DE2639129C3 - Verfahren zur Abtrennung von Enzymen - Google Patents
Verfahren zur Abtrennung von EnzymenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Enzymen von Zelltrümmern oder Zellen, die diese
Enzyme besitzen.
Die Fest-Flüssig-Trennung zur Abtrennung von Zelltrümmern oder Zellen von Enzymlösungen ist noch
immer ein technisches Problem, insbesondere wenn große Volumina gehandhabt werden müssen. Konventionelle Methoden für derartige Trennungen sind das
Zentrifugieren und Filtrieren. Beide Methoden bieten Schwierigkeiten, die sich aus der Viskosität der
anfallenden Suspensionen, aus der kolloidalen Natur der Komponenten und aus häufig geringen Dichteunterschieden zwischen suspendiertem Feststoff und Flüssigkeit ergeben und zu niedrigen Durchflußraten führen
(vgl.Naeher&ThuminSpencer,Industrial Aspects
of Biochemistry, 1974).
Beispielsweise wird bei der Abtrennung von PuIIuIanase von Klebsiella pneumoniae in einem ersten Schritt
das Enzym von intakten Zellen mit Detergentien abgelöst. Dieser Schritt ist ohne Schwierigkeiten in
beliebigem Maßstab durchführbar. Bei Versuchen zur Abtrennung der Zellen ergab sich jedoch, daß dafür
relativ hohe g-Zahlen erforderlich sind, die im technischen Maßstab nicht realisiert werden können.
Eine Abtrennung durch Filtration ist wegen der anwesenden Detergentien gleichfalls nur sehr schwierig
durchzuführen. (Zum Stand der Technik vgl. DE-AS 45 342).
ist es bekannt ein Enzym {Phospholtpase A I) aus
Escherichia coli unter Anwendung einer Phasenverteilungs-Methode
zu gewinnen. Man geht dabei so vor, daß
man die Zelten homogenisiert die Zellflüssigkeit durch Zentrifugieren abtrennt und danach das Enzym aus der
Zellmembran löst Zur Phasenverteilung werden Mehrphasensysteme mit einem Gehalt an Polypropylenglykol,
Polyäthylenglykol, Trimethylaminopolyäthylenglykol, Polyäthylenglykolsulfonat Ficoll und Dextran
verwendet Abgesehen davon, daß diese Druckschrift kaum Hinweise für die Übertragbarkeit der vorgeschlagenen
Lehre auf die Gewinnung anderer Enzyme gibt läßt sich das Abzentrifugieren der Zellflüssigkeit in
technischem Maßstab nicht durchführen. Das gilt auch für die aus Eur. J. Biochem, 1974, Band 46, Seiten 75 bis
81, und Eur. J. Biochem, 1974, Band 48, Seiten 63 bis 63,
bekannten Phasenverteilungs-Methoden, bei denen entweder von gereinigten Enzymen oder von Hefelysat
ausgegangen wird, das durch Zentrifugieren einer homogenisierten Hefesuspension erhalten wurde.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus Zellen in technische.η
Maßstab vorzusehen, bei dem man die Enzyme ohne vorhergehendes Abtrennen von Zellflüssigkeit Zelltrümmern
oder Zellen aus aufgeschlossenen oder ganzen Zellen mit Hilfe einer Verteilung in einem
Mehrphasensystem gewinnen kann. Bei diesem Verfahren soll von beliebigen Zellen ausgegangen werden
können, um beliebige Enzyme abzutrennen, beispielsweise Pullulanase (Amylopectin-6-glucanohydrolase)
und Phosphorylase aus Klebsiella-Arten, Maltese
(tx-Glucosidase) z. B. aus Bierhefezellen und AminoacyltRNA-Synthetasen
z. B. aus Escherichia coli.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß sich befriedigende Abtrennungen in wäßrigen Mehrphasensystemen
auch dann erhalten lassen, wenn man die Zellflüssigkeit nicht zuvor von den Zelltrümmern
bzw. Zellen abtrennt
Gemäß der Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Abtrennung von Enzymen von Zelltrümmern
oder Zellen gelöst, die diese Enzyme besitzen, wobei man die Zelltrümmer bzw. Zellen so behandelt,
daß die Enzyme in Lösung gehen; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet daß man das so erhaltene
System mit den Zelltrümmern bzw. Zellen und der Zellflüssigkeit zwischen verschieden η Phasen eines
wäßrigen Mehrphasensystems
(a) mit einem Gehalt an mindestens einem Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierten
Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und Polysaccharide gebildeten Gruppe und
mit mindestens einem anorganischen Salz; oder
(b) mit einem Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte
Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und Polysaccharide gebildeten Gruppe
verteilt
die Phasen voneinander trennt, die Enzyme von den Hochmolekularen in der Enzymphase abtrennt und
gegebenenfalls isoliert
Man kann bei der Veffährünsväriänte (a) beispielsweise
ein Mehrphasensystem mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol verwenden. Bei einem Mehrphasensystem
mit einem Gehalt an einem gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther kann ihr
durchschnittliches Molekulargewicht kleiner als 40 000 und insbesondere kleiner nh 10 000 sein.
Man kann beispielsweise ein Mehrphasensystem mit
einem Gehalt an einem Sulfat z. B. einem Alkalisulfat
und/oder einem Phosphat verwenden, z, B. einem Alkaliphosphat, wie Kaliumphosphat
So kann beispielsweise ein Mehrphasensystem ein Hochmolekulares, wie Polyäthylenglykol, und ein Salz,
wie Kaliumphosphat enthalten. Ein derartiges Mehrphasensystem ist beispielsweise zur Abtrennung von
Enzymen, wie Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, von Escherichia coli geeignet Bei einem derartigen System
kann man mit solchen Mengen an Wasser, Hochmolekularen und Salz arbeiten, bei denen diese Komponenten
allein nur eine Phase bilden würden.
Bei der Verfahrensweise (b) kann man aus wirtschaftlichen Gründen ein Mehrphasensystem mit einem
Gehalt an Polyäthylenglykol und Dextran verwenden.
Als Hochmolekulare kann man einen gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther mit einem
deutlich kleineren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des Enzyms verwenden, vorzugsweise mit einem
durchschnittlichen Molekulargewicht kleiner als 40 000, insbesondere kleiner als 10 000, besonders bevorzugt
kleiner als 6000, z.B. im Bereich von 5000 bis 1550, beispielsweise von etwa 4000, und ein gegebenenfalls
substituiertes Polysaccharid mit einem deutlich größeren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des
Enzyms verwenden. (Die Pullulanase besitzt z. B. ein Molekulargewicht von etwa 145 000.)
Dadurch kann man erreichen, daß die Enzyme in die Polyalkohol- bzw. Polyätherphase gehen und daß sich
diese Hochmolekularen beispielsweise durch Ultrafiltration leicht von den Enzymen abtrennen lassen.
In dem Mehrphasensystem kann der Gesamtgehalt an Polyäthylenglykol 1 und mehr und vorzugsweise 4 bis
9 Gew.-°/o und der Gesamtgehalt an Dextran 0,1 bis 15 und vorzugsweise 0,1 bis 7 Gcw.-% betragen.
Durch die Zugabe von Phosphationen, wie Orthophosphat- (z. B. in Form der verschiedenen Kaliumphosphate),
Pyrophosphat-, Polyphosphat- und/oder Metaphosphationen läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren
in Abhängigkeit vom pH-Wert noch verbessern.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann von beliebigen Zellen ausgegangen werden, die das gewünschte
Enzym enthalten. Für die Abtrennung von Pullulanase und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen kann mar. vorteilhaft
ein Mehrphasensystem mit einem Gehalt an einem Hochmolekularen und einem anorganischen Salz, für
die Abtrennung von Pullulanase, Phosphorylase und Maltase vorteilhaft ein Mehrphasensystem mit einem
Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen verwertden.
Die Enzyme können beispielsweise durch Aufschließen von Zellen und/oder Behandeln mit Detergentien
solubilisiert werden. Als Detergentien eignen sich z. B. Triton, Cholat, Desoxycholat und Dodecylsulfat
Als im Mehrphasensystem unlösliche Anteile werden beispielsweise Zelltrümmer oder nicht aufgeschlossene
Zellen angesehen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren können Salze zugegen sein, die 7. B. auf Detergentien oder Puffer
zurückgehen.
Es können alle Hochmolekularen verwendet werden, die bisher in Mehrphasensystemen zur Verteilung von
Mikroorganismen oder hochmolekularen biochemischen Verbindungen eingesetzt wurden. Dazu sei u. a.
auf Albertsson, Partition of Cell Particles and
Macromolecules, NY 1971, (und Folgeauflagen) hingewiesen.
Beispiele für Hochmolekulare, die sich beim erfin-
dungsgemäßen Verfahren verwenden lassen, sind
Polypropylenglykol, Polyäthylenglykol,
Methoxypolyäthylenglykol,
Trimethylaminopolyäthylenglykol,
Polyäthylenglykolsulfonat, Polyvinylalkohol,
Polyvinylpyrrolidon, Methylzellulose,
Äthylhydroxyäthylzellulose, DEAE-Zellulose,
Alkylicarboxymethylzellulose, Dextran,
Hydroxypropyldextran, DEAE-Dextran,
Dextransulfat, Alkalicarboxymethyldextran und
Rohrzuckerpolymeres (W ca. 400 000).
Man kann ein Mehrphasensystem mit einem Verhältnis von Gesamtvolumen/Zellmasse ä2 und vorzugsweise
> 5 verwenden.
Vorzugsweise arbeitet man bei einem pH-Wert von 6 bis 9 und insbesondere 7 bis 8.
Die Phasen lassen sich großtechnisch z. B. mit Separatoren trennen, beispielsweise mit Tellerseparatoren oder Dekantern.
Durch die Erfindung wird gezeigt, daß sich die Phasen auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von Zelltrümmern
oder Zellen unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Separatoren trennen lassen. Damit steht
eine hochentwickelte Separator-Technologie für solche Enzymtrennungen zur Verfugung, die sehr hohe
Durchsatzleistungen ermöglicht und damit Aktivitätsverluste von Enzymen durch lange Bearbeitungszeiten
vermeidet.
Ein weiterer Vorteil der vorgeschlagenen Flüssig-Flüssig-Trennung ist außerdem darin zu sehen, daß
durch die Verteilung zwischen mehreren Phasen nicht nur die unlöslichen Bestandteile von der gewünschten
Enzymlösung getrennt werden, sondern eine zusätzliche Reinigung aufgrund der unterschiedlichen K-Werte der
Proteine erzielt werden kann.
Die das erfindungsgemäße Mehrphasensystem aufbauenden Hochmolekularen und durch die Zellen
miteingebrachten Proteine können durch Anwendung von Methoden abgetrennt werden, die in der Technik
üblich sind. Als Beispiele seien die Fällung der Enzyme r\A**w DUitrAnifjsctoilttrKT | IWfofiltf-otii-tn ΠιλΚιρα Helnar.
. ..~ — o, .
, ., , 1
meation, Adsorbentien, Ionenaustauscher oder Elektrophorese genannt.
Man kann das erfindungsgemäße Verfahren bei Raumtemperatur durchführen, insbesondere dann,
wenn die Enzyme von den verwendeten Hochmolekularen stabilisiert werden.
Zum besseren Verständnis dieser Verhältnisse soll im folgenden auf einige der Fig. 1 bis 16 näher
eingegangen we/den. Es zeigt
F i g. 1 ein Phasendiagramm für ein System aus Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 6000),
Dextran (mittleres Molekulargewicht 500 000) und Wasser;
F i g. 2 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase vom mittleren Molekulargewicht des
Polyäthylenglykols in einem wäßrigen PolyäthylenglykoI/Dex tran-Sys tem;
F i g. 3 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase vom pH-Wert und Pufferion in einem
wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;
F i g. 4 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Phosphatkonzentration in
einem wäßrigen Polyäthylengh/koI/Dextran-System;
F i g. 5 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Natriumcholat-Konzentration
in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;
K für Pullulanase von der Natriumdesoxycholat-Konzentration in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;
F i g. 7 den Grad der Abtrennung von Pullulanase von Klebsiella-Zellen in der oberen Phase in Abhängigkeit
von der Natriumcholat-Konzentration in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;
F i g. 8 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase vom Gehalt an DEAE-Dextran in der
unteren Phase eines wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systems;
F i g. 9 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten
K für Maltase von der Phosphatkonzentration in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;
Fig. 10 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase von der Kaliumchlorid-Konzentration
in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;
F i g. 11 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase von der Natriiimsiilfai-Konzentration
in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;
Fig. 12 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase vom pH-Wert in wäßrigen
Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;
Fig. 13 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase von der Konzentration und vom
mittleren Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglyicols in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;
Fig. 14 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten Al für Maltase von der Konzentration des Dextrans
und vom mittleren Molekulargewicht des Polyäthylenglykols in wäßrigen Polyäthylengiykoi/Dextran-Systemen;
Fig. 15 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase vom Anteil der Zellmasse am
Gesamtsystem in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/ Dextran-System und
F i g. 16 die Abhängigkeit der Aktivitätsausbeute vom
Anteil der Zellmasse am Gesamtsystem in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;
c;» 17 u:-
fizienten K für Isoleucyl-tRNA-Synthetase von verschiedenen Parametern in einem Zweiphasensystem mit
einem Gehalt an Polyäthylenglykol und Dextran.
4-, Fig. 1 zeigt also ein Phasendiagramm für wäßrige
Systeme mit einem Gehalt an Dextran (mittleres Molekulargewicht 500 000) und Polyäthylenglyko!
(mittleres Molekulargewicht 6000). Unterhalb der ausgezogenen Kurve tritt keine Phasentrennung auf, so
-,o daß in diesem Bereich ein homogenes System vorliegt.
Oberhalb der ausgezogenen Kurve tritt jedoch eine Phasentrennung auf. Der Punkt A repräsentiert
beispielsweise ein System mit 6 Gew.-% Dextran und 5Gew.-% PolyäthylenglykoL Ein derartiges System
bildet 2 Phasen aus, wobei der Punkt B der
Zusammensetzung der Oberphase und der Punkt Cder Zusammensetzung der Unterphase entspricht Jeder
Punkt, der auf der die Punkte B, A und C verbindenden
Geraden liegt und die Gesamtzusammensetzung eines
bo bestimmten Systems widerspiegelt, gilt für ein 2-Phasensystem gleicher Zusammensetzung der beiden
Phasen, aber unterschiedlicher Volumina der Phasen. Das Verhältnis des Abschnitts B-A zum Abschnitt A-C
der durch die Punkte β und Cbegrenzten und durch den
b5 Punkt A laufenden Strecke entspricht dem Gewichtsverhältnis Unterphase/Oberphase. Da die Dichte der
Phasen etwa 1 g/ml beträgt, spiegelt das Verhältnis der
Abschnitte B-A und A-C etwa das Verhältnis der
Volumina der beiden Phasen wider (zur Diskussion eines derartigen Phasendiagramms vergleiche auch
Albertsson, Methods Microbiol. 5B, 385 bis 423 [1971]).
Auch für diese wäßrigen Zweiphasensysteme gilt der Nernstsche Satz:
wobei Co und C„ die Konzentration eines über die
beiden Phasen verteilten Stoffs in der Oberphase bzw. in der Unterphase bedeuten. Die Verteilung kann auch
allgemein mit der Bronsted-Gleichung beschrieben werden:
lnK=lambdaM/)t7;
wobei M das Molekulargewicht und T die absolute Temperatur bedeuten und lambda ein Faktor ist, der
VOn uCi
ailuCrCn
Man ersieht aus der Gleichung, daß kleinste Änderungen von lambda bei großem Molekulargewicht drastische
absolute Veränderungen des Verteilungskoeffizienten zur Folge haben.
Wenn es dementsprechend auch vor der vorliegenden Erfindung theoretisch denkbar war, Enzyme in einem
Mehrphasensystem einseitig zu verteilen, so mußte noch die zusätzliche Aufgabe gelöst werden, auch Zelltrümmer
oder Zellen (von denen die Enzyme getrennt werden sollen) einseitig, und zwar in eine andere Phase
zu verteilen. Diese Aufgabe wurde erst durch die vorlegende Erfindung gelöst.
Nachstehend soll das Verfahren gemäß der Erfindung anhand des als Beispiel gewählten Polyäthylenglykol/
Dextran-Systems für Pullulanase und Maltase als Beispiele für Enzyme noch näher erläutert werden. Für
dieses System wurde festgestellt, daß die Zellen überraschenderweise vollständig in die dextranreiche
untere Phase gehen. Für die Enzyme lassen sich beispielsweise Verteilungskoeffizienten von 03 ermitteln.
Das bedeutet, daß sich die Konzentration eines Enzyms in der Oberphase zu seiner Konzentration in
der Unterphase wie 03 :1 verhält. Ein System mit einem
K-Wert von 03 ist also durchaus für eine Abtrennung
der Enzyme über die Oberphase geeignet, da die Zellen vollständig in der Unterphase vorliegen. Allerdings muß
mit einem nicht optimalen Volumenverhältnis der beiden Phasen gearbeitet werden, um eine befriedigende
Trennung zu erreichen; das ergibt sich aus der folgenden Definition des Trenngrades G-.
wobei Vo und Vtt das Volumen der Oberphase bzw. der
Unterphase bedeuten. Aus der vorstehenden Gleichung für den Trenngrad ergibt sich bei einem #-Wert von 03,
daß das Volumen der Oberphase etwa dreimal so groß wie das der Unterphase sein muß, um 50% eines
verteilten Enzyms in der Oberphase anzureichern.
In Hinblick auf den Trenngrad ist es also vorteilhaft,
mit einem Mehrphasensystem mit einem Gesamtgehalt an Polyäthylenglykol von mindestens 1 und vorzugsweise
4 bis 8 Gew.-% und mit einem Gesamtgehalt an Dextran von 0,1 bis 15 Gew.-% und vorzugsweise 0,1 bis
7 Gew.-% zu arbeiten. Hinzu kommt, daß bei gleichen Komponenten des Systems der Verteilungskoeffizient
der Enzyme günstiger werden kann, wenn die Poiyäthyiengiykoi-Konzentration fällt (vgl F i g. 13).
Da es erwünscht ist, bei noch höheren K-Werten als
03 zu arbeiten, sollen im folgenden noch weitere Parameter untersucht werden, mit denen der Verteilungskoeffizient
der Enzyme zu höheren Werten verschoben werden kann. So kann man den Fi g. 2 und
13 entnehmen, daß bei Verwendung von Polyäthylenglykol mit kleineren Kettenlängen der Verteilungskoef-
•i fizient steil ansteigt und Werte von ca. 1 erreicht werden
können. (Dadurch wird unter einem anderen Gesichtspunkt hervorgehoben, daß es erfindungsgemäß vorteilhaft
ist, Polyalkohole und Polyäther mit einem deutlich kleineren durchschnittlichen Molekulargewicht als das
in der Pullulanase zu verwenden, vorzugsweise mit einem
durchschnittlichen Molekulargewicht kleiner als 40 0000, insbesondere kleiner als 10 000, besonders
bevorzugt kleiner als 6000, z. B. im Bereich von 5000 bis 1550, beispielsweise von etwa 4000).
Ii Durch die Zugabe von Phosphationen, wie Orthophosphat-,
Pyrophosphat-, Polyphosphat- und/oder Metaphosphationen, insbesondere Orthophosphatio-
votn pH-Wert in überraschender Weise erhöhen (F i g. 3 .'o bis 4 und 9 bis 12).
Pullulanase
Wenn man bei diesem Enzym die Verteilung in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System bei einem
2-, Verteilungskoeffizienten von 0,3, einer 100-mmolaren
Natriumphosphat-Konzentration und einem Volumenverhältnis der Oberphase zur Unterphase von 10:1
durchführt, so ergibt sich für einen einzigen Verteilungsschritt folgende Ausbeute:
)(1 Ausbeute (%) = 100/( 1 + VJ V0 K)= 97.
Zweckmäßigerweise arbeitet man bei einer mehr als 0,001, vorzugsweise mehr als 0,005, insbesondere mehr
als 0,02 m Phosphationen-Konzentration und bei einem 1-5 pH-Wert von 6 bis 9 und insbesondere 7 bis 8.
Daß sich das erfindungsgemäße Verfahren in besonders vorteilhafter Weise in Gegenwart von
Phosphationen und in der Umgebung des Neutralpunktes durchführen läßt, ist aus folgenden Gründen
überraschend.
1. Wenn man den pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 variiert, ohne Phosphationen zuzugeben, so läßt
sich der Verteilungskoeffizient nicht wesentlich beeinflussen. Ferner führt eine Erhöhung der
j Ionenstärke beispielsweise mit Natriumchlorid zur Herabsetzung des Verteilungskoeffizienten, so daß
bei hoher Natriumchlorid-Konzentration die dextranhaitige Unterphase bevorzugt ist (vgi. auch
F ig. 10).
2. Pullulanase zeigt eine maximale Aktivität beim pH-Wert 5.
Da sich das beanspruchte Verfahren jedoch bei höheren pH-Werten ohne Beeinträchtigung d«r Pullulanase-Aktivität
durchführen läßt, wird angenommen, daß
die Hochmolekularen das Enzym stabilisieren. Diese Überlegungen gelten sinngemäß auch für andere
Enzyme.
Das Phasendiagramm und der Verteilungskoeffizient hängen außerdem von der Temperatur ab. Da
Pullulanase von den Hochmolekularen, z. B. Polyäthylenglykol
und Dextran, stabilisiert werden kann, kann man ohne Aktivitätsverluste bei Raumtemperatur
arbeiten. Auch diese Feststellungen gelten sinngemäß für andere Enzyme.
Puilulanase spaltet Glukose-«-1-6-Bindungen und
wird zum Entzweigen und vollständigen Abbau von Stärken und Glycogenen zusammen mit anderen
Enzymen eingesetzt, beispielsweise in Brauereien, bei
der Brotfabrikation und in der Analytik. Reine Pulluilanase kann zur Linearisierung von Stärke und zur
Gewinnung linearer Oligo- oder Polyglycane-«-l-4 führen.
Die für Pullulanase folgenden Beispiele erläutern auch den Fall, daß man bereits mit einem einzigen
Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierten Polyalkohole, Polyäther, Polyester und Polysaccharide
gebildete Gruppe und einem anorganischen Salz ein wäßriges Mehrphasensystem aufbauen kann,
wobei man beispielsweise in Gegenwart von Polyäthylenglykol und Ammoniumsulfat und gegebenenfalls
Phosphat arbeitet.
Maltase
Die Verhältnisse bei Maltase entsprechen im wesentlichen denen der Pullulanase, wobei die Effekte
jedoch etwas weniger ausgeprägt sind. Für die Ausführungsform des ertindungsgemäUen Verfahrens
mit mindestens zwei Hochmolekularen gilt: Wenn man in Gegenwart von Phosphationen arbeitet, so kann man
eine Phosphationenkonzentration von mehr als 0,1, vorzugsweise mehr als 0,3 und insbesondere mehr als
0,5 m anwenden.
Aminoacyl-tRNA-Synthetasen
Die für Aminoacyl-tRNA-Synthetasen folgenden Beispiele erläutern weiter den Fall, daß man bereits mit
einem einzigen Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierten Polyalkohole, Polyäther,
Polyester und Polysaccharide gebildeten Gruppe und Zellen bzw. Zelltrümmern als weiterem »Hochmolekularen«
ein wäßriges Mehrphasensystem aufbauen kann, wobei man beispielsweise in Gegenwart von Polyäthylengüykol
und vorzugsweise in Gegenwart von Kaliumphosphat arbeitet.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
M bedeutet das mittlere Molekulargevächt.
10
I. Allgemeines
Versuch 1 (F ig. 1)
Versuch 1 (F ig. 1)
Dieses Beispiel für ein Phasendiagramm für wäßrige Systeme mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M
6000) und Dextran (M 500 000) beruht auf Angaben von Albertsson.
II. Pullulanase
Versuch 2(Fig.2)
Versuch 2(Fig.2)
Ls wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten
K von Pullulanase vorn mittleren Polyäthylenglykol-Molekulargewicht in einem wäßrigen System mit einem
Gehalt an Polyäthylenglykol, Dextran (M 500 000) unci Enzym untersucht. Das Verhältnis; von Polyäthylenglykol
zu Dextran betrug 12:1 auf Gewichtsbasis. Die erhaltenen Werte sind in F ι g. 2 graphisch ausgewertet.
Versuch 3
Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von Pullulanase vom mittleren Dextran-Molekulargewicht
in einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran, Enzym
und
(a) ohne Phosphat bzw.
(b) mit Phosphat (Konzentration 0,1 m, pH 7,5)
untersucht.
untersucht.
Die eingesetzte Enzymlösung hatte eine Aktivität von 20,8 U/ml, eine 0,02 m Salzkonzentration und einen
pH-Wert von 7,5.
Die Systeme enthielten jeweils 10 Teile Polyäthylenglykol und 5 Teile Dextran und wurden mit Wasser auf
100 Teile ergänzt.
Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Aus ihnen ergibt sich, daß das mittlere Molekulargewicht
des verwendeten Dextrans den Verteilungskoeffizienten K kaum beeinflußt.
M Dextran | Volumen | Volumen | U/ml | U/ml | Λ-Wert |
X 105 | Oberphase | Unterphase | Oberphase | Unterphase | |
(ml) | (ml) | ||||
a) | |||||
1,1 | 7,7 | 1,9 | 6,4 | 28,8 | 0,22 |
5,0 | 7,8 | 2,0 | 7,0 | 24,8 | 0,28 |
20,0 | 7,8 | 1,8 | 6,8 | 28,4 | 0,24 |
10,0*) | 8,0 | 1,8 | 7,9 | 22,7 | 0,35 |
b) | |||||
1,1 | 7,5 | 2,0 | 4,5 | 3,9 | 1,15 |
5,0 | 7,4 | 2,1 | 4,6 | 3,6 | 1,28 |
20,0 | 7,6 | 2,0 | 4,5 | 3,7 | 1,22 |
10,0*) | 7,8 | 1,6 | 4,3 | 5,1 | 0,80 |
*) NatriumdextransulfaL
Versuch 4 (F ig. 3)
Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskeeffizienten
K für Pulhilanase vom pH-Wert und von
Pufferionsn in einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M
6; 300 000), Enzym und
(a) Natriumphosphat bzw.
(b) Tris/Acetat
untersucht
untersucht
Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,35 auf Gewichtsbasis und die Konzentration
der Puffer (a) und (b) war jeweils lOOmmolar. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 3 graphisch ausgewertet.
Versuch 5 (F i g. 4)
Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Phosphatkonzentration in
einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M 500 000),
Enzym und Natriumphosphat untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf
Gewichtsbasis. Der pH-Wert des Natriumphosphat-Puffers betrug 7,8. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 4
graphisch ausgewertet.
Versuch 6 (F ig. 5)
Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten κ für Ruiiuianase von der Natriumchoiat-Konzentration
in einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M" 4000), Dextran (M 500 000),
Natriumphosphat und Enzym untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf
Gewichtsbasis; die Konzentration des Natriumphosphats war 100 mmolar und sein pH-Wert betrug 7,8. Die
erhaltenen Werte sind in F i g. 5 graphisch ausgewertet.
Versuch 7 (F i g. 6)
Es wurde die Abhängigkeit des Yerteilungskoeffiziente-i
K für Pullulanase von der Nairiumdesoxycholat-Konzentration
in einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M
500 000), Natriumphosphat und Enzym untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug
9:1,25 auf Gewichtsbasis; die Konzentration des Natriumphosphats war 100 mmolar und sein pH-Wert
betrug 7,8. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 6 graphisch ausgewertet.
Versuch8(Fig. 7) Es wurde die Abtrennung von Pullulanase von K.
r»n«ttrrt •***»!·>
*7 Il > rlenan ^Ic Fr» im K 1" ♦
worden war, in der oberen Phase eines wässerigen Systems mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M
4000), Dextran (M 500 000), Natriumphosphat und Zellen in Abhängigkeit von der Natriumcholat-Konzentration
untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf Gewichtsbasis und das
Verhältnis von Zellen zu Puffer betrug 1 :1,4; die Konzentration des Natriumphosphats war 200 mmolar
und sein pH-Wert betrug 8,0. Die erhaltenen Werte sind
in F i g. 7 graphisch ausgewertet.
Versuch 9 (F ig. 8)
Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase vom Gehalt an DEAE-Dextran in
der Dextranphase eines wässerigen Systems mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M
500 000), Natriumphosphat und Enzym untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug
i") 9:1,25 auf Gewichtsbasis; die Konzentration des
Natriumphosphats war lOOmmolar und sein pH-Wert betrug 7,8. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 8
graphisch ausgewertet.
,„ Herstellungsbeispiel
Es wurden Klebsiella pneumoniae-Zellen mit dem l,4fachen Volumen eines wässerigen 0,5 m Natriumphosphat-Puffers
(pH 8,0) suspendiert. Man gab 1% Natriumcholat zu und rührte kräftig 90 min lang bei
2r> Zimmertemperatur. Danach wog man 9% Polyäthylenglykol
(M 4000) und 1,25% Dextran (M 500 000) ein, mischte mit einem Mischer (Vibro-Mischer) etwa 10 min
lang und zentrifugierte bei 12 000 UpM 20 min lang ab.
Die zellfreie Oberphase ließ sich gut abgießen. Es wurde
«ι 48 h lang gegen fließendes Wasser dialysiert (Kühlraum).
)-> Es wurde die Pullulanase-Ausbeute bei einer einstufigen Extraktion in einem wässerigen System mit einem
Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M 500 000), Natriumphosphat und Enzym in Abhängigkeit
von der Phosphatkonzentntion untersucht. Das Ver-
At) hältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25
auf Gewichtsbasis und der pH-Wert des Natriumphosnhat«
betrug 7 8 Oas Opcamtvnhtmpn des verwendeten
Systems betrug 5 ml und die Aktivität der verwei deten
Enzymlösung entsprach 231,4 U insgesamt.
•ti Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 2 zu entnehmen.
•ti Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 2 zu entnehmen.
Tabelle | 2 | Gefundene Gesamt aktivität |
Oberphase Vol. |
Aktivität | (U total) | Unterphase Aktivität Vol. |
(U/ml) | (U total) | "τ. | Aus beute |
Proben Nr. |
Phosphat- Konzen tration |
(U) | (ml) | (U/ml) | 205,7 | (ml) | 37,4 | 18,7 | (%) | |
(mmolar) | 224,4 | 4,5 | 45,7 | 213,9 | 0,5 | 31,2 | 15,6 | 1,22 | 91,7 | |
1 | 1 | 229,5 | 4,5 | 47,5 | 237,2 | 0,5 | 31,4 | 15,7 | 1,52 | 93,2 |
2 | 10 | 252,9 | 4,5 | 52,7 | 248,0 | 0,5 | 26,1 | 13,1 | 1,67 | 93,8 |
3 | 20 | 261,1 | 4,5 | 55,1 | 221,7 | 0,5 | 26,9 | 10,7 | 2,11 | 95,0 |
4 | 30 | 232,4 | 4,6 | 48,2 | 230,9 | 0,4 | 22,0 | 8,8 | 1,79 | 95,4 |
5 | 40 | 239,7 | 4,6 | 50,2 | 227,2 | 0,4 | 13,3 | 5,3 | 2,28 | 96,3 |
6 | 50 | 232,5 | 4,6 | 49,4 | 249,8 | 0,4 | 11,6 | 5,8 | 3,70 | 97,7 |
7 | 100 | 255,6 | 4.5 | 55,5 | 256,9 | 0,5 | 7,9 | 4,7 | 4,78 | 97,7 |
8 | 200 | 261,6 | 4,4 | 58,4 | 0,6 | 7,39 | 98,2 | |||
9 | 300 | |||||||||
Es wurde die Abhängigkeit des .K-Wertes für
Pullulanase vom Anteil der Zellmasse am Gesamtansatz
in wäßrigen 2-Phasensystemen untersucht Dazu wurden gefrorene Klebsiella-Zeilen wie üblich behandelt,
mit Phosphatpuffer, Polyäthylenglykol (M 4000) und Dextran (M 500 000) versetzt Die Phosphatkonzentnition war 0,3 m. Danach wurde abzentrifugiert Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Tabelle 3 | Dextran | Oberphase | Unterphase |
Oberphase/
Unterphase |
AT-Wert |
Phosphat
puffer/ Zellmasse |
Gesamt
volumen/ Zellmasüe |
Polyäthylen
glykol |
(%) | (ml) | (ml) |
(0,3 m
Phosphat) |
(Teile/Teile) | (ml/g) | |
(%) | 2 | 4,6 | 5,4 | 0,85 | 1,92 | 0,7 | 2,0 |
9 | 2 | 5,5 | 3,7 | 1,5 | 2,00 | 1,0 | 2,6 |
9 | 2 | 6,0 | 3,4 | 1,7 | 2,69 | 1,4 | 3,2 |
9 | 2 | 6,9 | 3,3 | 2,1 | 2,66 | 2,0 | 3,9 |
9 | 2 | 6,8 | 2,8 | 2,4 | 3,06 | 2,5 | 4,6 |
9 | 2 | 7,0 | 2,4 | 2,9 | 2,96 | 3,0 | 5,3 |
9 | 2 | 7,8 | 2,5 | 3,1 | 2,80 | 4,0 | 6,6 |
9 | 2 | 8,0 | 2,3 | 3,5 | 3,00 | 5,5 | 8,5 |
9 | 2 | 8,65 | 1,05 | 8,2 | — | keine Zellmasse | |
9 | |||||||
Wenn Zellmasse in einer Menge von etwa 25% und mehr vorliegt, muß man mit einer Verkleinerung des
K-Wertes rechnen. Ferner verändert sich das Volumenverhältnis zugunsten der Unterphase, so daß es zu
größeren Aktivitätsverlusten kommt
Eine Zeilmassenkonzentration von etwa 25 bis 30% erscheint daher als zweckmäßig, zumal sich in diesem
Bereich die Viskositätszunahme in Grenzen hält und
sich mit Separatoren höhere Durchsatzleistungen als bei
größeren Zellmassenkonzentrationen erzielen lassen. Mit den Werten der Tabelle 14 ergibt sich für eine
Suspension mit etwa 25% Zellmasse (Phosphatpuffer : Zellmasse=3) etwa folgende Ausbeute:
100/(1 + VJ V0KJ= 100/1,123=90%.
Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von Pullulanase von verschiedenen Parametern in
einem wäßrigen Zweiphasensystem mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol und Ammoniumsulfat untersucht
(Beispiel 3). Zur Bildung des Zweiphasensystems 45 Tabelle 4 zu entnehmen.
wurden Polyäthylenglykol (M 4000, 50%ige wäßrige Lösung), festes Ammoniumsulfat und jeweils 5 ml einer
Enzymlösung (Reinheit 60%, pH 7,5, Salzkonzentration ca. 0,02 m PO3-) eingesetzt Die einzelnen Werte sind
Tabelle 4 |
Polyäthylen
glykol |
AT-Wert |
Aktivitätsaus
beute in Salz phase |
Oberphase | Unterphase |
(NH4)JSO4 |
(R4000;
·/. Gew./Gew.) |
(%) | (ml) | (ml) | |
(% Gew./Gew.) | 16 | 0,37 | 56,5 | _ | _ |
8,5 | 18 | 0,40 | 45,5 | 3,6 | 1,1 |
8,5 | 14 | 0,37 | 60,4 | 3,0 | 1,8 |
9,5 | 16 | 0,47 | 52,8 | 3,1 | 1,7 |
9,5 | 18 | 0,51 | 48,2 | 3,3 | 1,5 |
9,5 | 11 | 0,33 | 79,0 | 2,? | 2,5 |
Il | 12 | 0,38 | 69,4 | 2,4 | 2,3 |
11 | 14 | 0,39 | 66,9 | 2,6 | 2,1 |
11 | 16 | 1,08 | 43,4 | 2,4 | 2,2 |
11 | 18 | 2,38 | 23,2 | 2,6 | 2,1 |
11 | |||||
15 | 26 | 39 129 | 16 | Oberphase | Unterphase | |
Fortsetzung | Polyäthylen- | |||||
(NH4)2SO4 | glykol | ΑΓ-Wert | Aktivitätsaus | (ml) | (ml) | |
beute in Salz | ||||||
(M 4000; | phase | 1,5 | 3,2 | |||
(% Gew./Gew.) | % Gew./Gew.) | (%) | 1,6 | 3,1 | ||
8 | 1,8 | 2,8 | ||||
12 | 9 . | 0,28 | 88,2 | 2,0 | 2,7 | |
12 | 10 | 0,27 | 84,6 | 2,1 | 2,5 | |
12 | 12 | 0,29 | 77,6 | 2,2 | 2,4 | |
12 | 14 | 0,73 | 52,8 | 2,3 | 2,3 | |
12 | 16 | 0,93 | 44,2 | |||
12 | 18 | 1,10 | 30,1 | |||
12 | 9,36 | 7,8 | ||||
(Beispiel 4). Zur Bildungdes Zweiphasensystems ca. 0,02 m PO4 3-) und ein Kaiiumphosphatpuffer (pH
wurden Polyäthylenglykol (M 4GG0, 5ö%ige wäßrige 2ΰ 7,5) eingesetzt Die einzelnen Werte sind Tabeiie 5 zu
Lösung), festes Ammoniumsulfat, jeweils 5 ml einer entnehmen.
Enzymlösung (Reinheit 60%, pH 7,5, Salzkonzentration
Tabelle 5 | Polyäthylen | Kalium | AT-Wert | Aktivitätsaus | Oberphase | Unter |
(NKO2SO4 | glykol | phosphat | beute in Salz | phase | ||
phase | ||||||
(M 4000; % | (mmol) | (%) | (ml) | (ml) | ||
(% Gew./ | Gew./Gew.) | |||||
Gew.) | 14 | - | 0,38 | 58,5 | 3,0 | 1,6 |
9,5 | 14 | 10 | 0,29 | 69,9 | 2,8 | 1,9 |
9,5 | 14 | 20 | 0,42 | 62,9 | 2,8 | 2,0 |
9,5 | 14 | 30 | 0,31 | 72,5 | 2,6 | 2,1 |
9,5 | 14 | 50 | 0,40 | 67,1 | 2,6 | 2,1 |
9,5 | 14 | 100 | 0,88 | 52,1 | 2,4 | 2,3 |
9,5 | 14 | 200 | 6,47 | 12,9 | 2,3 | 2,3 |
9,5 | 14 | 300 | 42,63 | 1,1 | 2,1 | 2,6 |
9,5 | ||||||
Aus den Tabellen 4 bis 5 ergibt sich, daß sich die Pullulanase mit steigender Konzentration an Ammoniumsulfat und Polyäthylenglykol stärker in der Polyäthyienglykol-haltigen Oberphase löst Ferner ist mit
steigender Phosphat-Konzentration ein starker Anstieg des K- Werts zu erkennen.
Diese Beispiele sollen erläutern, daß für die Aufarbeitung der Pullulanase aus der Polyäthylenglykol-reicnen Phase verschiedene Wege zur Auswahl
stehen.
(Aufarbeitungsbeispiel 1) Zu einer Polyäthylenglykolreichen Phase mit einem Gehalt an Pullulanase
(Herstellungsbeispiel) wurden 18% Ammoniumsulfat zugegeben, wobei man ein neues Zweiphasensystem
Polyäthylenglykol/Ammoniumsulfat erhielt Die Pullulanase ging dabei quantitativ in die Salzphase Über. Die
beiden völlig klaren Phasen konnten in einem Separator getrennt werden. Aus der unteren Phase wurde das
Enzym durch Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration auf 35% ausgefällt. Der Niederschlag wurde
abzentrifugiert, in einem 20 mmolaren Phosphatpuffer gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert Die auf
diese Weise erhaltene Pullulanase besaß eine spezifische Aktivität von 28 U/mg und war nach den
Ergebnissen der Elektrophorese zu ca. 70% rein. Die Ausbeute betrug 78%. Das Präparat enthielt noch
Spuren von Protease.
(Aufarbeitungsbeispiel 2) Aus einer dem Herstellungsbeispiel entsprechenden Oberphase wurde das
Enzym an DEAE-Zellulose gebunden, mchdem durch Dialyse gegen Wasser die Detergentien entfernt
worden waren und die Salzkonzentration in der Lösung auf einen Wert von etwa 0,1 m (Phosphat) angehoben
worden war. Die DEAE-Zellulose konnte leicht abfiltriert oder in einer Siebzentrifuge abgetrennt
werden. Durch Waschen der DEAE-Zellulose mit Puffer wurde das Polyäthylenglykol praktisch vollständig
entfernt Die Pullulanase wurde anschließend mit einem Puffer ausreichender Salzkonzentration eluiert. Diese
Arbeitsweise ist auch technisch durchführbar. Die Ausbeuten betrugen 30 bis 50%.
(Aufarbeitungsbeispiel 3) Durch Zugabe von Dextran mit einem Gehalt an etwa 8% DEAE-Dextran zu einer
Polyäthylenglykol-reichen Phase ließ sich ein neues Zwei-Phasensystem aufbauen. Bei diesem DEAE-Dextrangehalt von etwa 8% ist der Verteilungskoeffizient K
kleiner 0,05, so daß praktisch das gesamte Enzym in die Unterphase übergeführt wurde (vgl. Fig.8). Durch
geeignete Einstellung der Volumina ließ sich auf diesem Wege eine Konzentrierung erreichen.
μΜοΙ CTAB/U Pullulanase
0,12 70
0,14 72
0,16 82
0,18 80
0,24 72
0,32 60
(Abhängigkeit der CTAB-Fällung von der
Pullulanase-Konzentration)
Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt. Es wurde eine Pullulanase·Lösung (Reinheit ca. 70%;
42 U/ml, 0,02 m PCV-, pH 7,5) mit steigenden Mengen einer 0,02 m Kaliumphosphatlösung (pH 7,5) verdünnt.
Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend einem Molverhältnis von
0,16μΜοΙ/υ. Bs wurde 15 min bei O0C gerührt Die
Niederschläge wurden abzentrifugiert und in 0,5 m
Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst Die Ergebnissei sind der
folgenden Tabelle 7 zu entnehmen.
Es wurde die Trennbarkeit eines 2-Phasen-Systems mit Pullulanase und Klebsiella-Zellen in einem Tellerseparator untersucht
Dazu wurde ein wässeriges 2-Phasensystem mit 10%
Polyäthylenglykol (M 4000) und 2% Dextran (M 500 000) in einem Tellerseparator aufgetrennt Bei
verschiedenen Versuchen mit 4 Düsen wurde eine optimale Düsenlänge von 13,5 mm und eine optimale
Durchflußleistung von 200 ml/min ermittelt Bei dieser Durchflußleistung betrug die Verweilzeit ca. 135 sea Es
wurde eine Reinheit der Oberphase von annähernd 100% bei einer Reinheit der Unterphase von ca. 82%
und einem Verlust an Oberphase von ca. 2% erzielt
Pullulanase ließ sich zu ca. 80% mit einer spezifischen
Aktivität von 5—8 U/mg gewinnen.
Anfarbeitungsbeispiel 5
(Bestimmung der optimalen CTAB-Konzentration)
Aus Vorversuchen war eine Abnahme der Pullulanase-Aktivitätsausbeute im Niederschlag der CTAB-Fällung mit größerer CTAB-Konzentration festgestellt
worden. Im Hinblick auf eine Abhängigkeit der Fällung vom Mol-Verhältnis CTAB/Pullulanase wird die CTAB-Konzentration im Fällungsansatz im folgenden in
|iMol/U Pullulanase angegeben.
Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt Es wurden jeweils. 10 ml Pullulanase-Lösung (Reinheit
60 bis 70%, 0,02 bis 0,03 m PQ4 ,pH 7,0,38 U/ml) mit
steigenden Mengen einer <0%igen CTAB-Lösung versetzt und 15 min bei 00C geröhrt *}er Niederschlag
wurde abzentrifugiert und in 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,5} gelöst Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 6
zu entnehmen.
Tabelle 7
μΜοΙ CTAB/U U/ml
Akt-Ausbeute
im Niederschiag
0,16
0,16
0,16
Gr16
0,16
42,0
30,0
21,2
14,0
9,9
82%
79%
81%
54%
40%
(Abhängigkeit der CTAB-Fällung vom pH-Wert)
Es wurden jeweils 5 ml einer 60 bis 70% reinen PuUulanase-Lösung (42 U/ml, 0,02 bis 0,03 m Kaliumphosphat pH 7,5) mit 0,1 m Salzsäure bzw. 0,1 m
Kaliumhydroxid auf pH-Wert von 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 bzw.
8,0 gebracht und auf 10 ml verdünnt Die daraus resultierenden Fällungsbedingungen waren: 0,02 bis
0,03 m PO*3- (Cl-); variabler pH-Wert; 0,16 μΜοΙ
CTAB/U Pullulanase; 20 bis 22 U/ml. Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung. Es
jo wurde 15 min bei 0? C gerührt Die Niederschläge
wurden abzentrifugiert und in 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst Die Ergebnisse sind der folgenden
Tabelle 8 zu entnehmen.
μΜοΙ
CTAB/U
CTAB/U
pH
U/ml
Akt-Ausbeute
im Niederschlag
0,16
0,16
0,16
0,16
0,16
8,0
7,5
7,0
6,5
6,0
22,5
22,1
20,3
20,3
20,0
50
65
74
65
36
(Abhängigkeit der CTAB-Fäliung von der
Salzkonzentration und der Ionenart des Puffers)
Es wurden jeweils 5 ml einer 60 bis 70% reinen Pullulanase-Lösung (ca. 42 U/ml, Salzkonzentratton
von 0,02 m PO43-) mit einer 1 m Kaliumphosphat-Lösung bzw. mit einer 1 m Ammoniumsulfat-Lösung (pH
7,0) auf ein Lösungsvolumen von 10 ml mit einer
Salzkonzentration entsprechend einer Molarität von
0,04, 0,06 und 0,08 gebracht Die daraus resultierenden Fällungsbedingungen waren: 0,16 μΜοΙ CTAB/U Pullulanase, 20 bis 22 U/ml, pH 7,0 und variable Salzkonzentration. Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer
10%igen CTAB-Lösung. Es wurde 15 min bei 0°C gerührt Die Niederschläge wurden abzentrifugiert und
in 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,0) gelöst Die Ergebnisse
sind der folgenden Tabelle 9 zu entnehmen.
CTAB/U
0,02 m
0,04 m
0,06 m
0,08 m
0,01m
0,01m
0,01m
0,03 m
0,01m
0,05 m
PO4 3"
PO4 3"
PO4 3"
PO4 3"
PO4 3"!
SO4 2-/
SO4
PO,3"!
SO4 2 -J
SO4 2 -J
7,0 0,16
7,0 0,16
7,0 0,16
7,0 0,16
7,0 O5Ib
7,0 0,16
7,0 0,16
20,8 22,0 20,5 23,0
20,6 21,1 19,8
Akt-Ausbeute im Niederschlag
80%
60%
10%
2%
50% 3% 2%
10
(Abhängigkeit der Aktivitfttsausbeute und der
spezifischen Aktivität vom Auflösen des
Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt Es wurden jeweils 10 ml einer dialysierten Oberphase
(Beispiel 11) auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und
auf 15 ml verdünnt Die Fällungsbedingungen waren: 0,02 m PO4 3-, pH 7,0, ca. 30 U/ml, ca. 11 U/mg und
0,16 μΜοΙ CTAB/U. Die Fällung erfolgte durch Zugabe
einer 10°/oigen CTAB-Lösung. Es wurde 15 min bei 00C
gerührt Die Niederschläge wurden abzentrifugiert und unter 15 min langem Rühren in Kaliumphosphat- bzw.
Ammoniumsulfat-Lösungen mit steigenden Konzentrationen gelöst Die erhaltenen Ergebnisse sind der
folgenden Tabelle 10 zu entnehmen.
Salzkonzentration
Akt-Ausbeute
Spez. Akt
(NH4J2SO4 | 0,05 m | 13% | 14 U/mg | ungelöster Rückstand |
(NH4J2SO4 | 0,10 m | 60% | 24 U/mg | ungelöster Rückstand |
(NH4J2SO4 | 0,15 m | 65% | 25 U/mg | geringe Mengen |
ungelöster Rückstand | ||||
(NH4J2SO4 | 0,20 m | 73% | 28 U/mg | geringe Mengen |
ungelöster Rückstand | ||||
(NH4J2SO4 | 0,25 m | 74% | 27 U/mg | geringe Mengen |
ungelöster Rückstand | ||||
(K5H)3PO4 | 0,05 m | 3% | 9 U/mg | ungelöster Rückstand |
(K5H)3PO4 | 0,10 m | 22% | 13 U/mg | ungelöster Rückstand |
(K1H)3PO4 | 0,15 m | 34% | 16 U/mg | ungelöster Rückstand |
(K-H)3PO4 | 0,20 m | 40% | 21 U/mg | ungelöster Rückstand |
(K5H)3PO4 | 0,30 m | 56% | 27 U/mgj | |
(K5H)3PO4 | 0,40 m | 67% | 28 U/mg 1 |
geringe Mengen
ungelöster Rückstand |
(K1H)3PO4 | 0,50 m | 73% | 27 U/mg |
(CTAB-Fällungsversuche mit verschiedenen Ausgangslösungen)
In den folgenden Versuchen wurde Pullulanase unter den in den Aufarbeitungsbeispielen 5 bis 9 gefundenen
optimalen Bedingungen aus verschiedenen Ausgangslösungen gefällt.
(Aufarbeitungsbeispiel 10) Ausgangslösung: 70 ml dialysierte Oberphase (Herstellungsbeispiel), Salzkonzentration entsprechend 0,02 bis 0,03 m PO4 3-, pH 7,0,
Aktivität 72 U/ml, spezifische Aktivität nach einer Gel-Elektrophorese 3,6 U/mg( =9% reine Pullulanase).
Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend 0,18 μΜοΙ CTAB/U Pullu- b0
lanase. Es wurde ca. 2 h lang bei 00C gerührt Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 50 ml 04 m
Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst
Es wurden folgende analytischen Werte erhalten: Aktivitätsausbeute 05 U/ml» 80%, spezifische Aktivität b3
ca. 21 U/mg ( =52%), Reinigungsfaktor 5,8 (Reinigungsfaktor »spezifische Aktivität im gelösten Niederschlag/spezifische Ausgangsaktivität).
(Aufarbeitungsbeispiel 11) Ausgangslösung: 5OmI dialysierte Oberphase (Herstellungsbeispiel), Salzkonzentration entsprechend 0,03 m PO4 3 -, pH 7,0, Aktivität
42 U/ml, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 12 U/mg (30%).
Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend 0,16 μΜοΙ CTAB/U Pullulanase. Es wurde ca 1 h lang bei 0°C gerührt. Der
Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 10 ml 0,5 m
Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst
Es ergaben sich folgende analytischen Werte: Aktivitätsausbeute 147 U/ml = 70%, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 30 U/mg ( =75%), Reinigungsfaktor 2,5.
Bei Tests auf Protease-Aktivität wurden im Ausgangsmaterial Spuren ermittelt, während im gelästen
Niederschlag nach CTAB-Fällung kein Nachweis geführt werden konnte. Bei Tests auf alpha-Amylase
(Phadebas alpha-Amylasetest/Pharmacia) wurde im
Ausgangsmaterial ein Wert von 30 U/l =-0,03 U/ml ermittelt, während im gelösten Niederschlag nach
CTAB-Fällung kein Nachweis geführt werden konnte.
(Aufarbeitungsbeispiel 12) Ausgangslösung: 20 ml
dialysierte Oberphase (Herstellungsbeispiel), Salzkonzentration 0,03 m PO43-, pH 7,0, Aktivität 28 U/ml,
spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 8,4 U/mg (21%).
Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend 0,18 μΜοΙ/U Pullulanase.
Es wurde ca. 15 min bei 4° C gerührt Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 20 ml 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst.
Es ergaben sich folgende analytischen Werte: Aktivitätsausbeute 22,5 U/ml =80%, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 23 U/mg (£■. 58%), Reinigungsfaktor 2,8.
(Aufarbeitungsbeispiel 13) Ausgangslösung: 15 ml einer Oberphase (Herstellungsbeispiel), die über eine
Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze ca. M 100 000/M 300 000) dialysiert wurde; Salzkonzentration
0,02 m PCV- pH 7,5, Aktivität 19 U/ml, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 23 U/mg (a 58%),
spezifische Aktivität nach L ο w r y 25 U/mg (= 62%).
Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend 0,16 μΜοΙ/U Pullulanase.
Es wurde ca. 15 min bei 00C gerührt. Der Niederschlag
wurde abzentrifugiert und in 10 ml 0,5 m Kaliumphosphat N-Cetylpyridiniumchlorid (pH 7,5) gelöst.
Es ergaben sich folgende analytischen Werte: Aktivitätsausbeute 22,8 U/mI-80%, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 34 U/mg (^ 85%), spezifische Aktivität nach Lo wry 36 U/mg (s 90%), Reinigungsfaktor 1,45.
Tests auf alpha-Amylase-Aktivität und auf Protease-Aktivität waren negativ.
Es wurde die Fällbarkcit von Pullulanase mit verschiedenen Kationen von Stickstoffbasen untersucht.
Es wurde von einer Enzymlösung mit folgenden Werten ausgegangen: Aktivität 20,8 U/ml, Salzkonzentration 0,02 m PO43-. pH 7JS. Der Niederschlag wurde
jeweils in 0,4 m Natriumchlorid gelöst
Von den Fällungsmitteln wurde jeweils eine 10%ige
wässerige Lösung hergestellt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 11 zu entnehmen.
% AM. im | % Akt. in | Bemerkungen |
Niederschlag | Lösung | |
0 | 85 | kein |
Niederschlag | ||
80 | 20 | |
82 | 6 |
N-Dodecylpyridiniumchlorid
N-Cetylpyridiniumchlorid
In diesem Beispiel wird die Qualität von Fallungen
von Pullulanase durch Cetyltrimethylammoniurribromid,
N-Dodecylpyridiniumchlorid und N-Cetylpyridiniumchlorid verglichen.
Als Ausgangslösung wurde eine durch Ultrafiltration
über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgi enze ca. MlOOOOO) konzentrierte Lösung verwendet (ca.
35 U/ml, ca. 31% Pullulainase im löslichen Protein,
0,05 m Kaliumphosphat pH 7,5).
Die Fällung erfolgte jeweils durch Zugabe von 0.;!% (Gewicht/Gewicht) des Fiillungsmittels entsprechend
0,15 bis 0,20μΜοΙ/υ Pullulanase. Es wurde 15 min lang
bei etwa 00C gerührt Die Niederschlage wurden in
0,4 m Natriumchlorid gelöst.
Die Ergebnisse können der folgenden Tabelle 12 entnommen werden.
53 80 82
26
20
61
48
53
1,97
1,54
1,70
Die Fällung mit CTAB lieferte hinsichllich des Reinigungsfaktors das beste Ergebnis. Weiten:: Versuehe zeigten bessere Ausbeuten.
Es wurde ein System nach Albertsson, Biochemistry 12, 2525 (1973) verwendet Das System enthielt
6,7% Dextran (RI 500 000Χ 8,0% Rohrzuckerpolymerisat (M ca. 400 000) und 53% Polyäthylenglykol
(M 6000) und stellte ein Zwei-Phasensystem dar. Es
wurde eine Pullulanase-Lösung mit einer Aktivität von
203 U/ml, einer 0,02 m Salzkonzentration und eirem
pH-Wert von 7,5 eingesetzt
Der Verteilungskoeffizient betrug 0,66.
Es wurde ein System nach Aibertsson, Biocrie mistry 12, 2525 (1973) mit einem Gehalt an 5% Dextran
(M 500 000), 6% Rohrzuckerpolymerisat
(M ca. 400 000), 4% Polyäthylenglykol (MeOOO]I und
25% Polypropylenglykol {TA 2020) angewendet, wobei
ein Drei-Phasensystem erhalten wurde. Dabei wurde eine Pullulanese-Lösung mit einer Aktivität von
20,8 U/ml, einer 0,02 m Salzkonzentration und einem pH-Wert von 7,5 verwendet.
Die Pullulanase war wie folgt verteilt:
Oberphase:
1,3 U/ml;
5,2 U/ml;
10,? U/ml.
K2 = CMi„JCo-V Cu=0,30
K3 = CJC0 +Cm« = 2,49
Ai4-Co/Cm,·,«-0,25
AT5 = Cf.:-;-J Cj=0.3?
Es wurde ein System nach Albertsson (Biochemistry 12, 2525, insbesondere 2527 rechts [1973] angewendet. Dazu wurden 20 g Klebsieila pneumoniae-Zellen in
150 ml (statt 1500 ml) mit Konzentrationen von 1% (Gewicht/Volumen) Octylphenol-polyäthylenglykoläther, 2 mol. Natriumrhodanid, 1 mmol. EDTA und
lOmmol. Tris (pH 8,0) 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Suspension wurden 22,2 g Dextran
(R 500 000) und 17,8 g Polyäthylenglykol (W 6000)
gegeoen.
Es fand eine einwandfreie Auftrennung in zwei Phasen statt. Die Zellen befanden sich in der
Unterphase. Der Pullulanase-Aktivitätstest wurde jedoch durch das anwesende Natriumrhodanid empfindlich gestört. (Die Verwendung des als Ersatz für
Natriumrhodanid empfohlenen Natriumchlorids [I. c. Seite 2526 rechts] befriedigt auch nicht, da kleine
Verteilungskoeffizienten erhalten werden.)
IH. Maltase
Versuche 10 bis 15
Es wurde Bierhefe dreimal bei -20°C eingefroren und bei +4° C aufgetaut Der pH-Wert wurde mit
Ammoniak bei 6,2 gehalten. Der klar zentrifugierte Überstand diente als Ausgangslösung für wässerige
2-Phasensysteme. Die Phasen wurden mit einer Tischzentrifuge getrennt (ca. 5 min bei 3800 U/min und
1850 g).
Die Maltase wurde mit Hilfe des Pseudosubstrates 4-Nitrophenylalpha-D-giucopyranosid (PNPG) bei
30° C unter Messung der Extinktionszunahme bei 400 nm bestimmt (eine Einheit entspricht einem Umsatz
von 1 μΜοΙ PNPG/min bei 300C).
(Versuche 10 bis 11; Fig.9). Es wurde die
Abhängigkeit des if-Wertes von der Phosphat-Konzentration und dem Polyäthylenglykol-Molekulargewicht
untersucht Dazu wurde mit einem wässerigen Polyäthylenglykol/Dextran-System mit einem Gesamtvolumen
von 5 ml, 7% Polyäthylenglykol (M 4000 bzw. 6000), 24% Dextran (GewVGew.; M 500 000), ca. 0,1ml
Enzymlösung und einem Kaliumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,8 gearbeitet Die erhaltenen
Ergebnisse sind in F i g. 9 graphisch wiedergegeben.
(Versuche 12 bis 13; F i g. 10) Es wurden die Versuche 10 bis 11 mit der Ausnahme wiederholt, daß in
Gegenwart von Kaliumchlorid in steigenden Mengen und 0,067 moL Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,8) gearbei-
tet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 10
graphisch wiedergegeben.
(Versuche 14 bis 15; F i g. 11) Es wurden die Versuche
10 bis 11 mit der Ausnahme wiederholt, daß in Gegenwart von Natriumsulfat in steigenden Mengen
und 0,067 mol. Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,8) gearbeitet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 11
graphisch wiedergegeben.
Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes für Maltase
vom pH-Wert untersucht (Aufschluß vergleiche Versuche 10 bis 15). Dazu wurde in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen mit
7% Polyäthylenglykol (M 4000) und
2,5% Dextran (Gew^Gew.; M 500 000)
(Versuch iö),
7% Polyäthylenglykol (M 6000) und
2,5% Dextran (Gew7Gew.; M 5 000 000)
(Versuch 17) bzw.
9% Polyäthylenglykol (M 4000) und
1,25% Dextran (Gew^Gew.; M 500 000)
(Versuch 18) und
mit jeweils einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, ca. 0,1 ml Enzymlösung und 0,067 mol. Kaliumphosphat-Puffer gearbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind
in F i g. 12 graphisch wiedergegeben.
Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes für Maltase
von der Konzentration und vom mittleren Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglykols untersucht
(Aufschluß vergleiche Versuche 10 bis 15). Dazu wurde in einem wässerigen Polyäthylenglykol/Dextran-System mit einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, steigenden Mengen an Polyäthylenglykol (M 4000 bzw. 6000),
2^% Dextran (GewyGew.; M 500 000), ca. 0,1 ml
/nU RB\ noot-KoUo* nip orholtonon Proohniccp sind in
Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes für Maltase
von der Dextran-Konzentration und dem mittleren Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglykols
untersucht (Aufschluß vergleiche Versuche i0 bis 15). Dazu wurde mit wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-
Systemen mit einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, 7%
Polyäthylenglykol (GewyGew.; K! 4000 bzw. 6000), steigenden Dextran-Mengen (GewyGew.; M 500 000),
ca. 0,1 ml Enzymlösung und 0,067 moL Kaliumphosphat-Puffer (pH 63) gearbeitet Die erhaltenen Ergebnisse
sind in F i g. 14 graphisch wiedergegeben.
Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes und der
Aktivitätsausbeute für Maltase vom Anteil der Zellmas
se am Gesamtansatz untersucht
Dazu wurde Bierhefe viermal aufgetaut und eingefroren (Aktivität ca. 47 143 mU/g). Es wurde in wäßrigen
Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen mit einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, 9% Polyäthylenglykol
(Ki 4000), 2% Dextran (GewTVolumen; R 500 000) und
04 mol. Kaliumphosphat-Puffer gearbeitet Der pH-Wert betrug ca 7,2. Die Zellmenge variierte. Die
Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 13 zu entnehmen.
Tabelle | 13 | Gesamt volum °n/ ZellmaSb'e |
Oberphase | der Aktivitätsausbeute für Maltaue | Oberphase/ Unterphase |
Aktivität Oberphiise |
vom Verhältnis | Gesamtvolumen/Gewicht | Ausbeute in der Oberphase |
(ml/g) | (ml) | Unterphase | [mil LmlJ |
[mU/ml] | Unterphase |
κ c°
Lu |
(%) | ||
Abhängigkeit des Af-Wertes und eingesetzter Zellmasse |
11,1 | 3,7 | (ml) | 2,85 | 5 000 | [mU/ml] | 87,2 | ||
Probe Nr. |
9,1 | 3,6 | 1,3 | 2,40 | 6429 | 2 143 | 2,33 | 87,7 | |
7,0 | 3,5 | 1,5 | 2,33 | 8215 | 3 214 | 2,00 | 86,0 | ||
1 | 5,4 | 3,6 | 1,5 | 2,00 | 11071 | 3 571 | 2,30 | 85,0 | |
2 | 4,2 | 3,3 | 1,8 | 1,65 | 13 572 | 4 714 | 2,35 | 76,0 | |
3 | 3,3 | 3,4 | 2,0 | 1,55 | 16 429 | 6 929 | 1,96 | 70,0 | |
4 | 2,0 | 2,3 | 2,2 | 0,85 | 15 000 | 10 929 | 1,50 | 35,0 | |
5 | 2,7 | 22 857 | 0,66 | ||||||
6 | |||||||||
7 |
Die Versuche zeigten, daß bei einem Zellanteil im Bereich von ca. 20% des Gesamtvolumens (Gesamtvolumen/Zellmasse
[ml/g] = 5) eine Aktivitätsausbeute im Bereich von 75 bis 85% möglich ist Die Hefezellen
lagen bei allen Versuchen in der Unterphase vor, die noch gut fließfähig war. Die erhaltenen Ergebnisse sind
in den F i g. 15 bis 16 graphisch wiedergegeben.
Weitere Versuche mit frisch zubereiteter Hefe brachten ein noch etwas günstigeres Volumenverhältnis.
In diesem Beispiel wurde die Trennbarkeit eines wäßrigen 2-Phasensystems mit Maltase und aufgeschlossenen
Bierhefezellen in einem Tellerseparator untersucht.
Dazu wurde von 830 g Bierhefe, die durch dreimaliges
(229,2 χ ΙΟ6 mti insgesamt) ausgegangen. Es wurde mit
einem wässerigen System mit einem Gesamtvolumen von 2500 ml, 9% (224 g) Polyäthylenglykol (M 4000), 2%
(49 g) Dextran (Gew/Volumen; M 500 000) und 0,5 m
Kaliumphosphat-Puffer gearbeitet Der pH-Wert betrug 7Z
Es wurde mit vier Düsen einer Düsenlänge von 13,5 mm, einer Durchflußleistung von 200 ml/min und
einer Verweilzeit von 135 see bei Raumtemperatur gearbeitet
Die Aktivitätsausbeute der gesammelten Oberphasenfraktionen betrug 74,4% verglichen mit dem
Ausgangsmaterial (theoretisch 79%).
Es wurde die Trennbarkeit eines wässerigen 2-Phasensystems
mit Maltase und aufgeschlossenen Bierhefezellen in einem Tellerseparator untersucht
Dazu wurde von 800 g Bierhefe ausgegangen, die durch dreimaliges Auftauen und Einfrieren aufgeschlossen
worden war (Aktivität 197,1 χ 106InU insgesamt).
Es wurde mit einem wäßrigen System mit einem Gesamtvolumen von 2£ 1 (2400 g), 9% (216 g) Polyäthylenglykol
(W 4000), 1,75% (Gew./Gew. 42 g) Dextran r> (M 500 000) und 0,5 m Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,2)
gearbeitet.
Der verwendete Separator wies vier Düsen mit einer Düsenlänge von 13,5 mm auf. Es wurde bei einer
Durchflußleistung von 200 ml/min, einer Verweilzeit jo von 135 see und bei Raumtemperatur gearbeitet. Die
Aktivitätsausbeute der gesammelten Oberphasen betrug 70,8% verglichen mit dem Ausgangsmaterial
(theoretisch 73,4%).
Weitere Versuche mit 20% Zellmasse (Gesamtvoluj-,
men/Zellmasse = 5) zeigten, daß sich noch etwas höhere Ausbeuten erzielen lassen.
IV. Aminoacyl-tRNA-Synthetasen
Versuche 23 bis 28
Versuche 23 bis 28
Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungsi.oeffizien-
ICH Λ. IUt
nen Parametern in einem wässerigen 2-Phasensystem mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol und Dextran
4-, untersucht
Versuch 23; Fig. 17). Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K vom pH-Wert in Gegenwart
verschiedener Puffer untersucht Dazu wurde ein Zweiphasensystem mit _5,0% Polyäthylenglykol
(Rl 6000), 5,0% Dextran (M 500 000), 2mmol. DTE,
1,5 μπιοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase und 0,06 m Puffer
(Kaliumphosphat, Natriumeitrat, Tris-maleat Natriumcacodylat,
Natriumacetat bzw. Tris/HCl) verwendet
Beim Kaliumphosphat- und Natriumcacodylat-Puffer steigt der .K-Wert mit steigendem pH-Wert an. In
Gegenwart anderer Puffer ist der K-Wert vom pH-Wert unabhängig. Daraus ergibt sich, daß der
pH-Wert nicht als einziger Parameter die Verteilung des Enzyms beeinflußt
Versuch 24; F i g. 18). Es wurde die Abhängigkeit des
Verteilungskoeffizienten K von der Konzentration verschiedener Pufferionen untersucht Dazu wurde ein
System mit 5,0% Polyäthylenglyko! (M 6000), 5,0% Dextran (M 500 000), 2 mmol. DTE, 1,5 μπιοΐ. IsoleucyliRNA-Synthetase
und den folgenden Puffern untersucht: Kaliumphosphat (pH 7,5), Natriumeitrat (pH 6,3),
Natriumcacodylat (pH 7,0), Tris/HCl (pH 7,0) und Natriumacetat (pH 6,0).
Der K-Wert steigt nur mit steigender Konzentration des Phosphptpuffers an; bei den anderen Puffern ist er
von der Pufferkonzentration praktisch unabhängig.
(Versuch 25; Fi g. 19). Es wurde die Abhängigkeit ries
Verteilungskoeffizienten K vom durchschnittlichen Molekulargewicht des Polyäthylenglykols untersucht.
Dazu wurde ein^ System mit 9,2% Polyäthylenglykol,
6,3% Dextran (M 2 000 000), 73 mmol. Kaliumphosphat (pH 7,0), 2 mmol. DTE und 3,4 μηιοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase
verwendet.
Bei einem mittleren Molekulargewicht des Polyäthylenglykols
von kleiner als 20 000 steigt der K- Wert stark mit fallendem Molekulargewicht an. Das Enzym
bevorzugt mehr und mehr die Polyäthylenglykol-reiche Phase mit fallendem Molekulargewicht des Polyäthylenglykols.
(Versuch 26; F i g. 20). Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K vom mittleren Molekulargewicht
des Uextrans untersucht. Dazu wurde ein System mit 9,2% PoNäthylenglykol (M 6000), 6,2% Dextran,-73
mmol. Kaliumphosphat (pH 7,0), 2 mmol. DTE und 3,4 μΐηοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase verwendet.
Das Molekulargewicht des Dextrans übt wie das des Polyäthylenglykols einen Einfluß auf den K-Wert aus;
jedoch steigt der K-Wert mit steigendem Molekulargewicht des Dextrans an.
(Versuche 27 bis 28; Fig.21 bis 22). Es wurde die
Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von der Dextran-Konzentration und de·· Polyäthylenglykol-Konzentration
untersucht Dazu wurde ein Zweiphasensystem mit 10,2% Polyäthylenglykol (M 1550), Dextran
(M 2 000 000), 73 mmol. Kaliumphosphat (pH 7,0), 2 mmol. DTE und 2,8 μπιοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase
bzw. ein Zweiphasensystem mit Polyäthylenglykol (IvI 1550), 6,3% Dextran (U 2 000 000), 73 mmol. Kaliumphosphat
(pH 7,0), 2 mmol. DTE und 2,8 μηιοΙ.
Isoleucyl-tRNA-Synthetase verwendet.
Es wurde festgestellt, daß die Konzentrationen der Hochmolekularen in den untersuchten Bereichen keinen
s sehr großen Einfluß auf den Verteilungskoefflzienteti K
besitzen.
Es wurde 1 kg Escherichia coli MRE 600 in 0,05 m
ίο wäßrigem Kaliumphosphat (pH 8,0) suspendiert und
zweimal bei 600 kg/cm2 im Hochdruckhomogenisator aufgeschlossen. Die Protein-Konzentration betrug
47,2 mg/ml. Dieser Aufschluß wurde für verschiedene Versuche verwendet, für die Einzelheiten in Tabelle 14
angegeben sind.
Nach dem Phasendiagramm des Polyäthylenglykoi
(M 6000)/Kaliumphosphat-Systems sollte unter den Bedingungen von Probe 3 keine Phasentrennung
eintreten. Es ist jedoch bekannt, daß Zeilen oder 2(i Zelltrümmer als Polymere in die Phasendiagramme
eingehen. Bei Probe 3 trat eine deutliche Phasentrennung ein, wobei die Zelltrümmer in die hochviskose
Unterphase gingen.
,.. - Beispiel 9
Es wurde 1 kg Escherichia coli MRE 600 in 1,4 I (0,05 Mol) wäßrigem Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0)
suspendiert und wie in Beispiel 8 aufgeschlossen. Die Suspension wurde mit 656 g einer 50%igen Polyäthyjo
lenglykol-Lösung (M 6000) und 525 g einer 50%igen Dikaliumhydrogenphosphat-Lösung (pH 7,8) versetzt.
Die Phasen wurden in einem Tellerseparator mit einer Düsenlänge von 14,5 mm und einer Durchflußrate von
160 ml/min getrennt; Verweilzeit 169 see.
Versuch Nr. |
Polyäthylenglykol | Dextran | M | K2HPO4 | Oberphase | Unterphase | Ausbeute an Isoleucyl- tRNA-Svnthp- |
tase | |||||||
(%) M | (%) | (%) | (ml) | (ml) | (%) | ||
1 | 17 | 1550 | 4 | 2 000000 | - | 7,5 |
2 | 17 | 1550 | 3 | 2 000000 | - | 7,7 |
3 | 10 | 6000 | - | _ | 8 | 7,4 |
2,3
2,1
1,9
2,1
1,9
16
21
96
21
96
Es wurde eine gute Abtrennung der Zelltrümmer bei guter Enzymausbeute und gleichzeitiger Verbesserung
der spezifischen Aktivität um etwa den Faktor2 erzielt. Einzelheiten lassen sich der folgenden Tabelle 15 entnehmen.
Tabelle 15 | Volumen (ml) |
Protein (mg/ml) |
(%) | Aktivität (%) IRS |
LRS | PRS |
Probe | 2100 2640 |
41,6 16,4 |
100 49 |
100 82 |
100 82 |
100 100 |
Rohextrakt Oberphase |
||||||
Abkürzungen:
IRS = Isoleucyl-tRNA-Synthetase.
LRS = Leucyl-tRNA-Synthetase.
PRS = Phenylalanyl-tRNA-Synthetase.
LRS = Leucyl-tRNA-Synthetase.
PRS = Phenylalanyl-tRNA-Synthetase.
Es wurden 500 g Escherichia coli in 700 ml 0,05 mol.
wäßrigem KalhiTnphosphat-Puffer (pH 8,0) suspendiert
und durch dreimaliges Durchleiten durch eine Glasperlenmühle aufgeschlossen (Glasperlen 0,25 bis 0,5 mm,
5 l/h, 3000 UpM). Die erhaltene Suspension wurde auf
Werte von 10% Polyäthylenglykol (M 6000) und 8%
Kaliumphosphat (pH 7,8) eingestellt und in einem Separator wie in Beispiel 9 getrennt.
Es wurde wieder eine gute Abtrennung der Zelltrümnier von der Oberphase bei gleichzeitig hoher
Enzymausbeute und einer Verbesserung der spezifischen Aktivität ure. den Faktor 2 erzielt Einzelheiten
lassen sich der folgenden Tabelle 16 entnehmen.
Tabelle 16 ' |
Volumen
(ml) |
Protein
(mg/ml) |
(%) |
Aktivität ("/
IRS |
4)
LRS |
PRS |
Probe |
1050
1600 |
44,0
12,4 |
100
43 |
100
93 |
100
75 |
100
86 |
Rohextrakt
Oberphase |
||||||
IRS = Isoleucyl-tRNA-Synthetase.
LRS = Leucyl-tRNA-Synthetase.
PRS = Phenylalanyl-tRNA-Synthetase.
V.Phosphorylase
Beispiel 11
In diesem Beispiel wird die Gewinnung von Phosphorylase mit Hilfe eines wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systems beschrieben.
Dazu wurde eine bei der Pullulanase-Isolierung
entsprechend dem Herstellungsbeispiel und Beispiel 2 anfallende Unterphase (0,65 kg Zellmasse/l) im Verhältnis 1:2 mit Wasser verdünnt, gegebenenfalls mit 5 mg
DNAase/1 versetzt, um die DNA enzymatisch abzubauen, mehrere h lang gerührt und danach mit einem
Homogenisator bei einem Druck von 600 kg/cm2 aufgeschlossen. Die Phosphorylaseaktivität betrug
11 U/ml, der Proteingehalt 19 mg/ml und die spezifische
Aktivität 0,6 U/mg.
Es wurde ein Zweiphasensystem durch Mischen der folgenden Komponenten in den angegebenen Mengen
aufgebaut:
2,0 ml verdünnte Unterphase der Pullulanaseabtren-
nung (Herstellungsbeispiel) nach Aufschluß
0,9 ml 50%iges Polyäthylenglykol (M 1550)
0,6 ml (5 m) NaCI
0,5 ml (2^m) K2HPO4 (pH 9,4)
0,7 ml Wasser mit 5 μΙ 0-Mercaptoäthanol
4,7 ml resultierendes Gemisch (pH ca. 7ß)
Die Suspension wurde 1,5 min lang kräftig gemisch!
und 10 min lang mit ca. 4000 g zentrifugiert Dabei wurden 3,4 ml klare Oberphase und Iß ml Unterphase
erhalten, die die Zelltrümmer enthielt Die Phosphorylaseaktivität in der Oberphase betrug 5,5 U/ml, dei
Proteingehalt 7,7 mg/ml, die spezifische Aktivität 0,7 U/mg, die Anreicherung etwa 1,2 und die Ausbeute
84%.
35 | Dextran | — Polysaccharid aus Glucose, |
empirische Formel | ||
(C6H19O5),; | ||
Tris | - Tris-(hydroxymethyl)- | |
aminomethan; | ||
40 | DEAE-Dextran | — Diäthylaminoäthyl-dexträn; |
DEAE-Cellulose | - Diäthylaminoäthyl-cellulose; | |
U | - Enzym-Einheit,d.h.die | |
Enzymmenge, die 1 μΜοΙ | ||
Substrat in Produkt je | ||
45 | min umsetzt; | |
EDTA | - Athylendiamintetraessig- | |
säure (Dinatriumsalz); | ||
CTAB | «« Cetyltrimethylammonium- | |
bromid; | ||
50 | DTE | — 1,4-Dimercapto-2,3-butandiol |
PEG | - Polyäthylenglykol. |
Claims (1)
- Patentansprüche:1. Verfahren zur Abtrennung von Enzymen von Zielltrümmern oder Zellen, die diese Enzyme besitzen, wobei man die Zelltrümmer bzw. die Zellen so behandelt, daß die Enzyme in Lösung gehen, dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene System mit den Zelltrümmern bzw. Zellen und der Zellflüssigkeit zwischen verschiedene Phasen eines wäßrigen Mehrphasensystems(a) mit einem Gehalt an mindestens einem Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und Polysaccharide gebildeten Gruppe und mit mindestens einem anorganischen Salz; oder(b) mit einem Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrroifdone und Polysaccharide gebildeten Gruppe verteilt,die Phasen voneinander trennt, die Enzyme von den Hochmolekularen in der Enzymphase abtrennt und gegebenenfalls isoliert2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Hochmolekulare aus der durchPolypropylenglykol, Polyäthylenglykol, Methoxypolyäthylenglykol, Trimethylaminopolyäthylenglykol, Polyäthylenglykolsulfonat, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Methylzellulose, Äthylhydroxyäthyliellulosc.DEAE-Zellulose, AlkalicarboxymethyhxUuIose, Dextran, Hydroxypropyldextran, DEA S-Dextran, Dextransulfat, Alkalicarboxymethy !dextran und synthetisches Polysaccharid (M ca. 400 000, gewonnen durch Polymerisation von Rohrzucker) gebildeten Gruppe verwendet.3. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (a) mit einem Gehalt an einem gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht kleiner als 40 000 und insbesondere kleiner als 10 000 verwendet.4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein System gemäß (a) mit solchen Mengen an Wasser, Hochmolekularem und Salz verwendet, bei dem diese Komponenten allein nur eine Phase bilden.5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem Gehalt an einem gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther mit einem deutlich kleineren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des Enzyms verwendet, vorzugsweise mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht kleiner als 40 000, insbesondere kleiner als IO 000, besonders bevorzugt kleiner als 6000, z. B. von 5000 bis 1550, z. B. von etwa 4000.6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem Gehalt an einem gegebenenfalls substituierten Polysaccharid mit einem deutlich größeren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des Enzyms verwendet.7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem Gesamtgehalt an Polyäthylenglykol von 1 und mehr und vorzugsweiseί von 4 bis 9 Gew,-% verwendet8. Verfahren nach einem der Aüsprfiche 1,2, 5,6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem Gesamtgehalt an Dextran von 0,1 bis 15 und vorzugsweise vonin 0,1 bis 7 Gew.-% verwendet.9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,5,6,7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem zusätzlichen Gehalt an Phosphatieren verwendetr> 10. Verfahren nach mindestens einem dervorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensysiem mit einem Verhältnis von Gesamtvoluimen/Zellmasse >2, vorzugsweise > 5 verwendet2Ii U. Verfahren nach mindestens einem dervorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem mit einem pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise von 7 bis 8 verwendet2) 12. Verfahren nach mindestens einem dervorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phasen unter Verwendung eines Separators auftrennt13. Verfahren nach mindestens einem derjo vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß man die Hochmolekularen durch Fällung des Enzyms oder durch Phasenverteilung, Ultrafiltration, Dialyse, Gelpermeation, Adsorbentien, Ionenaustauscher oder Elektrophorese vom Enzymi") abtrennt.
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