DE3224217A1

DE3224217A1 - Enzymimmunoassay-methode zur qualitativen und quantitativen bestimmung von substanzen

Info

Publication number: DE3224217A1
Application number: DE19823224217
Authority: DE
Inventors: Richard Julian Stuart London Duncan; Peter David Bromley Kent Weston
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1981-06-30
Filing date: 1982-06-29
Publication date: 1983-01-13
Also published as: GB2102946A; GB2102946B; FR2508486A1; JPS587561A; FR2508486B1

Description

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Anwalts-Akte: 32 291 29. Juni 1982

THE WELLCOME FOUNDATION LTD. LONDON N.W.1 / GROSSBRITANNIEN

Enzymimmunoassay-Methode zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Substanzen

Priorität: Land: GROßBRITANNIEN

Aktenzeichen: 8120149

Anmeldetag: 30. Juni 1981

«■ (089) 9882 72-74 Telex: 0524560 BERG d Bankkonten: Bayer. Vereinsbank München 453100 (BLZ 700202 70)

Telegramme (cable): Telekopierer: (089) 983049 Hypo-Bank München 4410122850 (BLZ 70020011) Swill Code: HYPO DE MM

BERGSTAPFPATENT München KaIIo Infotec 6000 Posischeck München 65343-808 (BLZ 70010080)

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine Enzymimmunoassaymethode zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer Substanz in einem Medium, in dem diese Substanz vermutet wird.

Es sind eine Reihe von Enzymimmunoassayverfahren bekannt. Dazu gehören Methoden, bei denen ein Enzym an einen Antikörper oder ein Antigen gebunden wird, dessen Vorhandensein festgestellt werden soll. Enzymimmunoassaymethoden, insbesondere homogene Enzymimmunoassaymethoden werden in der UK-Patentanmeldung 2 043 245 A beschrieben. Diese Anmeldung betrifft einen homogenen Enzymimmunoassay, bei dem ein Enzym und ein irreversibler Hemmer dieses Enzyms vorhanden sind; dabei ist der irreversible Enzymhemmer mit einem Analogen des zu bestimmenden Liganden konjugiert, und das Konjugat kann mit dem Enzym reagieren, indem es kovalente Bindungen bildet, welche die Enzymstruktur verändern und dadurch die Enzymaktivität irreversibel hemmen. Ferner ist ein bindendes Protein, das den zu bestimmenden Liganden binden kann, und das Ligandenkonjugat vorhanden; dieses Konjugat wird inaktiviert, wenn OS an das bindende Protein gebunden wird. Die Menge des zu bestimmenden Liganden beeinflußt die Bindung zwischen dem Konjugat und dem bindenden Protein und somit die Wirkung, die das Konjugat auf die Enzymaktivität hat. Die Enzymaktivität wird gemessen, mit der Aktivität bei NichtVorhandensein des Liganden verglichen, und die Menge des vorhandenen Liganden wird bestimmt.

Ifl d,en FEBS Letters, Vol. 16, Juli 1980, Seite 285-288, wird ebenfalls ein solches System beschrieben, zusätzlich werden jerfoch verschiedene alternative homogene Enzymimmunoassaysys^eme vorgeschlagen, die nach ähnlichen Prinzipien funktionieren. Es werden dafür jedoch keine Beispiele gegeben. Für eines dieser Systeme wird die Verwendung eines Enzymaktivators vorgeschlagen, wie z.B. eines Antikörpers zu der Wildtyp E. co^i 3-Galactosidase. -/6

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues homogenes Enzymimmunoassay verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Substanz, deren Vorhandensein angenommen wird. Es basiert auf der Aktivierung eines inaktiven Enzyms, wobei der Grad der Enzymaktivierung von der Menge der vorhandenen Substanz abhängt .

Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer Substanz in einem Medium, in welchem diese Substanz vermutet wird, und umfaßt die folgenden Schritte:

a) Das Medium wird mit einem Konjugat aus der an einen Antikörper, der ein praktisch inaktives Enzym aktivieren kann, gebundenen Substanz, ferner mit einem für die Substanz spezifischen Antikörper oder bindenden Protein, sowie mit einem Oberschuß des praktisch inaktiven Enzyms gemischt, wobei die Bestandteile in einer Reihenfolge zugegeben werden, bei der das Enzym nicht mit dem Konjugat vermischt wird, bevor alle Substanz in dem Medium die Möglichkeit hatte, mit dem für die Substanz spezifischen Antikörper oder bindenden Proteins zu reagieren;

b) es wird Substrat für das Enzym zugegeben und die Enzymaktivität bestimmt.

Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung einer Substanz in einem Medium, in dem diese Substanz vermutet wird, bei dem die folgenden Schritte ausgeführt werden:

a) Das Medium wird zu einem Gemisch aus einem für die Substanz spezifischen Antikörper oder bindenden Protein und einem Oberschuß des praktisch inaktiven Enzyms gegeben;

b) es wird ein Konjugat zugegeben, das aus der an einen Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, gebundenen Substanz besteht, und es wird ferner

c) ein Substrat für das Enzym zugegeben und die Enzymaktivität bestimmt.

Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung einer Substanz in einem Medium, in dem diese Substanz vermutet wird, das die folgenden Schritte vorsieht:

a) Das Medium wird mit einem Konjugat gemischt, das aus der an einen Antikörper, welcher ein praktisch inaktives Enzym aktivieren kann, gebundenen Substanz besteht;

b) für die Substanz spezifischer Antikörper oder bindendes Protein wird zugegeben;

c) ein Oberschuß des praktisch inaktiven Enzyms wird zugegeben, und

d) Substrat für das Enzym wird zugegeben und die Enzymaktivität bestimmt.

Der Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.

Der für die Substanz spezifische Antikörper bzw. das bindende Protein kann sich mit der Substanz verbinden, wenn diese unkonjugiert oder mit dem aktivierenden Antikörper konjugiert ist. Wird der für die Substanz spezifische Antikörper bzw. das bindende Protein an das Konjugat gebunden, dann verringert dies den Grad der beobachteten Enzymaktivität. Der zu verwendende Antikörper ist zweckmäßigerweise gereinigt, und zwar mit Standardverfahren wie z.B. Fraktionierung durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat und anschließender Säulenchromatographie auf Ionenaustauschercellulose. Der gereinigte Antikörper ist vorzugsweise praktisch frei von anderen Proteinen, d.h. er enthält weniger als 10% andere Proteine.

Es kann auch ein weiterer Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, mit dem Enzym gemischt werden, bevor dieses zu einem der anderen Bestandteile gegeben wird.

Unter praktisch inaktivem Enzym versteht man ein Enzym, wie z.B. eine inaktive Mutante der 3-Galectosidase, das weniger als 10%, vorzugsweise weniger als 5% und am besten weniger

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als 1% der Aktivität desselben Enzyms besitzt, wenn dieses aktiviert ist. Eine solche mutante Form der ß-Galactosidase kann durch Kultur eines mutanten Stammes von E. coli erzeugt werden.

Es wurde gefunden, daß eine Reihe von Typen von praktisch inaktiver ß-Galactosidase, die durch Kultur mutanter E. coli Stämme erzeugt wurden, instabil sind. Ferner wurde gefunden, daß eine Reihe von Typen von praktisch inaktiver ß-Galactosidase einen hohen Störpegel haben, d.h. eine Farbreaktion hervorrufen, wenn sie mit einem Substrat gemischt werden, ohne daß ein aktivierender Antikörper vorhanden ist. Dementsprechend sind für das erfindungsgemäße Verfahren diejenigen praktisch inaktiven ß-Galactosidasen geeignet, die stabil sind.(d.h., die die Fähigkeit, aktiviert zu werden, über einen Zeitraum von mehreren Monaten behalten und eine Reaktion katalysieren, die über viele Hinuten linear ist), und die keinen wesentlichen Störpegel erzeugen. Ein besonders geeigneter Typ der ß-Galactosidase ist der vom Stamm (WM 29 8) der E. coli, Allele, lac aba 627, zu beziehen von Dr. W. Messer, Max Planck Institut, 1000 Berlin 33 (Dahlem), Ihnestrasse 6 3-73.

Der in dem Verfahren verwendete aktivierende monoklonale Antikörper ist vorzugsweise ein intaktes Immunoglobulin, obwohl auch Immunoglobulinfragmente verwendet werden können. Der für die zu bestimmende Substanz spezifische Antikörper bzw. das bindende Protein ist vorzugsweise ein für diese Substanz spezifischer -polyklonaler Antikörper mit hohem Titer oder ein monoklonaler Antikörper.

Die Erfindung betrifft Methoden, die besonders zur Bestimmung von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit und Urin geeignet sind. Zu den für die qualitative und quantitative Bestimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Substanzen gehören Hormone, Proteine, Vitamine, Gifte, Pharmaka und Pharmakametaboliten. Die

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erfindungsgemäßen Methoden sind besonders für die Bestimmung von Substanzen mit medizinischer Bedeutung geeignet. Dazu gehören Steroide, Vitamine, Proteine und Proteinfragmente, Folsäure, Serotonin,Prostaglandine, Adrenalin, Noradrenalin, Opiate, Theophyllin, Dilantin, Barbiturate, Aminoglycosid, Antibiotika, Acyclovir, sowie antivirale Mittel. Vorzugsweise ist die Substanz ein Antiepileptikum, ein Antibiotikum, ein antivirales Mittel, ein Hormon oder ein Protein. Die Methode erwies sich als besonders geeignet für die quantitative Bestimmung von Diphenylhydantoin, Cortisol, Acyclovir, Fibrinogen und Fibrinogenzerfallsprodukt D. Es wird als besonders überraschend und vorteilhaft angesehen, daß die erfindungsgemäßen Methoden für die Bestimmung von Substanzen mit hohem Molekulargewicht, d.h. zwischen 10 000 und 1 000 000, also z.B. von Proteinen und Proteihfragmenten, geeignet sind.

Die quantitativ zu bestimmende Substanz ist normalerweise in einer Konzentration von über 1 nmol/1 vorhanden, vorzugsweise im Fall von Cortisol mit über 40 nmol/1, im Fall von Acyclovir mit über 250 nmol/1, im Fall von Diphenylhydantoin mit über 10 ymol/l, und im Fall von Fibrinogen und Fibrinogenzerfallsprodukt D mit über 60 nmol/1.

Das Konjugat, das aus der Substanz und dem Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, besteht, wird mit bekannten und üblichen Verfahren hergestellt. Die Substanz wird über konventionelle Brückengruppen an den Antikörper gebunden. Für Cortisol, Acyclovir und Diphenylhydantoin bestand ein besonders geeignetes Verfahren in der Einführung einer funktioneilen Carbonsäuregruppe in diese Liganden und anschließender Umwandlung zu dem N-Hydroxysuccinimidester, der sich leicht mit geeigneten funktioneilen Gruppen der monoklonalen Antikörper verbindet. Für das Fibrinogenzerfallsprodukt D bestand ein besonders geeignetes Verfahren in der Einführung von geschützten Thiolgruppen in das D-Fragment, und von Maleimidresten in den monoklonalen Anti-

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körper; dann wurde die Schutzgruppe von den Thiolresten entfernt, und die beiden Proteine zur Förderung der Kupplung gemischt. Weitere geeignete Konjugationsverfahren sind von Kabakoff in Enzyme Immunoassay, CR.C. Press, Editor E.T. Maggio, 1980, 71-104, beschrieben.

Der erfindungsgemäße Assay wird normalerweise in einem wässrigen flüssigen Medium mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 10, vorzugsweise etwa 7,4 durchgeführt. Der Assay kann leicht abgebrochen werden, indem man den pH-Wert auf etwa 10 anhebt und einen Chelatbildner für Magnesium, wie EDTA, und ein Iipidsolubilisierendes Mittel, wie Natriumcholat oder Natriumdesoxycholat zugibt. Vorzugsweise ist in dem wässrigen flüssigen Medium ein Alkanol oder Polyol vorhanden. Methanol, Ethanol, Propan-1,2-diol, Mannitol, Sorbitol und D-Arabit sind für die Zugabe zu dem wässrigen Medium besonders geeignet. Überraschend zeigte sich, daß D-Arabit die Empfindlichkeit des Assays erhöht und gleichzeitig die für die Durchführung des Assays benötigte Zeit verringert, und zwar mit einem Mechanismus, der sich von dem des Methanol unterscheidet und zusätzlich wirkt. Die Temperatur des flüssigen Mediums liegt während der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens normalerweise bei 10° bis 45 ⁰C, am besten bei 37 ⁰C.

Für den Fachmann ist ersichtlich, daß ein bestimmter Zeitraum (die Inkubationsperiode) eingeräumt werden muß, damit die entsprechenden immunologischen Reaktionen ablaufen können, d.h. die Reaktion des für die Substanz spezifischen Antikörpers oder bindenden Proteins mit dem Konjugat und mit der Substanz in dem Medium, sofern sie vorhanden ist, und auch damit das Enzym den entsprechenden aktivierten Zustand erreichen kann. Die genauen Stadien, in denen Inkubationen durchgeführt werden müssen, hängen von den besonderen Umständen ab, unter denen der Assay durchgeführt wird, z.B. von der Zugabereihenfolge der Reagentien; die Inkubation erfolgt jedoch immer vor der Zugabe des Substrats. Der Fachmann kann beurteilen, wann eine

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bestimmte Inkubationsstufe angezeigt ist.

Substanz, Konjugat» Enzym und Antikörper sind normalerweise in dem Medium löslich, in dem das Verfahren durchgeführt wird. Das Substrat kann in dem Medium löslich sein oder nicht, besser ist es löslich. Unter bestimmten Umständen kann die Verwendung eines unlöslichen synthetischen Substrats oder eines unlöslichen natürlichen Substrats angezeigt sein.

In den erfindungsgemäßen Assay sollte ein Überschuß an normalem Immunoglobulin» z.B. normalem Schaf-Immunoglobulin, aufgenommen werden, um den Effekt von zufällig in dem Medium vorhandenen Antikörpern zu neutralisieren, die mit den Antikörpern, die das praktisch inaktive Enzym aktivieren können, eine Reaktion eingehen könnten. Mutante Formen der 3-Galactosidase enthalten bekanntlich eine Thiolgruppe, die für ihre Aktivität wesentlich ist. Werden solche Enzyme in den erfindungsgemäßen Assays verwendet, wird normalerweise Dithiolthreitol oder ein ähnliches Reagenz zugegeben, um eine Oxidation der Thiolgruppe zu verhindern. Geeignete Konservierungsstoffe wie z.B. Natriumazid, können zweckmäßiger- und vorteilhafterweise in dem erfindungsgemäßen Assay zugegeben werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren konkurrieren die quantitativ zu bestimmende Substanz, wenn sie vorhanden ist, und das Konjugat aus der Substanz und dem Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym binden kann, um die Bindungsstellen an dem spezifischen Antikörper bzw. dem bindenden Protein. Da der Grad der Enzymaktivierung von dem genauen Ausmaß der Bindung zwischen dem Konjugat und dem spezifischen Antikörper oder bindenden Protein abhängt, hängt die Enzymaktivität der Probe von der Menge der Substanz in der Probe ab.

Die Art der Auswertung der Enzymaktivität kann je nach den Anforderungen variieren. Am besten werden zur Bestimmung des Grades der Enzymaktivität spektrophotoinetrische oder fluorometrische Messungen vorgenommen.

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Die Konjugate, die aus der zu bestimmenden Substanz und dem daran gebundenen Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, bestehen, sind neu und bilden einen weiteren wesentlichen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung.

Die Erfindung betrifft ferner ein Test-Kit aus den folgenden Bestandteilen:

Reagenz 1: spezifischer Antikörper für die zu analysierende Substanz, gemischt mit praktisch inaktivem Enzym. Reagenz 2: Konj ugat.
Reagenz 3: Substrat für das Enzym.
Reagenz 4: Unterbrecherreagenz.

Reagenz 1 enthält einen Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann. Ein geeignetes praktisch inaktives Enzym ist eine mutante Form der ß-Galactosidase, in welchem Fall Reagenz 1 normalerweise Dithiothreitol oder ein ähnliches Reagenz zur Verhinderung der Oxidation der in der ß-Galactosidase enthaltenen Thiolgruppe einschließt. Zweckmäßigerweise enthält das Reagenz 1 auch normales Immunoglobulin und zwar vorzugsweise normales Schaf-Immunoglobulin. Reagenz 1 und 2 können ein Polyol, vorzugsweise D-Arabit, enthalten.

Reagenz 2 kann ein normales Immunoglobulin, und zwar normales Schaf-Immunoglobulin enthalten.

Reagenz 3 enthält vorzugsweise ein Alkanol, wie z.B. Methanol. Das Unterbrechungsmittel ist ein Gemisch aus einem Puffer mit hohem pH-Wert, einem Chelatbildner für Magnesium und einem Iipidsolubilisierenden Mittel. Ein geeigneter pH-Puffer enthält Natriumhydroxid in GIyzin, der Chelatbildner ist EDTA und das lipidsolubilisierende Mittel ist Natriumcholat. Im folgenden werden die Bestandteile des erfindungsgemäßen Testverfahrens und die Durchführung des TestVerfahrens näher erläutert.

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Enzymreinigung

E. coli Stämme, die aktivierbare mutante ß-Galactosidase erzeugen (beschrieben von Melchers und Messer in Eur. J. Biochem., 17 (1978), 267) wurden in einem Mineralsalzmedium gezüchtet, das mit Natriumsuccinat und Thiamin ergänzt war (Fowler, J. Bacterial., 112 (1972), 856). Ein weiterer Stamm A 32 4-5 (beschrieben von Fowler, siehe oben) wurde zur Erzeugung von enzymatisch aktiver Wildtyp ß-Galactosidase gezüchtet.

Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren angereichert und bis zum Bedarf gefroren gelagert. Nach Auftauen und Ultraschallbehandlung wurde die ß-Galactosidase und ihre verschiedenen durch Antikörper aktivierbaren mutanten Formen mit klassischen Chromatographieverfahren gereinigt, wie sie von Craven et al. (J. Biol. Chem., 240 (1965), 2468) und Tenu et al. (Eur. J. Biochem., 20 (1981), 363) beschrieben sind. AffinitätsChromatographie kann ebenfalls verwendet werden, hat jedoch den Nachteil, daß die Synthese der Säulenmedien teuer und die Kapazitäten gering sind. Bei einer typischen Reinigung wurden 30 1 Wachstumsmedium mit Bakterien gewonnen, die Bakterien wurden mit Ultraschall behandelt, und die Suspension zentrifugiert. Man erhielt etwa 1 1 Überstand, der das gesamte $-Galactosidaseprotein der Bakterien enthielt, und das Enzym wurde teilweise gereinigt und konzentriert, indem man das Material sammelte, das zwischen 15%iger bis 45%iger Sättigung mit Ammoniumsulfat ausfiel. Nach Dialyse oder Gelfiltration wurde das Enzym auf eine DEAE-Cellulosesäule aufgetragen und mit einem Gradienten eluiert. Enzymhalt ige Fraktionen aus der DEAE-Säule wurden vereinigt, direkt auf eine Hydroxylapatitsäule aufgetragen und mit einem Phosphatgradienten eluiert. Die enzymhaltigen Fraktionen wurden wiederum vereinigt und dann direkt auf eine Säule mit. DEAE-Sepharose CL4B aufgetragen. Eluierung mit einem Gradienten ergab 500 bis 1000 mg homogene 3-Galactosidase. Die Ky-

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droxylapatitsäule konnte ohne Verlust an Effektivität durch eine Sephacryl S 300 Säule ersetzt werden.

Die gereinigten Enzyme können mehrere Monate ohne Verlust an tatsächlicher oder potentieller katalytischer Aktivität gelagert werden, wenn man sie in einer gepufferten Lösung von 50% gesättigtem Ammoniumsulfat suspendiert, das Mercaptoethanol oder einen anderen Sulphydryl-Schutzstoff enthält.

Herstellung des Antikörpers

Mäuse wurden mit gereinigter Wildtyp g-Galactosidase immunisiert, und mit den von Kohler und Milstein (Eur. J. Immunol., 6 (19 75) 511) entwickelten Methoden wurde ihre Milz mit einer Myelomazell-Linie fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in vitro in Multiwell-Platten kultiviert und die überständigen Lösungen auf Anti-3-Galactosidaseantikörper untersucht, welche die ansonsten inaktiven mutanten Enzyme aktivierten. Zellen aus den Behältern, welche die gewünschten Antikörper erzeugten, wurden mehrfach mit dem Verfahren der GrenzVerdünnung geklont. Auf diese Weise wurden monoklonale Antikörper-Zellinien hergestellt und nach Bedarf entweder in vitro auf Gewebekultur gezüchtet, oder in vivo in den Bauchhöhlen von Mäusen, so daß Ascitesflüssigkeit entstand. Die Antikörper wurden mittels Chromatographie auf Ionenaustauschercellulose von dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit gereinigt.

Vier Antikörper erzeugende Zell-Linien wurden etabliert und mit BG-18, BG-19, BG-79 und BG-81 bezeichnet. Das von diesen Linien erzeugte Immunoglobulin ergab bei Mischung mit inaktivem, gereinigtem, mutanten Enzym ß-Galactosidaseaktivität. Antikörper der Linie BG-79 zeigten eine besondere Eigenschaft: bei Mischen mit Antikörper aus einer der anderen drei Linien und Zugabe zu inaktivem mutanten Enzym wurde gefunden, daß die Enzymaktivität synergistisch erhöht wurde und größer war, als aus der Summierung der einzeln verwendeten Antikörper zu erwarten war. Die Aktivität kann durch Verwendung von Methanol,

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Ethandiol, Propan-l,2-diol oder anderer Verbindungen, welche die funktioneile Hydroxylgruppe enthalten, erhöht werden; ferner durch einen anderen Mechanismus, und zwar mit Zuckeralkoholen, insbesondere Sorbitol und Mannitol, und vor allem mit D-Arabit.

Der beobachtete Synergismus und die Wirkung der Methanolzugabe sind in Tabelle I dargestellt.

Tabelle I

Aktivierung des Enzyms Typ 2 95

Durch Antikörper	Kein Methanol	0,16	10% Methanol	0,4
BG-79	7,6 +	0,04	4,6 +	0,004
BG-81	0,86Jt₁	0,03	0,2 +	0,25
BG-18	12,5 ±	0,01	32 +_	0,003
BG-19	1,0 +	1,2	0,88J₁	1,8
BG-79 η	28 jf	0,2	46 +_	0,1
BG-79 H	10,9 +	0,5	16,9 +_	3,5
BG-79 H	42,5 +	93,5 +




ι- BG-81
ι· BG-19
ι- BG-18

BG-18 + BG-19 - 18 -

Die Enzymaktivität in Gegenwart von überschüssigem Antikörper wird ausgedrückt in pmol o-Nitrophenol/nmol Enzym/min und wird bestimmt durch Verwendung von o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid als Substrat.

Monoklonale Antikörper Nr. BG-18, BG-19, BG-79 und BG-81 sind von Wellcome Diagnostics, Dartford, Grossbritannien, erhältlich.

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Antikörperzubereitung

Als gefriergetrocknetes Pulver konservierte monoklonale Antikörper wurden rehydratisiert, dann durch Ausfällen mit 5o% gesättigtem Ammoniumsulfat fraktioniert. Nach Resuspendierung und Gelfiltration des gesammelten Niederschlags wurden die monoklonalen Antikörper auf eine Säule mit DEAE-Cellulose oder Procion-3B substituiertem Bio-Gel DE bei pH 7,0 in 10 mmol/1 Phosphatpuffer aufgetragen. Der eluierte Antikörper war praktisch homogen in einer Ausbeute von bis zu 45 mg Antikörper pro 10 ml resuspendiertem gefriergetrocknetem Pulver.

Der gereinigte monoklonale Antikörper wurde substituiert durch Behandlung mit einem N-Hydroxysuccinimidester oder einem anderen brauchbaren aktiven Derivat des jeweiligen Liganden.

Für Cortisol ließ man eine optimale Konzentration von 10 Molekülen N-(Cortisol-21-hemisuccinyl)-succinimid mit jedem gereinigten Antikörpermolekül 16 bis 20 h bei 0 ⁰C in einem Puffer, der 10% Dimethylformamid, Phosphat und Salzlösung enthielt, bei pH 7,4 reagieren. Der substituierte Antikörper wurde mit 70% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt, und nach Waschen durch Resuspendieren in 70% gesättigtem Ammoniumsulfat und mindestens zweimaligem Zentrifugieren wurden alle Spuren von Cortisol-21-hemisuccinat, soweit sie nicht proteingebunden waren, durch Gelfiltration entfernt. Das Produkt wurde entsprechend verdünnt und gefroren gelagert, auch konnte Gefriertrocknung verwendet werden.

Für Diphenylhydantoin ließ man 20 Moleküle N-Hydroxysuccinimidester des 3-(N-Carboxymethyl)-diphenylhydantoin mit jedem gereinigten Antikörpermolekül 16 h bei Raumtemperatur (20 ⁰C) in einem Puffer, der 0,01 mol/1 Phosphat und Salzlösung enthielt, bei pH 7,4 reagieren. Substituierter Antikörper wurde von freiem 3-(N-Carboxymethyl)-diphenylhydantoin durch Gelfiltration getrennt; dazu wurde eine Säule mit Biogel PlO, 200-400 mesh, und ein 6 ml Bettvolumen mit einer 1 ml Probe

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verwendet, die Säule war mit 0,15 mol/1 Salzlösung equilibriert.

Für Fibrinogen und das Fibrinogenzerfallsprodukt D wurde das gereinigte Protein oder D-Fragment mit S-Acetylmercaptosuccinsäureanhydrid umgesetzt, um die geschützten Thiolgruppen einzuführen. Der monoklonale Antikörper wurde mit Succinimidy1-4-(N-maIeimidomethy1)-eyelohexan-1-carboxylat umgesetzt, um Maleimidreste einzuführen. Für die Kupplung wurden die geschützten Thiolgruppen in dem Fibrinogen oder D-Fragment durch Behandlung mit 2 5 mmol/1 Hydroxylamin bei pH 7, 1 h bei Raumtemperatur, exponiert; das Thiolprotein oder Fragment D wurde mit dem Maleimid-monoklonalen Antikörper gemischt. Nach der Kupplung, die über Nacht stattfand, wurde das Konjugat mit Mercaptoethanol behandelt, um überschüssige Maleimidreste zu blockieren, dann mit •N-Ethylmaleimid, um überschüssige Thiolgruppen zu blockieren; das Konjugat wurde dann durch Chromatographie gereinigt und zwar auf Sepharose CL-4B für Fibrinogen-Antikörper, und auf Sephacryl S-300 für Fragment D-Antikörper. Die zuerst eluierten Proteine waren brauchbar.

Für das antivirale Mittel Acyclovir, chemische Bezeichnung 9-(2-Hydroxyethoxymethyl)-gTjanin, ließ man 10 Moleküle des N-Hydroxysuccinimidesters des Succinylacyclovir mit jedem gereinigten Antikörpermolekül 16 h bei Raumtemperatur (20 ⁰C) in einem Puffer, der 0,01 mol/1 Phosphat und Salzlösung enthielt, bei pH 7,4 reagieren. Substituierter Antikörper wurde von freien kleinen Molekülen mittels Gelfiltration getrennt, wozu eine Säule mit Biogel PlO, 200-400 mesh, und ein 6 ml Bettvolumen mit einer 1 ml Probe verwendet wurde, die Säule war mit 0,15 mol/1 Salzlösung equilibriert.

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Durchführung eines typischen homogenen Enzymassays Beispiel 1

Cortisol-Assay

50 μΐ einer Serum- oder Urinprobe, in der man 0 bis 1000 pmol Cortisol vermutete, wurde gemischt mit 1 pmol Cortisol-monoklonalem BG-79 Antikörperkonjugat, 60 pmol gereinigtem IgG aus einem Antiserum gegen Cortisol in 20 μΐ, und 50 yl 2 mmol/1 Natrium-8-anilino-l-naphthylensulfonat (pH 7,6). Nach 30 min Inkubation bei 37 ⁰C wurden etwa 1 pmol aktivierbares ß-Galactosidaseenzym, das bereits mit 130 nmol Dithiothreitol und 20 pmol eines zweiten unsubstituierten, aktivierenden Antikörpers BG-81 gemischt war, zusammen mit 200 yl 7 mmol/1 o-Nitrophenyl-3-D-Galactosidsubstrat in 100 mmol/1 Phosphatpuffer, pH 7,40, der 10% Methanol enthielt, zugegeben. Die Inkubation wurde 30 min fortgesetzt, dann wurde die optische Dichte bei 420 nm Wellenlänge abgelesen und notiert; die Reaktion wurde mit 1 ml 0,4 mol/1 Natriumcarbonat, das 10% DimethyIsulfoxid oder ein anderes organisches Lösungsmittel oder 1% Natriumdesoxycholat enthielt, abgebrochen. Für den entsprechenden Bereich wurden Standards hergestellt, ebenso Leerproben (kein Anti-Cortisol und kein substituierter Antikörper) für jede Probe. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle II.

Tabelle II

Cort i s öl-Standardkurve

Cortisol vorhanden 0.D.

(pmol)

0 0,68

5 0,95

10 1,07

20 1,12

40 1,18

60 1,21

100 1,25

1000 1,36

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Beispiel 2
Diphenylhydantoin-Assay

25 yl einer Serumprobe, in der man 0,5 bis 2,5 nmol Diphenylhydantoin vermutete, wurde mit 4 pmol in 25 yl Diphenylhydatoin-monoklonalem BG-79 Antikörperkonjugat und 900 pmol in 25 μΐ gereinigtem IgG aus einem Antiserum gegen Diphenylhydantoin gemischt. Die Röhrchen wurden bei 3 7 C inkubiert, und 6 pmol aktivierbares ß-Galactosidaseenzym wurde zugegeben, das bereits mit 500 nmol Dithiothreitol und 20 pmol eines zweiten unsubstituierten aktivierenden Antikörpers BG-81 gemischt war. 200 yl 7 mmol/1 o-Nitrophenyl-ß-D-Glactosidsubstrat in 100 mmol/1 Phosphatpuffer, pH 7,4, wurden dann zugegeben, so daß man ein Inkubationsvolumen von insgesamt 325 μΐ erhielt. Die Inkubation wurde 15 min bei 37 ⁰C fortgesetzt, dann wurde die Reaktion mit 1 ml 0,2 mol/1 Natriumcarbonat, das 1% Natriumdesoxycholat enthielt, abgebrochen, und die optische Dichte bei 420 nm abgelesen. Diphenylhydantoinstandards wurden für den entsprechenden Bereich von 5 bis 20 yg/ml Serum hergestellt, ebenso Leerproben (kein Antiphenytoin und kein Diphenylhydantoin-Antikörperkonjugat) für jede Probe. Die Ergebnisse finden· sich in Tabelle III.

Tabelle III

Diphenylhydantoin-Standardkurve

Diphenylhydantoin ' 0.D..,_ori

(yg/ml) ⁴²° ^nm

0 0,175

5 0,225

10 0,241

20 0,247

Kontrolle: kein Antikörper 0,32 8

Kontrolle: kein Konjugat 0,074

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Beispiel 3

Fibrinogenzerfallsprodukt D - Assay

10 μΐ einer Serumprobe, in der man 0,6 bis 24 pmol Fragement D vermutete, wurde mit 2 0 μΐ Reagenz 1 bei Raumtemperatur gemischt und 5 min zur Reaktion stehengelassen. Dann wurden
20 μΐ Reagenz 2 zugegeben, und die Inkubation bei 37 ⁰C für 10 min begonnen. 500 μΐ Substrat wurden dann zugegeben und die Inkubation bei 37 C 5 min lang fortgesetzt; danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 μΐ Unterbrecherreagenz abgebrochen und die optische Dichte der Lösung bei 420 nm abgelesen. Fragment D-Standards wurden für den entsprechenden Bereich
von 5 bis 200 μg/ml Serum hergestellt. Die verwendeten Reagenzien und die erhaltenen Resultate finden sich in Tabelle IV bzw. V.

Tabelle IV

Reagenzien für Fibrinogenzerfallsprodukt D - Assay

Reagenz 1: Antifragment D von Schafen (gereinigtes

Immunoglobulin) 15 mg/ml 520 μΐ

Dithiothreitol 250 mmol/1 in Wasser 400 μΐ

Monoclonal 81 (gereinigtes

Immunoglobulin)
1,9 mg/ml 400 μΐ

D(+) Arabit 300 mg/ml, normales Schaf-Immunoglobulin 1 mg/ml in Puffer 26 80 μΐ

Enzym: 12 μΐ 10 mg Suspension in
Ammoniumsulfat in 12 mmol/1 Dithiothreitol, 1 mg/ml normales Schaf-Immunoglobulin in Puffer 4000 μΐ

Reagenz 2:

Konjugat aus monoklonalem IgG-D-Fragment 800 μΐ. Arabit 300 mg/ml,
1 mg/ml normales Schaf-Immunoglobulin:
7200 μΐ in Puffer.

Puffer für Reagenzien 1 und 2 und Substrat:

50 mmol/1 Tris
25 mmol/1 Natriumchlorid 10 mmol/1 Magnesiumchlorid 1 mmol/1 EDTA bei pH 7,5

-/21

Tabelle IV - Fortsetzung

Substrat

o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid 2,5 mg/ml

in Puffer, der 2,5 mol/1 Methanol enthält.

Unterbrecher 2 mmol/1 Glycin

Reagenz 200 mmol/1 EDTA pH eingestellt auf 10,1 0,2% Natriumcholat mit Natriumhydroxid

Tabelle V

Fibrinogenzerfallsprodukt D Standardkurve

Fragment D °'^D'42O nm

μg/ml

0 0,404

15 0,409

25 0,412

40 0,426

65 0,464

100 0,548

200 0,566

Beispiel 4

Fibrinogen - Assay

20 μΐ einer Serumprobe, in der man 0 bis 3 mg/ml Fibrinogen vermutete, wurde mit 20 μΐ, 260 yg/ml eines gereinigten ■ IgG aus einem Antiserum gegen Fibrinogen gemischt. 20 yl konjugiertes Fibrinogen-IgG(79), 0D₀ _on + 0,22, wurde dann zu-

/ ο υ nm

gegeben, gefolgt von 20 yl Enzymgemisch, (6 μΐ Enzymammoniumsulfatsuspension, 100 yl 10 mg/ml mit Dithiothreitol, 1 ml 250 mmol/1 Tris-Puffer mit 1 ml kolbenkultiviertem monoklonalen Antikörper BG-81).Die gemischten Lösungen wurden 5 min bei

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37 ⁰C inkubiert, dann wurden 2 00 μΐ 7 mmol/1 o-Nitrophenylß-D-Galctosid in Tris-Puffer,der 10% Methanol enthielt, zugegeben. Die Inkubation wurde 20 min bei 37 ⁰C fortgesetzt, dann wurde die Reaktion mit 500 μΐ 0,4 mol/1 Natriumcarbonat, das 1% Nätriumdesoxycholat enthielt, abgebrochen. Für den entsprechenden Bereich wurden Standards hergestellt, ebenso eine Leerprobe ohne substituierten monoklonalen Antikörper für jede Probe. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI enthalten.

Tabelle VI

Fibrinogen-Standard Kurve

Fibrinogen 0.D.._lOri „_m

, / , τ 42 0 nm

(mg/ml) -

0 0,5.18

0,031 0,626

0,063 0,667

0,125 0,769

0,25 0,892

0,50 0,953

1,0 1,102

Beispiel 5

Acyclovir - Assay

Seren, von denen man annahm, daß sie 10 bis 100 pmol Acyclovir enthielten, wurden U-fach mit Puffer verdünnt, dann wurde eine 10 yl Probe mit 20 yl Reagenz A bei Raumtemperatur gemischt und 5 min zur Reaktion stehengelassen. Dann wurden 2 0 μΐ Reagenz B zugegeben und die Inkubation 10 min bei Raumtemperatur fortgesetzt. Dann wurden 500 μΐ auf 37 ⁰C vorgewärmtes Substrat gegeben und die Inkubation in einem Wasserbad

bei 37 ⁰C für 5 min begonnen; danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 μΐ Unterbrecherreagenz abgebrochen, und die optische Dichte der Lösung bei 420 nm abgelesen. Acyclovirstandards wurden für den entsprechenden Bereich von 1 bis ymol/l in Serum hergestellt. Die verwendeten Reagenzien und die erhaltenen Resultate finden sich in den Tabellen VII bzw. VIII.

Tabelle VII

Reagenzien für Acyclovir - Assay

Reagenz A Ascitesflüssigkeit,die monoklonale Antiacyclovir-Antikörper und AC/AINo 2 enthält

Bithiothreitol 250 mmol/1 in Wasser

Monoclonal 81 (gereinigtes Immunoglobulin) 1,9 mg/ml

D(+) Arabit

Enzym, 10 mg/ml Suspension in Ammoniumsulfat in 12 mmol/1 Dithiothreitol

Puffer

Reagenz B Konjugat von monoklonalem Ig6-Acyclovir, 20 yg/ml in Puffer mit 0,1 mg/ml normalem Schaf-Xmmunoglobulin.

Puffer» für Reagenz A und B und Substrat:

50 mmol/1 Tris

2 5 mmol/1 Natriumchlorid

10 mmol/1 Magnesiumchlorid 1 mmol/1 EDTA pH 7,5 eingestellt mit

Salzsäure

Subitrat o-Nitrophenyl-ß-D-Galaetosid, 2 mg/ml in Puffer, dsr 2,5 mol/1 Methanol enthält.

Unterbreehermittel

200	Vl
800	μΐ
200	yi
1,2	g
12	Ml
3000	Ul

pH 10,1 eingestellt mit Natriumhydroxid

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Tabelle VIII

Acyclovir-Standard Kurve

Acyclovir O.D. __Q

(Duplikat-Assays)

0,329

0,345

2,5 0,391

0,395 0,569

0,575

7,5 0,645

0,629 0,675

0,665

Ende der Beschreibung

Claims

Patentansprüche f IJ Methode zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer Substanz in einem Medium, in dem diese Substanz vermutet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Schritte ausgeführt werden:

1.1 Das Medium wird mit einem Konjugat, das aus der an einen Antikörper, der ein praktisch inaktives Enzym aktivieren kann, gebundenen Substanz besteht, ferner mit einem für die Substanz spezifischen Antikörper oder bindenden Protein, sowie mit einem Überschuß des praktisch inaktiven Enzyms gemischt, wobei die einzelnen Bestandteile in einer Reihenfolge zugegeben werden, bei der das Enzym nicht mit dem Konjugat gemischt wird, bevor alle Substanz in dem Medium die Möglichkeit hatte, mit dem für die Substanz spezifischen Antikörper oder bindenden Protein zu reagieren, und

1.2 es wird Substrat für das Enzym zugegeben und die Enzymaktivität bestimmt.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne.t , daß die folgenden Schritte ausgeführt werden:

2.1 Das Medium wird zu einem Gemisch aus einem für die Substanz spezifischen Antikörper oder bindenden Protein und praktisch inaktivem Enzym gegeben,

2.2 es wird ein Konjugat zugegeben, das aus der an einen Antikörper, der ein praktisch inaktives Enzym aktivieren kann, gebundenen Substanz besteht, und

2.3 es wird Substrat für das Enzym zugegeben und die Enzymaktivität bestimmt.

»(089) 9882 72-74 Telegramme (cable): BERGSTAPFPATENT München

Telex: 0524 560 BERGd Telekopieter: (089) 983049

KaIIe Inlolec 6000

-/2

Bankkonten: Bayer. Vereinsbank München 453100 (BLZ 70020270) Hypo-Bank München 4410122850 (BLZ 70020011) Swift Code: HYPO D Postscheck München 653 43-808 (BLZ 70010080)

.3. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die folgenden Schritte ausgeführt werden:

3.1 Das Medium wird mit einem Konjugat, das aus der an einen Antikörper, der ein praktisch inaktives Enzym aktivieren kann, gebundenen Substanz besteht, sowie mit für die Substanz spezifischem Antikörper oder bindendem Protein gemischt,

3.2 es wird ein Überschuß des praktisch inaktiven Enzyms zugegeben, und

3.3 es wird Substrat für das Enzym zugegeben und die Enzymaktivität bestimmt.

4. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, ein monoklonaler Antikörper ist.

5. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß ein weiterer Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, mit dem Enzym gemischt wird, bevor dieses zu einem der anderen Bestandteile gegeben wird.

6. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das praktisch inaktive Enzym eine mutante Form der ß-Galactosidase ist, die weniger als 1% der Aktivität von aktivierter 3-Galactosidase besitzt.

7. Methode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die mutante Form der 3-Galactosidase durch Kultur eines mutanten Stammes von E. coli erzeugt wird.

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8. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein Antiepileptikum, ein Antibiotikum, ein antivirales Mittel, ein Hormon oder ein Protein ist.

9. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay bei einem pH-Wert von etwa 7,4 in Gegenwart eines Alkanols oder Polyols bei 10 ° bis 45 ⁰C durchgeführt wird.

10. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Gegenwart von D-Arabit durchgeführt wird.

11. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Gegenwart von Methanol durchgeführt wird.

12. Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay abgebrochen wird, indem man den pH-Wert auf etwa 10 anhebt und einen Chelatbildner für Magnesium, sowie ein Ixpidsolubilisierendes Mittel zugibt.

13. Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer, wie oben definierten, zu bestimmenden Substanz besteht, die an einen Antikörper gebunden ist, der ein praktisch inaktives Enzym aktivieren kann.

14. Test-Kit, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Bestandteile enthält:

Reagenz 1: Für die zu analysierende Substanz spezifischer Antikörper, gemischt mit praktisch inaktivem Enzym,

Reagenz 2: Konjugat aus der an einen Antikörper, der das praktisch inaktive Enzym aktivieren kann, ge-

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bundenen Substanz,

Reagenz 3: Substrat für das praktisch inaktive Enzym, Reagenz 4: Unterbrechermittel.

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