化学工業）に、ゲル容量として０．８　ｍ
ｌ充填した。水、メタノールで洗浄後、ＰＢＳに置換し
た。

（６）モノクローン　休園　　カラムの種々の濃度の標
準１．１−ｄｈＴＸＢｚに、一定量の３Ｈ−標識された
ｏ−ｄｈｎＢ２（アマジャム製）を添加した溶液をカラ
ムに負荷した。カラムをＰＢＳ（１０ｍｌ）及び水（５
［１１１）で洗浄後、９５％メタノール溶液で溶出した
。その一部を採り、液体シンチレーションカウンターで
回収された放射能を測定した。

固定化抗体カラムを使用した回収率を第３図に示す。縦
軸は、回収率（％）を示し、横軸は負荷量を示す。

実施例３ ＰＧＥ２１５　ｍｇをアセトニトリル０．４５　ｍｌに
溶解し、これにＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジル　カーボ
ネート１１．４　ｍｇとトリエチルアミン６．２μｍを
加え、室温にて１０分間混合した。適量の酢酸エチルエ
ステルを加えた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、つ
いで食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水
した。溶媒を留去して得られたＰＧＥ２のＮ−サクシン
イミジルエステルの７．７５　ｍｇをピリジン０．７８
　ｍｌに溶解し、牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）３７
　ｍｇ′＠：０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，３、
以下ＰＢ）０．７８　ｍｌに溶解したものと混合し、４
℃で２４時間攪拌した。得られた反応液に５囲ジメチル
ホルムアミド水溶液を加えて総量を３　ｍｌとした後、
５囲ジメチルホルムアミド水溶液で２４時間、次いで生
理的食塩水で４８時間、ともに４℃にて透析を行った。

得られた人工抗原３６　ｍｇに生理的食塩水を１８　ｍ
ｌ加え、−２０℃にて保存した。

２　　　および　　　Ａ 上記ＰＧＥ２とＢＳＡとの結合物を、フロイントの完全
アジュバントでエマルジョンとし、６〜８週令のＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスの腹腔内に、毎回の蛋白量として５０μｇ
を投与した。２週間毎に４回免疫を行い、最終免疫後３
日目にマウスの肺臓を取り出し、牌リンパ球とミエロー
マ細胞（ＳＰＹ）をポリエチレングリコール法で細胞融
合させて、ＨＡＴ培地でハイブリドーマを選出１．た。

３　　　　生　　のスクリーニング 市販の３Ｈ−標識ＰＧＥ２を用い、抗体産生能のスクリ
ーニングを行なった。

Ωγり匹に≦；Ｚグ 目的の抗体産生細胞を寒天培地にごく少数まく軟寒天法
で行った。

５　モノクローン　　の ハイブリドーマをマウス腹腔内で増殖させて、腹水を集
め、硫安分画とプロティンＡセファロースカラムクロマ
トグラフィーにて目的とするモノクローナル抗体を得た
。

尿中の抗体の交差反応性Ｃ％）は、表３に示した通りで
ある。

［表３］ ＰＧＥ２　　　　　　　　　　　　　　　　　１００Ｐ
ＧＥ１７．０ ＰＣＩ’ｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
　、０ＰＧＡ２０・２ ＰＧＥ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　、
０ＰＧＦ　１α　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．ＩＰＧＦ！α　　　　　　　　　　　　　　　　　４
．３６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ　１　ａ　　　　　　　　　
　　　　　　５．４１３．１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５
−ｋｅｔｏ−ＰＧＥｚ　　　　　　　　　　　　　＜０
．１１３、１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−Ｐ
ＧＦ２　ａ　　　　　　＜０．１５　ａ　、７　ａ　−
ｄｉｈｙｄｒｏ−１１−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒｐ
ｒｏｓｔａｎｅ−１，１６−ｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ　　
　＜０．１１５−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ２　ａ　　　　　　
　　　　　　　　＜０　、１ＴＸＢ２　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　＜０．１（６）抗体固定化カラ
ムの作製 蛋白量として、２００　ｍｇのモノクローナル抗体を透
析膜に封入後、ポリエチレングリコール２０００を用い
て濃縮し、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）で、４
℃にて２４時間透析した。固定化は公知の方法［続生化
学実験講座（５）、免疫生化学研究法、日本生化学会編
集、東京化学同人（１９８６）、２９〜３１頁］により
、以下の様に行った。即ち、４０　ｇのセファロース４
Ｂに水７０ｍ１を加え。水冷下、細かく砕いた臭化シア
ン４．５ｇをｐＨ１１，０〜１１．５に保ちながら、添
加し混合した。ＰＨが降下しなくなった時点でセファロ
ース４Ｂを２０倍８の０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，
０）で洗浄し、臭化シアン活性化セファロース４Ｂを得
た。

これに透析後のモノクローナル抗体を加え、４℃にて２
４時間攪拌した。０．１Ｍ　Ｉ−リス塩酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）にて洗浄後、ＰＢＳ　（ｐ）１７．４）に置
換し、４℃で保存した。

７　　　　　　カラムによる前　理法 固定化抗体をポリプロピレン製カラム（セパコールミニ
ＰＰ、生化学工業）にゲル容量として１．０　ｍｌ充填
した。水、アセトニトリルで洗浄後、ＰＢＳに置換した
。尿検体あるいは種々の濃度の標準ＰＧＥ２及び尿検体
に標準ＰＧＥ２を加えた溶液１．０　ｍｌをカラムに負
荷した。カラムを水（５ｍｌ、３回）で洗浄後、メタノ
ール５　ｍｌにて溶出し、蒸発乾固した後、酵素免疫測
定用の検体とした。

本抗体固定化カラムの回収率を第４図に示す。

縦軸は、回収率（％）を示し、横軸は負荷量を示す。

図に示すように、負荷量として０．１〜１００　ｎｇの
ＰＧＥ２を良好な回収率で簡便に前処理できた。

てａ」獲素七１１口【Ｕ調裂迭 山水等の方法［ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＢＩＯＣＨＥＭ
ＩＳＴＲＹ耳追。

２８５　（１９３＆）に記載］に従って、β−ガラクト
シダーゼにより標識された９−デオキシ−９−メチレン
−ＰＧＦ２αを調製した。

９ＰＧＥ”　　　　　キ・・　　の Ｕまフ」ｄ凹回ｊ■ キットは以下の各試薬より構成される。

（ａ）緩衝液： （、（）０．：１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネ
シウム。

０．１％アジ化ナトリウム及び０．１％オブアルブミン
を含む１０ｎ＋Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０、以下Ａ緩衝
液）、１００　ｍｌ （ロ）緩衝液（ａ）より０．１％オブアルブミンを除い
たもの（ｐＨ７，０、以下Ｂ緩衝液）、１０ｍ１゜（ｂ
）標準ＰＧＥ２： ＰＧＥ４０．１　ｍｇをエタノール１　ｍｌに溶解した
もの。

希釈はＢ緩衝液にて行う。

（Ｃ＞第１抗体固相化チューブ：１００本山本等の方法
［ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ月
汲。

２８５　（１９８８）に記載］により、ポリスチレンチ
ューブに第１抗体を吸着させたもの、 （ｄ）β−ガラクトシダーゼ標識９−デオキシ−９−メ
チレン−ＰＧＦ２　ａ　：　１０　ｍｌ （８）で調製したものを緩衝液Ａで２０　ｎｇ／ｍｌに
希釈したもの、 （ｅ）酵素基質：３０　ｍｌ ０．１−の４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドを含む緩衝液Ａ、 （ｆ）酵素反応停止液：２５０　ｍｍ １００Ｉグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ＰＨ１０
，３）、 （ｇ）第１抗体を担体に結合、第１抗体を架橋又は第１
抗体を包括させたカラム用充填剤を充填したカラム、１
００本。

或いは第１抗体を担体に結合、第１抗体を架橋又は第１
抗体を包括させたカラム用充填剤及びカラム用外筒、１
００本。

■吐」世肥ジ匁附定 山水等の方法［ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＢＩＯＣＨＥＭ
ＩＳＴＲＹ川も２８７−２９１　（１９８８）に記載］
に従って、尿中ＰＧＥ２の測定を行なった。

検量線を第５図に示す。

縦軸は、Ｂ／ＢＯ（５％）を示し、横軸は、１ｌ−ｄｈ
ＴＸＢｚの使用量を示す。

尚、Ｂは、横軸で示される１ｌ−ｄｈＴＸＢｚの量を使
用した場合の酵素活性を示し、Ｂｏは、１ｌ−ｄｈＴＸ
Ｂｚを使用しない場合の酵素活性を示す。

抗１ｌ−ｄｈＴＸＢｚ抗体は、実施例１（１）及び（２
）に従って得た。

農」Ｌ泪庸創危胆＠阻艮法 ＨＲＰで標識された１、１−ｄｈＴＸＢｚは、実施例］
、（５）に従って得た。

３　　　　　　　ＤＡＳＰボール ウサギのγ−グロブリン山羊抗血清（第１ラジオアイソ
トープ社製造）を用い、硫酸アンモニウム分画とＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラムクロマトグラフィーにより第２抗
体ＩｇＧ画分を調製した。１　ｍｇ／ｍｌの濃度になる
ように第２抗体ＩｇＧを溶解した０、０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，４）５００　ｍｌにポリスチレンボール３
０００個を浸し、室温で２時間、更に４℃で一夜放置し
て吸着させ、目的とするＤＡＳＰボールを得た。

４　ＤＡＳＰ”　による１ｌ−ｄｈＴＸＢｚの実施例１
（６）記載の測定キットにおいて、コンポーネント（ｅ
）の代わりに、ＤＡＳＰポールを第２抗体として使用し
た。１ｌ−ｄｈＴＸＢｚは、５〜５００　ｐｇ／ｍｌで
容易に測定できた。

［実施例の効果］ （１）本発明の固定化抗体カラムによる前処理及び１ｌ
−ｄｈＴＸＢｚの酵素免疫測定法を用いることにより、
血漿中濃度として５〜５００　ｐｇ／ｍｌの範囲で１ｌ
−ｄｈＴＸＢｚの測定が可能となった。

（２）本発明の抗体固定化カラムによる前処理及びＰＧ
Ｅ２の酵素免疫測定法を用いることにより、尿中濃度と
して１〜１００　ｐｇ／ｍｌの範囲でＰＧＥ２の測定が
可能となった。

（３）選択的な前処理法を用いることにより、交差反応
性を示す乃至は抗原抗体反応を阻害する物質の効率的な
除去が可能となった。

（４）前処理に溶媒抽出やＨＰＬＣ法等の熟練を必要と
する工程が含まれておらず、容易であり自動化が可能で
ある。

（５）用いた固定化抗体カラムを極性有機溶媒で洗浄す
ることにより再利用が可能である。

（６）本発明による酵素免疫測定法はマイクロタイター
プレートを用いることにより酵素活性の自動測定も可能
である。

（７）’　ＧＣ−Ｈ８法に比べ前処理が簡単であり、−
度に多数の測定が可能である。

（８）　ＲＩＡ法のような特定の管理施設で有資格者が
取扱う必要がなく、標識試薬も長期に亘り安

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１（４）で得られた、１ｌ−ｄｈＴＸ
Ｂ２の回収率を示す。 第２図は、実施例１（７）で得られた。　１ｌ−ｄｈＴ
ＸＢ２の標準検量線を示す。 第３図は、実施例２（６）で得られた、１ｌ−ｄｈＴＸ
Ｂ２の回収率を示す。 第４図は、実施例３（７）で得られた、ＰＧＥ２の回収
率を示す。 第５図は、実施例３（１０）で得られた、ＰＧＥ２の標
準検量線を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロスタグランジン類、トロンボキサン類又はロ
   イコトリエン類と蛋白との結合物を第１動物に投与して
   得られる第１抗体を担体に固定化させたカラム用充填剤
   。
2. （２）請求項１記載のカラム用充填剤を充填したカラム
   。
3. （３）請求項２記載のカラムを用いて、相当するプロス
   タグランジン類、トロンボキサン類又はロイコトリエン
   類を精製する方法。
4. （４）請求項２記載のカラムを用いて、相当するプロス
   タグランジン類、トロンボキサン類又はロイコトリエン
   類を精製し、精製物の量を酵素免疫測定法により測定す
   る方法。
5. （５）少なくとも、 （Ａ）請求項２記載のカラム、 （Ｂ）相当するプロスタグランジン類、トロンボキサン
   類又はロイコトリエン類と蛋白との 結合物を第１動物に投与して得られる第１抗体 （Ｃ）酵素標識された適当なプロスタグランジン類、ト
   ロンボキサン類又はロイコトリエン 類からなる抗原及び （Ｄ）第１動物の血清若しくはγ−グロブリンを第２動
   物に投与して得られる第２抗体又はその固相担体結合物 からなる相当するプロスタグランジン類、トロンボキサ
   ン類又はロイコトリエン類の定量用組成物。