JPH01269494A - 生体物質固定化用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医化学、生化学、バイオテクノロジー等の分
野における。特にイムノアッセイや生化学分析での生体
物質の微量分析や、パイオリアクターを用いた物質の生
産に好適な生体物質固定化用担体に関する。

〔従来の技術〕

従来の生体物質固定化用担体としては、「蛋白質核酸酵
素、別冊３１号、第３］−９〜３２４ページ」、および
「実験と応用、アフィニティークロマトグラフィー、（
千畑一部著、講談社刊）」において論じられている。

これらの従来技術に示されるように、プラスチック製の
担体においては、担体表面が疎水性であるため、物質量
の疎水性相互作用による物理的吸着を利用した生体物質
の固定がなされている。

担体となるプラスチックとしては、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、メタアクリル、アクリルニ
１〜リル、ブタジェンとスチレンの共重合体、ナイロン
などが使用される。また、ポリスチレンやナイロンなど
では、それらの表面にカルボキシル基などを導入し、生
体物質を化学的結合によって担体表面に固定する方法も
知られている。

また、その他の担体としては、カラス製のものやセルロ
ースあるいは親水性ゲルを用いたものも知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

」二記担体のうち、プラスチックはカラス等にくらべ比
重が小さく溶液中にけん濁しやすく、また微生物などに
対して□安定である等すぐれた点を多数もつ。しかも生
体物質を物理的な吸着によりプラスチック表面に固定す
る方法は、簡便であるため、特にイムノアッセイ用に抗
体を固定する手段として多用されている。これは、抗体
の疎水性が高いためプラスチック表面に吸着しやすいと
いう性質を利用している。しかし、疎水性相力１作用の
ノ」１さい、糖、糖タンパク質、水溶性タンパク質やア
ミノ酸などの低分子物質は、うまく固定できなかったり
、固定されても保存中に十［（体からＭ離するといった
問題があった。

また、プラスチック表面にカルボキシル基などの残基を
導入し、架橋剤を用いて共有結合で生体物質を担体上に
固定する方法が開発さ才している。

しかし、プラスチック表面に溝入することができる残基
の種類にはかぎりがあり、特にポリエチレンやポリプロ
ピレンの場合、生体物質を固定できるような残基の導入
はほとんど不可能であった。

さらに、プラスチック表面に導入する残基の数に自由に
コン１〜ロールすることも難かしいという問題があった
。

本発明の目的は、これらの従来技術の問題点を解決し、
疎水性相互作用の低い物質であっても容易に固定でき、
微生物等により分解されず、しかも溶液中にけん濁しや
すい生体物質固定化用担体を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

−１−１記１」的は、プラスチックなどの担体表面に金
属層を設けることで達成される。

〔イ乍用〕

多くの金属はシランカッブリンク剤により仔膚、の残基
を渾人することがｊｑ能である。金属表面に導入する残
基の数は、シランカップリング剤の濃度を変化させるこ
とでコン１−ロールできる。従がつてシランカップリン
ク反応を行なうことのできる金属層をプラスチック表面
に形成しておけば、任意の残基を任意の数だけプラスチ
ック製の担体表面に導入することができる。これによっ
てタンパク質等の生体物質を金属表面に導入した残基を
介してプラスチックなどの担体上に固定化することがで
きる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を示す。

実施例」 ポリアセタール小球を、「実務表面技術、−劣λ（７）
、３０（１９８５）」に記載されているような既知の無
電解メツキ法を用いてニッケルメッキした。

すなわち、ポリアセタール小球を１４０℃で１時間加熱
したのち、弱酸性脱脂剤で脱脂する。十分な洗浄後、Ｓ
　ｎ　ＣＱ　２の希酸溶液とこれに続くＰ　（］　’Ｃ
”　Ｄ、　２の希酸溶液で表面を活性化し、アルカリタ
イプの化学ニッケル浴によりニッケル皮膜を形成した。

」二連のようにしてニッケルメッキしたプラスチック小
球（直径１００　／Ｌｍ　）からなる担体を、３０　ｍ
　Ｍ　３−　（２−アミノエチルアミノプロビル）−ト
リメ１〜キシシラン水溶液に３０分間浸漬したのち熱乾
燥させ、さらに室温で２．５　％グルタルアルデヒ１へ
水溶液に３０分間浸漬し、水洗した。

このノ」１球１ｇ当りについて、０　、１５　Ｍ　Ｎ　
ａ　ＣＯ。

を含む５０ｍＭりん酸す１−リウ１１のｐＨ７，４の水
溶液（以下ＰＢＳと略称する）にｉ　ｒｎ　ｇ　／　ｍ
　Ｑの割合でベルオキシターセを溶解した固定化反応液
０．５　　ｍＱを加えて室温で４時間かくはんした。

このように処理した担体をＰ　Ｂ　Ｓで洗浄したあと、
０．１ＭモノエタノールアミンとＯ、］−Ｍりん酸ナト
リウ１１からなる緩衝液（ｐ　Ｔ−Ｔ　７　、’４　）
を担体」ｇあたり５ｍ（ｉ加え、室温で１時間かくはん
した。これに再度Ｐ　ＲＳで洗浄し、５０ｍｇ／ｍＱ牛
血清アルブミンと０．０１　％メルチオレートを含むＰ
　ＢＳ溶液中に保存した。

一方、前記固定化反応溶液の」二清を取り、波長４０３
ｎ　ｒｎの光吸収を測定することによって上記−１−清
中に残るペルオキシダーゼの濃度を測定した。

これにより、担体上に固定されたペルオキシダーゼ量を
削算したところ、担体１００μαあたり４．８　μｇで
あった。

次にペルオキシダーゼを固定した」二記プラスチックか
らなる担体のペルオキシダーゼ活性を」り定した。測定
方法は次の通りである。

まず湿潤にした状態の体積で２５μＱ〜１００μの担体
を試験管にとり、これに１　ｍ　Ｍ　ｐ−ヒドロキシフ
ェニルプロピオン酸と３　ｍ　Ｍ　Ｉ−Ｉ　２０２のＰ
ＢＳ溶液を基質として３ｍＱ加える。２５°Ｃで１０分
間かくはんし、反応させたのち、０．１ＭＮａｚＳＯａ
水溶液０　、３　ｍ　Ｑ、を加え、反応を停止させた。

反応液を濾過して集め、蛍光強度（励起波長３２０　ｎ
　ｍ　、蛍光波長４０５ｎｍ）を測定することでプラス
チック小球」二に付加されたペルオキシダーゼ活性を測
定した。その結果を第１図に示す。

この結果より、メツキしたプラスチック小球上に活性を
有するペルオキシダーゼが固定されていることがわかる
。

ここで、前記各処理工程での洗浄や保存中に遊離してく
るペルオキシダーゼは検出限界以下であった。

以上の実施例の他に、金属をメツキできるプラスチック
としては、フェノール樹脂、ウレア樹脂。

メラミン樹脂、ポリエステル樹脂、メタクリル樹脂、ポ
リアミド樹脂スチロール樹脂、塩化ビニル。

酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネーＩ〜など
がある。また、これらプラスチックにメツキできる金属
としては、上記実施例のニッケル以外に、コバルト、ク
ロム、亜鉛等が挙げられる。

ここで、無電解メツキ法はメツキ可能な金属に制限があ
るが、むらが少ない特徴がある。

上記実施例のニッケルメッキを施したポリアセタールは
、タンパク質等の生体物質を固定化したあとも特に安定
で、メツキのはがれ等も極めて少ないという特徴がある
。

実施例２ ポリプロピレン小球に既知の真空蒸着法に従って、アル
ミニウムを蒸着することで表面にアルミ二つｔｓ％の層
を設けた。シランカプリング剤として３−グリシドキシ
プロピルトリメ１−キシシランの希酢酸水溶液に３０分
間浸し、熱乾燥させ、表面にエポキシ基を導入した。過
ヨウ素酸ナトリウムを用いて上記エポキシ基をアルデヒ
ド基に変換し、これを用いてｐ　Ｈ８、０の条件下で免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を固定した。シランカップリ
ング剤濃度を変化させると固定化されるタンパク質の量
をコントロールすることができた。ヒトＩｇＧを用いた
場合の固定化量の変化を第２図に示した。

上記実施例におけるアルミニウム蒸着ポリプロピレンは
、アルミニウム及びポリプロピレンが生化学物質の活性
等に影響を及ぼすことが少ないので、生体物質を固定化
する担体としては特に優れている。

ここで、上記実施例ではアルミニウムの真空蒸着法を用
いたが、金属表面が酸化膜になりやすい金属を用いれば
上記と同様の効果が得られる。また、真空蒸着法ばかり
でなく、既知のスパッタリジグ法などによりプラスチッ
ク表面に金ｙｃ層を形成しても同様の効果を得ることが
できる。

また本実施例においてポリプロピレン表面に導入したエ
ポキシ基を用いてｐ、　Ｈ１０以」二の反応条件でアミ
ノ基を有するアミノ酸やタンパク質、あるいは水酸基を
有する糖などを固定化することができた。

また、プラスチック表面に導入した金属層にシランカプ
リング剤により導入できる残基には、」二記実旅例】及
び２に記載したちの以外に、３−メタクリルオキシプロ
ピル１ヘリメトキシシランなどを用いてメタクリル基や
ビニル基を導入し、たり、γ−メルカプトプロピル１〜
リメ１−キシシランを用いてメルカプト残基を導入した
りすることなどができる。

実施例３ ポリカーボネート製の試験管の内面に、既知の無電解メ
ツキの手法を用いて、ニッケルメッキを施した。３０ｍ
Ｍ３−（２−アミノエチルアミノプロピル）−１−リメ
トキシシラン水溶液を加え。

（■０） ３０分間放置したのち熱乾燥させた。これに室温で２．
５　％グルタルアルデヒド水溶液を加え、３０分間放置
したのち、水洗し、アルデヒド基を導入した。既知の手
法（アナリテ力ル　バイオケミストリー、互旦、　２８
２　（１９７３）参照）を用いて１〜リプシンを固定化
した。

上記手法により調製した、トリプシンをニッケル層を介
して結合したポリカーボネート製試験管に、０　、５　
ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｄ、の濃度のカゼインのｐＨ７，４の
溶液を加え、３７°Ｃで１６時間放置した。試験管内の
溶液を取出したところ、カゼイン特有の濁りが見えなく
なっていた。すなわち、固定化されたトリプシンにより
カゼインが分解されることが確認された。

本発明を用いれば、安価なプラスチック製の容器に酵素
等を固定でき、また反応を終えた溶液から固定化した酵
素を容易に分離できるという効果がある。

上記実施例においては、プラスチック製の試験管の内面
にメツキを施した例を示したが、プラスチック製の管の
内面や、板の表面にトリプシンを固定化しても同様の効
果が得られた。また、内面に金属をメツキしたプラスチ
ック製の管に酵素を固定化したものは、反応溶液を連続
的に流して反応させることができるという特徴がある。

これら酵素などを固定化したプラスチック製の試験管や
管等は、ガラス製の試験管や管に比べ、破損しにくく、
また、軽量で取扱いが容易であり、しかも安価である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、プラスチックの表面に任意の残基を任
意の量導入できるので、生体物質を自由に固定化できる
効果がある。また、プラスチックの比重は０．９　　な
いし１．５　のものが多く、プラスチック小球や片を用
いると簡単に溶液中に分散させることができる効果があ
る。これにより固定化された生体物質を用いて化学反応
を行なわせる場合、わずかな撹拌でも溶液中の反応物質
と担体に固定化された生体物質が混り合い、反応が容易
に進行する効果がある。また、プラスチック試験管や管
や、＃−に本発明を用いれば容器状で破損しにくい生体
物質固定化用の担体が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例により得られたペルオキシダ
ーゼを固定化したプラスチック小球の活性の測定結果を
示すグラフ、第２図は、本発明の他の実施例のアルミニ
ウムを蒸着した直径１００μｍのプラスチック］ｇ当り
に固定化されるヒトＩｇＧの量のシランカプリング剤濃
度に対する変化を示したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プラスチックより成る生体物質を固定化する担体に
   おいて、表面の一部または全部に金属層を設け、さらに
   金属層に生体物質と反応する残基を導入したことを特徴
   とする生体物質固定化用担体。 ２、形成される金属層がプラスチック製の小球あるいは
   小片の表面、あるいは、プラスチック製の管の内面、あ
   るいはプラスチック製の試験管の内面、あるいは、プラ
   スチック製の板の表面であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の生体物質固定化用担体。