DE2315508C2

DE2315508C2 -

Info

Publication number: DE2315508C2
Application number: DE2315508A
Authority: DE
Inventors: Jiri Dipl.-Ing. Prag/Praha Cs Coupek; Jaroslava Dipl.-Ing. Cesky Brod Cs Turkova; Olga Hubalkova; Miroslava Dipl.-Ing. Prag/Praha Cs Krivakova
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1972-03-29
Filing date: 1973-03-28
Publication date: 1987-07-16
Also published as: JPS4913385A; DE2315508A1; JPS5738236B2; AT336180B; FR2178085A1; NL7304275A; ATA278873A; SE411905B; CS167530B1; FR2178085B1; CH577524A5; CA999820A; GB1429534A; BE797512A

Description

Die Erfindung betrifft trägerfixierte Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Antikörper, Antigene, Hormone, immunoaktive Verbindungen und Antibiotika als biologisch aktive Verbindungen, die chemisch an einen wasserunlöslichen polymeren Träger aus einem Copolymer auf der Basis von hydrophilen Monomeren und Divinyl- oder Polyvinylver bindungen in Form eines polymeren makroporösen Gels gebunden sind, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Bindung der zunächst löslichen entsprechenden biolo gisch aktiven Verbindungen an den polymeren Träger gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. 2.

Derartige unlösliche, trägerfixierte biologisch aktive Produkte besitzen z. B. die Eigenschaften selek tiv wirksamer heterogener Katalysatoren (trägerfixier te Enzyme) oder von Inhibitoren (trägerfixierte Enzym inhibitoren) bzw. von Verbindungen mit anderer spezifischer Wirkungsweise.

Die Vorteile der Trägerfixierung werden im folgenden am Beispiel der Enzyme als den am häufig sten angewandten biologisch aktiven Verbindungen erläutert.

Die Weltproduktion der für die Katalyse chemi scher Reaktionen in der pharmazeutischen Industrie und Lebensmittelindustrie benutzten Enzyme liegt in der Größenordnung von mehreren Tausend Tonnen pro Jahr.

Der möglichen breiteren Anwendung der Enzyme für die Katalyse chemischer Reaktionen im techni schen Maßstab stehen neben ihrem Preis die geringe Stabilität und besonders ihre sehr unwirtschaftli che Anwendungsweise im Wege: Bei der üblichen Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen wird das Enzym wie eine der reagierenden Komponen ten der Lösung bzw. Reaktionsmischung zugesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wird das Enzym aus dem Endprodukt durch Verfahren entfernt, die in der Regel seine Aktivität zerstören, oder es ver bleibt im Endprodukt als Verunreinigung, üblicher weise gemeinsam mit den zugesetzten Desaktivatoren für die betreffende Enzymreaktion. Verfahren, die man für die Rückgewinnung der aktiven Enzyme anwen den könnte, sind in der Regel im technischen Maß stab nicht durchführbar. Die Enzyme werden also bei dieser Verfahrenweise jeweils nur einmal ver wendet und dann zerstört.

Die Erzeugung unlöslicher trägerfixierter Enzyme durch Bindung des löslichen Enzyms an einen polymeren Träger ermöglicht andererseits die wiederholte Anwen dung des unlöslichen Enzyms bei absatzweiser oder kontinuierlicher Reaktionsführung, wobei das un lösliche Enzym als heterogener Katalysator wirkt. Bei der so durchgeführten Katalyse ist die Abtren nung des Enzyms vom erhaltenen Reaktionsgemisch un problematisch; außerdem sind die Kosten sowohl bei diskontinuierlicher als auch bei kontinuierlicher Reaktionsführung wesentlich geringer. Ferner läßt sich ein solcher Prozeß bei kontinuierlicher Durchführung leichter automatisieren.

Bei Hindurchleiten einer Lösung eines Substrats für eine enzymatische Reaktion durch eine Gelsäule mit chemisch gebundenem trägerfixiertem Enzym wird die Geschwindigkeit der enzymatisch katalysierten Reaktion nicht nur durch die Art und Aktivität des Enzyms, sondern auch durch die Art der Bindung des Enzyms an den Träger, durch dessen physikalisch- chemische Eigenschaften (Porosität, Oberfläche), durch die hydrodynamischen Parameter der Apparatur und durch die Durchflußgeschwindigkeit der Substrat lösung beeinflußt. Die gleichzeitige oder aufeinander folgende Einwirkung mehrerer Enzyme kann ferner durch Vermischen oder Schichtung der Säulenfüllung oder durch Serienschaltung von Säulen mit verschiedenen träger fixierten Enzymen erreicht werden.

Eine ähnliche Situation liegt auch bei anderen biologisch aktiven Stoffen mit spezifischer Wirk samkeit (Coenzymen, Enzymhibitoren, Antigenen, Antikörpern, Hormonen, immunoaktiven Verbindungen und Antibiotika) vor. Nach Reaktion des Substrats für die betreffende biochemische Reaktion mit den trägerfixierten biologisch aktiven Verbindungen können die Reaktionsprodukte durch übliche Trenn verfahren, wie Sedimentation, Filtration, Zentri fugieren, wirtschaftlich und schnell abgetrennt werden.

Als polymere Träger für biologisch aktive Ver bindungen wurden bisher poröses Glas, Cellulose und Cellulosederivate, Stärke, Derivate von ver netztem Polystyrol, Ethylen-Maleinsäureanhydrid- Copolymere, Polyacrylamid und Polysaccharide heran gezogen. Die letztgenannten Verbindungen sind dank ihrer relativ hohen Porosität in gequollenem Zu stand häufig angewandte Träger. Mit Ausnahme von porösem Glas und Polystyrol besitzen die genannten Gele allerdings eine nur sehr geringe mechanische Festigkeit, die ein Arbeiten unter Druck und damit die Erzielung höherer Durchsätze durch entsprechende Gelsäulen ausschließt. Häufig ist auch die geringe Hydrolysebeständigkeit der bisher angewandten Träger hinderlich. Ferner sind Fälle bekannt, bei denen die Reaktion des Substrats mit dem träger fixierten biologisch aktiven Stoff durch ungenügende Hydrophilie der Trägeroberfläche oder unspezifische Sorption an der Gelmatrix kompliziert bzw. erschwert wird. Geringvernetzte Polysaccharide oder Acryl amide können zudem in trockenem Zustand nicht in Form diskreter Teilchen erzeugt werden.

Zur Immobilisierung der biologisch aktiven Verbindungen wird oft ein Verfahren angewandt, bei dem eine höhermolekulare biologisch aktive Verbindung mechanisch in der dreidimensionalen Struktur eines geringvernetzten Gels eingeschlos sen wird. Die Diffusion des Substrats wird dann durch die Vernetzungsdichte der Gelmatrix bestimmt. Die mechanischen Eigenschaften dieser Materialien sind in der Regel nicht sehr zufriedenstellend; ferner wird auch die biologische Aktivität durch die Art der Gelmatrix und ihre Vernetzung stark beeinflußt.

Aus der GB-PS 12 18 620 sind trägerfixierte biologisch aktive Verbindungen bekannt, die durch kovalente Bindung von Proteinmaterialien, worunter Proteine als solche und Verbindungen mit Peptidstruktur verstanden werden, die min destens eine α- oder ε-Aminogruppe aufweisen, an ein mit Hexamethylendiamin vernetztes Ethylen- Maleinsäureanhydrid-Copolymer hergestellt sind.

Die Bindung der biologisch aktiven Verbindung erfolgt in diesem Fall durch Reaktion ihrer Amino gruppen mit Carbonsäureanhydridgruppen der Polymer matrix unter Ausbildung entsprechender Carbonsäure amidstrukturen. Die mechanische Festigkeit sowie insbesondere die biologische Aktivität, die für den praktischen Einsatz große Bedeutung besitzen, sind allerdings bei diesen herkömmlichen träger fixierten Verbindungen nicht zufriedenstellend.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, trägerfixierte biologisch aktive Verbin dungen und ihre Herstellung anzugeben, die auf einem geeigneteren Bindungsprinzip beruhen.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Die erfindungsgemäßen trägerfixierten biologisch aktiven Verbindungen sind unter löslichen Enzymen, Coenzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern, Anti genen, Hormonen, immunoaktiven Verbindungen und Antibiotika ausgewählt und chemisch an einen wasserunlöslichen Träger aus einem Copolymer auf der Basis von hydrophilen Monomeren und monomeren Divinyl- oder Polyvinylverbindungen in Form eines polymeren homogenen oder heterogenen makroporösen Gels gebunden; sie sind erhältlich durch

(a) Aktivierung der Oberfläche des Trägers mit Bromcyan, Säureanhydriden, Säure chloriden, Diisocyanaten oder Isothiocyanat und
(b) Umsetzung des so aktivierten Gels mit den ent sprechenden biologisch aktiven Verbindungen.

Das Verfahren zur Herstellung der trägerfixier ten biologisch aktiven Verbindungen gemäß der Er findung ist entsprechend durch die obigen Schritte (a) und (b) gekennzeichnet.

Als Träger werden erfindungsgemäß Copolymere von hydrophilen Monomeren wie Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Oligo- oder Polyglycol acrylaten, Oligo- oder Polyglycolmethacrylaten, Acrylamiden, Methacrylamiden, Aminoalkylacrylaten, Aminoalkylmethacrylaten, Acrylsäure oder Methacryl säure mit monomeren Divinyl- oder Polyvinylverbin dungen, wie Alkyldiacrylaten, Alkyldimethacrylaten, Oligo- oder Polyglycoldiacrylaten, Oligo- oder Polyglycoldimethacrylaten, Alkylenbisacrylamiden oder Divinylbenzol, verwendet. Nach der Aktivierung der Trägeroberfläche mit Bromcyan, Säureanhydriden, Säurechloriden, Diisocyanaten oder Isothiocyanaten, die gegenüber funktionellen Hydroxyl- oder Amino gruppen reaktiv sind, werden die so aktivierten Gele dann der Reaktion mit den löslichen biologisch aktiven Verbindungen unterworfen, wobei diese löslichen Verbindungen unter Erhaltung ihrer chemi schen und biologischen Reaktivität chemisch an den polymeren Träger gebunden werden. Die resultierenden trägerfixierten Verbindungen übertreffen in ihren Eigenschaften die bisher bekannten Präparate.

Die erfindungsgemäß erhältlichen trägerfixierten biologisch aktiven Verbindungen zeichnen sich durch hervorragende mechanische Festigkeit, hohe Kapazität, hohe biologische Aktivität und Aktivitätsbeständig keit sowie durch die Herstellungsmöglichkeit in trockenem Zustand in Form von kugelförmigen Teil chen der gewünschten Größe und Größenverteilung aus. Die - auch im gequollenen Zustand - günstige Festigkeit der Gelteilchen mit dem gebundenen biolo gisch aktiven Stoff erlaubt bei der Durchführung von Reaktion in Säulen höhere Durchflußgeschwindigkeiten der Substratlösung, da durch die Anwendung von Druck weder eine Kompression der Gelsäule noch eine Ver größerung des Druckverlusts eintreten.

Bei Einhaltung vergleichbarer Reaktionsbedin gungen sind die Menge und Aktivität der an das Gel gebundenen biologisch aktiven Stoffe höher als bei Anwendung der bisher bekannten Träger bzw. Verfahren. In trockenem Zustand weisen die träger fixierten biologisch aktiven Verbindungen gegenüber ihren löslichen Formen ferner eine größere Aktivi tätsbeständigkeit auf. Die hervorragende Hydrolyse beständigkeit des Trägers gestattet eine häufige Wiederverwendung bzw. eine Langzeitanwendung der trägerfixierten Verbindungen, ohne daß es hierbei zu Abbauerscheinungen oder Schädigungen durch Neben reaktionen mit dem polymeren Träger kommt. Die hydrophile Natur der Oberfläche erleichtert fer ner die Diffusion des Substrats zum gebundenen aktiven Molekül und gewährleistet die hohe biologische Aktivität des Materials.

Durch Anwendung mikroporöser Träger auf der Basis von Acrylsäure- oder Methacrylsäureestern kann bei geeigneter innerer Struktur des Trägers die Diffusion von Substratmolekülen bestimmter Größe gefördert oder unterdrückt werden, was eine empfindlichere Steuerung der sich an der Geloberfläche abspielenden biochemischen Reaktion erlaubt.

Bei der erfindungsgemäßen Trägerfixierung wird in der ersten Stufe (a) das hydrophile Gel, das eine geeignete Porengrößenverteilung und spezifische Oberfläche besitzt, mit einer wässerigen Bromcyan lösung oder einer Lösung eines Dicarbonsäureanhydrids bzw. -chlorids oder mit der Lösung eines Diisocyanats oder Isothiocyanats aktiviert. Die Suspension wird in einer wässerigen Pufferlösung verrührt; nach Ein stellung des pH-Werts mit Natriumhydroxid und/oder Natriumcarbonat bzw. -hydrogencarbonat wird in der zweiten Stufe (b) der aktivierte Träger bei niedri ger Temperatur mit der betreffenden löslichen bio logisch aktiven Verbindung umgesetzt. Nach beendeter Reaktion wird das Produkt mit Pufferlösungen von für die gebundene biologisch aktive Verbindung optimalem pH-Wert gewaschen.

Bei so hergestellten Präparaten wurde der Ge halt an gebundener biologisch aktiver Verbindung bestimmt. So wurden beispielsweise bei gebundenen proteolytischen Enzymen die Esterspaltungs-Akti vität mit einer Lösung von Acetyltyroseinethylester bzw. Benzoylargininethylester beim pH-Optimum (9,1) und die proteolytische Aktivität an Hämo globin bestimmt.

In gleicher Weise mit Chymotrypsin umge setzte Agarose weist einen erheblich niedrigeren Gehalt an gebundenem Enzym im Gel und eine etwa viermal niedrigere Esterspaltungs- und proteolytische Aktivität auf.

Analog wurden die Proteasen Trypsin, Papain, Bromelain, Ficin, die Protease aus Streptomyces griseus, Subtilopeptidase, Leucinaminopeptidase u. a. sowie weitere Enzyme, wie Glucoseoxidase, Phenoloxidase, Ribonuclease, Alkoholdehydrogena se, Peroxidase, Lipase, Urease, Cytochrom C und α-Amylase, trägerfixiert.

Weitere Beispiele für derartige trägerfixierte biologisch aktive Stoffe sind u. a. Insulin, Vaso pressin, Fötus-Protein, Immunglobulin des Fötus- Proteins, Streptomycin und Folsäure.

Das erfindungsgemäße Trägerfixierungsprinzip ist ferner auch anwendbar, wenn die biologisch aktive Verbindung, etwa aus sterischen Gründen oder dann, wenn sie keine Aminogruppe enthält, über eine bewegliche Kette, einen sog. Spacer, gebunden, also nicht dicht an der Oberfläche des Trägers vorliegen soll. In diesem Fall kann eine bifunktionelle Zwischenverbindung verwendet werden, deren Molekül eine Aminogruppe, die eine chemische Bindung mit dem Träger ermöglicht, sowie weitere funktionelle Gruppen enthält, die eine chemische Bindung mit der biologisch aktiven Ver bindung eingehen können.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Bei spielen näher erläutert. Die Mengenangaben in Prozent und Teilen sind massebezogen.

Beispiel 1 Herstellung von trägerfixiertem Chymotrypsin

25 Teile eines durch Polymerisation in Ge genwart eines aus Cyclohexanol und Dodecylalkohol (9 : 1) bestehenden inerten Lösungsmittelsystems er haltenen, mit 39% Ethylendimethacrylat ver netzten Polyhydroxyethylmethacrylat-Gels mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 3 · 10⁵ wurde über Nacht in destilliertem Waser quellen gelassen. Nach Absaugen der Flüssigkeit fielen 100 ml ge quollenes Gel an, das in 100 Teilen destillier tem Wasser verrührt wurde. Die mit einem Magnet rührer gerührte Suspension wurde mit 100 Teilen einer unmittelbar vor der Anwendung frisch berei teten Bromcyanlösung versetzt und dann mit 4 n NaOH auf pH 11 eingestellt, worauf die Suspension unter stetigem Rühren bei Raumtemperatur 12 min lang unter weiterer Zugabe von 4 n NaOH auf diesem pH-Wert ge halten wurde. Danach wurde die Suspension auf einem Glasfilter mit 2000 Teilen einer gekühlten 0,1 n Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 9) gewaschen. Dieser Waschschritt ist möglichst schnell durchzu führen.

Das abgesaugte Gel wurde mit 100 Teilen 0,1 n NaHCO₃-Lösung (pH 9) verrührt und dann sofort mit 10 g festem Chymotrypsin versetzt; die Suspension wurde 24 h mit einem Magnetrührer bei 4°C gerührt. Dann wurde das Gel abgesaugt, mit 4000 Teilen einer Lösung von 0,1 m Natriumborat und 1 n Natrium chlorid (pH 8,5), anschließend mit 3000 Teilen einer Lösung von 0,1 m Natriumacetat und 1 n Natrium chlorid (pH 4,1) und schließlich mit 3000 Teilen 0,01 m Natriumacetatlösung (pH 4,1) gewaschen.

Das so hergestellte Gel besaß einen Chymotrypsin gehalt von 17,9 mg/ml, eine Esterase-Aktivität von 1320 µmol/min · ml (wobei die Aktivität des gebundenen Chymotrypsins 55% der Aktivität des freien Chymotrypsins beträgt) und eine proteolytische Aktivität von 28 Einheiten/ml (wobei die Aktivität des gebundenen Chymotrypsins 44% der Aktivität des freien Chymotrypsins beträgt). Die Esterase- Aktivität wurde mit Acetyltyrosinethylester, die proteolytische Aktivität mit Hämoglobin be stimmt.

Beispiel 2 Herstellung von trägerfixiertem Trypsin

Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß 10 Teile gequollenes, mit Brom cyan aktiviertes Gel eingesetzt und in 10 Teilen 0,1 n NaHCO₃-Lösung (pH 9) verrührt wurden, worauf zu der so erhaltenen Suspension 2 Teile festes Pankreas-Trypsin hinzugeführt wurden. Die Esterase- Aktivität wurde mit Benzoylargininethylester- Lösung, die proteolytische Aktivität mit Hämo globin bestimmt.

Beispiel 3 Herstellung von trägerfixierter Glucoseoxidase

Als Träger wurde ein durch Polymerisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat in Gegenwart von 24% Ehtylendimethacrylat erzeugtes Polyhydroxyethyl methacrylat-Gel verwendet. Das Verhältnis der die Porosität des Gels bestimmenden inerten Lö sungsmittelkomponenten Cyclohexanol und Dodecyl alkohol betrug 7 : 3. Die Ausschlußgrenze des hydrohpilen Gels lag bei einer Molmasse von 10⁸. Die Herstellung des Präparats erfolgte nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren mit dem Un terschied, daß das Gel nach der Aktivierung in 10 Teilen 0,1 m Phosphatpuffer (pH 6) suspendiert und die Suspension mit 2 Teilen Glucoseoxidase ver setzt wurde. Nach Bindung des Enzyms wurde die Suspension mit einer Lösung von 0,1 m Natrium phosphat und 1 m NaCl (pH 6,0) und den weiteren Puffern wie in Beispiel 1 und 2 gewaschen. Die Bestimmung der Aktivität des trägerfixierten Enzyms erfolgte anhand der freigesetzten Sauer stoffmenge/min · ml.

Beispiel 4 Herstellung von trägerfixierter α-Amylase

Es wurde wie in Beispiel 2 verfahren mit dem Unterschied, daß das angewandte Gel 30% Ethylendi methacrylat als Vernetzungsmittel enthielt, und als inerte Phase bei der Copolymerisation ein Gemisch aus 82% Cyclohexanol und 18% Dodecylalkohol eingesetzt wurde. Die Ausschlußgrenze dieses Gels lag bei einer Molmasse von 7 · 10⁵.

Das gemäß Beispiel 2 aktivierte Gel wurde in 10 Teilen 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert, worauf die Suspension mit 2 Teilen fester α-Amylase versetzt wurde. Als erste Waschlösung wurde 0,1 m Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 1 m NaCl (pH 7) angewandt. Die weiteren Waschlösungen waren die gleichen wie in Beispiel 2. Die Aktivitätsbestim mung erfolgte anhand der aus einer Stärkelösung freigesetzten Menge an reduzierenden Zuckern/min · mg.

Beispiel 5 Herstellung einer trägerfixierten Protease

30 Teile eines durch Polymerisation von Diethylenglycolmonomethacrylat in Gegenwart von 40% Ethylendimethacrylat und einer inerten Phase aus 90% Cylclohexanol und 10% Dodecylalkohol hergestellten Gels wurden mit überschüssigem destilliertem Wasser (100 Teile) 20 h lang quellen gelassen. Das anfallende gequollene Gel (120 ml) wurde mit 100 Teilen destilliertem Wasser ver dünnt und dann nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aktiviert. Zu 15 Teilen aktiviertem Gel wurden anschließend 3 Teile Protease aus Streptomyces griseus hinzugefügt, worauf das Gemisch analog zu Beispiel 1 reagieren gelassen wurde. Die proteolytische Aktivität wurde an Hämoglobin bestimmt.

Beispiel 6 Herstellung von trägerfixiertem Bromelain

Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß als Träger ein aus Hydroxyethyl acrylat und Ethylendiacrylat hergestelltes Copolymer mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 5 · 10⁵ verwendet wurde, und 50 Teile der Suspen sion nach erfolgter Aktivierung mit 5 Teilen Bromelain versetzt wurden. Die proteolytische Akti vität wurde an Hämoglobin, die Esterase-Aktivität an Benzol-L-arginin-ehtylester bestimmt.

Beispiel 7 Herstellung von trägerfixierter Subtilopeptidase

20 Teile eines durch Copolymerisation von Di ehtylenglycolmonomethacrylat mit Tetraethylenglycol dimethacrylat hergestellten hydrophilen Gels mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 3 · 10⁵ wurden nach 24 h langem Quellen in überschüssigem destilliertem Wasser abgesaugt, wonach 80 Teile der gebildeten Suspension in 100 Teilen destil liertem Wasser verrührt wurden. Das Gel wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aktiviert. 12 Teile des aktivierten Gels wurden mit 2 Teilen Subtilopeptidase versetzt. Nach 24 h Reaktion bei 4°C und Waschen mit Pufferlösungen gemäß Beispiel 1 wurde die Esterase-Aktivität an Acetyltyrosinethylester bestimmt.

Beispiel 8 Herstellung von trägerfixierter Leucinamino peptidase

30 Teile eines durch Copolymerisation von 2- Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat hergestellten Gels mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 10⁶ wurden in überschüssigem destilliertem Wasser 12 h quellen gelassen. Die erhaltene Suspension wurde auf einer Fritte abge saugt, in 100 Teilen destilliertem Wasser verrührt und nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren aktiviert, wobei auf 30 Teile Gel 5 Teile Leucinaminopeptidase eingesetzt wurden. Die Akti vitätsbestimmung erfolgte anhand der Hydrolyse von L-Leucinamid, die durch Alkalititration er mittelt wurde.

Beispiel 9 Herstellung von trägerfixiertem Ficin

Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren, wobei je doch 10 Teile gequollenes Gel mit 2 Teilen Ficin versetzt wurden. Die Esterase-Aktivität wurde an hand der Hydrolyse von Benzol-L-argininethylester bestimmt.

Beispiel 10 Herstellung von trägerfixierter Lipase

20 Teile eines durch Copolymerisation von Diethylenglycolmonomethacrylat mit Ethylendimeth acrylat hergestellten Gels mit einer Ausschluß grenze bei einer Molmasse von 3 · 10⁵ wurden nach Quellung mit Wasser wie in Beispiel 1 aktiviert. 10 Tele des aktivierten Gels wurden dann mit 2 Teilen Pankreas-Lipase versetzt; im übrigen wurde wie in Beispiel 1 verfahren. Die Aktivität wurde anhand der Hydrolyse von Olivenöl bestimmt.

Beipsiel 11 Herstellung von trägerfixierter Alkohol dehydrogenase

25 Teile eines durch Copolymerisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat hergestellten Gels mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 10⁹ wurden nach Quellung in Wasser wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 20 Teile des aktivierten Gels wurden dann in gequollenem Zustand mit 5 Teilen Alkohol dehydrogenase 20 h lang reagieren gelassen. Die biochemische Aktivität des erhaltenen Präparats wurde mit NAD bestimmt.

Beispiel 12 Herstellung von trägerfixiertem Insulin

Es wurde wie in Beispiel 2 verfahren mit dem Unter schied, daß in die Suspension des aktivierten Gels anstelle von Trypsin 2 Teile kristallisiertes In sulin gegeben wurden. Die Aktivität wurde aus dem Desoxyribose-Gehalt nach Reaktion des gebundenen Insulins mit α -Aminobuttersäure in Gegenwart von Epithelzellen nach T. Oka, Y. J. Topper, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68 (1971) 2066, bestimmt.

Beispiel 13 Herstellung von trägerfixiertem Vasopressin

Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß als Träger ein mit Diethylenglycol dimethacrylat vernetztes Polydiethylenglycolmono methacrylat-Gel mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 10⁵ und als biologisch aktive Verbindung Vasopressin eingesetzt wurden. Die Menge des gebundenen Vasopressins wurde anhand des Amino säuregehalts bestimmt.

Beispiel 14 Herstellung von trägerfixiertem Fetalprotein

20 Teile des nach Beispiel 1 durch Copoly merisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylen dimethacrylat hergestellten und mit Bromcyan aktivier ten Gels wurden unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen mit 4 Teilen aus Labor-Ratten gewonnenem Fetalprotein reagieren gelassen. Die biologische Aktivität des gebundenen Proteins wurde immunchemisch mit dem entsprechenden Immunglobulin bestimmt.

Beispiel 15 Herstellung von trägerfixiertem Immunglobulin

Es wurde wie in Beispiel 14 verfahren mit dem Unterschied, daß ein durch Copolymerisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat hergestelltes Gel mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 10⁸ eingesetzt wurde. 15 Teile dieses Gels wurden in destilliertem Wasser gequol len und wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. Das aktivierte Gel wurde dann 24 h lang mit dem Immunglobulin des in Beispiel 14 eingesetzten Fetal proteins reagieren gelassen. Nach Waschen mit Puffern wurde die Aktivität des gebundenen Immunglobulins immunchemisch bestimmt.

Beispiel 16 Herstellung von trägerfixiertem Streptomycin

25 Teile eines durch Copolymerisation von 2-Hydroxy ethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat hergestellten Gels mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molmasse von 10⁵ wurden in gequollenem Zustand mit Bromcyan aktiviert. Das aktivierte Gel wurde dann wie in Beispiel 1 mit 8 Teilen Streptomycin reagieren gelassen. Die Menge des gebundenen Antibiotikums wurde anhand des Stickstoffgehalts bestimmt.

Beispiel 17 Herstellung von über eine Zwischenverbindung trägerfixierter Folsäure

20 Teile eines Gels von gleicher Ausschluß grenze und Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurden nach gleicher Aktivierung wie in Beispiel 1 mit 10 Teilen Hexamethylendiamin reagieren gelassen; das erhaltene Gel wurde dann bei 40°C mit 8 Teilen Folsäure umgesetzt. Die Bestimmung der Aktivität des resultierenden Präparats erfolgte mit der entsprechenden Reductase.

Beispiel 18 Herstellung von trägerfixiertem NAD

50 Teile eines durch Copolymerisation von Hydroxydecylmethacrylat in Gegenwart von 50% Butylen diacrylat und einer inerten Phase erzeugten Gels wurden in überschüssigem destilliertem Wasser ge quollen und wie in Beispiel 1 aktiviert. 10 Teile des aktivierten Gels wurden mit 1 Teil des Coenzyms Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) ver setzt, worauf das Gemisch wie in Beispiel 1 umge setzt wurde.

Beispiel 19 Herstellung von trägerfixiertem Chymotrypsin- Inhibitor

Ein durch Copolymerisation von 40% Ethylen dimethacrylat, 50% 2-Hydroxyethylmethacrylat und 10% Acrylnitril hergestelltes makroporöses Gel wurde wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 10 Teile des aktivierten Gels wurden dann mit 1 Teil aus Kartoffeln isoliertem Chymotrypsin- Inhibitor versetzt, worauf das Gemisch unter Rühren 12 h lang bei 4°C umgesetzt wurde.

Beispiel 20 Herstellung von trägerfixierter Folsäure

Ein durch Suspensionscopolymerisation von Poly glycolacrylat mit einer mittleren Molmasse von 400 (90%) mit Butylendiacrylat (10%) in Ge genwart von Dibutylether hergestelltes makroporöses Gel wurde mit Methylen-bis(phenylisocyanat) akti viert. 10 Teile des erhaltenen aktivierten Gels wurden in Dioxan mit 1 Teil Folsäure umgesetzt.

Beispiel 21 Herstellung von trägerfixiertem Chymotrypsin

10 Teile des makroporösen Gels von Beispiel 1 wurden mit einer Lösung von 25 Teilen Phosgen in 100 Teilen Benzol aktiviert. 5 Teile des aktivierten Gels wurden unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen mit 1 Teil Chymotrypsin umgesetzt.

Beispiel 22 Herstellung von über eine Zwischenverbindung träger fixierter Tryptase

Ein durch Copolymerisation von 40 Teilen Hydroxyethyldimethacrylat, 40 Teilen Ethylen dimethacrylat und 20 Teilen Methacrylnitril in Gegenwart einer aus Cyclohexanol und Dodecyl alkohol (9 : 1) bestehenden inerten Phase herge stelltes makroporöses Copolymer wurde durch Reaktion mit Thionylchlorid aktiviert. Das gebildete Halogen derivat wurde mit der gleichen Menge Phenylendiamin umgesetzt. Aus den aromatischen Amingruppen wurden durch Reaktion mit Thiophosgen Isothiocyanatgruppen hergestellt. 3 Teile des so aktivierten Gels wurden unter den in Beispiel 3 angeführten Bedingungen mit Pankreas-Trypsin umgesetzt.

Beispiel 23 Herstellung von trägerfixiertem Insulin-Antikörper

Ein durch Copolymerisation von Polyglycolmethacrylat mit einer mittleren Molmasse von 360 (90%) mit Ethylendiacrylat (10%) in Gegenwart von Toluol hergestelltes makroporöses Gel wurde wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 5 Teile des so aktivierten Gels wurden mit 1 Teil durch Affinitätschromato graphie gewonnenem Antikörper des Insulins 24 h lang bei 4°C umgesetzt.

Beispiel 24 Herstellung von trägerfixiertem Chymotrypsin

20 Teile eines durch Copolymerisation von N,N-Dimethylacrylamid (50%), Methylenbis(acrylamid) (10%) und 2-Hydroxyethylmethacrylat (40%) hergestellten Gels wurden wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 10 Teile des aktivierten Gels wurden unter den in Beispiel 1 angeführten Bedingungen mit Chymotrypsin umgesetzt.

Beispiel 25 Herstellung von trägerfixiertem Trypsin

10 Teile eines durch Copolymerisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat (60%), Acrylsäure (20%) und Ethylendiacrylat (20%) herge stellten makroporösen Gels wurden durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid (30%) in Gegenwart von 30 Teilen Pyridin in 60 Teilen Diethyl ether aktiviert. Das so aktivierte Gel wurde mit 3 Teilen Trypsin in einem Puffer (pH 7) umge setzt.

Beispiel 26 Herstellung von trägerfixiertem Trypsin

Es wurde wie in Beispiel 25 verfahren mit dem Unterschied, daß bei der Copolymerisation anstelle von Acrylsäure die gleiche Menge Methacryl säure verwendet wurde.

Beispiel 27 Herstellung von trägerfixiertem Chymotrypsin

Es wurde wie in Beispiel 24 verfahren mit dem Unterschied, daß bei der Copolymerisation anstelle von N,N-Dimethylacrylamid N-Ehtylmethacrylamid ver wendet wurde.

Beispiel 28 Herstellung von trägerfixiertem Chymotrypsin

Ein durch Copolymerisation von 39% Ethylen dimethacrylat, 20% Diethylaminoethylmethacrylat und 41% 2-Hydroxyethylmethacrylat hergestelltes makroporöses Gel wurde mit Bromcyan aktiviert und wie in Beispiel 1 mit Chymotrypsin umgesetzt.

Beispiel 29 Herstellung von trägerfixiertem Chymotrypsin

Es wurde wie in Beispiel 28 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle von Diethylaminoethyl methacrylat Diethylaminoethylacrylat verwendet wurde.

Beispiel 30 Herstellung von trägerfixierter α-Amylase

Es wurde wie in Beispiel 4 verfahren mit dem Unterschied, daß als Vernetzungsmittel anstelle von Ethylendimethacrylat Divinylbenzol verwendet wurde.

Beispiel 31 Herstellung von trägerfixierter Folsäure

Es wurde wie in Beispiel 20 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle von Butylendiacrylat ein durch Reaktion von Acrylsäurechlorid mit einem Glycol gemisch mit einer mittleren Molmasse von 360 gebilde tes Diacrylat verwendet wurde.

Beispiel 32 Herstellung von trägerfixiertem Trypsin

Es wurde wie in Beispiel 25 verfahren mit dem Unterschied, daß das Gel mit 30 Teilen Glutar säureanhydrid aktiviert wurde.

Claims

1. Trägerfixierte biologisch aktive Verbindungen,
die unter löslichen Enzymen, Coenzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern, Antigenen, Hormonen, immunoaktiven Verbin dungen und Antibiotika ausgewählt und an einen wasserun löslichen Träger aus einem Copolymer auf der Basis von hydrophilen Monomeren und monomeren Divinyl- oder Poly vinylverbindungen in Form eines polymeren homogenen oder heterogenen makroporösen Gels gebunden sind,
erhältlich durch

(a) Aktivierung der Oberfläche des Trägers mit Bromcyan, Säureanhydriden, Säurechloriden, Diisocyanaten oder Isothiocyanaten und
(b) Umsetzung des so aktivierten Gels mit den entspre chenden biologisch aktiven Verbindungen.

2. Verfahren zur Herstellung der trägerfixierten biolo gisch aktiven Verbindungen nach Anspruch 1 unter Verwen dung eines durch Copolymerisation von hydrophilen Mono meren mit monomeren Divinyl- oder Polyvinylverbindungen erzeugten polymeren homogenen oder heterogenen makro porösen Gels, gekennzeichnet durch