DE3613407A1 - Verfahren zur affinitaetschromatographischen trennung von peptiden (enzymen) aus waessrigen loesungen mit hilfe fester traeger und daran gebundener spezifischer liganden - Google Patents

Verfahren zur affinitaetschromatographischen trennung von peptiden (enzymen) aus waessrigen loesungen mit hilfe fester traeger und daran gebundener spezifischer liganden

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Description

Das Verfahren ist eine affinitäts-chromatographische Methode zur Abtrennung von Peptiden (Enzymen) aus wäßrigen Lösungen mit Hilfe fester Kunststoffe und daran gebundener Mono- bis Oligomerverbindungen. Diese haben teilweise Substrat- und/oder kompetitiven Inhibitorcharakter, oder es handelt sich um Substratanaloga und/oder Inhibitoren.
Das vorliegende Verfahren kann zur streng selektiven Reinigung von Enzymen und anderer Proteine bzw. zur Eleminierung von kontaminierenden unerwünschten Proteinen (Enzymen) eingesetzt werden.
Der Vorteil des Verfahrens beruht auf dem strengen Selektivitätsprinzip durch die Interaktion dieser Verbindungen mit den Aktiven Zentren der jeweiligen Enzyme. Diese enzymselektiven Verbindungen sind insofern neu, als daß sie Verbindungen einfachster Natur sind, die das Aktive Zentrum mit seinen gesamten Subsites entweder abdecken oder aber eine hohe Affinität haben und zur Substrat- und/oder kompetitiven Inhibitorklasse des jeweiligen Enzyms gehören oder einfache Substratanaloga und/ oder einfache Inhibitoren sind. Diese Substanzen haben die Eigenschaft, das Enzym selektiv zu binden, ohne selbst in irgendeiner Weise umgesetzt zu werden. Sie lassen also die Mög- zu, eine Vielzahl von Peptiden (Enzymproteinen) in hoher Ausbeute in einem Schritt effektiv von Begleitstoffen abzutrennen. Je nach Wahl der Bedingungen (Steilheit des Elutionssalzgradienten, Elution mit anderen Molekülen mit Affinität zum Enzym, Temperaturänderung während der Elution etc.) ist es sogar möglich, die jeweiligen Peptide in Unterfraktionen bzw. die Enzyme in Isoenzyme aufzutrennen.
Es werden durch diese affinitäts-chromatographische Methode aus einem Gemisch aller möglichen Substanzen, wie sie bei Anzuchten von Mikroorganismen zur Gewinnung extrazellulärer Peptide (Enzyme) bzw. bei Zellaufschlüssen zur Gewinnung intrazellulärer Peptide (Enzyme) anfallen, je nach Säulenmaterial nur die gewünschten Peptide gewonnen bzw. unerwünschte abgetrennt.
Für die großtechnische Reinigung von technisch relevanten oder analytisch relevanten Enzymen werden heutzutage Salzfällungen, Hitzeinaktivierungen unerwünschter Aktivitäten, Ionenaustauscher- und Molekülsiebchromatographie eingesetzt, deren Selektivität sehr eingeschränkt ist und deren Preise enorm hoch sind, wie auch die der bereits eingesetzten Affinitätsmedien.
Das affinitäts-chromatographische Trennprinzip ist bekannt. Die Schwierigkeiten liegen jedoch in der Wahl geeigneten Trägermaterials und in der Wahl der Liganden. Die in der Literatur:
(Biological aspects of reactions on solid supports, G. R. Stark, Acad. Press., New York 1971.
Methods in Enzymology, Band 34, S. 3ff, Acad. Press., 1974).
Methods in Enzymology, Band 104, S. 3ff, Acad. Press., 1984.)
und in den Patentschriften (DE 26 11 258 C2, 17 68 934, 15 17 753) vorgeschlagenen Ligandentypen sind von den in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen verschieden und für den Einsatz zur großtechnischen Trennung von Peptiden unbrauchbar, da sie zu teuer sind.
Das vorgeschlagene Trennprinzip ist von dem in der Patentschrift DE 26 11 258 C2 vorgeschlagenen insofern verschieden, als in dem genannten Patent Träger und Ligand zunächst einen wasserlöslichen Komplex bilden und dann dieser Komplex ausgefällt wird unter Bildung eines erneuten Komplexes und anschließend das Enzym abdissoziiert wird.
Im vorgeschlagenen Verfahren wird das Enzym mit an den Träger gekoppelten Liganden bei relativ niedriger Ionenstärke und/oder optimalem pH und/oder Temperatur zusammengebracht und bei hoher Ionenstärke und/oder nicht optimalem pH und/oder Temperatur abgelöst. Dabei kann ein Säulen- wie auch ein Batchverfahren angewandt werden, wobei das Säulenverfahren im allgemeinen höhere Kapazitäten besitzt.
Die nachfolgende Abtrennung des Enzyms kann mit Gradient oder stufig erfolgen; auch können zur Elution Stoffe verwendet werden, die ebenfalls eine hohe Affinität zum Enzym haben.
Die heute als Trennmatrix eingesetzten Ionentauscher, Molekülsiebe und Affinitätsmedien werden v. a. aus Cellulose, Agarose, Dextran und Polyacrylamid hergestellt.
Die speziellen trennspezifischen Gruppen werden meist nachträglich eingefügt oder unter gleichzeitiger Polymerisation eingeführt. Der Vorteil des bei dem zur Anmeldung stehenden Verfahrens der Pfropfung von Polymeren wie Polyethylen oder Polypropylen etc. bzw. der Einführung von epoxidtragenden Gruppen in bestimme Polymere liegt einmal in der wesentlich größeren chemischen Stabilität, der besseren mechanisch physikalischen Eigenschaften im Hinblick auf Salz- und pH-Verträglichkeit und der gegenüber herkömmlichen Verfahren wesentlich besseren Zugänglichkeit der funktionellen Gruppen, was eine erheblich größere Kapazität durch eine freiere Enzym-Substrat-Interaktion bewirkt. Darüber hinaus ist wegen des billigen Säulenrohstoffes, der billigen Modifikationstechnik und der billigen Liganden eine wesentliche Kostensenkung gegenüber herkömmlichen Verfahren zu erwarten.
Herstellung von Trägermaterial für die Kopplung von Biomolekülen A) Pfropfverfahren und Einführung von Oxirangruppen
Polymere in Form von Polyethylen, Polypropylen, Poylvinylchlorid, Polymethylmethacrylat oder irgendeines anderen synthetischen Produktes werden mit Vinylmonomeren gepfropft. Die Pfropfung wird vorzugsweise mittels Gamma-Strahlen oder anderer energiereicher Strahlen durchgeführt. Die Pfropfung kann entweder nach der Simultanmethode oder nach der Vorbestrahlungstechnik (Pre-irradiation) durchgeführt werden. Beim Simultanverfahren werden Basispolymer (Polyethylen, Polypropylen etc.) und das Vinylmonomer simultan bestrahlt; im Falle der Vorbestrahlungstechnik wird das Basispolymer zunächst separat der Strahlung ausgesetzt und erst anschließend mit der Monomerenlösung in Kontakt gebracht.
Beispiel 1
Als Monomere kommen in Frage: alle Oxiran-Ring tragenden Vinylmonomeren wie z. B. 2,3-Epoxypropylacrylat, 2,3-Epoxypropylmethacrylat.
Die Monomerenkonzentration im Pfropfansatz beträgt max. 50 Vol%; als Lösungsmittelzusatz kommen sämtliche, die Propfung unterstützenden Agenzien in Frage, z. B.: Methylenchlorid, Methanol, DMF, Dioxan, Wasser; ggfls. werden noch Schwermetallsalze wie Cu(NO3)2 in geringer Konzentration (ca. 0,02-0,005 Mol/l) zugesetzt, um eine eventuelle Homopolymerisation im Falle der Simultanbestrahlung zu unterdrücken.
Als Comonomere zur Erzielung einer hydrophilen Trägeroberfläche kommen sämtliche polaren Vinylmonomeren in Frage, z. B.: Hydroxyethylmethacrylat, Acrylamid, Vinylacetat, N-Vinylpyrrolidon, Acrylsäure, Methacrylsäure.
Durch die Co-Pfropfung werden zum einen Oxirangruppen direkt in das Basispolymer eingeführt, zum anderen wird das ursprünglich hydrophobe Basispolymer mit einer hydrophilen Oberflächenschicht versehen, die die Immobilisierungseigenschaften des Trägers erhöhen.
Durch die Pfropfung werden Polymere mit Epoxydgruppen direkt in das Basispolymer eingeführt.
Beispiel 2
Außer der direkten Einführung Oxirangruppen enthaltender Monomeren, können Epoxydgruppen über eine nachträgliche Behandlung der gepfropften Basispolymeren mit Hilfe von Epichlorhydrin eingeführt werden. Polymere der o. a. Art werden zunächst mit einem Hydroxylgruppen enthaltenden Monomeren gepfropft. z. B. Hydroxymethylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Vinylacetat (das nach üblichen Methoden zum Alkohol verseift wird).
In die Hydroxylgruppen enthaltenden Pfropfpolymeren werden anschließend mittels Epichlorhydrin in alkalischer Lösung Epoxydgruppen eingeführt.
In der Regel wird hierfür 3-4 N NaOH und eine 30-50%ige Epichlorhydrin- Lösung genommen.
Beispiel 3
Ein mit einem Acrylsäure oder irgendeinem anderen Carboxylgruppen enthaltenden Monomeren gepfropftes Basispolymer wird zunächst mit einem Überschuß eines löslichen Polymeren oder Oligomeren, das Hydroxylgruppen enthält, mit Hilfe üblicher Veresterungsmethoden verestert. Polymere und Oligomere dieser Art sind: Polyäthylenglykol, Polyvinylalkohol.
Nach erfolgter Veresterung werden die Hydroxylgruppen des Polymeren bzw. Oligomeren nach unter Beispiel 2 beschriebenen Verfahren mit Epichlorhydrin umgesetzt. Hierdurch werden in das Pfropfpolymer die entsprechenden Epoxydgruppen eingeführt.
Beispiel 4
Polymere wie z. B. Polyamide werden mit epoxidhaltigen Verbindungen verschiedener Art umgesetzt und so ein Polymer mit entsprechenden Oxirangruppen hergestellt.
Die Epoxy-aktivierten Träger können für die folgenden Anwendungen eingesetzt werden:
  • a) direkte Kupplung an Hydroxylgruppen von Zuckern und Kohlenwassertsoffen;
  • b) Kupplung an Liganden mit Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppen;
  • c) Kupplung an Zellen oder Mikroorganismen mit entsprechenden funktionellen Gruppen.
B) Kopplungsprozedur Beispiel
Zuckermoleküle werden in dest. Wasser oder einer Pufferlösung, die keine nukleophilen Komponenten enthält (Glycin, Amin etc.), gelöst. Der pH-Wert der Lösung bzw. des Puffers liegt vorzugsweise zwischen 8 und 13.
Bei Aminogruppen enthaltenden Verbindungen kann der pH des Puffers zwischen 0 und 12 liegen. Die Lösung wird dem aktiven Träger zugefügt und für 24 bis 40 Stunden beim Raumtemperatur bis 40°C geschüttelt. Die Effektivität der Kupplung ist vom pH und der Temperatur abhängig. Die gekoppelten Träger werden anschließend mehrfach mit Pufferlösung gewaschen (z. B. Bicarbonat pH 8,0, Acetatpuffer pH 4) und eventuell verbliebene Epoxydgruppen mit 1 M Äthanolaminlösung blockiert.
C) Trennung Beispiel 1
Trennung einer Maltase mittels trägergekoppelter Maltose
Eine bestimmte Menge Maltose, die der Kapazität der Oxirangruppen entspricht, wird nach Beispiel B (für Zuckermoleküle) an das Trägermaterial gekoppelt.
Das Material wird in üblicher Weise in Säulen gegeben. Der Durchfluß ist der Geometrie der Säule entsprechend und sollte im Bereich des 1.5-2fachen des Säulenbettvolumens/Std. betragen, um 100%ige Absorption zu erreichen. Das entsprechende Enzym (Maltase) wird dann in einem geeigneten Puffer der optimalen Enzymaktivität (hier Phosphatpuffer pH 6) auf die Säule aufgetragen. Die Pufferkonzentration beträgt 0,001 M-0,01 M. Danach wird mit einem Puffergradienten (0,001 M-0,01 M)-(0,2 M-1 M) eluiert.
Bei Batchansätzen wird Gel und Enzymsuspension (Phosphatpuffer pH 6 der oben genannten Ionenstärke) zusammen gegeben und 15-20 Min. unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wird filtriert, zentrifugiert oder Gel und Suspension durch Absitzenlasen des Gels voneinander getrennt. Das Gel wird mehrmals gewaschen und das Enzym durch Inkubation mit 1 M Phosphatpuffer vom Träger gelöst.
Beispiel 2
Trennung einer Laktase mittels trägergekoppelter Laktose
Eine bestimmte Menge Laktose, die der Kapazität der Oxirangruppe entspricht wird nach Beispiel B (für Zuckermoleküle) an das Trägermaterial gekoppelt.
Das Material wird in üblicher Weise in Säulen gegeben. Der Durchfluß ist der Geometrie der Säule entsprechend und sollte im Bereich des 1.5-2fachen des Säulenbettvolumens/Std. betragen. Das entsprechende Enzym (Laktase) wird dann in einem geeigneten Puffer (hier Phosphatpuffer pH 6,6) auf das Gel aufgetragen. Die Pufferkonzentration beträgt 0,001 M-0,01 M. Danach wird mit einem Puffergradienten (0,001 M-0,01 M)-1 M eluiert. Bei Batchansätzen wird Gel und Enzymsuspension (Phosphatpuffer pH 6 der oben genannten Ionenstärke) zusammen gegeben und 15- 20 Min. unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wird filtriert, zentrifugiert oder Gel und Suspension durch Absitzenlassen des Gels voneinander getrennt. Das Gel wird mehrmals gewaschen und das Enzym durch Inkubation mit 1 M Phosphatpuffer vom Träger gelöst.

Claims (24)

1. Verfahren zu affinitätschromatographischen Trennung von Peptiden (Enzymen) aus wässrigen Lösungen und Immobilisierung von Peptiden (Enzymen) mit Hilfe fester Kunststoffe und/oder Polysaccharide an die Epoxidgruppen gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß als Liganden in das feste Basispolymer Epoxydgruppen enthaltende Verbindungen eingeführt werden und erst daran Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren, die in Wechselwirkungen mit den Aktiven Zentren der jeweiligen Enzyme treten, zum selektiven Abtrennen des jeweiligen Enzyms kovalent gebunden werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als festes Basispolymer handelsüblicher Kunststoff von beliebiger Geometrie (bevorzugt Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polymethylmethacrylat und Polyamide) und von beliebiger äußerer Form verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung Epoxydgruppen enthaltender Polymere Oxiranring tragende Vinylmonomere auf das Basispolymer gepfropft werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxirangruppen enthaltenden Vinylmonomere mit einer hydrophilen Vinylmonomerkomponente (Comonomeres) co-gepfropft werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropfung mittels Gamma-Strahlen oder anderer energiereicher Strahlen nach der Simultanmethode oder nach der Vorbestrahlungsmethode das Basispolymer zunächst der Strahlung ausgesetzt und dann erst anschlißend mit der Monomerlösung in Kontakt gebracht wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung Epoxydgruppen enthaltender Polymere zuerst ein Hydroxylgruppen enthaltendes Vinylmonomer auf das Basispolymer gepfropft wird und erst dann mit Hilfe von Epichlorhydrin in alkalischer Lösung Epoxydgruppen in das gepfropfte Basispolymer eingeführt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung Epoxydgruppen enthaltender Polymere ein mit einem Carboxylgruppen enthaltenden Vinylmonomer gepfropftes Basispolymer zunächst mit einem Überschuß an löslichem Polymer oder Oligomer, das Hydroxylgruppen enthält, verestert wird und gemäß Anspruch 6 mit Epichlorhydrin die Epoxydgruppen eingeführt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung Epoxdygruppen enthaltender Polymere diese Polymere bevorzugt Polyamide, mit Epoxydgruppen enthaltenden Verbindungen gekoppelt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von α-, β- und Glucoamylase alle bekannten Mono- und Dimerzucker, Maltotriose und alle bekannten Triosen, Isomaltose und Oligomere bis zum Polymergrad 8 und die Oligomere der Maltosereihe bis Polymergrad 8 sind.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Glukoseisomerase Fruktose, Xylose, Xylit und alle anderen bekannten monomeren, dimeren und trimeren Zucker sind.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von sauren, neutralen und alkalischen Proteinasen und allen möglichen Peptidasen alle möglichen Mono- bis Oligomer-Aminosäurekombinationen und deren Derivate und Mischverbindungen bzw. spezifische Inhibitoren sind.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Pektinasen und Pektinesterasen Monogalakturonsäure bis alle Pektinsäureoligomere bis zum Polymergrad 8, ebenso veresterte Mono- bis Oligopektinsäure bis zum Polymergrad 8, ebenso Alginsäure (verestert/unverestert) von Mono- bis Oligomer (Oligomergrad 8), ebenso alle diese Verbindungen mit ungesättigtem Charakter sind.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Hemicellulasen (Galactanasen, Xylanasen, Arabinasen, Mannanasen) alle entsprechenden Monomere wie Arabinose, Xylose, Galaktose und Mannose und alle einheitlichen Oligomere bis zum Polymergrad 8 und alle Mischoligomere bis zum gleichen Oligomergrad (α oder β gebunden) sind.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Cellulasen alle möglichen Zuckermonomere, Di- und Trimere und in der Glukosereihe die Oligomere (α oder β gebunden) bis zum Oligomergrad 8 sind.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Dextranasen das Monomer Glukose und alle Oligomere der Maltosereihe bzw. der Isomaltosereihe bis zum Oligomergrad 8 sind.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Laktase die Laktose selbst, ebenso Glukose und Galaktose und alle weiteren bekannten Mono- und Dizucker ebenso Trizucker und alle anderen α- und β-Pyranosidverbindungen sind.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Invertase Saccharose, Glukose und Fruktose bzw. alle mono-, di- und trimeren Zuckerverbindungen sind.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Ligninasen alle Stoffe, die eine Affinität zum Aktiven Zentrum dieses Enzymtyps haben, z. B. Phenolverbindungen etc. sind.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiveen Abtrennen von Dehydrogenasen alle Coenzyme wie NAD, NADP, FAD etc. und andere Verbindungen wie AMP, ATP, Oxamat und die jeweiligen Enzymsubstrate selbst bzw. Substratanaloga sind.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von DNA-spaltenden Enzymen alle Nukleotide oder Oligonukleotide bzw. Analoga, Nukleotid-Di- und Triphosphate sind.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Lipasen alle Stoffe, die eine Affinität zum Aktiven Zentrum dieses Enzymtyps haben, z. B. Tributyrin sind.
22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Aminosäuren synthetisierenden Enzymen α-Ketosäuren, Glutamat, Coenzyme wie NAD etc., Nukleotide wie z. B. ATP, GTP sind.
23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von β-Glucanasen Glukose, β 1-3, β 1-6, β 1 4 gebundene Oligomere der Glukose bis zum Polymergrad 8 sind.
24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono- bis Oligomerverbindungen mit teilweisem Substrat- und/ oder kompetitivem Inhibitorcharakter oder Substratanaloga und/oder Inhibitoren zum selektiven Abtrennen von Glukoseoxidase Gluconsäure, alle Monomerzucker und Derivate und alle weiteren Stoffe, die Affinität zum Aktiven Zentrum dieses Enzymtyps haben, sind.
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