DE2639129B2

DE2639129B2 - Verfahren zur Abtrennung von Enzymen

Info

Publication number: DE2639129B2
Application number: DE19762639129
Authority: DE
Inventors: Stefica 3300 Braunschweig Grandja; Helmut Dipl.-Chem. Dr. 3174 Meine Hustedt; Karl-Heinz Kroner; Maria-Regina Dipl.-Chem. Dr. Kula; Wolfgang 3321 Salzgitter Stach
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG
Priority date: 1976-08-31
Filing date: 1976-08-31
Publication date: 1979-02-15
Also published as: JPS5329992A; JPS5763083A; JPS6025116B2; DE2639129C3; BR7705813A; JPS5741907B2; DE2639129A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Enzymen von Zelltrümmern oder Zellen, die diese Enzyme besitzen.

Die Fest-Flüssig-Trennung zur Abtrennung von Zelltrümmern oder Zellen von Enzymlösungen ist noch immer ein technisches Problem, insbesondere wenn große Volumina gehandhabt werden müssen. Konventionelle Methoden für derartige Trennungen sind das Zentrifugieren und Filtrieren. Beide Methoden bieten Schwierigkeiten, die sich aus der Viskosität der anfallenden Suspensionen, aus der kolloidalen Natur der Komponenten und aus häufig geringen Dichteunterschieden zwischen suspendiertem Feststoff und Flüssigkeit ergeben und zu niedrigen Durchflußraten führen (vgl. Naeher&Thumin Spencer, Industrial Aspects of Biochemistry, 1974).

Beispielsweise wird bei der Abtrennung von Pullulanase von Klebsieila pneumoniae in einem ersten Schritt das Enzym von intakten Zellen mit Detergentien abgelöst. Dieser Schritt ist ohne Schwierigkeiten in beliebigem Maßstab durchführbar. Bei Versuchen zur Abtrennung der Zellen ergab sich jedoch, daß dafür relativ hohe g-Zahlen erforderlich sind, die im technischen Maßstab nicht realisiert werden können. Eine Abtrennung durch Filtration ist wegen der anwesenden Detergentien gleichfalls nur sehr schwierig durchzuführen. (Zum Stand der Technik vgl. DE-AS 45 342).

Aus Biochemistry, 1973, Band 12, Seiten 2525 bis 2530,

ist es bekannt, ein Enzym (Phospholipase A 1) aus Escherichia coli unter Anwendung einer Phasenverteilungs-Methode zu gewinnen. Man geht dabei so vor, daß man die Zellen homogenisiert, die Zellflüssigkeit durch Zentrifugieren abtrennt und danach dai Enzym aus der Zellmembran löst Zur Phasenverisilung werden Mehrphasensysteme mit einem Gehalt an Polypropylenglykol, Polyäthylenglykol, Trimethylaminopolyäthylenglykol, Polyäthylenglykolsulfonat, Ficoll und Dextran verwendet Abgesehen davon, daß diese Druckschrift kaum Hinweise für die Übertragbarkeit der vorgeschlagenen Lehre auf die Gewinnung anderer Enzyme gibt, läßt sich das Abzentrifugieren der Zellflüssigkeit in technischem Maßstab nicht durchführen. Das gilt auch für die aus Eur. J. Biochem., 1974, Band 46, Seiten 75 bis 81, und Eur. J. Biochem, 1974, Band 48, Seiten 63 bis 69, bekannten Phasenverteilungs-Methoden, bei denen entweder von gereinigten Enzymen oder von Hefelysat ausgegangen wird, das durch Zentrifugieren einer homogenisierten Hefesuspension erhalten wurde.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus Zellen in technischem Maßstab vorzusehen, bei dem man die Enzyme ohne vorhergehendes Abtrennen von Zellflüssigkeit, Zelltrümmern oder Zellen aus aufgeschlossenen oder >ί ganzen Zellen mit Hilfe einer Verteilung in einem Mehrphasensystem gewinnen kann. Bei diesem Verfahren soll von beliebigen Zellen ausgegangen werden können, um beliebige Enzyme abzutrennen, beispielsweise Pullulanase (Amylopectin-6-glucanohydrolase) so und Phosphorylase aus Klebsiella-Arten, Maltase (a-Glucosidase) z. B. aus Bierhefezellen und AminoacyltRNA-Synthetasen z. B. aus Escherichia coli.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß sich befriedigende Abtrennungen in wäßrigen Mehr- r> phasensystemen auch dann erhalten lassen, wenn man die Zellflüssigkeit nicht zuvor von den Zelltrümmern bzw. Zellen abtrennt.

Gemäß der Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Abtrennung von Enzymen von Zelltrümmern oder Zellen gelöst, die diese Enzyme besitzen, wobei man die Zelltrümmer bzw. Zellen so behandelt, daß die Enzyme in Lösung gehen; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene System mit den Zelltrümmern bzw. Zellen und der 4^r> Zellflüssigkeit zwischen verschiedenen Phasen eines wäßrigen Mehrphasensystems

(a) mit einem Gehalt an mindestens einem Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierten Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrro- >o lidone und Polysaccharide gebildeten Gruppe und mit mindestens einem anorganischen Salz; oder

(b) mit einem Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrro- μ lidone und Polysaccharide gebildeten Gruppe verteilt,

die Phasen voneinander trennt, die Enzyme von den Hochmolekularen in der Enzymphase abtrennt und gegebenenfalls isoliert. ω>

Man kann bei der Verfahrensvariante (a) beispielsweise ein Mehrphasensystem mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol verwenden. Bei einem Mehrphasensystem mit einem Gehalt an einem gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther kann ihr <>■> durchschnittliches Molekulargewicht kleiner als 40 000 und insbesondere kleiner als 10 000 sein.

Man kann beispielsweise ein Mehrphasensystem mit einem Gehalt an einem Sulfat z. B. einem Alkalisulfat, und/oder einem Phosphat verwenden, z. B. einem Alkaliphosphat, wie Kaliumphosphat

So kann beispielsweise ein Mehrphasensystem ein Hochmolekulares, wie Polyäthylenglykol, und ein Salz, wie Kaüumphosphat enthalten. Ein derartiges Mehrphasensystem ist beispielsweise zur Abtrennung von Enzymen, wie Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, von Escherichia coli geeignet Bei einem derartigen System kann man mit solchen Mengen an Wasser, Hochmolekularen und Salz arbeiten, bei denen diese Komponenten allein nur eine Phase bilden würden.

Bei der Verfahrensweise (b) kann man aus wirtschaftlichen Gründen ein Mehrphasensystem mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol und Dextran verwenden.

Als Hochmolekulare kann man einen gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther mit einem deutlich kleineren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des Enzyms verwenden, vorzugsweise mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht kleiner als 40 000, insbesondere kleiner als 10 000, besonders bevorzugt kleiner als 6000, z. B. im Bereich von 5000 bis 1550, beispielsweise von etwa 4000, und ein gegebenenfalls substituiertes Polysaccharid mit einem deutlich größeren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des Enzyms verwenden. (Die Pullulanase besitzt z. B. ein Molekulargewicht von etwa 145 000.1

Dadurch kann man erreichen, daß die Enzyme in die Polyalkohol- bzw. Polyätherphase gehen und daß sich diese Hochmolekularen beispielsweise durch Ultrafiltration leicht von den Enzymen abtrennen lassen.

In dem Mehrphasensystem kann der Gesamtgehalt an Polyäthylenglykol 1 und mehr und vorzugsweise 4 bis 9 Gew.-% und der Gesamtgehalt an Dextran 0,1 bis 15 und vorzugsweise 0,1 bis 7 Gew.-% betragen.

Durch die Zugabe von Phosphationen, wie Orthophosphat-(z. B. in Form der verschiedenen Kaliumphosphate), Pyrophosphat-, Polyphosphat- und/oder Metaphosphationen läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren in Abhängigkeit vom pH-Wert noch verbessern.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann von beliebigen Zellen ausgegangen werden, die das gewünschte Enzym enthalten. Für die Abtrennung von Pullulanase und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen kann man vorteilhaft ein Mehrphasensystem mit einem Gehalt an einem Hochmolekularen und einem anorganischen Salz, für die Abtrennung von Pullulanase, Phosphorylase und Maltase vorteilhaft ein Mehrphasensystem mit einem Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen verwenden.

Die Enzyme können beispielsweise durch Aufschließen von Zellen und/oder Behandeln mit Detergentien solubilisiert werden. Als Detergentien eignen sich z. B. Triton, Cholat, Desoxycholat und Dodecylsulfat.

Als im Mehrphasensystem unlösliche Anteile werden beispielsweise Zelltrümmer oder nicht aufgeschlossene Zellen angesehen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren können Salze zugegen sein, die z. B. auf Detergentien oder Puffer zurückgehen.

Es können alle Hochmolekularen verwendet werden, die bisher in Mehrphasensystemen zur Verteilung von Mikroorganismen oder hochmolekularen biochemischen Verbindungen eingesetzt wurden. Dazu sei u. a. auf A1 b e r t s s ο η, Partition of Cell Particles and Macromolecules, NY 1971, (und Folgeauflagen) hingewiesen.

Beispiele für Hochmolekulare, die sich beim erfin-

dungsgemäßen Verfahren verwenden lassen, sind
Polypropylenglykol, Polyäthylenglykol,
Methoxypolyäth ylenglykol,
Trimethylaminopolyäthylenglykol,
Polyäthylenglykolsulfonat, Polyvinylalkohol,
Polyvinylpyrrolidon, Methylzellulose,
Äthylhydroxyäthylzellulose, DEAE-Zellulose,
Alkylicarboxymethylzellulose, Dextran,
Hydroxypropyldextran, DEA E-Dextran,
Dextransulfat, Allkalicarboxymethyldextran und
Rohrzuckerpolymeres (M ca. 400 000).
Man kann ein Mehrphasensystem mit einem Verhältnis von Gesamtvolumen/Zellmasse ^2 und vorzugsweise S 5 verwenden.

Vorzugsweise arbeitet man bei einem pH-Wert von 6 bis 9 und insbesondere 7 bis 8.

Die Phasen lasss:n sich großtechnisch z. B. mit Separatoren trennen, beispielsweise mit Tellerseparatoren oder Dekantern.

Durch die Erfindung wird gezeigt, daß sich die Phasen auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von Zelltrümmern oder Zellen unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Separatoren trennen lassen. Damit steht eine hochentwickelte: Separator-Technologie für solche Enzymtrennungen zur Verfügung, die sehr hohe Durchsatzleistungen ermöglicht und damit Aktivitätsverluste von Enzymen durch lange Bearbeitungszeiten vermeidet.

Ein weiterer Vorteil der vorgeschlagenen Flüssig-Flüssig-Trennung ist außerdem darin zu sehen, daß durch die Verteilung zwischen mehreren Phasen nicht nur die unlöslichen Bestandteile von der gewünschten Enzymlösung getrennt werden, sondern eine zusätzliche Reinigung aufgrund der unterschiedlichen K-Werte der Proteine erzielt werden kann.

Die das erfindungsgemäße Mehrphasensystem aufbauenden Hochmolekularen und durch die Zellen miteingebrachten Proteine können durch Anwendung von Methoden abgetrennt werden, die in der Technik üblich sind. Als Beispiele seien die Fällung der Enzyme oder Phasenverteilung, Ultrafiltration, Dialyse, Gelpermeation, Adsorbentien, Ionenaustauscher oder Elektrophorese genannt.

Man kann das erfindungsgemäße Verfahren bei Raumtemperatur durchführen, insbesondere dann, wenn die Enzyme von den verwendeten Hochmolekularen stabilisiert werden.

Zum besseren Verständnis dieser Verhältnisse soll im folgenden auf einige der Fig. 1 bis 16 näher eingegangen werden. Es zeigt

F i g. 1 ein Phasendiagramm für ein System aus Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 6000), Dextran (mittleres Molekulargewicht 500 000) und Wasser;

F i g. 2 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase vom mittleren Molekulargewicht des Polyäthylenglykols in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;

Fi g. 3 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase vom pH-Wert und Pufferion in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;

F i g. 4 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Phosphatkonzentration in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;

F i g. 5 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Natriumcholat-Konzentration in einem wäßrigen Polyäthylenglykoi/Dextran-System; F i g. 6 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Natriumdesoxycholat-Kon zentration in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dex tran-System;

F i g. 7 den Grad der Abtrennung von Pullulanase vor Klebsiella-Zellen in der oberen Phase in Abhängigkeil von der Natriumcholat-Konzentration in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;

F i g. 8 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienter K für Pullulanase vom Gehalt an DEAE-Dextran in der

ίο unteren Phase eines wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systems;

F i g. 9 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienter K für Maltase von der Phosphatkonzentration in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;

Fig. 10 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase von der Kaliumchlorid-Konzentration in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;

F i g. 11 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase von der Natriumsulfat-Konzentration in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;

Fig. 12 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Maltase vom pH-Wert in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;

Fig. 13 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizien-

2"> ten K für Maltase von der Konzentration und vom mittleren Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglykols in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;

Fig. 14 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizien-

j(j ten K für Maltase von der Konzentration des Dextrans und vom mittleren Molekulargewicht des Polyäthylenglykols in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen;

Fig. 15 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizien-

j-, ten K für Maltase vom Anteil der Zellmasse am Gesamtsystem in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/ Dextran-System und

F i g. 16 die Abhängigkeit der Aktivitätsausbeute vom Anteil der Zellmasse am Gesamtsystem in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System;

Fi g. 17 bis 22 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Isoleucyl-tRNA-Synthetase von verschiedenen Parametern in einem Zweiphasensystem mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol und Dextran.

3 Fig. 1 zeigt also ein Phasendiagramm für wäßrige Systeme mit einem Gehalt an Dextran (mittleres Molekulargewicht 500 000) und Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 6000). Unterhalb der ausgezogenen Kurve tritt keine Phasentrennung auf, so daß in diesem Bereich ein homogenes System vorliegt. Oberhalb der ausgezogenen Kurve tritt jedoch eine Phasentrennung auf. Der Punkt A repräsentiert beispielsweise ein System mit 6 Gew.-% Dextran und 5 Gew.-% Polyäthylenglykol. Ein derartiges System bildet 2 Phasen aus, wobei der Punkt B der Zusammensetzung der Oberphase und der Punkt C der Zusammensetzung der Unterphase entspricht Jeder Punkt, der auf der die Punkte B, A und Cverbindenden Geraden liegt und die Gesamtzusammensetzung eines bestimmten Systems widerspiegelt, gilt für ein 2-Phasensystem gleicher Zusammensetzung der beiden Phasen, aber unterschiedlicher Volumina der Phasen. Das Verhältnis des Abschnitts B-A zum Abschnitt A-C der durch die Punkte Sund Cbegrenzten und durch den Punkt A laufenden Strecke entspricht dem Gewichtsverhältnis Unterphase/Oberphase. Da die Dichte der Phasen etwa 1 g/ml beträgt spiegelt das Verhältnis der Abschnitte B-A und A-C etwa das Verhältnis der

Volumina der beiden Phasen wider (zur Diskussion eines derartigen Phasendiagramms vergleiche auch Albertsson, Methods Microbiol. 5B, 385 bis 423 [1971]).

Auch für diese wäßrigen Zweiphasensysleme gilt der Nernstsche Satz:

wobei Co und C_u die Konzentration eines über die beiden Phasen verteilten Stoffs in der Oberphase bzw. in der Unterphase bedeuten. Die Verteilung kann auch allgemein mit der Bronsted-Gleichung beschrieben werden:

lnK=lambdaM/A:7:

wobei M das Molekulargewicht und T die absolute Temperatur bedeuten und lambda ein Faktor ist, der von den anderen Eigenschaften des Systems abhängt. Man ersieht aus der Gleichung, daß kleinste Änderungen von lambda bei großem Molekulargewicht drastische absolute Veränderungen des Verteilungskoeffizienten zur Folge haben.

Wenn es dementsprechend auch vor der vorliegenden Erfindung theoretisch denkbar war, Enzyme in einem Mehrphasensystem einseitig zu verteilen, so mußte noch die zusätzliche Aufgabe gelöst werden, auch Zelltrümmer oder Zellen (von denen die Enzyme getrennt werden sollen) einseitig, und zwar in eine andere Phase zu verteilen. Diese Aufgabe wurde erst durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Nachstehend soll das Verfahren gemäß der Erfindung anhand des als Beispiel gewählten Polyäthylenglykol/ Dextran-Systems für Pullulanase und Maltase als Beispiele für Enzyme noch näher erläutert werden. Für dieses System wurde festgestellt, daß die Zellen überraschenderweise vollständig in die dextranreiche untere Phase gehen. Für die Enzyme lassen sich beispielsweise Verteilungskoeffizienten von 0,3 ermitteln. Das bedeutet, daß sich die Konzentration eines Enzyms in der Oberphase zu seiner Konzentration in der Unterphase wie 0,3 :1 verhält. Ein System mit einem K-Wert von 0,3 ist also durchaus für eine Abtrennung der Enzyme über die Oberphase geeignet, da die Zellen vollständig in der Unterphase vorliegen. Allerdings muß mit einem nicht optimalen Volumenverhältnis der beiden Phasen gearbeitet werden, um eine befriedigende Trennung zu erreichen; das ergibt sich aus der folgenden Definition des Trenngrades C:

G=Co Vo/Cu V_U=K VJVu,

wobei V₀ und V₁₁ das Volumen der Oberphase bzw. der Unterphase bedeuten. Aus der vorstehenden Gleichung für den Trenngrad ergibt sich bei einem K-'Wert von 0,3, daß das Volumen der Oberphase etwa dreimal so groß wie das der Unterphase sein muß, um 50% eines verteilten Enzyms in der Oberphase anzureichern.

In Hinblick auf den Trenngrad ist es also vorteilhaft, mit einem Mehrphasensystem mit einem Gesamtgehalt an Polyäthylenglykol von mindestens 1 und vorzugsweise 4 bis 8 Gew.-% und mit einem Gesamtgehalt an Dextran von 0,1 bis 15 Gew.-% und vorzugsweise 0,1 bis 7 Gew.-% zu arbeiten. Hinzu kommt, daß bei gleichen Komponenten des Systems der Verteilungskoeffizient der Enzyme günstiger werden kann, wenn die Polyäthylenglykol-Konzentration fällt (vgl. F i g. 13).

Da es erwünscht ist, bei noch höheren /C-Werten als 03 zu arbeiten, sollen im folgenden noch weitere Parameter untersucht werden, mit denen der Verteilungskoeffizient der Enzyme zu höheren Werten verschoben werden kann. So kann man den F i g. 2 und 13 entnehmen, daß bei Verwendung von Polyäthylenglykol mit kleineren Kettenlängen der Verteilungskoef-) fizient steil ansteigt und Werte von ca. 1 erreicht werden können. (Dadurch wird unter einem anderen Gesichtspunkt hervorgehoben, daß es erfindungsgemäß vorteilhaft ist, Polyalkohole und Polyäther mit einem deutlich kleineren durchschnittlichen Molekulargewicht als das

ίο der Pullulanase zu verwenden, vorzugsweise mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht kleiner als 40 0000, insbesondere kleiner als 10 000, besonders bevorzugt kleiner als 6000, z. B. im Bereich von 5000 bis 1550, beispielsweise von etwa 4000).

r> Durch die Zugabe von Phosphationen, wie Orthophosphat-, Pyrophosphat-, Polyphosphat- und/oder Metaphosphaiionen, insbesondere Orthophosphationen, läßt sich der Verteilungskoeffizient in Abhängigkeit vom pH-Wert in überraschender Weise erhöhen (F i g. 3

2(i bis 4 und 9 bis 12).

Pullulanase

Wenn man bei diesem Enzym die Verteilung in einem wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-System bei einem 2) Verteilungskoeffizienten von 0,3, einer 100-mmolaren Natriumphosphat-Konzentration und einem Volumenverhältnis der Oberphase zur Unterphase von 10:1 durchführt, so ergibt sich für einen einzigen Verteilungsschritt folgende Ausbeute:

J(I

Ausbeute (%) = 100/(1 + VJ V₀ K)= 97.

Zweckmäßigerweise arbeitet man bei einer mehr als 0,001, vorzugsweise mehr als 0,005, insbesondere mehr als 0,02 m Phosphationen-Konzentration und bei einem ;> pH-Wert von 6 bis 9 und insbesondere 7 bis 8.

Daß sich das erfindungsgemäße Verfahren in besonders vorteilhafter Weise in Gegenwart von Phosphationen und in der Umgebung des Neutralpunktes durchführen läßt, ist aus folgenden Gründen überraschend.

1. Wenn man den pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 variiert, ohne Phosphationen zuzugeben, so läßt sich der Verteilungskoeffizient nicht wesentlich beeinflussen. Ferner führt eine Erhöhung der j lonenstärke beispielsweise mit Natriumchlorid zur Herabsetzung des Verteilungskoeffizienten, so daß bei hoher Natriumchlorid-Konzentration die dextranhaltige Unterphase bevorzugt ist (vgl. auch Fig. 10).

2. Pullulanase zeigt eine maximale Aktivität beim pH-Wert 5.

Da sich das beanspruchte Verfahren jedoch bei

höheren pH-Werten ohne Beeinträchtigung der PuIIuIa-

• nase-Aktivität durchführen läßt, wird angenommen, daß die Hochmolekularen das Enzym stabilisieren. Diese

Überlegungen gelten sinngemäß auch für andere Enzyme.

Das Phasendiagramm und der Verteilungskoeffizient hängen außerdem von der Temperatur ab. Da Pullulanase von den Hochmolekularen, z. B. Polyäthylenglykol und Dextran, stabilisiert werden kann, kann man ohne Aktivitätsverluste bei Raumtemperatur arbeiten. Auch diese Feststellungen gelten sinngemäß für andere Enzyme.

Pullulanase spaltet Glukose-a-l-6-Bindungen und wird zum Entzweigen und vollständigen Abbau von Stärken und Glycogenen zusammen mit anderen Enzymen eingesetzt, beispielsweise in Brauereien, bei

der Brotfabrikation und in der Analytik. Reine Pullulanase kann zur Linearisierung von Stärke und zur Gewinnung linearer Oligo- oder Polyglycane-«-l-4 führen.

Die für Pullulanase folgenden Beispiele erläutern auch den Fall, daß man bereits mit einem einzigen Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierten Polyalkohole, Polyäther, Polyester und Polysaccharide gebildete Gruppe und einem anorganischen Salz ein wäßriges Mehrphasensystem aufbauen kann, wobei man beispielsweise in Gegenwart von Polyäthylenglykol und Ammoniumsulfat und gegebenenfalls Phosphat arbeitet.

Maltase

Die Verhältnisse bei Maltase entsprechen im wesentlichen denen der Pullulanase, wobei die Effekte jedoch etwas weniger ausgeprägt sind. Für die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit mindestens zwei Hochmolekularen gilt: Wenn man in Gegenwart von Phosphationen arbeitet, so kann man eine Phosphationenkonzentration von mehr als 0,1, vorzugsweise mehr als 0,3 und insbesondere mehr als 0,5 m anwenden.

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

Die für Aminoacyl-tRNA-Synthetasen folgenden Beispiele erläutern weiter den Fall, daß man bereits mit einem einzigen Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierten Polyalkohole, Polyäther, Polyester und Polysaccharide gebildeten Gruppe und Zellen bzw. Zelltrümmern als weiterem »Hochmolekularen« ein wäßriges Mehrphasensystem aufbauen kann, wobei man beispielsweise in Gegenwart von Polyäthylenglykol und vorzugsweise in Gegenwart von Kaliumphosphat arbeitet.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.

M bedeutet das mittlere Molekulargewicht.

2(1

1»

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I. Allgemeines
Versuch 1 (Fig. 1)

Dieses Beispiel für ein Phasendiagramm für wäßrige Systeme mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 6000) und Dextran (M 500 000') beruht auf Angaben von Albertsson.

II. Pullulanase
Versuch2(Fig. 2)

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von Pullulanase vom mittleren Polyäthylenglykol-Molekulargewicht in einem wäßrigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol. Dextran (M 500 000) und Enzym untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 12:1 auf Gewichtsbasis. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 2 graphisch ausgewertet.

Versuch 3

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von Pullulanase vom mittleren Dextran-Molekulargewicht in einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran, Enzym und

(a) ohne Phosphat bzw.

(b) mit Phosphat (Konzentration 0,i m, pH 7,5)
untersucht.

Die eingesetzte Enzyrnlösurig hatte eine Aktivität von 20,8 U/ml, eine 0,02 m Salzkonzentration und einen pH-Wert von 7,5.

Die Systeme enthielten jeweils 10 Teile Polyäthylenglykol und 5 Teile Dextran und wurden mit Wasser auf 100 Teile ergänzt.

Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Aus ihnen ergibt sich, daß das mittlere Molekulargewicht des verwendeten Dextrans den Verteilungskoeffizienten K kaum beeinflußt.

Tabelle 1	Volumen	Volumen	U/ml	U/ml	A'- W ert
M Dextran	Oberphase	Unterphase	Oberphase	Unterphase
XlO⁵	(ml)	(ml)

a)	7,7	1,9	6,4	28,8	0,22
1,1	7,8	2,0	7,0	24,8	0,28
5,0	7,8	1,8	6,8	28,4	0,24
20,0	8,0	1,8	7,9	22,7	0,35
10,0»)
b)	7,5	2,0	4,5	3,9	1,15
1,1	7,4	2,1	4,6	3,6	1,28
5,0	7,6	2,0	4,5	3,7	1,22
20,0	7,8	1,6	4,3	5,1	0,80
10,0*)

*) Natriumdextransulfat

, . _x Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M

Versuch 4 (F ig. 3) _{65 500} 000), Enzym und

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizien- (a) Natriumphosphat bzw. ten K für Pullulanase vom pH-Wert und von (b) Tris/Acetat Pufferionen in einem wässerigen System mit einem untersucht

^»■mxaKx&mmri

Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf Gewichtsbasis und die Konzentration der Puffer (a) und (b) war jeweils lOOmmolar. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 3 graphisch ausgewertet.

Versuch 5 (F ig. 4)

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Phosphatkonzentration in einem wässerigen System mit einem _Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M 500 000), Enzym und Natriumphosphat untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf Gewichtsbasis. Der pH-Wert des Natriumphosphat-Puffers betrug 7,8. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 4 graphisch ausgewertet.

Versuch 6 (F ig. 5)

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienien K für Pullulanase von der Natriumcholat-Konzentration in einem wässerigen System mit einejn Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M 500 000), Natriumphosphat und Enzym untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf Gewichtsbasis; die Konzentration des Natriumphosphats war 100 mmolar und sein pH-Wert betrug 7,8. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 5 graphisch ausgewertet.

Versuch 7(Fig. 6)

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase von der Natriumdesoxycholat-Konzentration in einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (IvI 500 000), Natriumphosphat und Enzym untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9:1,25 auf Gewichtsbasis; die Konzentration des Natriumphosphats war 100 mmolar und sein pH-Wert betrug 7,8. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 6 graphisch ausgewertet.

Versuch8(Fig. 7)

Es wurde die Abtrennung von Pullulanase von K. pneumoniae-Zeüen, von denen das Enzym abgelöst worden war, in der oberen Phase eines wässerigen Systems mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M 500 000), Natriumphosphat und Zellen in Abhängigkeit von der Natriumcholat-Konzen-

tration untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf Gewichtsbasis und das Verhältnis von Zellen zu Puffer betrug 1 : 1.4: die Konzentration des Natriumphosphats war 200 mmolar und sein pH-Wert betrug 8,0. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 7 graphisch ausgewertet.

Versuch9(Fig. 8)

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Pullulanase vom Gehalt an DEAE-Dextran in der Dextranphase eines wässerigen Systems mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M 500 000), Natriumphosphat und Enzym untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9:1,25 auf Gewichtsbasis; die Konzentration des Natriumphosphats war lOOmmolar und sein pH-Wert betrug 7,8. Die erhaltenen Werte sind in F i g. S graphisch ausgewertet.

Herstellungsbeispiel

Es wurden Klebsiella pneumoniae/ellen mit dem l,4fachen Volumen eines wässerigen 0.5 m Natrium phosphat-Puffers (pH 8,0) suspendiert. Man cab I¹V Natriumcholat zu und rührte kriiftig 90 min lang bei Zimmertemperatur. Danach wog man 9°\ l'oKatlnlenglykol (M 4000) und 1,25% Dextran (M 5(X) (XX)) cm. mischte mit einem Mischer (Vibro-Mischer) etwa 10 min lang und zentrifugierte bei 12 000 UpM 20 min lang ab. Die zellfreie Oberphase ließ sich gut abgießen. Es wurde 48 h lang gegen fließendes Wasser dialysiert (Kühlraum).

Beispiel 1

Es wurde die Pullulanase-Ausbeute bei einer einstufigen Extraktion in einem wässerigen System mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol (M 4000), Dextran (M 500 000), Natriumphosphat und Enzym in Abhängigkeit von der Phosphatkonzentration untersucht. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Dextran betrug 9 :1,25 auf Gewichtsbasis und der pH-Wert des Natriumphosphats betrug 7,8. Das Gesamtvolumen des verwendeten Systems betrug 5 ml und die Aktivität der verwendeten Enzymlösung entsprach 231,4 LJ insgesamt.

Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 2 zu entnehmen.

Tabelle	2	Gefundene	Oberphase	Aktivität	(U total)	Unterphasc	Aktivität	(U total)	A- - ^c«	Aus
Proben	Phosphat-	Gesamt- aklivität	Vol.	(U/ml)	205,7	Vol.	(U/ml)	18,7	Λ *C₁₁*	beute
Nr.	Konzen tration	(U)	(ml)	45,7	213,9	(ml)	37,4	15,6		(%)
	(mmolar)	224,4	4,5	47,5	237,2	0,5	31,2	15,7	1,22	91,7
1	1	229,5	4,5	52,7	248,0	0,5	31,4	13,1	1,52	93,2
2	10	252,9	4,5	55,1	221,7	0,5	26,1	10,7	1,67	93,8
3	20	261,1	4,5	48,2	230,9	0,5	26,9	8,8	2,11	95,0
4	30	232,4	4,6 ·	50,2	227,2	0,4	22,0	5,3	1,79	95,4
5	40	239,7	4,6	49,4	249,8	0,4	13,3	5,8	2,28	96,3
6	50	232,5	4,6	55,5	256,9	0,4	11,6	4.7	3,70	97,7
7	100	255,6	4,5	58,4		0,5	7.9		4,78	97,7
8	200	261,6	4,4			0,6		7.39	98.2
9	300

Beispiel 2

Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes für PuUulanase vom Anteil der Zellmasse am Gesamtansatz in wäßrigen 2-Phasen ,ystemen untersucht Dazu wurden gefrorene Klebsiella-Zellen wie üblich behandelt.

mit Phosphatpuffer, Poiyäthylenglykol (M 4000) un Dextran (M 500 000) versetzt Die Phosphatkonzentra tion war 03 m. Danach wurde abzentrifugiert Di erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengt stellt

Tabelle 3	Dextran	Oberphase	Unterphase	Oberphase/ Unterphase	tf-Wert	Phosphat- pufTer/ Zellmasse	Gesamt volumen/ Zellmasse
Polyäthylen- giykol	(%)	(ml)	(m!)		(0,3 m Phosphat)	(Teile/Teile)	(ml/g)
(%)	2	4,6	5,4	0,85	1,92	0,7	2,0
9	2	5,5	3,7	1,5	2,00	1,0	2,6
9	2	6,0	3,4	1,7	2,69	1,4	3,2
9	2	6,9	3,3	2,1	2,66	2,0	3,9
9	2	6,8	2,8	2,4	3,06	2,5	4,6
9	2	7,0	2,4	2,9	2,96	3,0	5,3
9	2	7,8	2,5	3,1	2.80	4,0	6,6
9	2	8,0	2,3	3,5	3,00	5,5	8,5
9	2	8,65	1,05	8,2	-		keine Zellmasse
9

Wenn Zellmasse in einer Menge von etwa 25% und mehr vorliegt, muß man mit einer Verkleinerung des K-Wertes rechnen. Ferner verändert sich das Volumenverhältnis zugunsten der Unterphase, so daß es zu größeren Aktivitätsverlusten kommt.

Eine Zeilmassenkonzentration von etwa 25 bis 30% erscheint daher als zweckmäßig, zumal sich in diesem Bereich die Viskositätszunahme in Grenzen hält und sich mit Separatoren höhere Durchsatzleistungen als be größeren Zellmassenkonzentrationen erzielen lassen Mit den Werten der Tabelle 14 ergibt sich für ein« Suspension mit etwa 25% Zellmasse (Phosphatpuf fer : Zellmasse = 3) etwa folgende Ausbeute:

100/(1 + VJ V_nK)= 100/1,123 = 90%.

Beispiele 3bis4

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von PuUulanase von verschiedenen Parametern in einem wäßrigen Zweiphasensystem mit einem Gehalt an Poiyäthylenglykol und Ammoniumsulfat untersucht.

(Beispiel 3). Zur Bildung des Zweiphasensystems π Tabelle 4 zu entnehmen.

wurden Polyäthylenglykol (M 4000, 50%ige wäßrige Lösung), festes Ammoniumsulfat und jeweils 5 ml einei Enzymlösung (Reinheit 60%, pH 7,5, Salzkonzentratior ca. 0,02 m PO³-) eingesetzt. Die einzelnen Werte sine

Tabelle 4

(NH₄J₂SO₄	Poiyäthylen glykol	Λ-Wcrl	Aktivilätsaus- bculc in SaI/- phasc	Oberphase	Unterphasc
(% Gew./Gew.)	(M 4000; "A Gcw./Gew.)		(%)	(mi)	(ml)
8,5	16	0,37	56,5	-	-
8,5	18	0,40	45,5	3,6	1,1
9,5	14	0,37	60,4	3,0	',8
9,5	16	0,47	52,8	3,1	1,7
9,5	18	0,51	48,2	3,3	1,5
Il	11	0,33	79,0	2,2	2,5
11	12	0,38	69,4	2,4	2,3
Il	14	0,39	66,9	2,6	2,1
Il	16	1,08	43,4	2,4	2,2
11	18	2,38	23,2	2,6	2,1

	15	26	39 129	16	Oberphase	Unterphase

Fortsetzung	Polyäthylen
(NII₄)JSO₄	glykol	/f-Wert	Aktivitätsaus	(ml)	(ml)
			beute i.i Salz
	(M 4000;		phase	1,5	3,2
("/«üew./üew.)	% Gew./Gew.)		<%)	1.6	3,1
	8			1,8	2,8
12	9	0,28	88,2	2,0	2,7
12	10	0,27	84,6	2,1	2,5
12	12	0,29	77,6	2,2	2,4
12	14	0,73	52,8	2,3	2,3
12	16	0,93	44,2
12	18	1,10	30,1
12	9,36	7,8

(Beispiel 4). Zur Bildung_des Zweiphasensystems ca. 0,02 m PO₄ ³") und ein Kaliumphosphatpuffer (pH

wurden Polyäthylenglykol (M 4000, 50%ige wäßrige 20 7,5) eingesetzt. Die einzelnen Werte sind Tabelle 5 zu

Lösung), festes Ammoniumsulfat, jeweils 5 ml einer entnehmen. Enzymlösung (Reinheit 60%, pH 7,5, Salzkonzentration

Tabelle 5	Polyäthylen glykol	Kalium phosphat	tf-Wert	Aktivitätsaus beute in SaIz- phasc	Oberphase	Unter phase
(NlU)₂SO₄	(M 4000; % Gew./Gew.)	(mmol)		(%)	(ml)	(ml)
(% Gew./ Gew.)	14	-	0,38	58,5	3,0	1,6
9,5	14	10	0,29	69,9	2,8	1,9
9,5	14	20	0,42	62,9	2,8	2,0
9,5	14	30	0,31	72,5	2,6	2,1
9,5	14	50	0,40	67,1	2,6	2,1
9,5	14	100	0,88	52,1	2,4	2,3
9,5	14	200	6,47	12,9	2,3	2,3
9,5	14	300	42,63	1,1	2,1	2,6
9,5

Aus den Tabellen 4 bis 5 ergibt sich, daß sich die Pullulanase mit steigender Konzentration an Ammoniumsulfat und Polyäthylenglykol stärker in der Polyäthylenglykol-haltigen Oberphase löst. Ferner ist mit steigender Phosphat-Konzentration ein starker Anstieg des K-Werts zu erkennen.

Aufarbeitungsbeispiele 1 bis 3

Diese Beispiele sollen erläutern, daß für die Aufarbeitung der Pullulanase aus der Polyäthylenglykol-reichen Phase verschiedene Wege zur Auswahl stehen.

(Aufarbeitungsbeispiel i) Zu einer Polyäthylenglykolreichen Phase mit einem Gehalt an Pullulanase (Herstellungsbeispiel) wurden 18% Ammoniumsulfat zugegeben, wobei man ein neues Zweiphasensystem Polyäthylenglykol/Ammoniumsulfat erhielt. Die Pullulanase ging dabei quantitativ in die Salzphase über. Die beiden völlig klären Phasen konnten in einem Separator getrennt werden. Aus der unteren Phase wurde das Enzym durch Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration auf 35% ausgefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, in einem 20 mmolaren Phosphatpuffer gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die auf diese Weise erhaltene Pullulanase besaß eine spezifische Aktivität von 28 U/mg und war nach den Ergebnissen der Elektrophorese zu ca. 70% rein. Die Ausbeute betrug 78%. Das Präparat enthielt noch Spuren von Protease.

(Aufarbeitungsbeispiel 2) Aus einer dem Herstellungsbeispiel entsprechenden Oberphase wurde das Enzym an DEAE-Zellulose gebunden, nachdem durch Dialyse gegen Wasser die Detergentien entfernt

■»ο worden waren und die Salzkonzentration in der Lösung auf einen Wert von etwa 0,1 m (Phosphat) angehoben worden war. Die DEAE-Zellulose konnte leicht abfiltriert oder in einer Siebzentrifuge abgetrennt werden. Durch Waschen der DEAE-Zellulose mit Puffer wurde das Polyäthylenglykol praktisch vollständig entfernt. Die Pullulanase wurde anschließend mit einem Puffer ausreichender Salzkonzentration eluiert. Diese Arbeitsweise ist auch technisch durchführbar. Die Ausbeuten betrugen 30 bis 50%.

Mi (Aufarbeitungsbeispiel 3) Durch Zugabe von Dextran mit einem Gehalt an etwa 8% DEAE-Dextran zu einer Polyäthylenglykol-reichen Phase ließ sich ein neues Zwei-Phasensystem aufbauen. Bei diesem DEAE-Dextrangehalt von etwa 8% ist der Verteilungskoeffi.?.ient K

bi kleiner 0,05, so daß praktisch das gesamte Enzym in die Unterphase übergeführt wurde (vgl. F i g. 8). Durch geeignete Einstellung der Volumina ließ sich auf diesem Wege eine Konzentrierung erreichen.

Aufarbeitungsbeispiel 4

Tabelle 6

μΜοΙ CTAB/U Pulluianase

Akt.-Ausbeute

0,12 70

0,14 72

0,16 82

0,18 80

0,24 72

0,32 60

Aufarbeitungsbeispiel 6

(Abhängigkeit der CTAB-Fällung von der
Pullulanase-Konzentration)

Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt. Es wurde eine Pullulanase-Lösung (Reinheit ca. 70%; 42 U/ml, 0,02 m PO₄ ³", pH 7,5) mit steigenden Mengen einer 0,02 m Kaliumphosphatlösung (pH 7,5) verdünnt. Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend einem Molverhältnis von 0,16μΜο1/υ. Es wurde 15 min bei 0⁰C gerührt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert und in 0,5 m Kaliumphosphat (pH 74) gelöst Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 7 zu entnehmen.

Es wurde die Trennbarkeit eines 2-Phasen-Systems mit Pulluianase und Klebsiella-Zellen in einem Tellerse- ~> parator untersucht

Dazu wurde ein wässeriges 2-Phasensystem mit 10% Polyäthylenglykol (M 4000) und 2% Dextran (M 500 000) in einem Tellerseparator aufgetrennt Bei verschiedenen Versuchen mit 4 Düsen wurde eine optimsJe Düsenlänge von 13,5 mm und eine optimale Durchflußleistung von 200 mUmin ermittelt Bei dieser Durchflußleistung betrug die Verweilzeit ca. 135 sec Es wurde eine Reinheit der Oberphase von annähernd 100% bei einer Reinheit der Unterphase von ca. 82% und einem Verlust an Oberphase von ca. 2% erzielt

Pulluianase ließ sich zu ca. 80% mit einer spezifischen Aktivität von 5—8 U/mg gewinnen.

Aufarbeitungsbeispiel 5

(Bestimmung der optimalen CTAB-Konzentration)

Aus Vorversuchen war eine Abnahme der Pullulanase-Aktivitätsausbeute im Niederschlag der CTAB-Fällung mit größerer CTAB-Konzentration festgestellt worden. Im Hinblick auf eine Abhängigkeit der Fällung vom Mol-Verhältnis CTAB/Pullulanase wird die CTAB-Konzentration im Fällungsansatz im folgenden in μΜοΙ/U Pulluianase angegeben.

Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt. Es wurden jeweils 10 ml Pullulanase-Lösung (Reinheit 60 bis 70%, 0,02 bis 0,03 m PO₄- - -, pH 7,0,38 U/ml) mit steigenden Mengen einer 10%igen CTAB-Lösung versetzt und 15 min bei 0⁰C gerührt Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 0,5 m Kaliumphosphat (pH r> 7,5) gelöst Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 6 zu entnehmen.

Tabelle 7	U/ml	Akt-Ausbeute im Niederschlag
μΜοΙ CTAB/U	42,0 30,0 21,2 14,0 9,9	82% 79% 81% 54% 40%
0,16 0,16 0,16 0,16 0,16

Aufarbeitungsbeispiel 7
(Abhängigkeit der CTAB-Fällung vom pH-Wert)

Es wurden jeweils 5 ml einer 60 bis 70% reinen Pullulanase-Lösung (42 U/ml, 0,02 bis 0,03 m Kaliumphosphat, pH 7,5) mit 0,1 m Salzsäure bzw. 0,1 m Kaliumhydroxid auf pH-Wert von 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 bzw. 8,0 gebracht und auf 10 ml verdünnt Die daraus resultierenden Fällungsbedingungen waren: 0,02 bis 0,03 m PO₄ ³- (Cl-); variabler pH-Wert; 0,16 μΜοΙ CTAB/U Pulluianase; 20 bis 22 U/ml. Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung. Es wurde 15 min bei 0^cC gerührt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert und in 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst. Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 8 zu entnehmen.

Tabelle 8

40 μΜοΙ
CTAB/U

pH

U/ml	Akt-Ausbeute
	im Niederschlag
22,5	50
22,1	65
20,3	74
20,3	65
20,0	36

0,16 8,0

0,16 7,5

0,16 7,0

0,16 6,5

0,16 6,0

5» Aufarbeitungsbeispiel 8

(Abhängigkeit der CTA B- Fällung von der
Salzkonzentration und der lonenartdes Puffers)

Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt.

Es wurden jeweils 5 ml einer 60 bis 70% reinen Pullulanase-Lösung (ca. 42 U/ml, Salzkonzentration von 0,02 m PO₄ ³-) mit einer 1 m Kaliumphosphat-Lösung bzw. mit einer 1 m Ammoniumsulfat-Lösung (pH 7,0) auf ein Lösungsvolumen von 10 ml mit einer

bo Salzkonzentration entsprechend einer Molarität von 0,04, 0,06 und 0,08 gebracht. Die daraus resultierenden Fällungsbedingungen waren: 0,16 μΜοΙ CTAB/U Pulluianase, 20 bis 22 U/ml, pH 7,0 und variable Salzkonzentration. Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung. Es wurde 15 min bei 0^cC geiührt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert und in 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,0) gelöst. Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 9 zu entnehmen.

Tabelle 9

19

Salzkonz.	pH	μΜοΙ U/ml	Akt-Aus
		CTAB/U	beute im
			Nieder
			schlag

0,02 m PO₄ ³" 0,04 m PO₄ ³" 0,06 m PO₄ ³" 0,08 m Po₄ ³" 0,01 m PO₄ ³" Ί 0,0ImSO₄ ²"/ 0,01 m PO₄ ³" 1 0,03 m SO₄ ²" '

0,0ImPO₄ ³"! 0,05 m SO₄ ²" J

7,0 7,0 7,0 7,0

7,0 7,0 7,0

0,16 0,16 0,16 0,16

0,16 0,16 0,16

20,8 22,0 20,5 23,0

20,6 21,1 19,8

80%

60%

10%

2%

50% 3% 2%

Aufarbeitungsbeispiel 9

(Abhängigkeit der Aktivitätsausbeute und der

spezifischen Aktivität vom Auflösen des

CTAB-Niederschlages in Salzlösungen steigender

Salzkonzentrition)

Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt Es wurden jeweils 10 ml einer dialysierten Oberphase (Beispiel 11) auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf 15 ml verdünnt Die Fällungsbedingungen waren: 0,02 m PO₄ ³-, pH 7,0, ca. 30 U/ml, ca. 11 U/mg und 0,16 μΜοΙ CTAB/U. Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung. Es wurde 15 min bei O⁰C gerührt Die Niederschläge wurden abzentrifugiert und unter 15 min langem Rühren in Kaliumphosphat- bzw. Ammoniumsulfat-Lösungen mit steigenden Konzentrationen gelöst Die erhaltenen Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 10 zu entnehmen.

Tabelle 10

Salzlösung

Salzkonzentration

Akt-Ausbeute Spez. Akt

Bemerkungen

(NH₄J₂SO₄ (NH₄)jSO₄ (NH₄J₂SO₄

(NH₄J₂SO₄ (NH₄J₂SO₄

(K₇H)₁PO₄ (K₁H)₃PO₄ (K,H),PO₄ (K₁H)₁PO₄ (K₁H)₃PO₄ (K₅H)₁PO₄ (K₁H)₁PO₄

0,05 m 0,10 m 0,15 m

0,20 m 0,25 m

0,05 m 0,10m 0,15 m 0,20 m 0,30 m 0,40 m 0,50 m

13% 60% 65%

73% 74%

3% 22% 34% 40% 56% 67% 73% U/mg

U/mg

U/mg
U/mg
U/mg
U/mg
27U/mg|

U/mg 1
U/mgj

ungelöster Rückstand
ungelöster Rückstand
geringe Mengen
ungelöster Rückstand

geringe Mengen
ungelöster Rückstand

ungelöster Rückstand
ungelöster Rückstand
ungelöster Rückstand
ungelöster Rückstand

geringe Mengen
ungelöster Rückstand

Aufarbeitungsbeispiele 10 bis

(CTA B- Fällungs versuche mit verschiedenen Ausgangslösungen)

In den folgenden Versuchen wurde Pullulanase unter den in den Aufarbeitungsbeispielen 5 bis 9 gefundenen optimalen Bedingungen aus verschiedenen Ausgangslösungen gefällt.

(Aufarbeitungsbeispiel 10) Ausgangslösung: 70 ml dialysierte Oberphase (Herstellungsbeispiel), Saizkonzentration entsprechend 0,02 bis 0,03 m PO₄ ³-, pH 7,0, Aktivität 72 U/ml, spezifische Aktivität nach einer Gel-Elektrophorese 3,6 U/mg( =9% reine Pullulanase).

Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer lO°/oigen CTAB-Lösung entsprechend 0,18 μΜοΙ CTAB/U Pullulanase. Es wurde ca. 2 h lang bei 0°C gerührt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 50 ml 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst.

Es wurden folgende analytischen Werte erhalten: Aktivitätsausbeute 85 U/ml = 80%, spezifische Aktivität ca. 21 U/mg ( =52%), Reinigungsfaktor 5,8 (Reinigungsfaktor= spezifische Aktivität im gelösten Niederschlag/spezifische Ausgangsaktivität).

(Aufarbeitungsbeispiel U) Ausgangslösung: 50 ml dialysierte Oberphase (Herstellungsbeispiel), Salzkonzentration entsprechend 0,03 m PO₄ ³-, pH 7,0, Aktivität 42 U/ml, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 12 U/mg (30%).

Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend 0,16 μΜοΙ CTAB/U Pullulanase. Es wurde ca. 1 h lang bei 0⁰C gerührt Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 10 ml 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst.

Es ergaben sich folgende analytischen Werte: Aktivitätsausbeute 147 U/ml = 70%, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 30 U/mg ( =75%), Reinigungsfaktor 2,5.

Bei Tests auf Protease-Aktivität wurden im Ausgangsmaterial Spuren ermittelt, während im gelösten Niederschlag nach CTAB-Fällung kein Nachweis geführt werden konnte. Bei Tests auf alpha-Amylase (P'iadebas alpha-Amylasetest/Pharmacia) wurde im Ausgangsmaterial ein Wert von 30 U/l = 0,03 U/ml ermittelt, während im gelösten Niederschlag nach CTAB-Fällung kein Nachweis geführt werden konnte.

(Aufarbeitungsbeispiel 12) Ausgangslösung: 20 ml

dialysierte Oberphase (Herstellungsbeispiel), Salzkonzentration 0,03 m PO₄ ³", pH 7,0, Aktivität 28 U/ml, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 8,4 U/mg (21 o/o).

Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend 0,18μΜοΙ/υ Pullulanase. Es wurde ca. 15 min bei 4°C gerührt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 20 ml 0,5 m Kaliumphosphat (pH 7,5) gelöst.

Es ergaben sich folgende analytischen Werte: Aktivitätsausbeute 22,5 U/ml = 80%, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 23 U/mg (= 58%), Reinigungsfaktor 2,8.

(Aufarbeitungsbeispiel 13) Ausgangslösung: 15 ml einer Oberphase (Herstellungsbeispiel), die über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze ca. M 100 000/M 300 000) dialysiert wurde; Salzkonzentration 0,02 m PO₄ ³" pH 7,5, Aktivität 19 U/ml, spezifische Aktivität nach Gel-Elektrophorese 23 U/mg (= 58%), spezifische Aktivität nach L ο w r y 25 U/mg (= 62%).

Die Fällung erfolgte durch Zugabe einer 10%igen CTAB-Lösung entsprechend 0,16μΜο1/υ Pullulanase.

Es wurde ca. 15 min bei 0⁰C gerührt. Der Niederschlaj wurde abzentrifugiert und in 10 ml 0,5 m Kaliumphos phat N-Cetylpyridiniumchlorid(pH 7,5) gelöst.

Es ergaben sich folgende analytischen Werte Aktivitätsausbeute 22,8 U/ml = 80%, spezifische Aktivi tat nach Gel-Elektrophorese 34 U/mg (= 85%), spezifi sehe Aktivität nach Lo wry 36 U/mg (= 90%), Reini gungsfaktor 1,45.

Tests auf alpha-Amylase-Aktivität und auf Protease

κι Aktivität waren negativ.

Aufarbeitungsbeispiel 14

Es wurde die Fällbarkeit von Pullulanase mi verschiedenen Kationen von Stickstoffbasen untersucht r> Es wurde von einer Enzymlösung mit folgender Werten ausgegangen: Aktivität 20,8 U/ml, Salzkonzen tration 0,02 m PO₄ ³-, pH 7,5. Der Niederschlag wurde jeweils in 0,4 m Natriumchlorid gelöst.

Von den Fällungsmitteln wurde jeweils eine 10%ige 2(i wässerige Lösung hergestellt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgender Tabelle 11 zu entnehmen.

Tabelle Il

Probe I-ällungsmittel

% Akt. im % Akt. in
Niederschlag Lösung

Bemerkungen

Tetramethylammoniumchlorid

N-Dodecylpyridiniumchlorid
N-Cetylpyridiniumchlorid

80
82

85

20 6

kein
Niederschlag

Aufarbeitungsbeispiel 15

In diesem Beispiel wird die Qualität von Fällungen von Pullulanase durch Cetyltrimethylammoniumbromid, N-Dodecylpyridiniumchlorid und N-Cetylpyridiniumchlorid verglichen.

Als Ausgangslösung wurde eine durch Ultrafiltration über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze ca. MlOOOOO) konzentrierte Lösung verwendet (ca.

Tabelle 12

35 U/ml, ca. 31% Pullulanase im löslichen Protein, 0,05 m Kaliumphosphat, pH 7,5).

Die Fällung erfolgte jeweils durch Zugabe von 0,2% (Gewicht/Gewicht) des Fällungsmitlels entsprechend 0,15 bis 0,20 μΜοΙ/U Pullulanase. Es wurde 15 min lang bei etwa 0⁰C gerührt. Die Niederschläge wurden in 0,4 m Natriumchlorid gelöst.

Die Ergebnisse können der folgenden Tabelle 12 entnommen werden.

Fällungsmittel

Akt. im	Akt. in	Pull. n. Gel.	Reim-
Niederschlag	Lösung	im Protein-	gungs
(%»	(%)	Niederschlag	faktor
53	26	61	1,97
80	20	48	1,54
82	6	53	1,70

Cetyltrimethylammoniumbromid
N -Dodecyl py ridi niumchlorid
N-Cetylpyridiniumchlorid

Die Fällung mit CTAB lieferte hinsichtlich des Reinigungsfaktors das beste Ergebnis. Weitere Versuche zeigten bessere Ausbeuten.

Vergleichsbeispiel 1

Es wurde ein System nach Albertsson, Biochemistry 12, 2525 (1973) verwendet Das System enthielt 6,7% Dextran (M 500 000), 8,0% Rohrzuckerpolymerisat (M ca. 400 000) und 5,3% Polyäthylenglykol (M 6000) und stellte ein Zwei-Phasensystem dar. Es b5

wurde eine Pullulanase-Lösung mit einer Aktivität vor 20,8 U/ml einer 0,02 m Salzkonzentration und einen pH-Wert von 7,5 eingesetzt
Der Verteilungskoeffizient betrug 0,66.

Vergleichsbeispiel 2

Es wurde ein System nach Albertsson, Biochemistry 12, 2525 (1973) mit einem Gehalt an 5% Dextrar (M 500 000), 6% Rohrzuckerpolymerisai

(M ca. 400 000), 4% Polyäthylenglykol (M 6000) unc

25% Polypropylenglykol (M 2020) angewendet, wobei ein Drei-Phasensystem erhalten wurde. Dabei wurde eine Pulluianese-Lösung mit einer Aktivität von 20,8 U/ml, einer 0,02 m Salzkonzentration und einem pH-Wert von 7,5 verwendet.
Die Pullulanase war wie folgt verteilt:

Oberphase:

Mittelphase:

Unterphase:

1,3 U/ml;

5,2 U/ml;

16,2 U/ml.

Daraus ergeben sich folgende Verteilungskoeffizienten:

K, = CJCm₁W +Cu=0,06
K₂ = CWG,+C₁₁ = 0,30

K₃ = C₁ZC₀+CW= 2,49

K₅=

Cu=0,32

Vergleichsbeispiel 3

Es wurde ein System nach Albertsson (Biochemistry 12, 2525, insbesondere 2527 rechts [1973] angewendet. Dazu wurden 20 g Klebsiella pneumoniae-Zellen in 150 ml (statt 1500 ml) mit Konzentrationen von 1% (Gewicht/Volumen) Octylphenol-polyäthylenglykoläther, 2 mol. Natriumrhodanid, 1 mmol. EDTA und lOmmol. Tris (pH 8,0) 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Suspension wurden 22,2 g Dextran (M 500 000) und 17,8 g Polyäthylenglykol (M 6000) gegeben.

Es fand eine einwandfreie Auftrennung in zwei Phasen statt. Die Zellen befanden sich in der Unterphase. Der Pullulanase-Aktivitätstest wurde jedoch durch das anwesende Natriumrhodanid empfindlich gestört. (Die Verwendung des als Ersatz für Natriumrhodanid empfohlenen Natriumchlorids [I.e. Seite 2526 rechts] befriedigt auch nicht, da kleine Verteilungskoeffizienten erhalten werden.)

III.Maltase
Versuche 10 bis 15

Es wurde Bierhefe dreimal bei — 20⁰C eingefroren und bei +4°C aufgetaut. Der pH-Wert wurde mit Ammoniak bei 6,2 gehalten. Der klar zentrifugierte Überstand diente als Ausgangslösung für wässerige 2-Phasensysteme. Die Phasen wurden mit einer Tischzentrifuge getrennt (ca. 5 min bei 3800 U/min und 1850 g).

Die Maltase wurde mit Hilfe des Pseudosubstrates 4-Nitrophenylalpha-D-glucopyranosid (PNPG) bei 30°C unter Messung der Extinktionszunahme bei 400 nm bestimmt (eine Einheit entspricht einem Umsatz von 1 μΜοΙ PNPG/min bei 30° C).

(Versuche 10 bis 11; Fig.9). Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes von der Phosphat-Konzentration und dem Polyäthylenglykol-Molekulargewicht untersucht Dazu wurde mit einem wässerigen Polyäthylenglykol/Dextran-System mit einem Gesamtvolumen von 5 ml, 7% Polyäthylenglykol, (M 4000 bzw. 6000), 2£% Dextran (Gew^Gew.; M 500 000), ca. 0,1 ml Enzymlösung und einem Kaliumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,8 gearbeitet Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 9 graphisch wiedergegeben.

(Versuche 12 bis 13; Fi g. 10) Es wurden die Versuche 10 bis 11 mit der Ausnahme wiederholt, daß in Gegenwart von Kaliumchlorid in steigenden Mengen und 0,067 mol. Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,8) gearbeitet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 10 graphisch wiedergegeben.

(Versuche 14 bis 15; Fig. 11) Es wurden die Versuche 10 bis 11 mit der Ausnahme wiederholt, daß in Gegenwart von Natriumsulfat in steigenden Mengen und 0,067 mol. Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,8) gearbeitet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 11 graphisch wiedergegeben.

Versuche 16 bis 18 (F ig. 12)

Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes für Maltase vom pH-Wert untersucht (Aufschluß vergleiche Versuche 10 bis 15). Dazu wurde in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen mit

7% Polyäthylenglykol (M 4000) und
2,5% Dextran (Gew./Gew.; M 500 000)
(Versuch 16),

7% Polyäthylenglykol (M 6000) und
2(i 2,5% Dextran (Gew./Gew.; M 5 000 000)
(Versuch 17) bzw.

9% Polyäthylenglykol (M 4000) und
1,25% Dextran (Gew./Gew.; M 500 000)
(Versuch 18) und

mit jeweils einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, ca. 0,1 ml Enzymlösung und 0,067 mol. Kaliumphosphat-Puffer gearbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 12 graphisch wiedergegeben.

^S" Versuche 19 bis 20(F ig. 13)

Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes für Maltase von der Konzentration und vom mittleren Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglykols untersucht

si (Aufschluß vergleiche Versuche 10 bis 15). Dazu wurde in einem wässerigen Polyäthylenglykol/Dextran-System mit einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, steigenden Mengen an Polyäthylenglykol (M 4000 bzw. 6000), 2,5% Dextran (Gew./Gew.; M 500 000), ca. 0,1 ml

4(i Enzymlösung und 0,067 mol. Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,8) gearbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 13 graphisch wiedergegeben.

Versuche 21 bis 22 (F ig. 14)

-> Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes für Maltase von der Dextran-Konzentration und dem mittleren Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglykols untersucht (Aufschluß vergleiche Versuche 10 bis 15). Dazu wurde mit wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-

j(i Systemen mit einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, 7% Polyäthylenglykol (Gew7Gew.; M 4000 bzw. 6000), steigenden Dextran-Mengen (GewiGew.; M 500 000), ca. 0,1 ml Enzymlösung und 0,067 mol. Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,8) gearbeitet Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 14 graphisch wiedergegeben.

Beispiel 5(Fig. 15bis 16)

Es wurde die Abhängigkeit des K-Wertes und der Aktivitätsausbeute für Maltase vom Anteil der Zellmas-

bo se am Gesamtansatz untersucht

Dazu wurde Bierhefe viermal aufgetaut und eingefroren (Aktivität ca. 47 143 mU/g). Es wurde in wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systemen mit einem Gesamtvolumen von ca. 5 ml, 9% Polyäthylenglykol

b5 (M 4000), 2% Dextran (Gew/Volumen; M 500 000) und 0,5 mol. Kaliumphosphat-Puffer gearbeitet Der pH-Wert betrug ca. 7,2. Die Zellmenge variierte. Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 13 zu entnehmen.

Tabelle 13

Abhängigkeit des /T-Wertes und der Aktivitätsausbeute für Maltase vom Verhältnis Gesamtvolumen/Gewicht eingesetzter Zellmasse

Gesamt- Oberphase Unterphase Oberphase/ Aktivität

volumen/ Unterphase

Zellmasse Oberphase Unterphase

(ml/g)

(ml)

LmlJ |mU/ml] [niU/ml]

Ausbeute in der Oberphasc

1	11,1	3,7
2	9,1	3,6
3	7,0	3,5
4	5,4	3,6
5	4,2	3,3
6	3,3	3,4
7	2,0	2,3

1,3
1,5
1,5
1,8
2,0
2,2
2,7

2,85	5 000	2 143	2,33
2,40	6 429	3214	2,00
2,33	8215	3 571	2,30
2,00	11 071	4714	2,35
1,65	13 572	6 929	1,96
1,55	16 429	10 929	1,50
0,85	15 000	22 857	0,66

87,2 87,7 86,0 85,0 76,0 70,0 35,0

Die Versuche zeigten, daß bei einem Zellanteil im Bereich; von ca. 20% des Gesamtvolumens (Gesamtvolumen/Zellmasse [ml/g] = 5) eine Aktivitätsausbeute im Bereich von 75 bis 85% möglich ist. Die Hefezellen lagen bei allen Versuchen in der Unterphase vor, die noch gut fließfähig war. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den F i g. 15 bis 16 graphisch wiedergegeben.

Weitere Versuche mit frisch zubereiteter Hefe brachten ein noch etwas günstigeres Volumenverhältnis.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wurde die Trennbarkeit eines wäßrigen 2-Phasensystems mit Maltase und aufgeschlossenen Bierhefezellen in einem Tellerseparator untersucht.

Dazu wurde von 830 g Bierhefe, die durch dreimaliges Auftauen und Einfrieren aufgeschlossen worden war (229,2 χ 10⁶mU insgesamt) ausgegangen. Es wurde mit einem wässerigen System mit einem Gesamtvolumen von 2500 ml, 9% (224 g) Polyäthylenglykol (M 4000), 2% (49 g) Dextran (GewVVolumen; M 500 000) und 0,5 m Kaliumphosphat-Puffer gearbeitet. Der pH-Wert betrug 7,2.

Es wurde mit vier Düsen einer Düsenlänge von 13,5 mm, einer Durchflußleistung von 200 ml/min und einer Verweilzeit von 135 see bei Raumtemperatur gearbeitet.

Die Aktivitätiausbeute der gesammelten Oberphasenfraktionen betrug 74,4% verglichen mit dem Ausgangsmaterial (theoretisch 79%).

4(1

^r>5

Beispiel 7

Es wurde die Trennbarkeit eines wässerigen 2-Phasensystems mit Maltase und aufgeschlossenen Bierhefezellen in einem Tellerseparator untersucht

Dazu wurde von 800 g Bierhefe ausgegangen, die durch dreimaliges Auftauen und Einfrieren aufgeschlossen worden war (Aktivität 197,1 χ 10⁶HiU insgesamt). Es wurde mit einem wäßrigen System mit einem Gesamtvolumen von 2,21 (2400 g), 9% (216 g) Polyäthy-

b0

b5 lenglykol (M 4000), 1,75% (GewVGew. 42 g) Dextran (M 500 000) und 0,5 m Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,2) gearbeitet.

Der verwendete Separator wies vier Düsen mit einer Düsenlänge von 13,5 mm auf. Es wurde bei einer Durchflußleistung von 200 ml/min, einer Verweilzeit von 135 see und bei Raumtemperatur gearbeitet. Die Aktivitätsausbeute der gesammelten Oberphasen betrug 70,8% verglichen mit dem Ausgangsmaterial (theoretisch 73,4%).

Weitere Versuche mit 20% Zellmasse (Gesamtvolumen/Zellmasse = 5) zeigten, daß sich noch etwas höhere Ausbeuten erzielen lassen.

IV. Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Versuche 23 bis 28

Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K für Isoleucyl-tRNA-Synthetase von verschiedenen Parametern in^einem wässerigen 2-Phasensystein mit einem Gehalt an Polyäthylenglykol und Dextran untersucht

Versuch 23; Fig. 17). Es¹ wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K vom pH-Wert in Gegenwart verschiedener Puffer untersucht. Dazu wurde ein Zweiphasensystem mit _5,0% Polyäthylenglykol (M 6000), 5,0% Dextran (M 500 000), 2 mmol. DTE, 1,5 μπιοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase und 0,06 m Puffer (Kaliumphosphat, Natriumcitrat, Tris-maleat, Natriumcacodylat, Natriumacetat bzw.Tris/HCl) verwendet.

Beim Kaliumphosphat- und Natriumcacodylat-Puffer steigt der K-Wert mit steigendem pH-Wert an. In Gegenwart anderer Puffer ist der K-Wtrt vom pH-Wert unabhängig. Daraus ergibt sich, daß der pH-Wert nicht als einziger Parameter die Verteilung des Enzyms beeinflußt

Versuch 24; Fig. 18). Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von der Konzentration verschiedener Pufferionen untersucht Dazu wurde ein System mit 5,0% Polyäthylenglykol (M 6000), 5,0% Dextran (M 500 000), 2 mmol. DTE, 1,5 μΐηοΐ. IsoleucyltRNA-Synthetase und den folgenden Puffern untersucht: Kaliumphosphat (pH 74), Natriumcitrat (pH 63), Natriumcacodylat (pH 7,0), Tris/HCl (pH 7,0) und Natriumacetat (pH 6,0).

Der K-Wert steigt nur mit steigender Konzentration des Phosphatpuffers an; bei den anderen Puffern ist er von der Pufferkonzentration praktisch unabhängig.

(Versuch 25; F i g. 19). Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K vom durchschnittlichen Molekulargewicht des Polyäthylenglykols untersucht. Dazu wurde ein_ System mit 9,2% Polyäthylenglykol, 6,3% Dextran (M 2 000 000), 73 mmol. Kaliumphosphat (pH 7,0), 2 mmol. DTE und 3,4 μίτιοΙ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase verwendet.

Bei einem mittleren Molekulargewicht des Polyäthylenglykols von kleiner als 20 000 steigt der K-Wert stark mit fallendem Molekulargewicht an. Das Enzym bevorzugt mehr und mehr die Polyäthylenglykol-reiche Phase mit fallendem Molekulargewicht des Polyäthylenglykois.

(Versuch 26; F i g. 20). Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K vom mittleren Molekulargewicht des Dextrans untersucht._Dazu wurde ein System mit 9,2% Polyäthylenglykol (M 6000), 6,2% Dextran,· 73 mmol. Kaliumphosphat (pH 7,0), 2 mmol. DTE und 3,4 μπιοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase verwendet.

Das Molekulargewicht des Dextrans übt wie das des Polyäthylenglykols einen Einfluß auf den K-Wert aus; jedoch steigt der K-Wert mit steigendem Molekulargewicht des Dextrans an.

(Versuche 27 bis 28; Fig.21 bis 22). Es wurde die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten K von der Dextran-Konzentration und der Polyäthylenglykol-Konzentration untersucht. Dazu wurde_ein Zweiphasensystem mit 10,2% Polyäthylenglykol (M 1550), Dextran (U 2 000 000), 73 mmol. Kaliumphosphat (pH 7,0), 2 mmol. DTE und 2,8 μπιοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase bzw. ein Zweiphasensystem mit Polyäthylenglykol (M 1550), 6,3% Dextran (M 2 000 000), 73 mmol. Kaliumphosphat (pH 7,0), 2 mmol. DTE und 2,8 μπιοΐ. Isoleucyl-tRNA-Synthetase verwendet.

Es wurde festgestellt, daß die Konzentrationen der Hochmolekularen in den untersuchten Bereichen keinen sehr großen Einfluß auf den Verteilungskoeffizienten K besitzen.

Beispiel 8

Es wurde 1 kg Escherichia coli MRE 600 in 0,05 m wäßrigem Kaliumphosphat (pH 8,0) suspendiert und zweimal bei 600 kg/cm² im Hochdruckhomogenisator aufgeschlossen. Die Protein-Konzentration betrug 47,2 mg/ml. Dieser Aufschluß wurde für verschiedene Versuche verwendet, für die Einzelheiten in Tabelle 14 angegeben sind.

Nach dem Phasendiagramm des Polyäthylenglyko! (M 6000)/Kaliumphosphat-Systems sollte unter den Bedingungen von Probe 3 keine Phasentrennung eintreten. Es ist jedoch bekannt, daß Zellen oder Zelltrümmer als Polymere in die Phasendiagramme eingehen. Bei Probe 3 trat eine deutliche Phasentrennung ein, wobei die Zelltrümmer in die hochviskose Unterphase gingen.

- Beispiel 9

Es wurde lkg Escherichia coli MRE 600 in 1,41 (0,05 Mol) wäßrigem Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0) suspendiert und wie in Beispiel 8 aufgeschlossen. Die Suspension wurde mit 656 g einer 50%igen Polyäthylenglykol-Lösung (M 6000) und 52.5 g einer 50%igen Dikaliumhydrogenphosphat-Lösung (pH 7,8) versetzt. Die Phasen wurden in einem Tellerseparator mit einer Düsenlänge von 14,5 mm und einer Durchflußrate von 160 ml/min getrennt; Verweilzeit 169 see.

Tabelle 14

Versuch	Polyäthylenglykol	M	Dextran	M	K₃IlPO₄	Oberphase	Unterphase	Ausbeute an
Nr.		1550		2 000 000				Isoleucyl-
		1550		2 000 000				IRNA-Syiuhc-
		6000		-				tase
	(%)	(%)	(%)	(ml)	(ml)	(%)
1	17	4	_	7,5	2,3	16
2	17	3	-	7,7	2,1	21
3	10	-	8	7,4	1,9	96

Es wurde eine gute Abtrennung der Zelltrümmer bei guter Enzymausbeute und gleichzeitiger Verbesserung der spezifischen Aktivität um etwa den Faktor 2 erzielt. Einzelheiten lassen sich der folgenden Tabelle 15 entnehmen.

Tabelle 15	Volumen (ml)	Protein (mg/ml)	(%)	Aktivität (%) IRS	LRS	PRS
Probe	2100 2640	41,6 16,4	100 49	100 82	100 82	100 100
Rohextrakt Oberphase

Abkürzungen:

IRS = Isoleucyl-tRNA-Synthetase.
LRS = Leucyl-tRNA-Synthetase.
PRS = Phenylalanyl-tRNA-Synthetase.

Beispiel 10

Es wurden 500 g Escherichia coli in 700 ml 0,05 mol. wäßrigem Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0) suspendiert und durch dreimaliges Durchleiten durch eine Glasperlenmühle aufgeschlossen (Glasperlen 0,25 bis 03 mm, 5 l/h, 3000 UpM). Die erhaltene Suspension wurde auf Werte von 10% Polyäthylenglykol (M 6000) und 8% Kaliumphosphat (pH 7,8) eingestellt und in einjem Separator wie in Beispiel 9 getrennt

Es wurde wieder eine gute Abtrennung der Zelltrümmer von der Oberphase bei gleichzeitig hoher Enzymausbeule und einer Verbesserung der spezifischen Aktivität um den Faktor 2 erzielt. Einzelheiten lassen sich der folgenden Tabelle 16 entnehmen.

Tabelle 16	Volumen (ml)	Protein (mg/ml)	(%)	Aktivität (%) IRS	LRS	PRS
Probe	1050 1600	44,0 12,4	100 43	100 93	100 75	100 86
Rohextrakt Oberphase

Abkürzungen:

IRS = Isoleucyl-tRNA-Synthetase.
LRS = Leucyl-tRNA-Synthetase.
PRS = Phenylalanyl-tRNA-Synthelase.

V. Phosphorylase
Beispiel 11

In diesem Beispiel wird die Gewinnung von Phosphorylase mit Hilfe eines wäßrigen Polyäthylenglykol/Dextran-Systems beschrieben.

Dazu wurde eine bei der Pullulanase-Isolierung entsprechend dem Herstellungsbeispiel und Beispiel 2 anfallende Unterphase (0,65 kg Zellmasse/l) im Verhältnis 1 : 2 mit Wasser verdünnt, gegebenenfalls mit 5 mg DNAase/1 versetzt, um die DNA enzymatisch abzubauen, mehrere h lang gerührt und danach mit einem Homogenisator bei einem Druck von 600 kg/cm² aufgeschlossen. Die Phosphorylaseaktivität betrug 11 U/ml, der Proteingehalt 19 mg/ml und die spezifische Aktivität 0,6 U/mg.

Es wurde ein Zweiphasensystem durch Mischen der folgenden Komponenten in den angegebenen Mengen aufgebaut:

2,0 ml verdünnte Unterphase der Pullulanaseabtren-

nung (Herstellungsbeispiel) nach Aufschluß

0,9 ml 50%iges Polyäthylenglykol (M 1550)

0,6 ml (5 m) NaCl

0,5 ml (2,5 m) K₂HPO₄(pH 9,4)

0,7 ml Wasser mit 5 μΙ 0-Mercaptoäthanol

4,7 ml resultierendes Gemisch (pH ca. 7,8)

Die Suspension wurde 1,5 min lang kräftig gemischt und 10 min It ig mit ca. 4000 g zentrifugiert. Dabei wurden 3,4 ml klare Oberphase und 1,3 ml Unterphase erhalten, die die Zelltrümmer enthielt. Die Phosphorylaseaktivität in der Oberphase betrug 5,5 U/ml, der Proteingehalt 7,7 mg/ml, die spezifische Aktivität 0,7 U/mg, die Anreicherung etwa 1,2 und die Ausbeute 84%.

Verwendete Abkürzungen:

r, Dextran

Tris

4(i DEAE-Dextran
DEAE-Cellulose
U

EDTA
CTAB

■-,» DTE
PEG

Polysaccharid aus Glucose,
empirische Formel
(C₆H₁₀O₅),;
Tris-(hydroxymeihyl)-aminomethan;
Diäthylaminoäthyl-dextran;
Diäthylaminoäthyl-cellulose;
Enzym-Einheit, d. h. die
Enzymmenge, die 1 μΜοΙ
Substrat in Produkt je
min umsetzt;
Äthylendiamintetraessigsäure (Dinatriumsalz);
Cetyltrimethylammoniumbromid;

l,4-Dimercapto-2,3-butandiol;
Polyäthylenglykol.

20 Hhitt /.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Enzymen von Zelltrümmern oder Zellen, die diese Enzyme besitzen, wobei man die Zelltrümmer bzw. die Zellen so behandelt, daß die Enzyme in Lösung gehen, dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene System mit den Zelltrümmern bzw. Zellen und der Zellflüssigkeit zwischen verschiedene Phasen eines wäßrigen Mehrphasensystems

(a) mit einem Gehalt an mindestens einem Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und Polysaccharide gebil- ι ^r> deten Gruppe und mit mindestens einem anorganischen Salz; oder

(b) mit einem Gehalt an mindestens zwei Hochmolekularen aus der durch gegebenenfalls substituierte Polyalkohole, Polyäther, Polyester, Polyvinylpyrrolidone und Polysaccharide gebildeten Gruppe verteilt,

die Phasen voneinander trennt, die Enzyme von den Hochmolekularen in der Enzymphase abtrennt und gegebenenfalls isoliert 2^r>

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Hochmolekulare aus der durch

Polypropylenglykol,Polyäthylenglykol,
Methoxypolyäthylenglykol,
Trimethylaminopolyäthylenglykol, so

Polyäthylenglykolsulfonat, Polyvinylalkohol,
Polyvinylpyrrolidon, Methylzellulose,
ÄthylhydroxyäthylzelluloscDEAE-Zellulose,
Alkalicarboxymethyizellulose, Dextran,
Hydroxypropyldextran, DEAE-Dextran, r>

Dextransulfat, Alkalicarboxymethyldextran und synthetisches Polysaccharid (M ca. 400 000,
gewonnen durch Polymerisation von
Rohrzucker)
gebildeten Gruppe verwendet. ίο

3. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (a) mit einem Gehalt an einem gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther mit einem durchschnitt- 4^r> liehen Molekulargewicht kleiner als 40 000 und insbesondere kleiner als 10 000 verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein System gemäß (a) mit solchen Mengen an Wasser, Hochmolekula- w rem und Salz verwendet, bei dem diese Komponenten allein nur eine Phase bilden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem Gehalt an einem v> gegebenenfalls substituierten Polyalkohol oder Polyäther mit einem deutlich kleineren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des Enzyms verwendet, vorzugsweise mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht kleiner als 40000, insbesondere ω> kleiner als 10 000, besonders bevorzugt kleiner als 6000, z. B. von 5000 bis 1550, z. B. von etwa 4000.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem Gehalt an einem μ gegebenenfalls substituierten Polysaccharid mit einem deutlich größeren durchschnittlichen Molekulargewicht als das des Enzyms verwendet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mk einem Gesamtgehalt an Polyäthylenglykol von 1 und mehr und vorzugsweise von 4 bis 9 Gew.-°/o verwendet

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 5, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem Gesamtgehalt an Dextran von 0,1 bis 15 und vorzugsweise von 0,1 bis 7 Gew.-% verwendet

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,5,6,7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem gemäß (b) mit einem zusätzlichen Gehalt an Phosphationen verwendet

10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem mit einem Verhältnis von Gesamtvolumen/Zellmasse >2, vorzugsweise > 5 verwendet

11. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mehrphasensystem mit einem pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise von 7 bis 8 verwendet

12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phasen unter Verwendung eines Separators auftrennt.

13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hochmolekularen durch Fällung des Enzyms oder durch Phasenverteilung, Ultrafiltration, Dialyse, Gelpermeation, Adsorbentien, Ionenaustauscher oder Elektrophorese vom Enzym abtrennt