DE60013338T2

DE60013338T2 - Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin Komplex

Info

Publication number: DE60013338T2
Application number: DE60013338T
Authority: DE
Inventors: Akira Sapporo-shi Kitabatake; Ichiro Sapporo-shi Sakuma; Kunihiko Sendai-shi Nakai; Tohru Yokohama-shi Yasukohchi
Original assignee: Hokkaido University NUC; NOF Corp
Current assignee: Hokkaido University NUC; NOF Corp
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: EP1029551A2; EP1029551A3; DE60013338D1; EP1029551B1; US6667292B1; JP2000230000A

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex, der in Blutersatzstoff- und Organperfusionslösungen verwendbar ist, auf ein Verfahren zur Herstellung dieses Komplexes und auf eine Sauerstoffträgerlösung, die den Komplex enthält, insbesondere auf einen zellfreien Sauerstoffträger auf Hämoglobinbasis, der eine hohe Sicherheit im Blut hat und zur Zeit der Injektion in den lebenden Körper keine Probleme wie z.B. Hypertension (Blutdruckerhöhung) verursacht.
2. Stand der Technik
Derzeit werden erfolgreich Anstrengungen unternommen, zellfreies Hämoglobin, das aus humanen oder Rindererythrozyten extrahiert wurde, als Sauerstoffträgerersatzstoff für eine Erythrozyten-Bluttransfusion zu verwenden.
Es ist notwendig, verschiedene Probleme zu lösen, um zellfreies Hämoglobin direkt als Sauerstoffträgerersatzstoff zur Erythrozyten-Bluttransfusion zu verwenden. Erstens, Stroma bleibt als Membranfragment in Erythrozytenhämolysat zurück und verursacht eine Blutkoagulation. Rabiner et al. haben auf diesem Gebiet 1967 ein Verfahren zur Produktion von stromafreiem Hämoglobin entwickelt, bei dem Stroma aus einer Hämoglobinlösung entfernt wird (Rabiner S.F. et al., Evaluation of a stroma-free hemoglobin solution use as a plasma expander, J. Exp. Med., 126, 1127–1142, 1967); dies löste das Problem der dissiminierten intravasklären Koagulation (DIC) fast vollständig. Außerdem treten Hämoglobinmoleküle aus den Nierenglomeruli aus und üben Toxizität auf den Nierenleiter aus. Das Problem der renalen Toxizität wurde auf der Feststellung von Bunn et al. von 1969, daß eine Exkretion von Hämoglobin aus den Glomeruli durch Einführung einer intramolekularen Vernetzung in Hämoglobin (Bunn F. et al., The renal handling of Hämoglobin, J. Exp. Med., 129, 909 – 924, 1969) vermieden werden kann, daß eine Exkretion von Hämoglobin in Urin verhindert werden kann und seine intravaskuläre Halbwertszeit verlängert werden kann, indem das Molekulargewicht von Hämoglobin durch seine chemische Modifikation mit Polyethylenglykol erhöht wird, (z.B. JP-B-5-64128 und JP-B-6-76333; der Ausdruck "JP-B", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine "geprüfte japanische Patentpublikation") fast vollständig gelöst. Auf der Basis dieser technischen Verbesserung wurden Studien über zellfreies Hämoglobin als Erythrozyten-Substitutionssauerstoffträger vorangetrieben und in den Vereinigten Staaten sind bereits mehrere Produkte beim Eintreten in klinische Tests.
Mit Fortschreiten der Untersuchungen an solchen Hämoglobin-Derivaten traten allerdings zwei neue Probleme auf. Das heißt, eine Blutdruckerhöhungsreaktion, begleitet von Vasokonstruktion, und Bauchschmerzen, begleitet von einer Darmkonstriktion.
Es wird davon ausgegangen, daß der Hauptgrund für die Blutdruckerhöhungsreaktion als das erste Problem eine Vasokonstriktion, insbesondere der Arteriole ist, welche durch die Verabreichung von Hämoglobin-Derivaten induziert wird. Dieses Phänomen wird als unerwünscht angesehen, da es bei Durchführung einer normalen Erythrozytentransfusion nicht erkannt wird, und die Konstriktion der Arteriole den Blutfluß in Kapillargefäße inhibiert, wo ein Sauerstofftransfer durchgeführt wird. Es wird davon ausgegangen, daß diese Vasokonstriktion infolge der Reaktion eines vom Endothel stammenden relaxierenden Faktors [EDRF: als Stickstoffmonoxid oder eine Stickstoffmonooxid-freisetzende Substanz angesehen (I. Sakuma, NO as blood vessel relaxin factor, Experimental Chemistry, 9, 1347–1351, 1991)] mit zellfreiem Hämoglobin auftritt, die eine Eliminierung von EDRF verursacht und dadurch eine Konstriktion von Blutgefäßen nach sich zieht (Motterlini R. et al., Hemoglobin-nitric oxide, interactian and ist implications, Transfusion Med. Rev., 10, 77–84, 1996). Es ist besonders wichtig daß EDRF durch den Einbau von Hämoglobin-Molekülen in die Gefäße durch Endothelspalten im Inneren des Blutgefäßes verschwindet (Nakai K. et al., Permeability characteristics of hemoglobin derivatives across cultured endothelial cell monolayers, J. Lab. Clin. Med., 132, 313–319, 1998).
Mit der Beginn der klinischen Tests am menschlichen Körper in den letzten Jahren hat die intestinale Konstriktion, die durch zellfreie Hämoglobin-Derivate verursacht wird, als neues Problem die Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Obwohl der Grund noch nicht spezifiziert ist, wird dieses Phänomen in den meisten klinischen Tests mit Hämoglobin vom intramolekularen Vernetzungstyp beobachtet und es wird angenommen, daß der Grund hierfür die Eliminierung von Stickstoffmonoxid als Kandidat eines anti-adrenergen, anticholinergen Neurotransmitters ist, die auch durch das zellfreie Hämoglobin, das zum Beispiel aus dem Endothel entweicht, verursacht wird (Murray J.A. et al., The effects of recombinant human hemoglobin on esophageal motor functions in humans, Gastroenterology, 109, 1241 – 1248, 1995).
Da die Eliminierung von Stickstoffmonoxid durch Hämoglobin der Grund für jede dieser Nebenwirkungen ist, wurde vorgeschlagen, daß es effektiv ist, Stickstoffmonooxidmetabolit-gebundenes Hämoglobin zu verwenden, dem Übertragungs- und Freisetzungsfähigkeiten des Stickstoffmonooxidmetaboliten verliehen wurden (Stamler, WO 96/30006). Das Stickstoffmonooxidmetabolit-gebundene Hämoglobin ist eine modifizierte Form von Hämoglobin, in der ein Stickstoffmonooxidmetabolit reversibel an den β-Ketten-Cysteinrest von Hämoglobin gebunden ist, die den Stickstoffmonoxidmetaboliten, der die physiologische Aktivität hat, die Eliminierung von Stickstoffmonooxid durch das Häm von Hämoglobin zu kompensieren, freisetzen kann. Da allerdings dieses Stickstoffmonooxidmetabolit-gebundene Hämoglobin ein Hämoglobin des intramolekularen Vernetzungstyps mit kleinem Molekulargewicht ist, besteht das Problem, daß seine Halbwertszeit in Blutgefäßen infolge seiner Fähigkeit, in Urin ausgeschieden zu werden, kurz ist.
Demnach sind die modifizierten Formen von Hämoglobin als Sauerstoffträger zum Beispiel für eine Erythrozyten-Substitutionsbluttransfusions- und Organperfusionslösung vielversprechend, allerdings wurde, wie im vorangehenden beschrieben, noch nichts über ihr Gegenstück geschrieben, das nicht leicht ausgeschieden wird, daher eine lange Halbwertszeit im Körper hat und keine Nebenwirkungen wie z.B. Vasokonstriktion und Darmkonstriktion zeigt.
Dementsprechend wurden große Anstrengungen auf die Entwicklung eines zellfreien Hämoglobin-Derivats gerichtet, das sicher und frei verwendet werden kann und das über einen langen Zeitraum lagerungsfähig ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Sauerstoffträgers, der sicher und frei verwendet werden kann und für einen längeren Zeitraum gelagert werden kann, dessen Auslecken aus den Nierenglomeruli und dem Gefäßendothel äußerst begrenzt ist und der Stickstoffmonooxidmetaboliten freisetzende Fähigkeit hat, die eine Entfernung von aus Endothel stammenden Stickstoffmonoxid kompensieren kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Sauerstoffträgerlösung, die eine spezifische Menge des Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes der Erfindung (nachfolgend manchmal als "modifizierte Verbindung" bezeichnet) enthält. Da die Sauerstoffträgerlösung leicht und einfach hergestellt werden kann, ist sie als Erythrozyten-Substitutionsbluttransfusions- oder Organperfusionslösung einsetzbar.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive Studien über einen Sauerstoffträger durchgeführt, der sicher und frei verwendet werden kann, der keine Nebenwirkungen wie z.B. Nierentoxizität, Hypertension und Bauchschmerzen verursacht, und haben als Resultat der Anstrengungen festgestellt, daß ein Derivat mit einem Molekulargewicht von 100 000 bis 2 000 000, hergestellt durch Binden eines spezifizierten Polyoxyalkylen-Derivats und einer S-Nitrosoniedermolekularen Thiol-Verbindung mit einem Molekulargewicht von 1000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonooxidmetabolit an zellfreies Hämoglobin, das aus humanen oder Rindererythrozyten extrahiert worden ist, ein vielversprechender Sauerstoffträger ist, was zur Vollendung der vorliegenden Erfindung führte.
Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes (modifizierte Verbindung) mit einem Molekulargewicht von 100 000 bis 2 000 000 Dalton, worin ein Polyoxyalkylen-Derivat an 10 bis 30 % der Gesamtmenge an bindungsfähigen Amino-Gruppen im Hämoglobin gebunden ist und eine S-Nitroso-niedermolekulare Thiol-Verbindung mit einem Molekulargewicht von 1000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonooxidmetabolit an 10 bis 100 % der gesamten Thiolgruppen der Cysteinreste gebunden ist.
Es wird insbesondere der gerade beschriebene Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex beschrieben, worin ein Polyoxyalkylen-Derivat der Formel (1) verwendet wird:
worin B einen Rest einer Verbindung mit 2 bis 6 Hydroxyl-Gruppen repräsentiert; AO repräsentiert eine Oxyalkylen-Gruppe mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen, R repräsentiert eine Kohlenwasserstoff-Gruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxy-Gruppe, k und m sind Zahlen, welche jeweils 0 ≤ k ≤ 500 bzw. 0 ≤ m ≤ 500 erfüllen, wie auch 20 ≤ k + m ≤ 1.000, als die mittlere Zugabemolzahl an Oxyethylen-Gruppen, 1 und n sind Zahlen, welche jeweils 0 ≤ 1 5 10 bzw. 0 ≤ n ≤ 10 erfüllen, wie auch 0 ≤ 1 + n ≤ 10, als die mittlere Zugabemolzahl an Oxyalkylen-Gruppen, a und b sind Zahlen, die jeweils 0 ≤ a ≤ 6 bzw. 1 ≤ b ≤ 6 erfüllen, wie auch 2 ≤ a + b ≤ 6, und X repräsentiert eine funktionelle Gruppe, die geeignet ist zur Bindung an die Aminogruppe und in den Formeln (2), (3), (4) oder (5) dargestellt ist: -(CH₂)_c-COOY (2) worin c eine Zahl von 0 bis 2 ist und Y repräsentiert Wasserstoff oder eine p-Nitrophenyl-Gruppe oder einen N-Hydroxybernsteinsäureimid-Rest, -OG(CH₂)d-COOY (3)worin d eine Zahl von 2 bis 6 ist und Y repräsentiert Wasserstoff oder einen N-Hydroxybernsteinsäureimid-Rest, -(CH₂)_e-CHO (4)worin e 1 oder 2 ist, und -COZ (5)worin Z eine Imidazol-Gruppe repräsentiert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung des vorstehend genannten Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes, worin er als S-Nitroso-niedermolekulare Thiol-Verbindung mit 1000 Dalton oder weniger zum Beispiel S-Nitrosoglutathion als Stickstoffmonooxidmetabolit verwendet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Sauerstoffträgerlösung, welche den Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex in einer Menge von 10 g/l bis 200 g/l umfaßt.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einem Molekulargewicht von 100 000 bis 2 000 000 Dalton, worin ein Polyoxyalkylen-Derivat gebunden ist an 10 bis 30 % der Gesamtmenge an bindungsfähigen Amino-Gruppen im Hämoglobin und eine S-Nitroso-niedermolekulare Thiol-Verbindung mit einem Molekulargewicht von 1000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonooxidmetabolit gebunden ist an 10 bis 100 % der Gesamtmenge an Thiol-Gruppen der Cystein-Reste, umfassend das Umsetzen eines Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einem Stickstoffmonooxidmetaboliten in einem Einstufenverfahren.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahren zur Herstellung eines Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einem Molekulargewicht von 100 000 bis 2 000 000 Dalton, worin ein Polyoxyalkylen-Derivat gebunden ist an 10 bis 30 % der Gesamtmenge an bindungsfähigen Amino-Gruppen im Hämoglobin und eine S-Nitroso-niedermolekulare Thiol-Verbindung mit einem Molekulargewicht von 1000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonooxidmetabolit gebunden ist an 10 bis 100 % der Gesamtmenge der Thiol-Gruppen der Cystein-Reste, umfassend Durchführen eines Zweistufenverfahrens, nämlich Umsetzen eines Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einem Stickstoffmonooxidmetaboliten und dann mit einem Polyoxyalkylen-Derivat.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das ein Resultat einer Gelpermeationschromatographie-Messung des S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplexes zeigt, der im erfindungsgemäßen Beispiel 1 unter Verwendung von humanem Erythrozytenhämoglobin erhalten wurde.
2 ist ein Diagramm, das ein Resultat der Messung des Verhältnisses von S-Nitrosoglutathion zeigt, das in den S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplex eingeführt worden war, der im erfindungsgemäßen Beispiel 1 erhalten wurde.
3 ist ein Diagramm, das ein Resultat der Gelpermeationschromatographiemessung des S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplexes zeigt, der im erfindungsgemäßen Beispiel 2 unter Verwendung von Rindererythrozytenhämoglobin erhalten worden war.
4 ist eine schematische Darstellung, die das Permeabilitätsmeßverfahren unter Verwendung einer kultivierten Rinderendothel-Monolayer, die im erfindungsgemäßen Beispiel 4 verwendet wurde, zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Was das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende zellfreie Hämoglobin angeht, so kann eines vom Menschen oder Rind als solches oder nach seiner intramolekularen Vernetzung eingesetzt werden; unter ethischen Gesichtspunkten ist es allerdings wünschenswert, Hämoglobin humanen Ursprungs zu verwenden und es ist wünschenswerter, solche Hämoglobine zu verwenden, die intramolekular mit Pyridoxalphosphaten wie z.B. Pyridoxal-5'-phosphat und 2-Nor-2-formylpyridoxanol-5'-phosphat, Pyridoxalsulfaten, z.B. Pyridoxal-5'-sulfat, Glycerinphosphaten wie z.B. Glycerin-2,3-diphosphat, oder Zuckerphosphaten wie z.B. Glucose-6-phosphat und Adenosin-5'-phosphat, vernetzt sind.
In Abhängigkeit von den zu verwendenden Hämoglobintypen variiert auch die Anzahl an bindungsfähigen Amino-Gruppen (Amino-Gruppen von Lysinresten und N-terminale Amino-Gruppen). Es wird davon ausgegangen, daß die Gesamtzahl an bindungsfähigen Amino-Gruppen im Fall von humanem Hämoglobin 48, einschließlich 4 N-terminaler Amino-Gruppen und 44 Lysinrest-Aminogruppen, ist, und daß die Gesamtzahl an bindungsfähigen Amino-Gruppen im Fall von Rinderhämoglobin 50, einschließlich 4 N-terminaler Amino-Gruppen und 46 Lysinrest-Aminogruppen, ist. Außerdem variiert sie auch in Abhängigkeit von der Anzahl funktioneller Gruppen (b) des zu verwendenden Polyoxyalkylen-Derivats, so daß, wenn die Anzahl der an die Amino-Gruppen zu bindenden Polyoxyalkylen-Derivatmoleküle, obgleich sie nicht genau spezifiziert werden kann, zu klein ist, das Molekulargewicht der interessierenden Verbindung nicht zu einem Level erhöht werden kann, der ausreichend hoch ist, um sein Auslecken aus Zellen zu verhindern; ihre übermäßige Bindung ist ebenfalls unerwünscht, da sie strenge Reaktionsbedingungen erfordert, die eine Reduktion der Sauerstoffübertragungskapazität von Hämoglobin bewirken, indem sie seine dreidimensionale Struktur zerstören. Dementsprechend wird die Zahl auf einen Bereich von 10 bis 30 % der Gesamtmenge an bindungsfähigen Amino-Gruppen beschränkt. Der bevorzugte Bereich ist 15 bis 25 %.
Wenn die Zahl eines Stickstoffmonooxid-Metaboliten, der an Thiol-Gruppen der zwei bindungsfähigen Cystein-Reste, die im Hämoglobin vorliegen, zu gering ist, so kann keine ausreichende Wirkung zur Inhibierung der Blutdruckerhöhungswirkung erreicht werden. Um die Blutdruckerhöhungswirkung zu inhibieren, ist es notwendig, den Stickstoffmonooxidmetaboliten an 10 bis 100 % der gesamten Thiol-Gruppen der Cysteinreste zu binden.
Beispiele für den Stickstoffmonooxidmetaboliten, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen einen beliebigen der folgenden: S-Nitroso-Derivate mit einem Molekulargewicht von 1000 Dalton oder weniger, Thiol-Verbindungen wie z.B. N-Acetyl-DL-penicillamin, N-Acetyl-L-cystein, S-Nitrosocystein und S-Nitrosoglutathion. Wenn allerdings Reaktivität und dgl. berücksichtigt werden, so ist es wünschenswert, S-Nitrosoglutathion wegen seiner überlegenen Reaktivität einzusetzen.
Das Molekulargewicht des Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes, der durch die vorliegende Erfindung erhalten werden soll, liegt im Bereich von 100 000 bis 2 000 000 Daltons, da ein Molekulargewicht von kleiner von 100 000 Dalton leicht ein Auslecken des Komplexes aus Endothel- und ähnlichen Geweben verursachen würde und ein Molekulargewicht von über 2 000 000 Dalton die Schwierigkeit der Handhabung infolge einer zu hohen Viskosität mit sich bringen würde.
Sein bevorzugter Bereich ist 150 000 bis 1 500 000 Dalton. Das Molekulargewicht ist das Peak-Molekulargewicht des Maximumpeaks.
Beispiele für den Verbindungsrest, der 2 bis 6 Hydroxyl-Gruppen hat und der in der Formel (1) durch B dargestellt wird, umfassen Reste von Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglykol, Glycerin, Trimethylolpropan, Diglycerin, Pentaerythritol, Triglycerin, Sorbit und Tetraglycerin.
Beispiele für die Oxyalkylen-Gruppe mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen, die durch AO dargestellt wird, umfassen die Oxypropylen-Gruppe, Oxyisopropylen-Gruppe, Oxybutylen-Gruppe und Oxyisobutylen-Gruppe.
Beispiele für die Kohlenwasserstoff-Gruppe, die 1 bis 30 Kohlenstoffatome hat und durch R dargestellt wird, umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl, Isohexyl, Octyl, Isooctyl, Nonyl, Isononyl, Decyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Octadecyl, Octadecenyl, Eicosyl, Docosyl, Tetracosyl, Hexacosyl, Octacosyl, Triacontyl und änliche Gruppen, von denen, obgleich eine beliebige von diesen in Abhängigkeit vom jeweiligen Zweck verwendet werden kann, solche bevorzugt sind, die 1 bis 4, bevorzugt 1 oder 2, Kohlenstoffatome haben, da, wenn die Kohlenstoffzahl groß ist, ein Problem wie z.B. Blasenbildung, infolge ihrer Eigenschaften als oberflächenaktives Mittel auftreten kann.
Die Oxyethylen-Gruppe ist zur Bildung einer hydrophilen Schicht an der Peripherie des Hämoglobin-Derivats essentiell und die Zugabemolzahl wird durch k und m ausgedrückt, wobei eine zu kleine Zahl ein häufiges Auslecken des Derivats aus den Nierenglomeruli infolge der unzureichenden Größe der hydrophilen Schicht bewirken würde und eine zu große Zahl Schwierigkeiten bei der Handhabung des Derivats infolge erhöhter Viskosität mit sich ziehen würde. Dementsprechend ist ihr Bereich, der zum Zweck der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, 0 ≤ k ≤ 500, 0 ≤ m ≤ 500 wie auch 20 ≤ k + m ≤ 1000, vorzugsweise 0 ≤ k ≤ 500, 0 ≤ m ≤ 500 und auch 50 ≤ k + m ≤ 800.
Die Oxyalkylen-Gruppe wird zum Zweck der Erhöhung der Stabilität der Bindungsstelle des Polyoxyalkylen-Derivats und des Hämoglobins eingeführt und die Zugabemolzahl an Oxyalkylen-Gruppen, ausgedrückt durch 1 und n, ist auf den Bereich 0 ≤ 1 ≤ 10, 0 ≤ n ≤ 10 wie auch 0 ≤ 1 + n ≤ 10 begrenzt, da eine Bildung der hydrophilen Schicht inhibiert wird, wenn die Zahl zu groß ist. Ein bevorzugter Bereich ist 0 ≤ 1 ≤ 4 , 0 ≤ n ≤ 4 wie auch 0 ≤ 1 + n ≤ 4 .
a stellt auch die Anzahl an Polyoxyalkylen-Ketten dar, die nicht an Hämoglobin binden können, und b stellt die Anzahl der Polyoxyalkylen-Ketten dar, die an Hämoglobin binden können. Die Zahl b muß mindestens eins sein, um eine Bindung von Hämoglobin und Oxyalkylen-Derivat zu erreichen; und wenn die Zahl b auf 2 oder darüber erhöht ist, wird es möglich, das Molekulargewicht des Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes durch partielle Vernetzung der Komplexmoleküle zu erhöhen. Wenn allerdings die Zahl b zu hoch ist, schreitet die Vernetzung zu einem Level fort, daß eine Gelierung und ähnlich Problem leicht auftreten, so daß der bevorzugte Bereich von b 1 bis 4 ist.
Als X kann beliebige fakultative funktionelle Gruppe verwendet werden, mit der Maßgabe, daß sie an die Amino-Gruppe des Lysinrestes und die N-terminale Amino-Gruppe binden kann, wenn allerdings ihre Reaktivität und dgl. berücksichtigt werden, ist es wünschenswert, einen aktivierten Carbonsäure-Typ, der durch die Formel (2) oder (3) dargestellt wird, einen Aldehyd-Typ, der durch die Formel (4) dargestellt wird, oder einen Imidazol-Typ, der durch die Formel (5) dargestellt wird, zu verwenden. Der aktivierte Carbonsäure-Typ, der durch die Formel (2) oder (3) dargestellt wird, ist besonders wünschenswert.
Der Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex der vorliegenden Erfindung kann seine Sauerstoffträgereigenschaften im gefriergetrockneten Zustand bemerkenswert stabil aufrechterhalten, so daß es möglich ist, ihn für einen langen Zeitraum einfach und leicht zu konservieren; er kann dann zum Beispiel bei einer Erythrozyten-Substitutionsbluttransfusion oder einer Organperfusion verwendet werden, indem er zum Beispiel zum Zeitpunkt seiner praktischen Verwendung mit physiologischer Salzlösung verdünnt wird. In diesem Fall kann die Konzentration des Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes nicht immer spezifiziert werden, da sie in Abhängigkeit vom Molekulargewicht des zu verwendenden Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex und der Struktur des in den Kern eingebauten Polyoxyalkylen-Derivats abhängt und auch von dem angestrebten Sauerstofftragevermögen der Sauerstoffträgerlösung abhängt; allerdings wird sie im allgemeinen 10 bis 200 g/l betragen, da die Konzentration, wenn sie kleiner 10 g/l ist, ein unzureichendes Sauerstofftragevermögen der Sauerstoffträgerlösung infolge einer zu niedrigen Konzentration des Hämoglobin-Derivats in der Lösung mit sich ziehen wird, und eine Konzentration von über 200 g/l Schwierigkeiten bei der Handhabung der Sauerstoffträgerlösung infolge ihrer zu hohen Viskosität verursachen wird. Sie ist vorzugsweise 50 bis 150 g/l, bevorzugter 60 bis 120 g/l.
Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Polyoxyalkylen-Derivat der Formel (1) kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren erhalten werden.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (6), die an ihrem Ende eine Hydroxyl-Gruppe hat, kann erhalten werden, indem die Reaktion des Anfügens von Ethylenoxid und bei Bedaruf eines Alkylenoxids mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen an die Verbindung, die durch B dargestellt wird und 2 bis 6 Hydroxyl-Gruppen hat, in üblicher Weise durchgeführt wird, wobei ein Alkalikatalysator, zum Beispiel, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, metallisches Natrium oder Natriummethylat verwendet werden, der Alkalikatalysator unter Verwendung einer Mineralsäure wie zum Beispiel Salzsäure oder Phosphorsäure neutralisiert wird, das Reaktionsgemisch dehydratisiert wird und das so gebildete neutralisierte Salz durch Filtration entfernt wird.
Als nächstes wird die terminale Hydroxyl-Gruppe der so erhaltenen Verbindung der Formel (6) in eine funktionelle Gruppe geändert, die fähig ist, an eine Amino-Gruppe zu binden und die durch die Formel (2), (3), (4) oder (5) dargestellt wird, was vom jeweiligen Zweck abhängt.
Diese Reaktion kann durch Verwendung verschiedener bekannter Verfahren durchgeführt werden.
Wenn zum Beispiel die terminale Hydroxyl-Gruppe in die Gruppe der Formel (2) geändert wird, kann die interessierende Verbindung erhalten werden, indem eine Verbindung mit einer Carbonsäure am Ende hergestellt wird, wobei ein Verfahren verwendet wird, in dem die Hydroxyl-Gruppe mit einer halogenierten Carbonsäure, zum Beispiel Monochloressigsäure oder Monobromessigsäure, in Gegenwart eines Alkalikatalysators reagieren gelassen wird; es kann auch ein Verfahren angewendet werden, bei dem die Hydroxyl-Gruppe mit Acrylnitril in Gegenwart eines Alkalikatalysators reagieren gelassen wird und danach eine Hydrolyse durchgeführt wird, oder es kann ein Verfahren angewendet werden, bei dem die terminale Hydroxyl-Gruppe unter Verwendung von Wasserstoffperoxid, Permangansäure oder Platin- oder Palladium-Kohle-Katalysator oxidiert wird und die resultierende Verbindung dann in einen N-Hydroxysuccinimidester unter Verwendung eines Dehydratisierungsmittels, zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid, umgewandelt wird. In einem alternativen Verfahren kann das Ende zuerst in die Form eines Säurechlorid gebracht werden, indem es mit einem Chlorformiat, z.B. Phosgen reagieren gelassen wird, und dann mit N-Hydroxysuccinimid reagieren gelassen wird. Die endständige Hydroxyl-Gruppe kann auch direkt mit einem aktivierten Chlorformiat, z.B. p-Nitrophenylchlorformiat, in Gegenwart eines basischen Katalysators reagieren gelassen werden. Für diese Reaktionen gibt es viele bekannte Verfahren und es kann eine beliebige angewendet werden.
Wenn die terminale Hydroxyl-Gruppe in eine Gruppe der Formel (3) umgewandelt worden ist, kann die interessierende Verbindung durch Herstellen einer Verbindung, die am Ende eine Carbonsäure hat, erhalten werden, indem die terminale Hydroxyl-Gruppe mit einem dibasischen Säureanhydrid, z.B. Bernsteinsäureanhydrid oder Glutarsäureanhydrid, direkt oder in Gegenwart eines basischen Katalysators, umgesetzt wird und die resultierende Verbindung dann in einen aktivierten Ester umgewandelt wird, indem sie mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, umgesetzt wird.
Auch wenn die terminale Hydroxyl-Gruppe in die Gruppe der Formel (4) übergeführt wird, kann die interessierende Verbindung erhalten werden, indem die terminale Hydroxyl-Gruppe in Gegenwart von Dimethylsulfoxid und Essigsäureanhydrid oder in Gegenwart von Kaliumpermanganat oxidiert wird.
Auch wenn die terminale Hydroxyl-Gruppe in die Gruppe der Formel (5) umgewandelt wird, kann die interessierende Verbindung erhalten werden, indem die terminale Gruppe mit Carbonyldiimidazol in Gegenwart eines basischen Katalysators umgesetzt wird.
Um den Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wird ein Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex (zur Vereinfachung als "Vorläufer-modifizierte Verbindung" im folgenden bezeichnet) zuerst erhalten, indem die Verbindung der Formel (1), die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wurde (Polyoxyalkylen-Derivat), mit Hämoglobin reagieren gelassen wird.
Als nächstes wird der Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex (im folgenden "modifizierte Hämoglobin-Verbindung von Interesse" bezeichnet) erhalten, indem die Vorläufer-modifizierte Verbindung mit einem Stickstoffmonooxidmetaboliten (z.B. S-Nitrosoglutathion) in einer Menge von 2 bis 10 mol, bezogen auf 1 mol verwendetes Hämoglobin, in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 bis 10 und bei einer Temperatur von 0 bis 40°C reagieren gelassen wird.
In diesem Fall werden nicht-umgesetztes Hämoglobin, nicht-umgesetztes Polyoxyalkylen-Derivat, Stickstoffmonooxidmetabolit und Puffersalz unter Verwendung einer geeigneten Ultrafiltrationsmembran entfernt. Danach kann das Produkt bei Bedarf gefriergetrocknet werden, um es in ein Pulver überzuführen.
Alternativ wird zuerst ein Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Derivat (im folgenden als "vorläufige Vorläufer-modifizierte Verbindung" bezeichnet) erhalten, indem das Polyoxyalkylen-Derivat der Formel (1) mit Hämoglobin umgesetzt wird, und der Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex (modifizierte Hämoglobin-Verbindung von Interesse) wird erhalten, indem die vorläufige Vorläufer-modifizierte Verbindung mit einem Stickstoffmonooxidmetabolit in der gleichen Weise, wie es oben beschrieben wurde, und dann mit der Verbindung der Formel (1) umsetzen gelassen wird. Auch in diesem Fall werden nicht-umgesetzte Materialien und dgl. unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran in der gleichen Weise wie oben beschrieben entfernt. Danach kann das Produkt gefriergetrocknet werden, um es bei Bedarf in ein Pulver überzuführen.
Die vorstehend beschriebene Vorläufer-modifizierte Verbindung oder vorläufige Vorläufer-modifizierte Verbindung wird erhalten, indem die Reaktion nach einem bekannten Verfahren (z.B. JP-B-6-76333 oder JP-B-5-64128) durchgeführt wird.
Das Verhältnis des Polyoxyalkylen-Derivats der Formel (1) zu Hämoglobin zur Zeit ihrer Reaktion kann nicht immer spezifiziert werden, da es in Abhängigkeit von der Struktur und dem angestrebten Molekulargewicht des Polyoxyalkylen-Derivats variiert, es beträgt im allgemeinen aber 0,5 bis 70 mol vorzugsweise 1 bis 20 mol, bezogen auf 1 mol Hämoglobin.
Der Stickstoffmonooxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex (modifizierte Hämoglobin-Verbindung von Interesse) der vorliegenden Erfindung zeigt keine Verringerung des Sauerstofftragevermögens von Hämoglobin, hat verbesserte Sicherheit und bewirkt kein Auslecken aus den Nierenglomeruli oder dem vaskulären Endothel infolge des zu einem gewissen Grad erhöhten Molekulargewichts von Hämoglobin, das durch Bindung eines Polyoxyalkylen daran erreicht wurde, und verursacht auch keine Probleme wie z.B. Hyptertension zum Zeitpunkt seiner Injektion in den lebenden Körper, und zwar infolge der Bindung einer spezifizierten Menge eines Stickstoffmonooxidmetaboliten, so daß es in einfacher und leichter Weise und auch sicher bei der Erythrozyten-Substitutionsbluttransfusion oder Organperfusion eingesetzt werden kann.
Das folgende beschreibt die vorliegende Erfindung anhand von Produktion-, erfindungsgemäßen und Vergleichsbeispielen erläuternd. Allerdings wird die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Herstellungsbeispiel 1
Ein Vierhalskolben, der mit einem Stickstoffeinblasrohr, einem Rührer, einem Thermometer und einem Kühler/Wassermeßrohr ausgestattet war, wurde mit 85 g Polyethylenglykol #6000 (hergestellt von NOF Corporation; Molekulargewicht 8500 Dalton), 100 ml Toluol und 0,2 g Natriumacetat beschickt und der Inhalt wurde auf 80°C erwärmt und gerührt, bis er sich vollständig gelöst hatte. Als nächstes wurde die resultierende Lösung unter Einblasen von Stickstoff langsam erwärmt, bis das Lösungsmittel (Toluol), mit dem Rückfluß begann und der Rückfluß wurde für eine Stunde fortgesetzt. Danach wurde das im Wassermeßrohr kondensierte Wasser verworfen und das Wassermeßrohr wurde vom Vierhalskolben gelöst und das Kühlerrohr wurde erneut am Kolben befestigt.
Als nächstes wurde die Reaktionslösung mit 2,4 g Bernsteinsäureanhydrid gemischt und 3 Stunden bei 105°C gerührt. Anschließend wurden nicht-umgesetztes Bernsteinsäureanhydrid und Toluol unter einem reduziertem Druck von 100 mmHg oder weniger verdampft. Nach Abkühlen des resultierenden Rückstands auf 80°C wurde überschüssiges Natriumacetat durch Filtration unter reduziertem Druck entfernt, wodurch 78 g Polyethylenglykoldisuccinat erhalten wurden.
Das so erhaltene Polyethylenglykoldisuccinat zeigte eine Säurezahl von 12,9 und eine Verseifungszahl von 26,1.
Als nächstes wurden 17,4 g Polyethylenglykoldisuccinat und 200 ml Dimethylformamid in einen Erlennneyerkolben mit Schliffstopfen gegeben und unter Rühren mit einem Magnetrührer auf 40°C erwärmt. Eine 0,98 g-Portion Dicyclohexylcarbodiimid und 0,56 g N-Hydroxysuccinimid wurden in den Kolben gegeben und das resultierende Gemisch wurde für 12 Stunden gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch tropfenweise unter Rühren zu 1 l Diethylether gegeben und die so präzipitierten Kristalle wurden durch Druckfiltration gesammelt, wodurch 16,5 g des aktivierten Esters von Polyethylenglykol #6000 als weiße Kristalle erhalten wurden.
Die Strukturformel der so erhaltenen Verbindung ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Herstellungsbeispiel 2
Eine 1000 g-Portion von Polyoxyethylenglycerylether (Uniox G-2000, hergestellt von NOF Corporation; Molekulargewicht 2000 Dalton) wurde in einen Autoklaven mit einem Fassungsvermögen von 5 l, der mit einem Rührer, einem Thermometer und einem Stickstoffeinblasrohr ausgestattet war gefüllt und auf 60°C erwärmt. Als nächste wurde das ganze mit 90 g Natriummethylat vermischt und es wurde eine Demethanolisierungsreaktion über 3 Stunden bei 100°C unter einem reduziertem Druck von 100 mmHg oder weniger durchgeführt. Die Temperatur wurde auf 115°C erhöht und allmählich wurden 252 g Methylmonobromacetat durch einen Tropftrichter in den Autoklaven gepreßt. Nach Beendigung der erzwungenen Zugabe wurden die Inhalte für weitere 5 Stunden bei derselben Temperatur gerührt.
Danach wurde das Reaktionsgemisch auf 30°C abgekühlt, mit 200 g einer 30%igen wäßrigen Kaliumhydroxid-Aufschlämmung vermischt, erneut auf 80°C erwärmt und dann für 5 Stunden gerührt, um eine Verseifungsreaktion durchzuführen.
Nach Beendigung der Verseifungsreaktion wurden die gesamte Portion der Reaktionslösung in einen Vierhaltkolben überführt und unter Verwendung von 17,5 % Salzsäure unter Rühren auf pH eingestellt. Als nächstes wurde das so gebildete Derivat von Polyethylenglykolmonoglycerylether mit terminaler Carbonsäure dreimal mit einem Liter Chloroform extrahiert. Die resultierenden Chloroformschichten wurden unter Verwendung eines Verdampfers zur Trockne eingeengt, wobei 982 g des Derivats erhalten wurden.
Eine 26 g-Portion des so erhaltenen Derivats wurde in 200 g Wasser gelöst und auf ein Anionenaustauscherharz Bio-Rad AGIX2 (Bio-Rad Laboratories, USA) aufgetragen, das Harz wurde das Derivat mit terminaler Carbonsäure adsorbieren gelassen, nicht-adsorbierte Verunreinigungen wie z.B. nicht-umgesetzter Polyethylenglykolmonoglycerylether wurde mit ionenausgetauschtem Wasser ausgewaschen und das adsorbierte Material wurde mit 1 l 0,05 N Salzsäure eluiert. Eine 230 g-Portion an Natriumchlorid und 1 1 Chloroform wurden zu dem Eluat gegeben und das gebildete Produkt wurde erneut in die Chloroformschicht extrahiert. Die resultierende Chloroformschicht wurde zur Trockene konzentriert, wobei ein Verdampfer verwendet wurden und 22,1 g gereinigtes Derivat mit terminaler Carbonsäure erhalten wurden. Das so erhaltene Derivat mit terminaler Carbonsäure zeigte eine Säurezahl von 81,3.
Danach wurde die terminale Carbonsäure unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccimimid in der gleichen Weise, wie es im Herstellungsbeispiel 1 beschrieben ist, in einen aktiven Ester umgewandelt.
Die Strukturformel der so erhaltenen Verbindung ist in Tabelle 1 angegeben.
Herstellungsbeispiel 3
Eine 20 g-Portion von Methoxypolyethylenglykol (Molekulargewicht 20 000 Dalton) wurde in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung wurde mit 10 ml Pyridin und 0,3 g p-Nitrophenylchlorformiat gemischt, um eine 5-stündige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen. Danach wurde die Reaktionslösung tropfenweise zu einem Liter Diethylether, der gerührt wurde, gegeben und die so präzipitierten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und in einem Exsikkator getrocknet, wodurch 19,8 g Methoxypolyethylenglykolmono-p-nitrophenylformiat erhalten wurden.
Die Strukturformel der so erhaltenen Verbindung ist in Tabelle 1 angegeben.
Erfindungsgemäßes Beispiel 1
Eine 100 ml-Portion von Erythrozyten aus entnommenen Blut zur Transfusion wurden in 100 ml einer 0,9%igen wäßrigen Natriumchlorid-Lösung suspendiert und 4-mal bei 4°C unter Verwendung einer Zentrifuge gewaschen. Eine 60 ml-Portion der gewaschenen humanen Erythrozyten wurde einer Hämolyse unterworfen, wobei 180 ml Wasser zur Injektionsverwendung eingesetzt wurde; die Membrankomponenten wurden unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,22 μm (Millipore C., USA) entfernt. Die Membrankomponenten, die noch zurückgeblieben waren, wurden durch einstündige Zentrifugation mit 6000 Upm entfernt.
Eine 3,29 g (0,051 mmol)-Portion des so erhaltenen humanen Hämoglobins wurde in 1000 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,6) gelöst und die Lösung wurde mit 4,54 g (0,51 mmol) des in Herstellungsbeispiel 1 produzierten aktivierten Polyoxyethylens vermischt, um dann eine zweiständige Reaktion bei 4°C durchzuführen, indem der Partialdruck von Sauerstoff auf 1 mmHg mit Argon reduziert wurde; dadurch wurde ein Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplex erhalten (sogenannte Vorläufer-modifizierte Verbindung).
Als nächstes wurde die Reaktionslösung der Vorläufermodifizierten Verbindung mit 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 0,5 mM DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) gemischt und dann wurde der pH mit Dinatriumhydrogenphosphat auf pH 8,6 eingestellt. Das ganze wurde dann mit 85,7 mg (0,255 mmol) S-Nitrosoglutathion (Stickstoffmonooxidmetabolit) unter Durchführung einer 12-stündigen Reaktion bei 4°C vermischt.
Nach der Reaktion wurde die Reaktionslösung auf eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichts-Cutoff- Wert von 30 000 Dalton (PM 30, hergestellt von Amicon) aufgetragen und die Reinigung wurde wiederholt, bis nicht-umgesetztes Polyethylenglykol-Derivat auf 100 ppm oder weniger verringert war.
Als nächstes wurde die so erhaltene Reaktionslösung gefriergetrocknet, wodurch 5,95 g eines S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplexes (sogenannte modifizierte Hämoglobin-Verbindung von Interesse) als eine Verbindung der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Das Resultat einer Gelpermeationschromatographie der so erhaltenen Verbindung ist in 1 gezeigt.
Die Meßbedingungen der Gelpermeationschromatographie sind wie folgt:
Säule: Toso SW4000XL
Entwicklungslösung: 50 mM NP, 0,2 M NaCl, pH 6,8
Durchflußgeschwindigkeit: 0,8 ml/min
Probeninjektion: 5 μl (0,5 %)
Meßextinktion: 420 nm
Aus 1 wird deutlich, daß das so erhaltene Produkt kein nicht-umgesetztes Hämoglobin und kein nicht-umgesetztes Polyoxyethylen enthielt, welche als Materialien eingesetzt wurden.
Es wurde festgestellt, daß der so erhaltene S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplex (modifizierte Verbindung) ein Molekulargewicht von 870 000 Dalton hat.
Es wurde festgestellt, daß die met-Formbildung (Oxidation von Hämoglobin) in der so erhaltenen Verbindung der vorliegenden Erfindung 1,2 % war.
Der met-Hämoglobingehalt wird durch ein Cyanid-met-Form-Bildungsverfahren gemessen. Jede der Hämoglobinproben wird dabei mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8), der 1 % Triton X (hergestellt von Aldrich) enthält, auf 4 ml verdünnt und dann in zwei Spektroskopiezellen verteilt. Die Probe in einer der Zellen wird bezüglich ihrer Extinktion bei 630 nm (λM1) gemessen und dann mit 10 μl 8%igem Kaliumcyanid vermischt, um die Extinktion in der gleichen Weise zu messen (λM2). Die Probe in der anderen Zelle wird mit 10 μl 8 % Kaliumferricyanid vermischt, um die Extinktion (λT1) zu messen, und wird dann mit demselben Volumen 8 % Kaliumcyanid vermischt, um die Extinktion in der gleichen Weise zu messen (λT2).
Der Anteil der met-Form-Bildung wurde auf der Basis der Formel (λM1 – λM2)/(λT1 – λT2) berechnet.
Die Messung des S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplexes wurde unter Verwendung eines Gelpermeationschromatographie-unterstützten Verfahrens durchgeführt (Akaike T. et al., Nanomolar quantification and identification of verious nitrosothiols by high performance liquid chromatography coupled with flow reactors of metals and Griess reagent, J. Biochem., 122, 459–466, 1997). Beispielspielhafte Meßbedingungen sind folgende:
Säule: Eicon GFC-200
Entwicklunglösung: 10 mM Acetatpuffer (pH 5,5) enthaltend 0,1 mM EDTA
Erste Reaktionslösung: 1,75 mM Quecksilberchlorid-Lösung in der obigen Entwicklungslösung, die kein EDTA enthält
Säule nach erster Reaktion: Eicom CA-ODS
Zweite Reaktionslösung: 1 % Sulfanilamid/0,1 % N-Naphthylethylendiamin/2 % Phosphorsäure (Griess- Reaktionslösung),
Messung- Extinktion bei 540 nm
Probeninjektion: 5 μl
Durch Messung des Nitritions als Standardsubstanz in der gleichen Weise wurde die Menge S-Nitrosoglutathion (Stickstoffmonooxidmetabolit)-Hämoglobin-Komplex aus dem Chromatographieintegrationswert errechnet und der Verhältnisanteil an S-Nitrosoglutathion (Stickstoffmonooxidmetabolit), der in Hämoglobin eingeführt worden war, wurde aus der Anzahl der injizierten Hämoglobinmoleküle errechnet.
Wie in 2 gezeigt ist, war der Verhältnisanteil von S-Nitrosoglutathion (Stickstoffmonooxidmetabolit), der in die so erhaltene Verbindung der vorliegenden Erfindung eingeführt worden war, 48 %.
Die Anzahl der reaktiven Amino-Gruppen wurde durch Titration mit Trinitrobenzolsulfonsäure (A.F.S.A. Habeeb, Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid, Annal. Biochem., 14, 328–336, 1966) gemessen und Modifizierungsverhältnis wurde bestimmt, indem die Werte vor und nach der Modifikation unter Verwendung des Polyoxyalkylen-Derivats verglichen wurden.
Die Berechnungsformel für das Modifizierungsverhältnis ist wie folgt. Modifizierungsverhältnis = 100 × (1 – Anzahl der restlichen Amino-Gruppen nach Modifizierung/Anzahl der Amino-Gruppen vor Modifizierung).
Als Resultate der Messungen in diesem Beispiel wurde das Modifizierungsverhältnis als 18,8 errechnet, was zeigt, daß die Verbindung von Herstellungsbeispiel 1 (aktiviertes Polyoxyethylen) an 9,02 Amino-Gruppen gebunden war.
In diesem Zusammenhang wird erwähnt, daß die vorstehend beschriebene Hämoglobinlösung entsprechend dem Verfahren, das in JP-B-6-76333 beschrieben ist, hergestellt wurde.
Erfindungsgemäßes Beispiel 2
Eine 50 ml-Portion frischer Rindererythrozyten wurde 4-mal bei 4°C mit 50 ml einer wäßrigen 0,9 % Natriumchlorid-Lösung unter Verwendung einer Zentrifuge gewaschen. Eine 40 ml Portion der so erhaltenen Erythrozyten-Lösung wurde einer Hämolyse unterworfen, indem 80 ml Wasser zur Injektionsverwendung zugesetzt wurden, das Lysat wurde bei 8000 Upm für 1 Stunde zentrifugiert und dann wurden die Membrankomponenten unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (Cutoff-Grenze 100 000 Dalton) von Hämoglobin abgetrennt.
Eine 3,87 g (0,06 mmol)-Portion des so erhaltenen Hämoglobins wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gelöst und die Lösung wurde auf ein Gesamtvolumen von 25 ml eingestellt. Nach Desoxidation der Lösung durch kräftiges Einblasen von Argon, bis der Partialdruck von Sauerstoff 2 mmHg oder weniger erreicht hatte, wurde der Zusatz von Pyridoxal-5'-phosphat nach einem bekannten Verfahren (R. Benesch et al., J. Biol. Chem. 257 (3), 1320 – 1324, 1982) durchgeführt, wobei Pyridoxal-modifiziertes Hämoglobin erhalten wurde. Die so erhaltene Lösung von Pyridoxal-modifiziertem Hämoglobin wurde durch Zusatz von 0,1 M Boratpuffer (pH 8,2) auf ein Gesamtvolumen von 1 l eingestellt.
Als nächstes wurde diese Lösung mit 0,23 g (0,09 mmol) des in Herstellungsbeispiel 2 hergestellten aktivierteren Polyoxyethylen-Derivats vermischt, um eine vierstündige Reaktion bei 2°C unter Verringerung des Partialdrucks von Sauerstoff auf 1 mmHg mit Argon durchzuführen; dadurch wurde ein Polyoxyethylen-Pyridoxal-modifizierter Hämoglobin-Komplex (sogenannte vorläufige Vorläufer-modifizierte Verbindung) erhalten.
Als nächstes wurde die Reaktionslösung der vorläufigen Vorläufer-modifizierten Verbindung mit 1 mmol EDTA und 0,5 mmol DTPA vermischt und dann wurde der pH mit Dinatriumhydrogenphosphat auf 8,6 eingestellt. Das ganze wurde dann mit 100 mg (0,3 mmol) S-Nitrosoglutathion vermischt, um eine 4-stündige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen; dadurch wurde ein S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Hämoglobin-Komplex (sogenannte Vorläufermodifizierte Verbindung) erhalten.
Diese Vorläufer-modifizierte Verbindung wurde außerdem mit 24,1 g (1,2 mmol) des in Herstellungsbeispiel 3 hergestellten aktivierten Polyoxyalkylen-Derivats vermischt und die Reaktion wurde 4 Stunden bei 4°C fortgesetzt.
Die Reaktionslösung wurde auf eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 100 000 Dalton (YM100, hergestellt von Amicon) aufgebracht und es wurde eine Reinigung durchgeführt, bis das nicht-umgesetzte Polyethylenglykol-Derivat auf 100 ppm oder weniger verringert war.
Als nächstes wurde die so erhaltene Reaktionslösung gefriergetrocknet, wodurch 13,8 g ein S-Nitrosoglutathion-Polyoxyethylen-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes (sogenannte modifizierte Hämoglobin-Verbindung von Interesse) als erfindungsgemäße Verbindung erhalten wurden.
Das Resultat der Gelpermeationschromatographie der so erhaltenen Verbindung ist in 3 gezeigt.
Das Molekulargewicht der so erhaltenen Verbindung der vorliegenden Erfindung war 1 670 000 Dalton und das Modifizierungsverhältnis der Amino-Gruppen war 20,1 %, was zeigte, daß die Polyoxyalkylen-Ketten an 10,1 Amino-Gruppen gebunden waren.
Das Einführungsverhältnis von S-Nitrosoglutathion (Stickstoffmonooxidmetabolit) wurde als 19 % festgestellt.
Vergleichsbeispiel 1
Die Synthese des Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes wurde gemäß dem in JP-B-6-76333 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Zuerst wurde ein aktivierter Ester von Polyethylenglykol #4000 (hergestellt von NOF-Corporation; Molekulargewicht 3100 Dalton) nach demselben Verfahren wie in Herstellungsbeispiel 1 synthetisiert.
Ein Vierhalskolben, der mit einem Stickstoffeinblasrohr, einem Rührer, einem Thermometer und einem Kühler/Wassermeßrohr ausgestattet war, wurde mit 62 g des gerade beschriebenen Polyethylenglykols, 100 ml Toluol und 0,2 g Natriumacetat beschickt und der Inhalt wurde auf 80°C erwärmt und gerührt, bis er vollständig gelöst war. Als nächstes wurde die resultierende Lösung unter Einblasen von Stickstoffgas langsam erwärmt, bis das Lösungsmittel (Toluol) zu refluxieren begann und der Rückfluß wurde für eine Stunde aufrechterhalten. Danach wurde das im Wassermeßrohr kondensierte Wasser verworfen, das Meßrohr wurde vom Vierhalskolben entfernt und dann wurde das Kühlerrohr erneut am Kolben befestigt.
Als nächstes wurde die Reaktionslösung mit 4,8 g Bernsteinsäureanhydrid gemischt und für 3 Stunden bei 105°C gerührt. Anschließend wurden nicht-umgesetztes Bernsteinsäureanhydrid und Toluol unter einem reduziertem Druck von 100 mmHg oder weniger verdampft. Nach Abkühlen des resultierenden Rückstands auf 80°C wurde überschüssiges Natriumacetat durch Filtration unter reduziertem Druck entfernt, wobei 57 g Polyethylenglykoldisuccinat erhalten wurden.
Das so erhaltene Polyethylenglykoldisuccinat zeigte eine Säurezahl von 33,9 und eine Verseifungszahl von 67,9.
Als nächstes wurden 13,2 g Polyethylenglykoldisuccinat und 200 ml Dimethylformamid in einen Erlenmeyer-Kolben mit Schliffstopfen gegeben und unter Rühren mit einem Magnetrührer auf 40°C erwärmt. Eine 1,96 g-Portion Dicyclohexylcarbodiimid und 1,12 g N-Hydroxysuccinimid wurden in den Kolben gegeben und das resultierende Gemisch wurde für 12 Stunden gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch tropfenweise unter Rühren zu 1 l Diethylether gegeben und die so präzipitierten Kristalle wurden durch Kompressionsfiltration gesammelt, wodurch 10,8 g des aktivierten Esters von Polyethylenglykol #4000 als weiße Kristalle erhalten wurden.
Eine 5,16 g (0,08 mmol)-Portion des von Membrankomponenten befreiten Rinderhämoglobins, das durch dasselbe Verfahren wie im erfindungsgemäßen Beispiel 2 hergestellt worden war, wurde in 200 ml 0,1 M Boratpuffer (pH 7,0) gelöst, die resultierende Lösung wurde mit 6,5 g (1,84 mmol) des aktivierten Esters von Polyethylenglykol #4000 und 113 mg (0,773 mmol) Lysin vermischt und dann wurde die Reaktion für 2 Stunden bei 4°C nach Verringerung des Sauerstoffpartialdrucks auf 2 mmHg mit Argon durchgeführt.
Die Reaktionslösung wurde auf eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 100 000 Dalton (YM100, hergestellt von Amicon) angewendet und die Reinigung wurde wiederholt, bis das nicht-umgesetzte Polyethylenglykol-Derivat auf 100 ppm oder weniger verringert war.
Danach wurde die so erhaltene Reaktionslösung gefriergetrocknet, wobei 6,46 g der interessierenden Verbindung erhalten wurden.
Das Molekulargewicht der so erhaltenen Verbindung war 89 000 Dalton und das Modifizierungsverhältnis der Amino-Gruppen war 12,6 %, was zeigte, daß die Polyoxyalkylen-Ketten an 6,3 Amino-Gruppen gebunden waren.
Vergleichsbeispiel 2
Die Synthese eines Stickstoffmonooxid-Metabolit-Hämoglobin-Komplexes wurde als Vergleichstest durchgeführt.
Zunächst wurde eine Lösung von Pyridoxal-modifiziertem Hämoglobin in der gleichen Weise, wie es im erfindungsgemäßen Beispiel 2 beschrieben ist, erhalten.
Eine 50 ml-Portion frischer Rindererythrozyten wurde 4-mal bei 4°C mit 50 ml einer 0,9%igen wäßrigen Natriumchlorid-Lösung unter Verwendung einer Zentrifuge gewaschen. Eine 40 ml-Portion der so erhaltenen Erythrozyten-Lösung wurde einer Hämolyse unterworfen, indem 80 ml Wasser zur Injektionsverwendung zugesetzt wurden, das Lysat wurde 1 Stunde lang bei 8000 Upm zentrifugiert und dann wurden die Membrankomponenten von Hämoglobin abgetrennt, wobei eine Ultrafiltrationsmembran (Cutoff-Grenze 100 000 Dalton) verwendet wurde.
Eine 3,87 g (0,06 mmol)-Portion des so erhaltenen Hämoglobins wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gelöst und die Lösung wurde auf ein Gesamtvolumen von 25 ml eingestellt. Nach Desoxidation der Lösung durch kräftiges Einblasen von Argon, bis der Partialdruck von Sauerstoff 2 mmHg oder weniger erreicht hatte, wurde eine Zugabe von Pyridoxal-5'-phosphat nach einem bekannten Verfahren (R. Benesch et al., J. Biol. Chem., 257 (3), 1320–1324, 1982) durchgeführt, wobei Pyridoxal-modifiziertes Hämoglobin erhalten wurde. Die so erhaltene Lösung von Pyridoxal-modifiziertem Hämoglobin wurde durch Zugabe von 0,1M Boratpuffer (pH 8,2) auf ein Gesamtvolumen von 1 l eingestellt.
Als nächstes wurde die Reaktionslösung mit 1 mmol EDTA und 0,5 mmol DTPA vermischt und dann mit Dinatriumhydrogenphosphat auf einen pH von 8,6 eingestellt. Das ganze wurde dann mit 100 mg (0,3 mmol) S-Nitrosoglutathion gemischt, um eine 4-stündige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen.
Die so erhaltene Reaktionslösung wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 30 000 Dalton (PM30, hergestellt von Amoicon) gereinigt, bis nicht-umgesetztes S-Nitrosoglutathion auf 5 ppm oder weniger verringert war.
Danach wurde die so erhaltene Reaktionslösung gefriergetrocknet, wobei 2,6 g der interessierenden Verbindung erhalten wurden.
Erfindungsgemäßes Beispiel 3
Jede der in den erfindungsgemäßen Beispielen 1 und 2 und den Vergleichsbeispielen 1 und 2 erhaltenen Verbindungen wurde in einer Konzentration von 5 % in physiologischer Salzlösung gelöst und Wistar-Ratten (7 bis 8 Wochen alt, 240 bis 280 g Körpergewicht) durch intravenöse Injektion mit einer Dosis von 2,5 ml/kg verabreicht.
Das Blutdruckerhöhungsverhältnis nach Injektion jeder Verbindung ist in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Erfindungsgemäßes Beispiel 4
Die Permeabilität für jede der in den erfindungsgemäßen Beispielen 1 und 2 und den Vergleichsbeispielen 1 und 2 erhaltenen Verbindungen durch vaskuläre Endothelzellen wurde durch das folgende Modellexperiment gemessen. 4 ist eine schematische Darstellung, die das Permeabilitätsmeßverfahren zeigt.
Rinderaorta-Endothelzellen wurden als Monolayer auf einem Collagen-Filter mit einer Porengröße von 0,4 μm (Transwellcollagen, hergestellt von Corning Cosaster) kultiviert und unter Verwendung der resultierenden oberen Schicht als hypothetische intravaskuläre Höhle und der unteren Schicht als hypothetische vaskuläre Wandseite wurde jede der Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Beispielen 1 und 2 und den Vergleichsbeispielen 1 und 2 erhalten worden waren, mit 125_I markiert und mit einer Hämoglobinkonzentration von 15,5 μM zu der Höhlenseite gegeben. Eine Stunde später wurde die Menge des Hämoglobinkomplexes, der in die untere Schicht übertragen worden war, mit einem gamma-Zähler gemessen, um so die Permeabilität (x 10^–6 cm/s) zu errechnen.
Tabelle 3

Claims

Ein Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex mit einem Molekulargewicht von 100.000 bis 2.000.000 Dalton, worin ein Polyoxyalkylenderivat an 10 bis 30 % der Gesamtmenge an bindungsfähigen Aminogruppen im Hämoglobin gebunden ist und eine S-Nitroso-niedermolekulare Thiolverbindung mit einem Molekulargewicht von 1.000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonoxidmetabolit an 10 bis 100 % der gesamten Thiolgruppen der Cysteinreste gebunden ist.
Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex gemäß Anspruch 1, worin das Polyoxyalkylenderivat repräsentiert wird durch eine Verbindung der Formel (1):
worin B einen Rest einer Verbindung mit 2 bis 6 Hydroxylgruppen repräsentiert, AO repräsentiert eine Oxyalkylengruppe mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen, R repräsentiert eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxygruppe, k und m sind Zahlen, welche jeweils 0 ≤ k ≤ 500 bzw. 0 ≤ m ≤ 500 erfüllen, wie auch 20 ≤ k + m ≤ 1.000, als die mittlere Zugabemolzahl an Oxyethylengruppen, 1 und n sind Zahlen, welche jeweils 0 ≤ 1 ≤ 10 bzw. 0 ≤ n ≤ 10 erfüllen, wie auch 0 ≤ 1 + n ≤ 10, als die mittlere Zugabemolzahl an Oxyalkylengruppen, a und b sind Zahlen, die jeweils 0 ≤ a ≤ 6 bzw. 1 ≤ b ≤ 6 erfüllen, wie auch 2 ≤ a + b ≤ 6, und X repräsentiert eine funktionelle Gruppe, die geeignet ist zur Bindung an die in Formeln (2), (3), (4) oder (5) dargestellte Aminogruppe: -(CH₂)_c-COO (2)worin c eine Zahl von 0 bis 2 ist und Y repräsentiert Wasserstoff oder eine p-Nitrophenylgruppe oder einen N-Hydroxybernsteinsäureimidrest, -OG(CH₂)d-COOY (3)worin d eine Zahl von 2 bis 6 ist und Y repräsentiert Wasserstoff oder einen N-Hydroxybernsteinsäureimidrest, -(CH₂)_e CHO (4)worin e 1 oder 2 ist, und -COZ (5)worin Z eine Imidazolgruppe repräsentiert.
Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der Stickstoffmonoxidmetabolit S-Nitrosoglutathion ist.
Sauerstoffträgerlösung, welche den Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplex von Anspruch 1, 2 oder 3 in einer Menge von 10 g/l bis 200 g/l umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einem Molekulargewicht von 100.000 bis 2.000.000 Dalton, worin ein Polyoxyalkylenderivat gebunden ist an 10 bis 30 % der Gesamtmenge an bindungsfähigen Aminogruppen im Hämoglobin und eine S-Nitroso-niedermolekulare Thiolverbindung mit einem Molekulargewicht von 1.000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonoxidmetabolit gebunden ist an 10 bis 100 % der Gesamtmenge an Thiolgruppen der Cysteinreste, umfassend das Umsetzen eines Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einer S-Nitroso-niedermolekularen Thiolverbindung mit einem Molekulargewicht von 1.000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonoxidmetabolit.
Verfahren zur Herstellung eines Stickstoffmonoxidmetabolit-Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einem Molekulargewicht von 100.000 bis 2.000.000 Dalton, worin ein Polyoxyalkylenderivat gebunden ist an 10 bis 30 % der Gesamtmenge an bindungsfähigen Aminogruppen im Hämoglobin und eine S-Nitroso-niedermolekulare Thiolverbindung mit einem Molekulargewicht von 1.000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonoxidmetabolit gebunden ist an 10 bis 100 % der Gesamtmenge an Thiolgruppen der Cysteinreste, umfassend das Umsetzen eines Polyoxyalkylen-Hämoglobin-Komplexes mit einer S-Nitroso-niedermolekularen Thiolverbindung mit einem Molekulargewicht von 1.000 Dalton oder weniger als Stickstoffmonoxidmetabolit und anschließend mit einem Polyoxyalkylenderivat.