DE69928219T2

DE69928219T2 - Lipasehemmende polymere

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Publication number: DE69928219T2
Application number: DE69928219T
Authority: DE
Inventors: Harry W. MANDEVILLE; Kate Molly BOIE; R. Venkata GARIGAPATI
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1998-01-09
Filing date: 1999-01-06
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2019-01-07
Also published as: CN1636574A; US20030185789A1; DK1043982T3; EP1043982A2; ATE308979T1; US6558657B1; DE69928219D1; NO20003511L; HUP0101128A3; ES2253872T3; HUP0101128A2; HK1079706A1; US6267952B1; KR100620634B1; NZ505296A; IL137098A0; IL137098A; AU2105699A; KR20010034012A; RU2207861C2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fettsucht bei Menschen ist ein bekanntes Gesundheitsproblem, wobei in den Vereinigten Staaten etwa 97 Millionen Personen als klinisch übergewichtig betrachtet werden. Die Ansammlung oder das Beibehalten von Körperfett steht in direkter Beziehung zur Kalorienaufnahme. Daher besteht eines der häufigsten Verfahren zur Gewichtskontrolle zur Bekämpfung von Fettsucht in der Verwendung von relativ fettarmen Diäten, d.h. Diäten, die weniger Fett als "normale Ernährung" oder die normalerweise vom Patienten aufgenommene Menge enthalten.
Das Vorhandensein von Fetten in sehr vielen Nahrungsmittelquellen beschränkt die Nahrungsmittelquellen, die bei einer fettarmen Diät verwendet werden können, stark. Ferner tragen Fette zum Aroma, Aussehen und den physikalischen Eigenschaften vieler Nahrungsmittel bei. Daher ist die Akzeptanz fettarmer Diäten und das Beibehalten derartiger Diäten schwierig.
Verschiedene chemische Ansätze wurden zur Bekämpfung von Fettsucht vorgeschlagen. Anorektika, wie Dextroamphetamin, die Kombination der Nichtamphetamin-Arzneimittel Phentermin und Fenfluramin (Phen-Fen) und Dexfenfluramin (Redux) allein, sind mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Unverdauliche Materialien, wie Olestra (OLEAN^®), Mineralöl oder Neopentylester (siehe US-Patent 2 962 419), wurden als Ersatzstoffe für Nahrungsfett vorgeschlagen. Es wurde beschrieben, dass Garciniasäure und Derivate derselben Fettsucht durch Eingreifen in die Fettsäuresynthese behandeln. Quellbare vernetzte Vinylpyridinharze wurden als Appetit zügler über den Mechanismus der Bereitstellung einer Masse ohne Nährwert, beispielsweise in US-Patent 2 923 662, beschrieben. Chirurgische Techniken, wie eine temporäre Ileumbypass-Chirurgie, werden in extremen Fällen verwendet.
Jedoch weisen Verfahren zur Behandlung von Fettsucht, wie die oben beschriebenen, schwere Nachteile auf, wobei eine kontrollierte Ernährung bzw. Diät das am stärksten vorherrschende Verfahren zur Bekämpfung von Fettsucht bleibt. Daher sind neue Verfahren zur Behandlung von Fettsucht nötig.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung von Fettsucht bei einem Patienten durch Verabreichen eines Polymers, das mit einer oder mehreren Gruppen, die eine Lipase hemmen können, substituiert ist oder diese umfasst, an den Patienten. Lipasen sind Schlüsselenzyme im Verdauungssystem, die Tri- und Diglyceride, die zu groß sind, um durch den Dünndarm absorbiert zu werden, in Fettsäuren zerlegen, die absorbiert werden können. Daher führt die Hemmung von Lipasen zu einer Verringerung der Absorption von Fett. In einer Ausführungsform kann die lipasehemmende Gruppe ein "Selbstmordsubstrat" sein, das die Aktivität der Lipase durch Ausbildung einer kovalenten Bindung mit dem Enzym entweder am aktiven Zentrum oder an anderer Stelle hemmt. In einer weiteren Ausführungsform ist die lipasehemmende Gruppe ein isosterer Inhibitor des Enzyms. Die Erfindung betrifft ferner die bei den hier beschriebenen Verfahren verwendeten Polymere sowie neue Zwischenprodukte und Verfahren zur Herstellung der Polymere.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung von Fettsucht bei einem Patienten durch Verabreichung eines Polymers, das eine oder mehrere Gruppen, die eine Lipase hemmen können, umfasst, an den Patienten. Da Lipasen für die Hydrolye von Fett verantwortlich sind, ist eine Folge von deren Hemmung eine Verringerung von Fetthydrolyse und -absorption. Die Erfindung betrifft ferner die bei den hier beschriebenen Verfahren verwendeten Polymere sowie neue Zwischenprodukte und Verfahren zur Herstellung der Polymere.
In einem Aspekt der Erfindung inaktiviert die lipasehemmende Gruppe eine Lipase, wie Magen-, Pankreas- und Linguallipasen. Eine Inaktivierung kann sich durch die Ausbildung einer kovalenten Bindung derart, dass das Enzym inaktiv ist, ergeben. Die kovalente Bindung kann mit einem Aminosäurerest an oder nahe dem aktiven Zentrum des Enzyms oder an einem Rest, der vom aktiven Zentrum entfernt ist, ausgebildet werden, vorausgesetzt, die Bildung der kovalenten Bindung führt zu einer Hemmung der Enzymaktivität. Lipasen enthalten eine katalytische Triade, die für die Hydrolyse von Lipiden zu Fettsäuren verantwortlich ist. Die katalytische Triade besteht aus Serin-, Aspartat- und Histidinaminosäureresten. Diese Triade ist auch für die Hydrolyse von Amidbindungen in Serinproteasen verantwortlich, und es wird angenommen, dass Verbindungen, die Serinproteaseinhibitoren sind, auch Lipasen hemmen. Daher sind Serinproteaseinhibitoren, die kovalent an ein Polymer gebunden sein können, bevorzugte lipasehemmende Gruppen. Beispielsweise kann eine kovalente Bindung zwischen der lipasehemmenden Gruppe und einem Hydroxyl an oder dem katalytischen Zentrum des Enzyms gebildet werden. Beispielsweise kann eine kovalente Bindung mit Serin gebildet werden. Eine Inaktivierung kann ebenfalls von einer lipasehemmenden Gruppe ausgehen, die eine kovalente Bindung mit einer Aminosäure, beispielsweise Cystein, die sich in einem gewissen Abstand vom aktiven Zentrum befindet, bildet. Ferner kann eine nicht-kovalente Interaktion zwischen der lipasehemmenden Gruppe und dem Enzym ebenfalls zu einer Inaktivierung des Enzyms führen. Beispielsweise kann die lipasehemmende Gruppe ein Isoster einer Fettsäure sein, das nicht-kovalent mit dem katalytischen Zentrum der Lipase interagieren kann. Ferner kann die lipasehemmende Gruppe mit natürlichen Triglyceriden um die Lipasehydrolyse konkurrieren.
In einem Aspekt der Erfindung kann eine lipasehemmende Gruppe durch die Formel I dargestellt werden:
worin
R für Wasserstoff, eine hydrophobe Einheit, -NR²R³, -CO₂H, -OCOR², -NHCOR², eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Gruppe steht;
R¹ für eine Aktivierungsgruppe steht;
Y für Sauerstoff, Schwefel, -NR²- steht oder nicht vorhanden ist;
Z und Z¹ unabhängig voneinander für einen Sauerstoff, ein Alkylen, Schwefel, -SO₃-, -CO₂-, -NR²-, -CONR²-, -PO₄H- oder eine Abstandsgruppe stehen;
R² und R³ unabhängig voneinander für einen Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Gruppe stehen;
m für 0 oder 1 steht; und
n für 0 oder 1 steht.
In einer Ausführungsform kann die lipasehemmende Gruppe der Formel I durch die folgenden Strukturen dargestellt werden:
worin R, R¹ und Y wie oben definiert sind.
In einer weiteren Ausführungsform kann die lipasehemmende Gruppe der Strukturformel I durch die folgenden Strukturen dargestellt werden:
worin R, R¹, R², R³ und Y wie oben definiert sind und p eine ganze Zahl (beispielsweise eine ganze Zahl zwischen null und etwa 30, vorzugsweise zwischen etwa 2 und etwa 10) ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Lipaseinhibitor der Formel I ein gemischtes Anhydrid. Gemischte Anhydride umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, lipasehemmende Gruppen eines gemischten Anhydrids von Phosphorsäure/Carbonsäure, Phosphorsäure/Sulfonsäure und Pyrophosphat, die durch die jeweiligen folgenden Strukturen dargestellt werden können:
worin R, R¹, Y und Z¹ wie oben definiert sind.
In einem weiteren Aspekt kann eine lipasehemmende Gruppe der Erfindung ein Anhydrid sein. In einer Ausführungsform ist das Anhydrid ein cyclisches Anhydrid der Formel II:
worin R, Z und p wie oben definiert sind, X für -PO₂-, -SO₂- oder -CO- steht und k eine ganze Zahl von 1 bis etwa 10, vorzugsweise 1-4, ist.
In einer weiteren Ausführungsform können die lipasehemmenden Gruppen eines Anhydrids ein cyclisches Anhydrid, das Teil eines kondensierten Ringsystems ist, sein. Anhydride dieses Typs können durch die Formel III dargestellt werden:
worin X und Z wie oben definiert sind und der Ring A eine optional substituierte cyclische aliphatische Gruppe oder aromatische Gruppe oder Kombinationen derselben, die ein oder mehrere Heteroarome im Ring umfassen können, ist. In einer speziellen Ausführungsform ist das cyclische Anhydrid ein Benzolsulfonsäureanhydrid der folgenden Struktur:
worin Z wie oben definiert ist und der Benzolring ferner substituiert sein kann.
In einem weiteren Aspekt ist die lipasehemmende Gruppe ein α-halogeniertes Carbonyl, das durch die Formel IV darge stellt werden kann:
worin R und Y wie oben definiert sind und W¹ und W² jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Halogen, beispielsweise -F, -Cl, -Br und -I, stehen, wobei mindestens ein Rest von W¹ und W² ein Halogen ist.
In einem weiteren Aspekt kann eine cyclische Verbindung mit einer endocyclischen Gruppe, die gegenüber einem nukleophilen Angriff empfindlich ist, eine lipasehemmende Gruppe sein. Lactone und Epoxide sind Beispiele für diesen Typ einer lipasehemmenden Gruppe und können durch die Formel V bzw. VI dargestellt werden:
worin R, Z, m und p wie oben definiert sind.
In einem weiteren Aspekt kann die lipasehemmende Gruppe eine Sulfonat- oder Disulfidgruppe der Formel VII bzw. VIII sein:
worin R, Z und p wie oben definiert sind und R⁵ nicht vorhanden ist oder für eine hydrophobe Einheit, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Gruppe steht.
In einer speziellen Ausführungsform kann die lipasehemmende Gruppe eines Disulfids durch die folgende Formel dargestellt werden:
worin R, Z und p wie oben definiert sind.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann eine lipasehem mende Gruppe eine Boronsäure sein, die an ein Polymer durch eine hydrophobe Gruppe oder, wenn das Polymer hydrophob ist, direkt an das Polymer gebunden sein kann. Lipasehemmende Gruppen einer Boronsäure können durch die folgende Struktur dargestellt werden:
worin R⁵, Z, n und m wie oben definiert sind.
In einem weiteren Aspekt kann eine isostere lipasehemmende Gruppe eine an das Polymer gebundene Phenolsäure sein. Lipasehemmende Gruppen einer Phenolsäure können durch die folgende Struktur dargestellt werden:
worin Z, R⁵, n und m wie oben definiert sind und -CO₂H und -OH ortho oder para in Bezug zueinander stehen.
Eine Vielzahl von Polymeren kann in der hier beschriebenen Erfindung verwendet werden. Die Polymere können aliphatische, alicyclische oder aromatische oder synthetische oder natürlich vorkommende sein. Jedoch sind aliphatische und alicyclische synthetische Polymere bevörzugt. Ferner kann das Polymer hydrophob, hydrophol oder Copolymere von hydrophoben und/oder hydrophilen Monomeren sein. Das Polymer kann insgesamt oder partiell nichtionisch (beispielsweise neutral), anionisch oder kationisch sein. Ferner können die Polymere aus Olefin- oder Ethylenmonomeren (beispielsweise Vinylalkohol) oder Kondensationspolymeren hergestellt sein.
Beispielsweise können die Polymere ein Polyvinylalkohol, Polyvinylamin, Poly-N-alkylvinylamin, Polyallylamin, Poly-N-alkylallylamin, Polyalkylenimin, Polyethylen, Polypropylen, Polyether, Polyethylenoxid, Polyamid, eine Polyacrylsäure, ein Polyalkylacrylat, Polyacrylamid, eine Polymethacrylsäure, ein Polyalkylmethacrylat, Polymethacrylamid, Poly-N-alkylacrylamid, Poly-N-alkylmethacrylamid, Polystyrol, Vinylnaphthalin, Ethylvinylbenzol, Aminostyrol, Vinylbiphenyl, Vinylanisol, Vinylimidazolyl, Vinylpyridinyl, Dimethylaminomethylstyrol, Trimethylammoniummethylmethacrylat, Trimethylammoniumethylacrylat, Kohlehydrat, Protein und substituierte Derivate der obigen (beispielsweise fluorierte Monomere derselben) und Copolymere derselben sein.
Bevorzugte Polymere umfassen Polyether, wie Polyalkylenglykole. Polyether können durch die Formel IX dargestellt werden:
worin R wie oben definiert ist und q eine ganze Zahl ist.
Beispielsweise kann das Polymer Polypropylenglykol oder Polyethylenglykol oder Copolymere derselben sein. Die Polymere können statistische oder Blockcopolymere sein. Ferner können die Polymere hydrophob, hydrophil oder eine Kombination derselben (beispielsweise in statistischen oder Blockpolymeren) sein.
Ein speziell bevorzugtes Polymer ist ein Blockcopolymer, das durch hydrophobe und hydrophile Polymerregionen gekennzeichnet ist. In einer derartigen Ausführungsform kann das "Kernpolymer" hydrophob sein, wobei ein Ende oder beide Enden mit einem hydrophilen Polymer bedeckt sind oder umgekehrt. Ein Beispiel für ein derartiges Polymer ist ein Polyethylenglykol-Polypropylenglykol-Polyethylenglykol-Copolymer, das unter der Marke PLURONIC^® (BASF Wyandotte Corp.) vertrieben wird. BRIJ^® und IGEPAL^® (Aldrich, Milwaukee, WI) sind Beispiele für Polymere mit einem Polyethylenglykolkern, der mit einer hydrophoben Endgruppe bedeckt ist. BRIJ^®-Polymere sind Polyethylenglykole, bei denen ein Ende mit einer Alkoxygruppe bedeckt ist, während die Hydroxygruppe am anderen Ende der Polymerkette frei ist. IGEPAL^®-Polymere sind Polyethylenglykole, bei denen ein Ende mit einer 4-Nonylphenoxygruppe bedeckt ist, während die Hydroxygruppe am anderen Ende der Polymerkette frei ist.
Eine weitere Klasse von Polymeren umfasst aliphatische Polymere, beispielsweise Polyvinylalkohol, Polyallylamin, Polyvinylamin und Polyethylenimin. Diese Polymere können ferner durch einen oder mehrere Substituenten, beispielsweise substituiertes oder unsubstituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, gekennzeichnet sein. Geeignete Substituenten umfassen anionische, kationische oder neutrale Gruppen, wie Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Aralkyl, Halogen, Amin und Ammoniumgruppen. Das Polymer kann günstigerweise eine oder mehrere reaktive funktionale Gruppen besitzen, die direkt oder indirekt mit einem Zwischenprodukt, das die lipasehemmenden Gruppen besitzt, reagieren können.
In einer Ausführungsform besitzen die Polymere die folgende Wiederholungseinheit:
worin
q eine ganze Zahl ist und
R⁴ für -OH, -NH₂, -CH₂NH₂, -SH oder eine Gruppe der folgenden Formel:
worin R, R¹, Y, Z, Z¹, m und n wie oben definiert sind, steht.
Ferner kann das Polymer ein Kohlehydrat, wie Chitosan, Cellulose, Hemicellulose oder Stärke, oder Derivate derselben sein.
Das Polymer kann linear oder vernetzt sein. Eine Vernetzung kann durch Umsetzung des Copolymers mit einem oder mehreren Vernetzungsmitteln mit zwei oder mehreren funktionalen Gruppen, beispielsweise elektrophilen Gruppen, die mit einem Alkohol des Polymers unter Bildung einer kovalenten Bindung reagieren, durchgeführt werden. Die Vernetzung kann in diesem Fall beispielsweise über einen nukleophilen Angriff der Polymerhydroxygruppen an den elektrophilen Gruppen erfolgen. Dies führt zur Bildung einer Verbrückungseinheit, die zwei oder mehrere Alkoholsauerstoffe von verschiedenen Polymersträngen verknüpft. Geeignete Vernetzungsmittel dieses Typs umfassen Verbindungen mit zwei oder mehreren Gruppen, die aus Acylchlorid, Epoxid und Alkyl-X, worin X eine geeignete Abgangsgruppe, wie eine Halogen-, Tosyl- oder Mesylgruppe, ist, ausgewählt sind. Beispiele für derartige Verbindungen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Epichlorhydrin, Succinyldichlorid, Acryloylchlorid, Butandioldiglycidylether, Ethandioldiglycidylether, Pyromellitsäuredianhydrid und Dihalogenalkan.
Die Polymerzusammensetzung kann auch durch Einarbeiten eines multifunktionalen Comonomers als Vernetzungsmittel in das Reaktionsgemisch vernetzt werden. Ein multifunktionales Comonomer kann in zwei oder mehrere wachsende Polymerketten eingearbeitet werden, wodurch die Ketten vernetzt werden. Geeignete multifunktionale Comonomere umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Diacrylate, Triacrylate und Tetraacrylate, Dimethacrylate, Diacrylamide, Diallylacrylamide und Dimethacrylamide. Spezielle Beispiele umfassen Ethylenglykoldiacrylat, Propylenglykoldiacrylat, Butylenglykoldiacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat, Butylenglykoldimethacrylat, Methylenbis(methacrylamid), Ethylenbis(acrylamid), Ethylenbis(methacrylamid), Ethylidenbis(acrylamid), Ethylidenbis(methacrylamid), Pentaerythrittetraacrylat, Trimethylolpropantriacrylat, Bisphenol-A-dimethacrylat und Bisphenol-A-diacrylat. Andere geeignete multifunktionale Monomere umfassen Polyvinylarene, wie Divinylbenzol.
Das Molekulargewicht des Polymers ist unkritisch. Es ist günstig, wenn das Polymer groß genug ist, damit es im Gastrointestinaltrakt im wesentlichen oder vollständig nicht absorbiert wird. Beispielsweise kann das Molekulargewicht mehr als 900 Dalton betragen.
Die Verdauung und Absorption von Lipiden ist ein komplexer Prozess, wobei wasserunlösliche Lipide unter Bildung einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit einem Öltröpfchendurchmesser von etwa 0,5 mm emulgiert werden. Diese emulgierte Ölphase hat aufgrund des Vorhandenseins von Fettsäuren und Gallensalzen, die die Hauptemulgatoren sind, eine negative Nettoladung. Lipasen, die in der wässrigen Phase vorhanden sind, hydrolysieren die emulgierten Lipide an der Emulsionsoberfläche. Die meisten Lipasen enthalten ein aktives Zentrum, das durch eine Oberflächenschleife von Aminosäuren, die direkt auf dem aktiven Zentrum sitzen, vergraben ist, wenn die Lipase in wässriger Lösung ist. Wenn jedoch die Lipase an der Lipid/Wasser-Grenzfläche einer Lipidemulsion mit Gallensalzen in Kontakt kommt, erfährt die Lipase eine Konformationsänderung, die die Oberflächenschleife auf eine Seite verschiebt und das aktive Zentrum freilegt. Diese Konformationsänderung ermöglicht der Lipase die Katalyse der Hydrolyse von Lipiden an der Lipid/Wasser-Grenzfläche der Emulsion. Es wird angenommen, dass Polymere, die die Oberfläche der Emulsion zerstören oder deren chemische Natur ändern, die Lipaseaktivität hemmen. Daher kann die Effektivität von Polymeren, die lipasehemmende Gruppen aufweisen, erhöht werden, wenn diese mit einem oder mehreren Polymeren, die die Emulsionsoberfläche ändern, verabreicht werden. Alternativ können lipasehemmende Gruppen direkt an ein derartiges Polymer gebunden werden.
Mehrere Arten fettbindender Polymere waren zur Zerstörung der Oberfläche der Lipidemulsion oder Änderung von deren chemischer Natur wirksam. Beispielsweise können Polymere, die positiv geladene Emulgatoren besitzen, stabile Polykationlipidemulsionen bilden. Die Lipide in einer derar tigen Emulsion sind keine Substrate für gastrointestinale Lipasen, da die Oberfläche der Emulsion eine positive Nettoladung anstelle der üblichen negativen Nettoladung aufweist. Eine andere Art eines fettbindenden Polymers destabilisiert die Emulsion, was das Zusammentreten der Öltröpfchen der Emulsion bewirkt. Dies verringert die Emulsionsoberfläche, an der Lipasen aktiv sind, und verringert daher die Lipidhydrolyse. Fettbindende Polymere sind ferner in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung des Aktenzeichens 09/004 963, eingereicht am 9. Januar 1998, und der Anmeldung des Aktenzeichens 09/166 453, eingereicht am 5. Oktober 1998, deren Inhalt hier als Bezug aufgenommen ist, definiert.
Die hier beschriebenen substituierten Polymere können nach allgemein einschlägig bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann ein durch eine reaktive Einheit gekennzeichnetes lipasehemmendes Zwischenprodukt mit einem Polymer, das durch eine mit der reaktiven Einheit reagierende funktionale Gruppe gekennzeichnet ist, in Kontakt gebracht werden. Siehe J. March, Advanced Organic Chemistry, 3. Auflage, John Wiley and Sons, Inc., New York (1985).
Der hier verwendete Ausdruck "hydrophobe Einheit" ist eine Einheit, die als getrennte Einheit in Octanol starker löslich als in Wasser ist. Beispielsweise ist die Octylgruppe (C₈H₁₇) hydrophob, da deren "Stamm"alkan, Octan, größere Löslichkeit in Octanol als in Wasser aufweist. Die hydrophoben Einheiten können eine gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe sein. Derartige Gruppen umfassen substituierte und unsubstituierte, normale, verzweigte oder cyclische aliphatische Gruppen mit mindestens vier Kohlenstoffatomen, substituierte oder unsubstituierte Arylalkyl- oder Heteroarylalkyl gruppen und substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Heteroarylgruppen. Vorzugsweise umfasst die hydrophobe Einheit eine aliphatische Gruppe mit zwischen etwa sechs und dreißig Kohlenstoffen. Spezielle Beispiele für geeignete hydrophobe Einheiten umfassen die folgenden Alkylgruppen: Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Octadecyl, Docosanyl, Cholesteryl, Farnesyl, Aralkyl, Phenyl und Naphthyl und Kombinationen derselben. Weitere Beispiele für geeignete hydrophobe Einheiten umfassen Halogenalkylgruppen mit mindestens vier Kohlenstoffen (beispielsweise 10-Halogendecyl), Hydroxyalkylgruppen mit mindestens sechs Kohlenstoffen (beispielsweise 11-Hydroxyundecyl) und Aralkylgruppen (beispielsweise Benzyl). Die hier verwendeten aliphatischen Gruppen umfassen gerade, kettenförmige, verzweigte oder cyclische C₄-C₃₀-Kohlenwasserstoffe, die vollständig gesättigt sind oder eine oder mehrere Nicht-sättigungseinheiten enthalten.
Zur Verwendung in der Erfindung geeignete aromatische Gruppen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, aromatische Ringe, beispielsweise Phenyl und substituiertes Phenyl, heteroaromatische Ringe, beispielsweise Pyridinyl, Furanyl und Thiophenyl, und kondensierte polycyclische aromatische Ringsysteme, in denen ein carbocyclischer aromatischer Ring oder Heteroarylring an einen oder mehrere andere carbocyclische oder Heteroarylringe ankondensiert ist. Beispiele für kondensierte polycyclische aromatische Ringsysteme umfassen substituiertes oder unsubstituiertes Phenanthryl, Anthracyl, Naphthyl, 2-Benzothienyl, 3-Benzothienyl, 2-Benzofuranyl, 3-Benzofuranyl, 2-Indolyl, 3-Indolyl, 2-Chinolinyl, 3-Chinolinyl, 2-Benzothiazol, 2-Benzooxazol, 2-Benzimidazol, 2-Chinolinyl, 3-Chinolinyl, 1-Isochinolinyl, 3-Chinolinyl, 1-Isoindolyl, 3-Isoindolyl und Acridinyl.
Eine "substituierte aliphatische oder aromatische Gruppe" kann einen oder mehrere Substituenten aufweisen, beispielsweise eine Arylgruppe (einschließlich einer carbocyclischen Arylgruppe oder Heteroarylgruppe), eine substituierte Arylgruppe, -O-(aliphatische Gruppe oder Arylgruppe), -O-(substituierte aliphatische Gruppe oder substituierte Arylgruppe), Acyl, -CHO, -CO-(aliphatische oder substituierte aliphatische Gruppe), -CO-(Aryl oder substituiertes Aryl), -COO-(aliphatische oder substituierte aliphatische Gruppe), -COO-(Aryl oder substituierte Arylgruppe), -NH-(Acyl), -O-(Acyl), Benzyl, substituiertes Benzyl, halogeniertes Niederalkyl (beispielsweise Trifluormethyl und Trichlormethyl), Fluor, Chlor, Brom, Iod, Cyano, Nitro, -SH, -S-(aliphatische oder substituierte aliphatische Gruppe), -S-(Aryl oder substituiertes Aryl), -S-(Acyl) und dgl.
Eine "Aktivierungsgruppe" ist eine Gruppe, die eine funktionale Gruppe oder Einheit reaktiv macht. Allgemein sind elektronenziehende Gruppen "Aktivierungsgruppen". R¹ oder Y-R¹ der obigen Formeln ist vorzugsweise eine gute Abgangsgruppe oder elektronenziehende Gruppe. Beispiele für gute Abgangsgruppen sind Phosphat, p-Nitrophenol, o,p-Dinitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, Imidazol, Ascorbinsäure, Pyridoxin, Trimethylacetat, Adamantancarbonylat, p-Chlorphenol, o,p-Dichlorphenol, Methansulfonylat, Mesitylsulfonylat und Triisopropylbenzolsulfonylat. Eine bevorzugte Abgangsgruppe ist N-Hydroxysuccinimid.
Eine Abstandsgruppe kann eine Gruppe sein, die ein bis etwa dreißig Atome aufweist und kovalent an den Lipaseinhibitor, das Polymer oder die hydrophobe Einheit gebunden ist. Allgemein kann die Abstandsgruppe kovalent an den Lipaseinhibitor, das Polymer oder eine hydrophobe Einheit über eine funktionale Gruppe gebunden sein. Beispiele für funktionale Gruppen sind Sauerstoff, Alkylen, Schwefel, -SO₂-, -CO₂-, -NR²- oder -CONR²-. Eine Abstandsgruppe kann hydrophil oder hydrophob sein. Beispiele für Abstandsgruppen umfassen Aminosäuren, Polypeptide, Kohlehydrate und optional substituierte Alkylen- oder aromatische Gruppen. Abstandsgruppen können aus beispielsweise Epichlorhydrin, Dihalogenalkan, Halogenalkylester, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und anderen vernetzenden oder difunktionalen Verbindungen hergestellt werden. Bromalkylacetat ist eine bevorzugte Abstandsgruppe.
Die Menge eines einem Subjekt verabreichten Polymers hängt von der Art und Schwere der Erkrankung und Kennzeichen des Subjekts, beispielsweise allgemeiner Gesundheitszustand, Alter, Körpergewicht und Arzneimitteltoleranz, ab. Sie hängt auch vom Grad der Fettsucht und mit Fettsucht in Zusammenhang stehenden Komplikationen ab. Der erfahrene Praktiker kann passende Dosierungen in Abhängigkeit von diesen und anderen Faktoren bestimmen. Typischerweise kann bei humanen Subjekten eine wirksame Menge des Polymers von etwa 10 mg pro Tag bis etwa 50 mg pro Tag für einen Erwachsenen reichen. Vorzugsweise reicht die Dosierung von etwa 10 mg pro Tag bis etwa 20 mg pro Tag.
Das Polymer kann auf jedem geeigneten Weg, der beispielsweise orale Verabreichung in Kapseln, Suspensionen oder Tabletten umfasst, verabreicht werden. Eine orale Verabreichung durch Mischen mit Nahrung ist ein bevorzugter Verabreichungsmodus.
Das Polymer kann dem Individuum in Verbindung mit einem akzeptablen pharmazeutischen Träger als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Die Formulierung eines zu verabreichenden Polymers variiert entsprechend dem gewählten Verabreichungsweg (beispielsweise Lösung, Emulsion, Kapsel). Geeignete pharmazeutische Träger können inerte Bestandteile enthalten, die mit den lipasehemmenden Gruppen des Polymers nicht interagieren. Pharmazeutische Standardfomulierungstechniken können verwendet werden, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Verfahren zur Verkapselung von Zusammensetzungen (beispielsweise in einem Überzug aus harter Gelatine oder Cyclodextran) sind einschlägig bekannt (Baker et al., "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986).
EXPERIMENTELLES
Synthese von Polymeren
Beispiel 1
Herstellung eines Polyethylenglykols mit einer hydrophoben Einheit n-Pentyl und lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphat:
Ein Gemisch aus n-Pentanol (19,5 mmol, 1,72 g) und N-Methylimidazol (19,5 mmol, 1,6 g) in wasserfreiem Methylenchlorid (40 ml) wurde langsam über 20 min unter wasserfreien Bedingungen zu einer Lösung von p-Nitrophenylphosphorodichloridat (5,0 g, 19,5 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (100 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wurde während der Zugabe in einem Wasserbad gekühlt. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Wasserbad entfernt und das Reaktionsgemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch aus Polyethylenglykol (MG = 8000, 10 mmol, 80 g) und N-Methylimidazol (19,5 mmol, 1,6 g) in wasserfreiem Methylenchlorid (150 ml) wurde zu dem Reaktionskolben unter wasserfreien Bedingungen gegeben. Das Gemisch wurde 25 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, der Rückstand wurde nach Verfahren A gereinigt und das Polymer wurde als weißes Pulver (70 g) erhalten.
Reinigungsverfahren
Verfahren A:
Der Rückstand wurde in entionisiertem Wasser (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde 24 h unter Verwendung von Spectra/Por Membran MWCO: 3500 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert und das Polymer wurde als weißes Pulver erhalten.
Verfahren B:
Der Rückstand wurde in 0,5 1 Diethylether gegossen und bei Raumtemperatur 1 h gerührt. Das Lösemittel wurde abdekantiert und durch frischen Diethylether (0,25 1) ersetzt. Das Gemisch wurde 1 h gerührt. Das Lösemittel wurde entfernt und das Polymer wurde bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet.
Verfahren C:
Das Reaktionsgemisch wurde mit einer 10%-igen wässrigen Natriumsulfatlösung (3 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde entfernt und das Polymer wurde bei Raumtemperatur getrocknet.
Unter Verwendung der obigen Verfahren wurden die folgenden angegebenen Verbindungen synthetisiert und in der folgenden Tabelle aufgelistet.
Tabelle 1: Polyethylenglykole (PEG) mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphat mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten
Beispiel 29
Herstellung eines PLURONIC^®-Polymers mit einer hydrophoben Einheit n-Tetradecyl und lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphat:
Ein Gemisch aus n-Tetradecanol (15 g, 70 mmol) und N-Methylimidazol (5,6 ml, 70 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (75 ml) wurde langsam über 20 min unter wasserfreien Bedingungen zu einer Lösung von p-Nitrophenylphosphorodichloridat (17,92 g, 70 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (50 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wurde während der Zugabe in einem Wasserbad gekühlt. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Wasserbad entfernt und das Reaktionsgemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch aus PLURONIC^® (MG = 1100, 39 g, 35 mmol) und N-Methylimidazol (5,6 ml, 70 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (150 ml) wurde unter wasserfreien Bedingungen zu dem Reaktionskolben gegeben. Das Gemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer kalten gesättigten NaCl-Lösung (3 × 150 ml) extrahiert, die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Natriumsulfat wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde gewonnen. Das Lösemittel wurde aus dem Filtrat unter vermindertem Druck entfernt, wobei 65 g einer blassgelben farbigen viskosen Flüssigkeit erhalten wurden. Das Material wurde eine Woche bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet. Dieses wurde direkt für den In-vitro- und In-vivo-Assay verwendet.
Die im folgenden angegebenen Beispiele wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt.
Tabelle 2: PLURONIC^®-Polymere (PLU) mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphat mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten
Beispiel 51
Herstellung eines Polypropylenglykols mit einer hydrophoben Einheit n-Hexadecyl und einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat:
Ein Gemisch aus n-Hexadecanol (28,41 g, 117 mmol) und N-Methylimidazol (9,34 ml, 117 mmol) in wasserfreiem Methy lenchlorid (75 ml) wurde langsam über 20 min unter wasserfreien Bedingungen zu einer Lösung von p-Nitrophenylphosphorodichloridat (30 g, 117 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (60 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wurde während der Zugabe in einem Wasserbad gekühlt. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Wasserbad entfernt und das Reaktionsgemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch aus Polypropylenglykol (MG = 1000, 58,5 g, 58,5 mmol) und N-Methylimidazol (9,3 ml, 117 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (150 ml) wurde unter wasserfreien Bedingungen zu dem Reaktionskolben gegeben. Das Gemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer kalten gesättigten Na₂SO₄-Lösung (3 × 150 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde gewonnen. Das Lösemittel wurde aus dem Filtrat unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein Produkt von 77 g erhalten wurde. Das Material wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur 4 Tage getrocknet.
Die im folgenden angegebenen Polypropylenglykol-p-nitrophenylphosphate wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt.
Tabelle 3: Polypropylenglykol (PPG) mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphat mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten
Beispiel 57
Herstellung eines Polyethylenglykolpolymers mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphonat und hydrophoben Einheiten Pentyl:
A. Herstellung von O,O-Dimethyl-n-pentylphosphonat:
O,O-Dimethylphosphonat (220 g, 2 mol) wurde tropfenweise zu einer Suspension von NaH (48 g, 2 mol) in wasserfreiem THF (600 ml) unter Stickstoff gegeben. Nach 1 h wurde 1-Brompentan (248 ml, 2 mol) in THF (400 ml) langsam zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 12 h refluxiert. Das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, Diethylether (1 l) wurde zugegeben, und die Salze wurden durch Filtration entfernt. Die Etherlösung wurde mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen, die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Ether wurde unter vermindertem Druck entfernt und das rohe Produkt wurde durch Destillation unter Vakuum gereinigt, wobei 171 g O,O-Dimethyl-n-pentylphosphonat erhalten wurden.
B. Herstellung von n-Pentylphosphonsäuredichlorid:
O,O-Dimethyl-n-pentylphosphonat (158 g, 0,88 mol) und N,N-Dimethylformamid (700 mg) wurden in Thionylchlorid (200 ml) gelöst und das gebildete Gemisch wurde 48 h refluxiert. Die flüchtigen Stoffe wurden unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt und das rohe Produkt wurde durch Destillation gereinigt, wobei eine farblose Flüssigkeit (135 g) erhalten wurde.
C. Herstellung eines Polyethylenglykols mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenyl-n-pentylphosphonat:
Zu einer Lösung von n-Pentylphosphonsäuredichlorid (2,65 g, 14 mmol) in 40 ml wasserfreiem Dichlormethan wurde leuchtend orange gefärbtes Natriumsalz von p-Nitrophenol (2,3 g, 14 mmol) unter wasserfreien Bedingungen gegeben. Die leuchtend orange Farbe verschwand innerhalb von 5-10 min. Nach 45 min wurde ein Gemisch aus Polyethylenglykol (MG = 8400, 56 g, 7 mmol) und N-Methylimidazol (1,5 ml, 20 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben und es wurde 24 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer 2%-igen K₂CO₃-Lösung (6 × 100 ml) und anschließend gesättigter NaCl-Lösung (6 × 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei eine viskose Flüssigkeit erhalten wurde. Das Produkt wurde in 200 ml Diethylether gegossen und 10 min gerührt. Der Etherteil wurde abdekantiert und das Verfahren wurde drei weitere Male wiederholt. Das Produkt wurde als weißes Pulver erhalten, das unter Vakuum bei Raumtemperatur eine Woche getrocknet wurde.
Die im folgenden angegebenen Polyethylenglykolpolymere mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphonat wurden durch dieses Verfahren hergestellt.
Tabelle 4: Polyethylenglykole mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphonat mit einer hydrophoben Einheit Pentyl.
Beispiel 61
Herstellung eines PLURONIC^®-Polymers mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphaten, die durch einen n-Pentyl-1,5-dioxy-Linker verknüpft sind, und einer hydrophoben Einheit n-Hexadecyl:
Ein 1-l-Rundkolben wurde mit Natriumhydrid (4,0 g als 60%-ige Dispersion von NaH in Mineralöl, 0,1 mol) beschickt und dann mit wasserfreiem Heptan (3 × 25 ml) gewaschen. Wasserfreies Tetrahydrofuran (THF) (150 ml) wurde zugegeben und die Suspension wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Eine Lösung von PLURONIC^® (MG = 1900, 50 Gew.-% Polyethylenglykol, 50 Gew.-% Polypropylenglykol, 95 g, 0,05 mol) in wasserfreiem THF (200 ml) wurde bei Raumtemperatur zugegeben. Eine Lösung von Brompentylacetat (20,9 g, 0,1 mol) in wasserfreiem THF (50 ml) wurde unter wasserfreien Bedingungen zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 16 h bei 60 °C refluxiert. Das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt und die gebildete Aufschlämmung wurde in Dichlormethan (300 ml) suspendiert. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösemit tel wurde entfernt, wobei eine blassbraune viskose Flüssigkeit (100 g) erhalten wurde. Dieses Material wurde in Methanol (500 ml) gelöst und mit wässriger 4 N NaOH (40 ml) behandelt. Nach 4 h wurde das Reaktionsgemisch mit konzentrierter HCl angesäuert und das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Das viskose Öl wurde in Dichlormethan gelöst, das mit Wasser (4 × 100 ml) gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde entfernt, wobei 5-Hydroxypentoxy-PLURONIC^® als blassbraune viskose Flüssigkeit (98 g) erhalten wurde.
In einem getrennten Kolben wurde ein Gemisch aus n-Hexadecanol (7,02 g, 29,0 mmol) und N-Methylimidazol (2,3 ml, 290 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (40 ml) langsam über 20 min unter wasserfreien Bedingungen zu einer Lösung von p-Nitrophenylphosphorodichloridat (7,41 g, 29,0 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (100 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wurde während der Zugabe in einem Wasserbad gekühlt. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Wasserbad entfernt und das Reaktionsgemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch aus Bis-5-hydroxypentoxy-PLURONIC^® (30 g, 14,48 mmol) und N-Methylimidazol (2,3 ml) in wasserfreiem Methylenchlorid (150 ml) wurde unter wasserfreien Bedingungen zu dem Reaktionskolben gegeben. Das Gemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt und dann mit gesättigter NaCl-Lösung (3 × 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde gewonnen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde entfernt, wobei eine viskose Flüssigkeit erhalten wurde. Diese wurde mit siedendem Hexan (6 × 50 ml) gewaschen und das Produkt wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet, wobei eine blassgelbe viskose Flüssigkeit (39 g) erhalten wurde.
Die folgenden Beispiele wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt.
Tabelle 5: PLURONIC^®-Polymere mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphat, die durch eine Vielzahl von Dialkoxygruppen angebunden sind, und mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten.
Beispiel 67
Herstellung eines Polyethylenglykolpolymers mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphaten, die durch einen n-Pentyl-1,5-dioxy-Linker angebunden ist, und mit einer hydrophoben Einheit n-Hexadecyl:
Ein 1-l-Rundkolben wurde mit Natriumhydrid (7,67 g als 60%-ige Dispersion von NaH in Mineralöl, 0,19 mol) beschickt und mit wasserfreiem Heptan (3 × 25 ml) gewaschen. Wasserfreies THF (200 ml) wurde zugegeben und die Suspension wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Eine Lösung von Polyethylenglykol (MG = 1500, 150 g, 0,1 mol) in wasserfreiem THF (200 ml) wurde bei Raumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde eine Lösung von Brompentylacetat (41,82 g, 0,2 mmol) in wasserfreiem THF (100 ml) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 60 °C 16 h refluxiert. Das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt und die gebildete Aufschlämmung wurde in Dichlormethan (300 ml) suspendiert. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde entfernt, wobei eine blassbraune viskose Flüssigkeit (110 g) erhalten wurde. Dieses Material wurde in Methanol (500 ml) gelöst und mit wässriger 4 N NaOH (80 ml) behandelt. Nach 4 h wurde das Reaktionsgemisch mit konzentrierter HCl angesäuert und das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Das viskose Öl wurde in Dichlormethan gelöst und mit Wasser (4 × 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde entfernt, wobei ein Bis-5-hydroxypentoxypolyethylenglykol als blassbraune viskose Flüssigkeit (98 g) erhalten wurde. Die p-Nitrophenylphosphatgruppe wurde in einer zu dem Verfahren in Beispiel 61 analogen Weise addiert.
Die im folgenden angegebenen Beispiele wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt.
Tabelle 6: Polyethylenglykole mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat, die durch einen Dialkoxylinker angebunden ist, und mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten.
Beispiel 75
Herstellung eines BRIJ^®-Polymers mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat und einer hydrophoben Einheit Hexadecyl:
p-Nitrophenylphosphorodichloridat (75 g, 0,29 mol) in wasserfreiem Dichlormethan (300 ml) wurde in einen 1-l-Dreihalsrundkolben mit Rührstäbchen, der mit N₂ gespült worden war, gegeben. Eine Lösung aus Hexadecanol (71,03 g, 0,29 mol) und N-Methylimidazol (23,35 ml, 0,29 mol) in wasserfreiem Dichlormethan (250 ml) wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 2 h zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde gerührt, bevor es in einen 1-l-Scheidetrichter gegossen wurde. N-Methylimidazolhydrochloridsalze trennten sich am Boden als Öl ab und wurden aus dem Trichter entfernt. Dichlormethan wurde aus dem Gemisch bei weniger als 30 °C unter Vakuum entfernt, wobei ein bernsteinfarbenes Öl erhalten wurde, das in Hexan (400 ml) aufgenommen und über Nacht in ein Gefriergerät gegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann aufgetaut und der lösliche Teil wurde filtriert, um die Kristalle von p-Nitrophenylphosphorodichloridat zu entfernen. Das Lösemittel wurde von dem Filtrat durch Rotationsverdampfung bei weniger als 35 °C entfernt, wobei n-Hexyl-p-nitrophenylphosphorochloridat erhalten wurde.
Ein 500-ml-Kolben mit Rührstäbchen wurde mit N₂ gespült. Das n-Hexyl-p-nitrophenylphosphorochloridat (20 g, 0,043 mol) in wasserfreiem THF (25 ml) wurde zugegeben und dann folgte die langsame Zugabe einer Lösung von BRIJ^® 58 (Polyoxyethylen(20)cetylether, 48,56 g, 0,043 mol) und N-Methylimidazol (3,45 ml, 0,043 mol) in wasserfreiem THF (200 ml). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 24 h gerührt. Das Lösemittel wurde bei weniger als 35 °C durch Rotationsverdampfung entfernt und der ölige Rückstand wurde in Methanol (50 ml) gelöst. Eine Lösung von Methanol/Wasser (85 ml:15 ml, 200 ml) wurde zugegeben. Das feste Bis-n,n-dihexyl-p-nitrophenylphosphat wurde durch Filtration gewonnen. Das Methanol wurde dann auf einem Rotationsverdampfer bei weniger als 35 °C abgestreift. Wasser wurde aus dem Produkt durch Lyophilisation entfernt.
Die Beispiele in Tabelle 7 können durch die im folgenden angegebene Struktur dargestellt werden und wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt.
Tabelle 7: BRIJ^®-Polymere mit einer terminalen lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten.
Beispiel 76
Herstellung eines IGEPAL^®-Polymers mit einer terminalen lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat mit hydrophoben Einheiten n-Hexadexyl:
Ein 500-ml-Kolben mit Rührstäbchen wurde mit N₂ gespült und n-Hexadecyl-p-nitrophenylphosphorochloridat (20 g, 0,043 mol) in wasserfreiem THF (25 ml) wurde zugegeben und dann folgte die langsame Zugabe einer Lösung von IGEPAL^® 720 (32,41 g, 0,043 mol) und N-Methylimidazol (3,45 ml, 0,043 mol) in THF (200 ml). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 24 h gerührt. Das Lösemittel wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt und das ölige Produkt wurde in Methanol (50 ml) aufgenommen. Eine Lösung von Methanol/Wasser (85:15, 200 ml) wurde zu dem Produkt gegeben. Das Bis-n,n-dihexyl-p-nitrophenylphosphat wurde abfiltriert und Methanol wurde dann unter Vakuum bei weniger als 35 °C abgestreift. Wasser wurde aus dem Produkt durch Lyophilisation entfernt.
Die Beispiele in Tabelle 8 können durch die im folgenden angegebene Struktur dargestellt werden und wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt.
Tabelle 8: IGEPAL^®-Polymere mit einer terminalen lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten.
Beispiel 80
Herstellung von [Poly(propylenglykol)-Blockpoly(ethylenglykol)-Block-poly(propylenglykol)]-Polymeren mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat mit einer hydrophoben Einheit n-Hexyl:
Ein 500-ml-Kolben mit Rührstäbchen wurde mit N₂ gespült und n-Hexyl-p-nitrophenylphosphorochloridat (20 g, 0,043 mol) in wasserfreiem THF (25 ml) wurde zugegeben und dann folgte die langsame Zugabe einer Lösung von [Poly(propylenglykol)-Block-poly(ethylenglykol)-Block-poly(propylenglykol)] (mittleres MG = 2000, 50 Gew.-% Ethylenglykol, 49,36 g, 0,0215 mol) und N-Methylimidazol (3,45 ml, 0,043 mol) in THF (200 ml). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 24 h gerührt. Das Lösemittel wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt und der ölige Rückstand wurde in Methanol (50 ml) aufgenommen. Ein Lösungsgemisch aus 85:15 Methanol:Wasser (200 ml) wurde zugegeben und der Bis-n,n-dihexyl-p-nitrophenylphosphatniederschlag wurde abfiltriert. Methanol wurde durch Rotationsverdampfung bei weniger als 35 °C abgestreift und Wasser wurde aus dem Produkt durch Lyophilisation entfernt.
Die folgenden Beispiele wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt.
Tabelle 9: Poly(propylenglykol)-Block-poly(ethylenglykol)-Block-poly(propylenglykol)-Polymere (PPG-PEG-PPG) mit lipasehemmenden Gruppen von p-Nitrophenylphosphat mit einer Vielzahl hydrophober Einheiten.
Beispiel 83
Herstellung eines PLURONIC^®-Polymers mit lipasehemmenden Gruppen von Phosphochloridat und einer hydrophoben Einheit Decyl:
Nach Spülen mit N₂ wurde eine Lösung von Phosphor(III)oxychlorid (30 g, 0,1956 mol) in wasserfreiem THF (100 ml) in einen 3-1-Kolben gegeben und das Gemisch auf 0-5 °C gekühlt. Ein Gemisch aus frisch destilliertem Triethylamin (27,27 ml, 0,1956 mol) und 1-Decanol (30,97 g, 0,1956 mol) in wasserfreiem THF (300 ml) wurde tropfenweise mit einer maximalen Rate von 75 ml/h zugegeben, wobei die Lösungstemperatur bei 5 °C gehalten wurde. Nach der Beendigung der Zugabe wurde ein Gemisch aus PLURONIC^® (mittleres MG = 2900, 142 g, 0,0489 mol) und frisch destilliertem Triethylamin (13, 7 ml, 0, 0978 mol) in wasserfreiem THF (300 ml) mit einer maximalen Rate von 75 ml/h zugegeben, wobei die Lösungstemperatur bei 5 °C gehalten wurde. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch sich auf Raum temperatur erwärmen gelassen und 24 h gerührt. Die Triethylammoniumhydrochloridsalze wurden durch Filtration entfernt. Das Lösemittel wurde unter Vakuum bei 30 °C entfernt und das gebildete Öl wurde mit Hexan (6 × 250 ml) zur Entfernung des nicht-umgesetzten n-Decylphosphorodichloridats gewaschen. Das Produkt, Bis-n-decylphosphorochloridat-PLURONIC^® wurde unter Hochvakuum (0,003 mm Hg) über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet.
Beispiel 84
Herstellung eines PLURONIC^®-Polymers mit lipasehemmenden Gruppen von N-Hydroxysuccinimidylphosphat und einer hydrophoben Einheit Decyl:
Ein 125-ml-Kolben mit Rührstäbchen wurde mit N₂ gespült und eine Lösung von Bis-n-decylphosphorochlorodat-PLURONIC^® (hergestellt wie in Beispiel 82, 30 g, 0,0178 mol) wurde zugegeben. N-Hydroxysuccinimid (2,05 g, 0,0178 mol) wurde als Feststoff zugegeben und sich auflösen gelassen. Frisch destilliertes Triethylamin (2,48 ml, 0,0178 mol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 0,5 h gerührt. Das Triethylammoniumhydrochloridsalz wurde abfiltriert und das THF wurde aus dem Filtrat durch Rotationsverdampfung bei 30 °C entfernt. Das Produkt wurde unter Hochvakuum (0,003 mm Hg) über Nacht getrocknet.
Beispiel 85
Herstellung von PLURONIC^®-Polymeren mit lipasehemmenden Gruppen von Pyridoxinylphosphat und einer hydrophoben Einheit Decyl:
Ein 125-ml-Kolben mit Rührstäbchen wurde mit N₂ gespült und Bis-n-decylphosphorochlorodat-PLURONIC^® (hergestellt wie in Beispiel 82, 30 g, 0,0178 mol) in wasserfreiem Dichlormethan (30 ml) wurde zugegeben. Pyridoxinhydrochlorid (2,54 g, 0,0178 mol) wurde als Feststoff zugesetzt und sich auflösen gelassen. Frisch destilliertes Triethylamin (4,96 ml, 0,0356 mol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 2 h gerührt. Das Triethylammoniumhydrochloridsalz wurde abfiltriert und das Lösemittel wurde durch Rotationsverdampfung bei weniger als 35 °C entfernt. Das Öl wurde in THF (50 ml) aufgenommen und erneut filtriert. Das Lösemittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt und das Produkt wurde unter Hochvakuum (0,003 mm Hg) über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet.
Die Tabelle 10 listet die in den Beispielen 83, 84 und 85 hergestellten Polymere auf.
Tabelle 10: PLURONIC^®-Polymere mit einer Vielzahl von Abgangsgruppen.
Beispiel 86
Herstellung eines PLURONIC^®-Polymers mit einer lipasehemmenden Gruppe eines β-Lactons (Reaktionsschema I):
Reaktionsschema I: Synthese des Zwischenprodukts 5.
Zwischenprodukt 1:
10-Hydroxymethyldecanoat 1 (20 g, 98 mmol), Benzyloxy-2,2,2-trichloracetimidat (30 g, 118 mmol), Dichlormethan (50 ml) und Cyclohexan (100 ml) wurden in einen 1-1-Rundkolben gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei Raumtemperatur gerührt. Trifluormethansulfonsäure (1,3 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch unter Stickstoffatmosphäre gegeben. Innerhalb einiger Minuten stieg die Temperatur von Raumtemperatur auf 37 °C. Die Reaktion wurde durch DC (Hexan:Ethylacetat, 9:1) überwacht. Nach 16 h verschwand das Ausgangsmaterial vollständig. Die Feststoffe wurden aus dem Reak tionsgemisch durch Filtration abgetrennt und das Filtrat wurde mit einer wässrigen gesättigten Natriumbicarbonatlösung (3 × 100 ml) und anschließend Wasser (3 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde gewonnen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung eines Gradienten von Ether/Hexan als mobile Phase gereinigt. Das Produkt wurde aus der Säule in Ether-Hexan (8:2) eluiert. Das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei 10-Benzyloxymethyldecaonat (Zwischenprodukt 1) als Feststoff (32 g) erhalten wurde.
Zwischenprodukt 2:
Das Zwischenprodukt 1 (30 g) wurde in 6 N NaOH-Lösung (100 ml) 12 h verseift und dann mit konzentrierter HCl angesäuert. Das Produkt wurde mit Chloroform (5 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei 10-Benzyloxydecansäure (Zwischenprodukt 2) (27 g) erhalten wurde, das direkt in der nächsten Reaktion verwendet wurde.
Zwischenprodukt 3:
n-Butyllithium in Hexan (1,6 M Lösung, 68 ml, 108 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von N,N-Diisopropylamin (15,14 ml, 108 mmol) in THF (50 ml), die bei 0 °C gehalten wurde, gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch weitere 10 min bei 0 °C gerührt. Das Gemisch wurde auf –50 °C gekühlt und dann wurde eine Lösung des Zwischenprodukts 2 (15 g, 54 mmol) in 100 ml THF tropfenweise zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann 1 h ge rührt. Das Gemisch wurde auf –78° C gekühlt und eine Lösung von Decylaldehyd (8,44 g, 54 mmol) in THF (40 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Nach Rühren während 3 h bei –78 °C wurde das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und dann durch Zugabe einer gesättigten Ammoniumchloridlösung (50 ml) gequencht. Das Gemisch wurde mit Diethylether (5 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert und über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Zwischenprodukt 3 (22 g) erhalten wurde.
Zwischenprodukt 4:
Benzolsulfonylchlorid (9,8 g, 56 mmol) wurde zu einer Lösung des Zwischenprodukts 3 (12 g, 28 mmol) in Pyridin (200 ml), die bei 0 °C gehalten wurde, gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch 24 h bei 4 °C in einem Kühlschrank gehalten, dann in zerstoßenes Eis (2 kg) gegossen und bei Raumtemperatur 20 min gerührt. Das Gemisch wurde mit Diethylether (6 × 150 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Das Produkt wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (9:1) gereinigt, wobei das Zwischenprodukt 4 als Öl (9,8 g) erhalten wurde.
IR: 1825 cm^–1.
Zwischenprodukt 5:
Das Zwischenprodukt 4 (9,5 g, 22 mmol) wurde in Methylenchlorid gelöst und dann unter Verwendung von 10 % Pd/C (1 g) als Katalysator unter 50 psi Wasserstoff 4 h hydriert. Die Lösung wurde filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei das Zwischenprodukt 5 als Öl (6,9 g) erhalten wurde.
Zwischenprodukt 6:
PLURONIC^® (MG = 1900, 570 g, 300 mmol) in THF (500 ml) wurde tropfenweise zu einer gerührten Suspension von Natriumhydrid (15 g) in THF (150 ml) gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch weitere 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von Ethyl-4-brombutyrat (117 g, 600 mmol) wurden tropfenweise zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei 60 °C gerührt. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wurden die Salze abfiltriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei hellbraunes viskoses Material erhalten wurde, das in Dichlormethan (1 l) suspendiert und mit Wasser (3 × 200 ml) gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde gewonnen und über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei das Zwischenprodukt 6 als viskose Flüssigkeit (770 g) erhalten wurde.
Zwischenprodukt 7:
Das Zwischenprodukt 6 wurde in einer Lösung von Methanol (1 l) und einer 50%-igen Natriumhydroxidlösung (100 ml) gelöst, dann 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit konzentrierter HCl angesäuert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (1 l) resuspendiert und dann mit Wasser (4 × 250 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei das Zwischenprodukt 7 als viskose Flüssigkeit (650 g) erhalten wurde.
Zwischenprodukt 8:
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (4,8 g, 25 mmol) wurde unter Stickstoff zu einer Lösung des Zwischenprodukts 7 (20,72 g, 10 mmol) in Dichlormethan (100 ml) in einem Rundkolben gegeben. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde N-Hydroxysuccinimid (2,3 g) zugegeben. Das Gemisch wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt, dann in einen Scheidetrichter überführt und mit Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei 22 g des Zwischenprodukts 8 erhalten wurden, das direkt in der nächsten Stufe verwendet wurde.
Beispiel 86:
Triethylamin (3 ml) wurde zu einer Lösung des Zwischenprodukts 8 (22 g, ~ 10 mmol) und des Zwischenprodukts 5 (6,5 g, 20 mmol) in Dichlormethan (150 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt, dann in einen Scheidetrichter gegossen und mit 5 % HCl (3 × 20 ml) und Wasser (3 × 50 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt. Das Beispiel 86 wurde als viskose Flüssigkeit (26 g) erhalten. Dieses Material wurde direkt in dem In-vitro- und In-vivo-Assay verwendet.
Beispiel 87:
Herstellung eines PLURONIC^®-Polymers mit einer lipasehemmenden Gruppe eines Disulfids:
Beispiel 87
Zwischenprodukt 9:
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (1,1 g, 5 mmol) wurde zu einer Lösung von 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (3,96 g, 10 mmol) in Dichlormethan (100 ml) gegeben. Nach 10 min wurde N-Hydroxysuccinimid (0,5 g, 5 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Scheidetrichter gegossen und dann mit Wasser (3 × 20 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei das Zwischenprodukt 9 erhalten wurden, das direkt in der nächsten Stufe verwendet wurde.
Eine Lösung von PLURONIC^® (MG = 1900, 9,5 g, 5 mmol) in Dichlormethan (50 ml) und anschließend Triethylamin (0,5 ml) wurden zu einer Lösung des Zwischenprodukts 9 in Dichlormethan (100 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt, dann in einen Scheidetrichter gegossen und mit Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei das Beispiel 87 als viskose Flüssigkeit (12 g) erhalten wurde.
Beispiel 88:
Herstellung eines PLURONIC^®-Polymers mit einer lipasehemmenden Gruppe eines Anhydrids:
Zwischenprodukt 10:
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (2,2 g, 10 mmol) wurde zu einer Lösung von 1,2,3-Benzoltricarbonsäureanhydrid (2,16 g, 10 mmol) in Dichlormethan (100 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 10 min gerührt, dann mit N-Hydroxysuccinimid (1,0 g, 10 mmol) versetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Scheidetrichter gegossen, dann mit Wasser (3 × 20 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei das Zwischenprodukt 10 erhalten wurden, das direkt in der nächsten Stufe verwendet wurde.
Eine Lösung von PLURONIC^® (MG = 1900, 9,5 g, 5 mmol) und Triethylamin (0,5 ml) in Dichlormethan (50 ml) wurde zu einer Lösung des Zwischenprodukts 10 in Dichlormethan (100 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt, dann in einen Scheidetrichter gegossen und mit Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei Beispiel 88 (11,2 g) als viskose Flüssigkeit erhalten wurde.
IN-VITRO-ASSAY
Verfahren 1: Tributyrinsubstrat
Potentielle Inhibitoren der Pankreaslipaseaktivität wurden unter Verwendung eines Titrationsverfahrens unter Verwendung eines pH Stat Instrument (Radiometer America, Westlake OH) bewertet. Substrat (1 ml Tributyrin) wurde zu 29,0 ml Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,0), der 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ und 4 mM Natriumtaurodeoxycholat enthielt, gegeben. Diese Lösung wurde 5 min gerührt, bevor 210 Einheiten Schweinepankreaslipase (Sigma, 21000 Einheiten/mg) in Assaypuffer gelöst zugegeben wurden. Die Freisetzung von Buttersäure durch die Lipase wurde über einen Zeitraum von 10 min durch Titration des Assaysystems auf einen konstanten pH-Wert von 7,0 mit 0,02 M NaOH überwacht. Die Enzymaktivität wurde als Milliäquivalente Base, die pro min pro g des Enzyms zugesetzt wurden, ausgedrückt. In anschließenden Assays wurden variierende Mengen Inhibitor in entweder Tributyrin oder Puffer in Abhängigkeit von den Löslichkeitseigenschaften der Verbindung solubilisiert und dem Assaysystem zum Zeitpunkt null zugesetzt.
Verfahren 2: Olivenölsubstrat
Potentielle Inhibitoren der Pankreaslipaseaktivität wurden unter Verwendung eines Titrationsverfahrens unter Verwendung eines pH Stat Instrument (Radiometer America, Westlake OH) bewertet. Substrat (15 ml einer Olivenölemulsion, die 80 mM Olivenöl und 2 mM Ölsäure enthielt, gelöst und ultraschallbehandelt in einem Puffer, der aus 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, der 110 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 2 mM Lecithin, 1,32 mM Cholesterin, 1,92 mM Natriumglykocholat, 1,28 mM Natriumtaurocholat, 2,88 mM Natriumglykodeoxycholat und 1,92 mM Natriumtaurodeoxycholat bestand) wurde zu 15 ml Assaypuffer (Tris-HCl, pH-Wert 8,0, der 110 mM NaCl und 10 mM CaCl₂ enthielt) gegeben. Diese Lösung wurde 4 min gerührt, bevor 1050 Einheiten Schweinepankreaslipase (Sigma, 21000 Einheiten/mg) in Assaypuffer gelöst zugegeben wurden. Die Hydrolyse von Triglycerid wurde über einen Zeitraum von 30 min durch Titration des Assaysystems auf einen konstanten pH-Wert von 8,0 mit 0,02 M NaOH überwacht. Die Enzymaktivität wurde als Milliäquivalente Base, die pro min pro g Enzym zugesetzt wurden, ausgedrückt. In anschließenden Assays wurden Stammlösungen des Inhibitors in entweder Ethanol oder DMSO hergestellt und variierende Mengen dem Assaysystem zum Zeitpunkt null zugesetzt.
Die Assays wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von entweder Verfahren 1 oder 2 durchgeführt und die prozentuale Hemmung wurde durch Vergleich der Enzymaktivitäten in Gegenwart und Abwesenheit von Inhibitor abgeleitet. Drei Konzentrationen des Inhibitors wurden getestet und die prozentuale Hemmung wurde gegen log der Inhibitorkonzentration aufgetragen, um die Konzentration zu bestimmen, bei der 50 Hemmung auftraten (IC₅₀). Die im folgenden angegebenen Verbindungen wurden getestet, wobei die angegebenen Werte für IC₅₀ in den Tabellen 11-17 dargestellt sind.
Tabelle 11:
Tabelle 12: IC₅₀-Werte von PLURONIC^®-Polymeren mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat und Dialkoxylinkern.
Tabelle 13: IC₅₀-Werte von Polyethylenglykolpolymeren mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat und Dialkoxylinkern.
Tabelle 14: IC₅₀-Werte für BRIJ^®-Polymere mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat.
Tabelle 15: IC₅₀-Werte für IGEPAL^®-Polymere mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat.
Tabelle 16: IC₅₀-Werte für PPG-PEG-PPG-Polymere mit einer lipasehemmenden Gruppe von p-Nitrophenylphosphat.
Tabelle 17: IC₅₀-Werte für PLURONIC^®-Polymere mit hydrophoben n-Hexadecylgruppen und einer Vielzahl von Abgangsgruppen.
In-vivo-Untersuchungen
Die Beispiele 8, 35, 36, 41, 42, 48, 62, 63, 67-69, 71-75, 78, 81 und 82 wurden auf deren Fähigkeit zur Verringerung der täglichen Kalorienaufnahme durch Erhöhen der Exkretion von Fett in die Fäzes und zur Verringerung einer Zunahme des Körpergewichts, bezogen auf die Kontrollgruppe, bei normalen Ratten über einen Zeitraum von sechs Tagen bewertet. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (eines Alters von fünf bis sechs Wochen) wurden individuell in Käfigen gehalten und nach Belieben mit einer pulverförmigen "fettreichen Diät" gefüttert, die aus einem Standardnagetierfutter, das mit 15 Gew.-% Fett (das aus 55 % Kokosöl und 45 % Maisöl bestand, gefüttert. Nach dem Füttern der Tiere mit dieser Diät während fünf Tagen wurden die Tiere gewogen und in die Behandlungs- oder Kontrollgruppen sortiert (6-8 Tiere pro Gruppe, wobei jede Gruppe gleiche mittlere Körpergewichte aufwies). Die Tiere wurden sechs Tage mit den Testverbindungen behandelt, die der "fettreichen Diät" mit Konzentrationen (Gew/Gew) von 0,0 % (Kontrolle), 0,3 oder 1,0 Prozent der Diät bzw. Nahrung zugesetzt wurden.
Die Nahrungsaufnahme wurde für jedes Tier während der gesamten Untersuchung ermittelt und als die Gesamtmenge der aufgenommenen Nahrung pro Tier über den Behandlungszeitraum von sechs Tagen ausgedrückt. Am Tag 6 wurde jedes Tier gewogen und die Gesamtzunahme des Körpergewichts über den Behandlungszeitraum berechnet.
Rattenfäzesproben wurden an den letzten drei Tagen der sechs Tage der Arzneimittelbehandlung gewonnen. Die Proben wurden gefriergetrocknet und zu einem feinen Pulver gemahlen. Ein halbes Gramm einer Probe wurde abgewogen und in Extraktionszellen überführt. Proben wurden in einer beschleunigten Lösemittelextraktionsvorrichtung(ASE 200 Accelerated Solvent Extractor, Dynoex Corporation, Sunnyvale, CA) mit 95 % Ethanol, 5 % Wasser und 100 mM KOH extrahiert. Die Probe wurde in 17 min bei 150 °C und 1500 psi extrahiert. Ein Aliquot des Extrakts wurde in ein Teströhrchen überführt, das einen molaren Überschuss HCl enthielt. Die Probe wurde dann eingedampft und in einer Detergenslösung, die aus 2 % Triton X-1200, 1 % Polyoxyethylenlaurylether und 0,9 % NaCl bestand, rekonstituiert. Fettsäuren wurden dann enzymatisch mit einem kolorimetrischen Kit (NEFAC, Wako Chemical GmbH, Neuss, Germany)quantitativ bestimmt.
Die Tabelle 18 enthält Werte für Fäzesfett/aufgenommenes Fett für sowohl Kontroll- als auch Testtiere (das enzyma tisch wie oben beschrieben bestimmt wurde) und Nahrungsaufnahme und Körpergewichtszunahme über 6 Tage im Vergleich zu Kontrolltieren.
Berechnung von Fäzesfett/aufgenommenes Fett:
Fettsäurekonzentrationen des enzymatischen Assays sind als mmol/ml ausgedrückt. Der Wert von mmol/ml Fettsäure wird dann durch die Zahl der Milliliter des Extrakts, der aus 500 mg einer Probe erzeugt wurde, multipliziert, wobei die gesamten mMole Fettsäure erhalten werden. Der Wert für die Gesamtzahl der mMole Fettsäure wird in die gesamten Milligramm Fettsäure unter Verwendung des durchschnittlichen Molekulargewichts einer mittel- bis langkettigen Fettsäure umgewandelt. Der Wert wird um etwaige Verdünnungen, die während der Probenaufarbeitung erfolgten, korrigiert. Wenn die Ergebnisse als mg/g Fäzes ausgedrückt werden, werden die gesamten Milligramm Fettsäuren mit 2 multipliziert. Wenn die Ergebnisse als die gesamten Milligramm Fettsäure, die in 24 h ausgeschieden werden, ausgedrückt werden, werden die mg/g des Fäzeswerts durch das Fäzesgewicht in Gramm, das in 24 h ausgeschieden wurde, multipliziert. Wenn die Ergebnisse als ausgeschiedenes Fett als Prozentsatz des in 24 h aufgenommenen ausgedrückt werden, wird das Gesamtgewicht des Fetts, das in 24 h ausgeschieden wurde, durch das Gewicht der Fettsäuren, die über 24 h aufgenommen wurden, geteilt und mit 100 multipliziert.
Tabelle 18: In-vivo-Ergebnisse von ausgewählten Polymeren mit lipasehemmenden Gruppen.
Die Tiere wurden mit einer Dosis von 1,0 % behandelt

* p < 0, 05
** p < 0,01

Obwohl diese Erfindung unter Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen derselben speziell angegeben und beschrieben ist, ist dem Fachmann selbstverständlich, dass verschiedene Änderungen hinsichtlich der Form und Einzelheiten hier durchgeführt werden können, ohne von der Idee und dem Umfang der Erfindung, die durch die angehängten Ansprüche definiert ist, abzuweichen. Der Fachmann erkennt oder kann unter Verwendung von nur Routinearbeiten viele Äquivalente der hier speziell beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung feststellen. Derartige Äquivalente sollen vom Umfang der Ansprüche umfasst sein.

Claims

Verwendung eines Polymers, das mit einer oder mehreren lipasehemmenden Gruppen substituiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments, das zur oralen Verabreichung zur Behandlung von Hypertriglyceridämie bei einem Säuger geeignet ist.
Verwendung eines Polymers, das mit mindestens einer lipasehemmenden Gruppe substituiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments, das zur oralen Verabreichung zur Behandlung von Fettsucht bei einem Säuger geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die lipasehemmende Gruppe mit einer Lipase reagiert und eine kovalente Bindung bildet.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die lipasehemmende Gruppe eine kovalente Bindung mit einem Aminosäurerest am aktiven Zentrum der Lipase bildet.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die lipasehemmende Gruppe eine kovalente Bindung mit einem Aminosäurerest, der sich nicht am aktiven Zentrum der Lipase befindet, bildet.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die lipasehemmende Gruppe ein Isoster einer Fettsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymer ein fettbindendes Polymer ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine zur Behandlung von Hypertriglyceridämie bei einem Säuger durch orale Verabreichung wirksame Menge eines Polymers, das mit einer oder mehreren lipasehemmenden Gruppen substituiert ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine zur Behandlung von Fettsucht bei einem Säuger durch orale Verabreichung wirksame Menge eines Polymers, das mit mindestens einer lipasehemmenden Gruppe substituiert ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die lipasehemmende Gruppe mit einer Lipase reagiert und eine kovalente Bindung bildet.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die lipasehemmende Gruppe eine kovalente Bindung mit einem Aminosäurerest am aktiven Zentrum der Lipase bildet.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die lipasehemmende Gruppe eine kovalente Bindung mit einem Aminosäurerest, der sich nicht am aktiven Zentrum der Lipase befindet, bildet.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die lipasehemmende Gruppe ein Isoster einer Fettsäure ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Polymer ein fettbindendes Polymer ist.