JP2009508809A - ＲＡＣ−１ＧＴＰａｓｅのＧＴＰａｓｅ阻害因子とその使用方法およびその結晶構造 - Google Patents

ＲＡＣ−１ＧＴＰａｓｅのＧＴＰａｓｅ阻害因子とその使用方法およびその結晶構造 Download PDF

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Abstract

好ましい実施形態は、一般的に、ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅのメンバー（好ましくは、Ｒａｃ（Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、および／またはＲａｃ３）のＧＴＰ結合活性に影響を与える方法および組成物、そのような組成物には、ＧＴＰ／ＧＤＰ交換活性を調節する化合物が含まれて、加えて、Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅを認識する化合物をスクリーニングする工程が含まれている化合物の使用、ならびに、Ｒａｃが含まれるＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅに関連するかまたはそれに関係している生理学的症状を処置する方法に関する。好ましい実施形態はまた、例えば、治療用ツール、診断用ツール、および研究用ツールとして、そのような化合物あるいはその誘導体を使用する方法にも関する。

Description

（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００５年７月２９日に提出された米国仮特許出願番号６０／７０３，５８７に対して、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）項の下で優先権を主張する。これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
（政府の支援を受けた研究に関する状況）
本発明は、国立衛生研究所に与えられた助成金番号Ｒ０１ ＧＭ６０５２３およびＲ０１ ＧＭ５３９４３の下で政府の支援によって、一部行われた。政府は本発明において一定の権利を有し得る。
（技術分野）
本発明は、一般的には、ＲａｓスーパーファミリーのＧＴＰａｓｅのメンバーのＧＴＰ結合活性に影響を与える方法および組成物、加えて、Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅを認識する化合物をスクリーニングする工程が含まれる化合物の使用、ならびに、ＲａｓスーパーファミリーのＧＴＰａｓｅに関連するかまたはそれに関係している生理学的症状を処置する方法に関する。
ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅは、細胞骨格の再構成、遺伝子発現、細胞周期の進行、細胞生存、および他の細胞性のプロセスを調節するシグナル伝達経路を制御する、分子スイッチである（Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｍａｎｎｅｖｉｌｌｅ，２００２）。これは、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
Ｒｈｏファミリーのタンパク質は、Ｒａｓスーパーファミリーの３つの主要な部門のうちの１つを構成する。Ｒｈｏタンパク質は、Ｒａｓタンパク質とおよそ３０パーセントのアミノ酸同一性を共有している。これまでに、少なくとも１４種類の哺乳動物のＲｈｏファミリータンパク質が同定されており、これには、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、ＲｈｏＤ、ＲｈｏＥ／Ｒｎｄ３、Ｒｎｄ１／Ｒｈｏ６、Ｒｎｄ２／Ｒｈｏ７、ＲｈｏＧ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｃｄｃ４２、ＴＣ１０、およびＴＴＦが含まれる。
好ましい実施形態によっては、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅの、強力であり選択的な阻害因子である化合物が提供される。具体的には、これらの化合物は、Ｒｈｏ関連Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅを阻害するために使用することができる。これらの阻害因子は、Ｒａｃの調節の不調（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が関係している疾患を処置するために使用することができる。さらに、これらの化合物は、Ｒａｃの調節の不調が関係しているガンを処置するために使用することができる。それらの活性を考慮すると、これらの化合物はまた、Ｒａｃの阻害に反応する他の障害を処置することにおいても使用することができる。
１つの実施形態には、哺乳動物のＲｈｏファミリーのタンパク質によって媒介される適応症を処置するための方法が含まれる。この方法には、そのような処置が必要な被験体に対して、以下の式（ＩＩａ）を有している少なくとも１つの化合物または式（ＩＩａ）の化合物の塩の安全であり有効な量を投与する工程が含まれる：
Figure 2009508809
 （式中、Ｒ１からＲ２は、Ｈ、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ’、および−Ｘ−Ｙ−Ｘ’からなる群より別々に選択され；式中、Ｘは、−ＣＲ７Ｒ８であり；Ｘ’は−ＣＨＲ７Ｒ８であり；ＡｌｋはＣ２〜Ｃ１８の置換されているか、または未置換の炭化水素鎖であり；Ｙは、Ｃ２〜Ｃ８の置換されているか、または未置換のアルキレン鎖であり；Ｒ６は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；ならびにＲ７およびＲ８は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群より別々に選択される。）
１つの実施形態には、哺乳動物のＲｈｏファミリーのタンパク質によって媒介される適応症を処置するための方法が含まれる。この方法には、そのような処置が必要な被験体に対して、以下の式（ＩＩＩ）を有している少なくとも１つの化合物または式（ＩＩＩ）の化合物の塩の、安全であり有効な量を投与する工程が含まれる：
Figure 2009508809
 （式中、Ｒ１０からＲ１２は、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、分岐した（Ｃ３〜Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ＮＯ２、およびＮＨ２からなる群より選択される基より別々に選択される。）
１つの実施形態には、哺乳動物のＲｈｏファミリーのタンパク質によって媒介される適応症を処置するための方法が含まれる。この方法には、そのような処置が必要な被験体に対して、以下の式（ＩＶ）を有している少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容される塩の、安全であり有効な量を投与する工程が含まれる：
Figure 2009508809
１つの実施形態には、Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミンおよび薬学的に許容される担体が含まれている医薬組成物が含まれる。
１つの実施形態には、空間基Ｐ２１と、ａ＝約４１．８オングストローム、ｂ＝約４０．０オングストローム、ｃ＝約５２．１オングストローム、およびβ＝約１０５．９３°の単位格子を有しているＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶が含まれる。
１つの実施形態には、結晶Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが含まれる。ここでは、上記結晶は、表１または表２の原子構造の座標を特徴とする三次元構造を有している。
１つの実施形態には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが含まれている結晶を作成する方法が含まれる。ここでは、結晶Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅには、少なくとも、配列番号１の配列のアミノ酸残基１から１８５が含まれる。ここでは、結晶は、５．０オングストロームより大きい解像度になるように原子座標を決定するためのＸ線を効率よく回折する。上記の結晶は、空間基Ｐ２１と、ａ＝約４１．８オングストローム、ｂ＝約４０．０オングストローム、ｃ＝５２．１オングストローム、およびβ＝約１０５．９３°の単位格子を有している。
上記方法には、２０％のＰＥＧ ８０００、５％のエチレングリコール、１５％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＮＳＣ２３７６６が含まれている緩衝液を使用して、２０℃で、ハンギングドロップ法によって結晶を成長させる工程；および
１８％のＰＥＧ ８０００、３．５％のエチレングリコール、１０．７％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴ、１４．３ｍＭのＮＳＣ２３７６６が含まれている液滴の中で、２５％のＰＥＧ ８０００、５％のエチレングリコール、１５％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴが含まれている緩衝液が含まれているレザーバー上で、結晶を平衡化させる工程が含まれる。
１つの実施形態には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定する方法が含まれる。この方法には：
（ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが含まれている複合体の結晶を得る工程；
（ｂ）結晶の原子座標を得る工程；および
（ｃ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定するために、原子の座標と１つ以上の分子モデル化技術を使用する工程
が含まれる。
１つの実施形態には、以下と会合する化学物質の能力を評価するための方法が含まれる：
ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ Ｔｒｐ−５６、Ｌｙｓ−５、Ｖａｌ−７、Ｓｅｒ−７１、Ｉｌｅ−３６、Ｔｙｒ−６４、Ａｒｇ−６８、およびＰｒｏ−７３の構造座標によって定義される結合ポケットが含まれている分子または分子複合体；または
ｂ）上記分子または分子複合体のホモログであって、上記ホモログには、約１．５オングストロームは超えない上記アミノ酸の骨格原子による標準偏差を有している結合ポケットが含まれ、この方法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）化学物質と分子または分子複合体の結合ポケットとの間でフィッティング操作（ｆｉｔｔｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）を行うために、コンピューターによる手段を使用する工程；および
ｉｉ）化学物質と結合ポケットとの間での結合を定量するために、上記フィッティング操作の結果を分析する工程。
１つの実施形態には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性を阻害するための化合物が含まれる。その活性部位は、空間基Ｐ２１と、ａ＝約４１．８オングストローム、ｂ＝約４０．０オングストローム、ｃ＝約５２．１オングストローム、およびβ＝約１０５．９３°の単位格子を有しているＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶による三次元構造を示す。
１つの実施形態は、ＧＤＰに結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶に関する。
１つの実施形態は、結晶Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに関する。ここでは、上記結晶は、表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３の原子と比較して、６Å以下、５Å以下、４Å以下、３Å以下、２Å以下、１Å以下の標準偏差を有している原子座標を有していることを特徴とする三次元構造を有する。いくつかのこのような実施形態においては、表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３の原子は、ペプチド骨格原子である。
１つの実施形態は、表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３の原子と比較して、６Å以下、５Å以下、４Å以下、３Å以下、２Å以下、１Å以下の標準偏差を有している原子座標に関する。請求項３３に記載される座標では、表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３がペプチド骨格原子である。
１つの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの三次元構造を特性決定する方法に関する。この方法には：（ａ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶を得る工程；および（ｂ）結晶化させられたＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの原子座標を得る工程が含まれる。
１つの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合させられたリガンドの三次元構造を特性決定する方法に関する。この方法には：（ａ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合させられたリガンドの結晶を得る工程；および（ｂ）結晶化させられたリガンドとＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの原子座標を得る工程が含まれる。
１つの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定する方法に関する。この方法には：（ａ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶を得る工程；および（ｂ）結晶化させられたＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの原子座標を得る工程；および（ｃ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定するために、原子座標と１つ以上の分子モデル化技術を使用する工程が含まれる。
１つの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を設計する方法に関する。この方法には、表１または表２のデータの少なくとも一部にアクセスする工程、および上記データを利用してＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに対する１つ以上の化合物の結合をモデル化する工程が含まれる。いくつかのそのような実施形態においては、モデル化には、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位との相互作用をモデル化することによって、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合する化合物の可能性を予想する工程が含まれる。いくつかのそのような実施形態にはさらに、上記データを、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅとリガンドとの間での１つ以上の相互作用を同定するために利用する工程が含まれる。いくつかのそのような実施形態においては、上記１つ以上の相互作用は、リガンドとタンパク質との間での１つ以上の水素結合；リガンドとタンパク質との間での１つ以上の静電気的相互作用；１つ以上の疎水性相互作用；リガンドとタンパク質との間での１つ以上の共有結合；タンパク質原子の複数の位置、例えばリガンド結合するアミノ酸側鎖などの中での１つ以上の変化；その位置が柔軟性を維持することができる立体構造に明確に定義される、複数の原子のうちの１つ以上の変化；１つ以上の水素結合ネットワーク；水素結合ネットワークへの１つ以上の構造変化、Ｍｇ２＋との相互作用への１つ以上の構造変化、ＧＤＰとの相互作用への１つ以上の構造変化、およびＧＴＰとの相互作用への１つ以上の構造変化からなる群より選択される。
Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を同定する方法には、請求項４０に記載される１つ以上の相互作用が含まれるデータを得る工程、およびＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用するように化合物をモデル化する工程が含まれる。ここでは、化合物には、請求項４０に記載される相互作用の１つ以上、または請求項４０に記載される１つ以上の相互作用の改善が含まれる。
１つの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を設計する方法に関する。この方法には、ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＸ線結晶構造の座標を得る工程、およびＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４３に記載される方法には、Ｍｇ２＋のＴｈｒ３５結合を阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４３または請求項４４に記載される方法であって、ここでは、アミノ酸残基６０〜６４が含まれているループの中での立体構造の変化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４３〜４５のいずれかに記載される方法であって、ここでは、Ｍｇ２＋を置換することによりＡｌａ５９を阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４６に記載される方法であって、上記化合物はＡｌａ５９に水素結合する。
請求項４３〜４７のいずれかに記載される方法であって、ここでは、ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣに結合することを阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４３〜４８のいずれかに記載される方法であって、ここでは、ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣから解離することを阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４３〜４９のいずれかに記載される方法であって、ここでは、スイッチＩのアミノ酸の中での立体構造変化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４３〜５０のいずれかに記載される方法であって、ここでは、スイッチＩＩのアミノ酸の中での立体構造変化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる。
請求項４３〜５１のいずれかに記載される方法であって、ここでは、上記化合物は、Ｌｅｕ７０またはＳｅｒ７１、あるいは両方に対する水素結合として同定される。
請求項４３〜５２のいずれかに記載される方法であって、ここでは、上記化合物は、Ｌｅｕ６７、Ｇｌｎ７４、Ａｓｐ５７、またはＳｅｒ７１、あるいはそれらの組み合わせに対する水素結合として同定される。
請求項４３〜５３のいずれかに記載される方法であって、ここでは、上記化合物は、Ｖａｌ３６、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、またはＰｒｏ７３、あるいはそれらの組み合わせとファンデルワールス接触しているとして同定される。
１つの実施形態は、プロテアソーム阻害因子を同定する方法に関する。この方法には、表１または表２の座標の１つ以上にアクセスする工程、および表１または表２のリガンドの座標の１つ以上の、約１．０から２．０オングストロームまたは約２．５から５．０オングストローム以内の範囲の位置を占めている化合物を同定する工程が含まれる。
請求項５５に記載される方法であって、ここでは、化合物は、表１〜５の少なくとも１つのリガンドの１つ以上の座標の、約１．２から１．７オングストローム、または約２．６から３．５オングストロームの位置を占めている。
１つの実施形態は、プロテアソーム阻害因子を同定する方法に関する。この方法には、
（ａ）リガンドとＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅとの間での１つ以上の相互作用を同定する工程；および
（ｂ）リガンドとサブユニットとの間での相互作用を修飾するために、リガンド上の置換基を変化させる工程
が含まれる。
請求項５７に記載される方法であって、ここでは、リガンドはＮＳＣ２３７６６である。
１つの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合する可能性がもっとも高い化合物を同定するために、１つ以上の化合物のセットをスクリーニングする方法に関する。この方法には、（ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位の中での、１つ以上の化合物のそれぞれについてのドッキングエネルギー（ｄｏｃｋｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ）をコンピューターによって決定する工程であって、ここでは、個々のそれぞれのドッキングエネルギーは、上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する上記化合物の結合の可能性を示す工程；および、（ｂ）閾値を上回る上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する結合の可能性を有していると示された１つ以上の化合物を選択する工程が含まれる。
１つの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位に結合する可能性がある化合物を同定する方法に関する。この方法には、（ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位の中での、１つ以上の化合物のそれぞれについてのドッキングエネルギーをコンピューターによって決定する工程であって、ここでは、個々のそれぞれのドッキングエネルギーは、上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する上記化合物の結合の可能性を示す工程；および、（ｂ）閾値を上回る上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する結合の可能性を有していると示された１つ以上の化合物を選択する工程が含まれる。
請求項５９〜６０のいずれかに記載される方法であって、ここでは、上記活性化部位には、表１または表２のタンパク質原子の１つ以上が含まれる。
１つの実施形態は、表１または表２に提供される原子座標の原子と比較して、６．０Å以下、５．５Å以下、５．０Å以下、４．５Å以下、４．０Å以下、３．５Å以下、３．０Å以下、２．５Å以下、２．０Å以下、１．７Å以下、１．５Å以下、１．４Å以下、１．３Å以下、１．２Å以下、１．１Å以下、１．０Å以下、０．９Å以下、０．８Å以下、０．７Å以下、０．６Å以下、０．５Å以下、０．４Å以下、０．３Å以下、０．２Å以下、または０．１Å以下の標準偏差を有している原子座標に関する。
請求項５９〜６１のいずれかに記載される方法であって、ここでは、上記活性化部位には、表１または表２に提供される原子座標の原子と比較して、６．０Å以下、５．５Å以下、５．０Å以下、４．５Å以下、４．０Å以下、３．５Å以下、３．０Å以下、２．５Å以下、２．０Å以下、１．７Å以下、１．５Å以下、１．４Å以下、１．３Å以下、１．２Å以下、１．１Å以下、１．０Å以下、０．９Å以下、０．８Å以下、０．７Å以下、０．６Å以下、０．５Å以下、０．４Å以下、０．３Å以下、０．２Å以下、または０．１Å以下の標準偏差を有している原子座標を有しているタンパク質原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、スイッチＩのアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、スイッチＩＩのアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、およびＡｓｐ３８から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６およびＬｅｕ７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｌｅｕ７０、およびＳｅｒ７１から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、およびＬｅｕ７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、またはＡｓｐ３８から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２に記載される原子座標または請求項６３に記載される方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。
請求項６２〜７６のいずれかに記載される原子座標または方法であって、ここでは、表１または表２に提供される原子座標の原子にはＭｇ２＋原子が含まれる。
請求項６２〜７６のいずれかに記載される原子座標または方法であって、ここでは、原子は、選択されたアミノ酸の全ての原子、選択されたアミノ酸の骨格原子のみ、および選択されたアミノ酸のα炭素原子のみからなる群より選択される。
請求項６３〜７８のいずれかに記載される方法であって、これらの方法にはさらに、上記活性化部位の中での上記化合物の立体構造を決定する工程が含まれる。
請求項６３〜７９のいずれかに記載される方法であって、ここでは、結合エネルギーを決定する上記工程には、さらに、上記活性化部位の格子ベースの受容体のフィールドの説明を作成する工程が含まれる。
請求項６３〜８０のいずれかに記載される方法であって、ここでは、結合エネルギーを決定する上記工程には、さらに、上記活性化部位の中での上記化合物の最適な立体構造を決定する工程が含まれる。
請求項６３〜８１のいずれかに記載される方法であって、ここでは、結合エネルギーを決定する上記工程には、さらに、上記活性化部位の中に上記化合物の原子を組み立て、それによって上記活性化部位に適合させる工程が含まれる。
コンピューターで読み取ることができる媒体であって、これには、請求項６２、または６４〜７８のいずれかに記載される原子座標が含まれている。
請求項８３に記載されるコンピューターで読み取ることができる媒体であって、これには、表１または表２のタンパク質原子の原子座標が含まれている。
コンピューターで読み取ることができる媒体であって、これには、表１または表２のリガンドについての原子座標が含まれている。
請求項８５に記載されるコンピューターで読み取ることができる媒体であって、ここでは、リガンドはＮＳＣ２３７６６である。
コンピューターで読み取ることができる媒体であって、これには、ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅについての原子座標の少なくとも一部が含まれている。
請求項８７に記載されるコンピューターで読み取ることができる媒体であって、これには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸１〜１８５が含まれている。
請求項８７に記載されるコンピューターで読み取ることができる媒体であって、これにはさらに、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧＤＰ以外のリガンドの原子座標の少なくとも一部が含まれている。
請求項８７または請求項８８に記載されるコンピューターで読み取ることができる媒体であって、ここでは、座標は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸１〜１８５についての座標に満たない。
コンピューターシステムであって、これには、請求項６２、６４〜７８、または８３〜９０のいずれかに記載される座標が含まれている。
請求項９１に記載されるコンピューターシステムであって、これによって、プロテアソーム／リガンド複合体についての構造を作成すること、および／またはそれについての合理的な薬物の設計を行うことができる。
好ましい実施形態の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される。しかし、好ましい実施形態は、構成および操作方法のいずれに関しても、そのさらなる目的およびその利点と一緒に、添付される図面と組み合わせて以下の説明を参照して最もよく理解され得る。
説明される実施形態の以下の記載においては、その一部を形成し、本発明を実施することができる様々な実施形態の例が示される添付の図面が参照される。他の実施形態を利用することができ、ならびに構造および機能の変更を、好ましい実施形態の範囲から逸脱することなく行うことができることが理解される。
本明細書を通じて、明確に記載されない限りは、全ての温度は摂氏で表され、全ての割合は重量パーセントである。以下は本明細書中で使用される用語の定義である。本明細書中の基または用語について提供される最初の定義は、他に明記されない限りは、個別に、または別の基の一部として、本明細書を通じてその基または用語に対して適用される。以下の定義は、他で定義されない限りは、好ましい実施形態に適用される：
用語「活性のある化合物」または「有効成分」は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶによって記載される物質のうち任意のものを意味する。
用語「アルキル」は、１個から１２個の炭素原子、またはそれ以上、好ましくは、１個から８個の炭素原子を有している、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を意味する。低級アルキル基、すなわち、１個から４個の炭素原子のアルキル基が最も好ましい。
用語「置換されたアルキル」は、少なくとも１つの置換基、例えばハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、−−ＮＨ（アルキル）、−−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２、−アルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、または複素環などを有している上記で定義されたアルキル基を意味する。用語「置換されたアルキル」にはまた、Ｎ（置換されたアルキル）またはＮ（置換されたアルキル）２で置換された、上記で定義されたアルキル基、または言い換えると、（ＣＨ２）基、ＮＨＲ’基、および（ＣＨ２）ｎ ＮＲ’Ｒ’’基が含まれ、式中、Ｒ’とＲ’’にはそれぞれ置換されたアルキルが含まれるか、またはＲ’とＲ’’は一緒にヘテロシクロ環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏ ｒｉｎｇ）を形成する。
用語「アルコキシ」は、酸素（−Ｏ−）によって結合した、上記で定義されたアルキル基を意味する。用語「アルキルチオ」は、硫黄（−Ｓ−）によって結合した、上記で定義されたアルキル基を意味する。
用語「シクロアルキル」は、少なくとも３個、好ましくは３個から９個、より好ましくは、３個から７個の炭素原子の完全に飽和している炭化水素環および部分的に不飽和である炭化水素環、ならびに、インダンのような縮合したアリール環を有しているそのような環を意味する。
用語「置換されたシクロアルキル」は、１個、２個、または３個の置換基、好ましくは、１個、例えばアルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−低級アルキル、アリール、複素環、ヘテロアリール、ケト、＝Ｎ−ＯＨ、＝Ｎ−Ｏ−低級アルキル、および５員または６員のケタール、すなわち、１，３−ジオキソランまたは１，３−ジオキサンなどを有しているそのような環を意味する。
用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
用語「アリール」は、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチルを意味し、フェニルが好ましい。用語「アリール」には、０個、１個、２個、または３個の置換基、例えばアルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＣＯ２Ｈ、−（Ｃ＝Ｏ）アルキル、−ＣＯ２−アルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（シクロアルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２−アルキル、フェニル、ベンジル、フェニルエチル、フェニルオキシ、フェニルチオ、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールなどを有しているそのような環が含まれる。
用語「ヘテロシクロ」は、置換された、および未置換の、非芳香族の３員から７員の単環基、７員から１１員の２環基、および１０員から１５員の３環基を意味する。これらは、環の少なくとも１つの中に少なくとも１つのヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮ）を有する。ヘテロ原子が含まれているヘテロシクロ基の個々の環には、個々の環の中のヘテロ原子の合計数が４個以下であるという条件、およびさらに、環に少なくとも１個の炭素原子が含まれるという条件で、１個または２個の酸素または硫黄原子、および／または１個から４個の窒素原子が含まれ得る。２環基および３環基が完了している（ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ）縮合環には炭素原子だけが含まれる場合があり、飽和、部分的に飽和、または、不飽和である場合もある。窒素原子および硫黄原子は、状況に応じて酸化させることができ、窒素原子は、状況に応じて四級化させることができる。複素環基は、任意の利用することができる窒素または炭素原子に結合させることができる。複素環には、１個、２個、または３個の置換基、例えばハロ、アミノ、シアノ、アルキル、置換されたアルキル、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、ベンジル、フェニルエチル、フェニルオキシ、フェニルチオ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−アルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（シクロアルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２−アルキル、ヘテロシクロ、ヘテロアリール、ケト、＝Ｎ−ＯＨ、＝Ｎ−Ｏ−低級アルキル、および５員または６員のケタール、すなわち、１，３−ジオキソランまたは１，３−ジオキサンなどが含まれ得る。
例示的な単環基としては、アゼチジニル、ピロリジニル、オキセタニル、イミダゾリニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロロジニル、２−オキソアゼピニル、アゼピニル、４−ピペリドニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン、１，３−ジオキソラン、およびテトラヒドロ−１，１−ジオキソチエニルなどが挙げられる。例示的な２環式ヘテロシクロ基には、キヌクリジニルが含まれる。
用語「ヘテロアリール」は、置換された、および未置換の、芳香族である５員または６員の単環基、９員または１０員の２環基、および１１員から１４員の３環基を意味する。これには、環の少なくとも１つの中に少なくとも１つのヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮ）が含まれる。ヘテロ原子が含まれているヘテロアリール基のそれぞれの環には、個々の環の中のヘテロ原子の合計数が４個以下であり、それぞれの環に少なくとも１個の炭素原子が含まれるという条件で、１個または２個の酸素または硫黄原子、および／または１個から４個の窒素原子が含まれ得る。２環基および３環基が完了している縮合環には炭素原子だけが含まれる場合があり、飽和、部分的に飽和、または不飽和である場合もある。窒素原子および硫黄原子は、状況に応じて酸化させることができ、窒素原子は、状況に応じて四級化させることができる。２環または３環であるヘテロアリール基には、少なくとも１つの完全な芳香環が含まれていなければならないが、他の縮合環（単数または複数）は芳香族であっても、芳香族でなくてもよい。ヘテロアリール基は、任意の環の任意の利用可能な窒素または炭素原子に結合させることができる。ヘテロアリール環系には、１個、２個、または３個の置換基、例えばハロ、アミノ、シアノ、アルキル、置換されたアルキル、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、フェニル、ベンジル、フェニルエチル、フェニルオキシ、フェニルチオ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−アルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（シクロアルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２−アルキル、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールなどが含まれ得る。
例示的な単環式ヘテロアリール基としては、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、チアジニルなどが挙げられる。
例示的な２環式ヘテロアリール基としては、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾキサキソリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、ベンゾピラニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、ピロロピリジル、フロピリジニル、ジヒドロイソインドリル、テトラヒドロキノリニルなどが挙げられる。
例示的な３環式ヘテロアリール基としては、カルバゾリル、ベンジドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニル、キサンテニルなどが挙げられる。
用語「置換されたイミダゾール」は、イミダゾール、アリール縮合されたイミダゾール、例えばベンズイミダゾールなど、またはヘテロアリール縮合されたイミダゾール、例えばピリドイミダゾールなどが挙げられる。これには、１個または２個の置換基、例えば水素、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−アルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（シクロアルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２−アルキル、フェニル、ベンジル、フェニルエチル、フェニルオキシ、フェニルチオ、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールなどが含まれる。
用語「置換されたトリアゾール」は、少なくとも１つの置換基、例えばアルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−アルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（シクロアルキル）、−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２−アルキル、フェニル、ベンジル、フェニルエチル、フェニルオキシ、フェニルチオ、ヘテロシクロ、およびヘテロアリールなどを有しているトリアゾールを意味する。
用語「（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル」、「（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」、および「（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル」は、単独で使用される場合は、直鎖のアルキルラジカルを意味する。
用語「分岐している（Ｃ３〜Ｃ４）アルキル」および「分岐している（Ｃ３〜Ｃ６）アルキル」は、直鎖である異性体を除く、示される数の炭素原子が含まれている全てのアルキル異性体を意味する。
用語「（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ」および「（Ｃ１〜Ｃ７）アルコキシ」は、直鎖または分岐鎖のアルコキシ基を意味する。
用語「ハロ（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル」は、１つ以上のハロ基で置換された直鎖または分岐している（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル基を意味する。
単独で使用されるか、または「置換されたフェニルチオ」もしくは「置換されたフェニルスルホニル」のように他の用語と組み合わせて使用される用語「置換されたフェニル」は、３個までの基、例えばハロ、Ｉ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、分岐している（Ｃ３〜Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ７）アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ７）アルコキシ、フェノキシ、フェニル、ＮＯ２、ＯＨ、ＣＮ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルカノイルオキシ、またはベンジルオキシなどによって置換されたフェニルを意味する。
用語「置換されたフェノキシ」は、少なくとも１つの基、例えばハロ、Ｉ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、分岐している（Ｃ３〜Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ７）アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ７）アルコキシ、フェノキシ、フェニル、ＮＯ２、ＯＨ、ＣＮ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルカノイルオキシ、またはベンジルオキシなどによって置換されたフェノキシを意味する。
用語「置換されたナフチル」、「置換されたピリジル」、および「置換されたフラニル」は、少なくとも１つの基、例えばハロ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ４）分岐しているアルキル、フェニル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシなどによって置換されたこれらの環系を意味する。
用語「不飽和炭化水素鎖」は、１個または２個の不飽和部位が含まれている炭化水素鎖を意味する。
好ましい実施形態によっては、ＲｈｏＧＴＰａｓｅ（特に、Ｒａｃ１ＧＴＰａｓｅ）の阻害因子として使用される、以下の式（Ｉ）のキノリン化合物またはその塩が提供される：
Figure 2009508809
式中：Ｒ１からＲ５は、別々に、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、分岐している（Ｃ３〜Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ２、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ、−Ｘ−Ｙ−Ｘ、−ＮＲ６、またはＯ−Ｒ６であり、式中、
ＸはＯ、ＮＲ６、またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ａｌｋは、ハロ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、またはアセチルで状況に応じて置換された、直鎖または分岐している、Ｃ２〜Ｃ１８の飽和または不飽和炭化水素鎖であり；
Ｙは、２個から８個の炭素原子長さのアルキレン鎖であり、これには状況に応じて、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＮＲ６基が含まれ、状況に応じて、３個から７個の炭素原子が含まれている飽和または不飽和炭素環が含まれ、状況に応じて、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ４）フェニル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、ハロ、または（Ｃ１〜Ｃ４）アシルで置換され；
Ａｒは、１，３−ベンゾジオキソリルフルオレニル、ピリジル置換されたピリジル、インドリル、フラニル、置換されたフラニル、状況に応じてＣＨ２またはＣｌで置換されたチエニル、チアゾリル、シクロペンチル、１−メチルシクロペンチル、シクロヘキセニル（テトラヒドロフェニル）、シクロヘキシル（ヘキサヒドロフェニル）、ナフチル、置換されたナフチル、ジヒドロナフチル、テトラヒドロナフチル、またはデカヒドロナフチルであり；
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはアセチルであり；
Ｒ７およびＲ８は、別々に、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシル、ハロ、−ＯＨ、Ｏ−Ｙ−Ａｒ、または−ＮＲ９−Ｙ−Ａｒであり；ならびに、
Ｒ９は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはアセチルである。
あるいは、式（Ｉ）の化合物の塩が提供されるが、ただしこれは具体的には、それ自体が公知である化合物が排除されるか、または公知の化合物と類似すると考えることができる。
好ましくは、Ｒ１からＲ５の少なくとも２つは、ＨまたはＣＨ３であり、Ｒ１からＲ２の少なくとも１つは、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ、もしくは−Ｘ−Ｙ−Ｘ、−ＮＲ６、またはＯ−Ｒ６であり、Ｒ１からＲ５の残りはＨまたはＣＨ３であり；式中：
ＸはＯ、ＮＲ６、またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ａｌｋは、状況に応じて、ハロ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、またはアセチルで置換された、直鎖または分岐している、Ｃ２〜Ｃ１８の飽和または不飽和炭化水素鎖であり；
Ｙは、２個から８個の炭素原子長さを有しているアルキレン鎖であり、これには状況に応じて、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＮＲ６基が含まれ、状況に応じて、３個から７個の炭素原子が含まれている飽和または不飽和炭素環が含まれ、状況に応じて、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ４）フェニル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、ハロ、または（Ｃ１〜Ｃ４）アシルで置換され；
Ａｒは、１，３−ベンゾジオキソリルフルオレニル、ピリジル置換されたピリジル、インドリル、フラニル、置換されたフラニル、状況に応じてＣＨ２またはＣｌで置換されたチエニル、チアゾリル、シクロペンチル、１−メチルシクロペンチル、シクロヘキセニル（テトラヒドロフェニル）、シクロヘキシル（ヘキサヒドロフェニル）、ナフチル、置換されたナフチル、ジヒドロナフチル、テトラヒドロナフチル、またはデカヒドロナフチルであり；
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはアセチルであり；
Ｒ７およびＲ８は、別々に、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシル、ハロ、−ＯＨ、Ｏ−Ｙ−Ａｒ、または−ＮＲ９−Ｙ−Ａｒであり；ならびに、
Ｒ９は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはアセチルである。
好ましくは、好ましい実施形態により、ＲｈｏＧＴＰａｓｅの阻害因子として使用される、式（ＩＩ）の化合物またはその塩が提供される：
Figure 2009508809
式中、
Ｒ１からＲ２は、別々に、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、分岐している（Ｃ３〜Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ２、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ、−Ｘ−Ｙ−Ｘ、−ＮＲ６、またはＯ−Ｒ６であり、式中、
ＸはＯ、ＮＲ６、またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ａｌｋは、ハロ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、またはアセチルで状況に応じて置換された、直鎖または分岐している、Ｃ２〜Ｃ１８の飽和または不飽和炭化水素鎖であり；
Ｙは、２個から８個の炭素原子長さのアルキレン鎖であり、これには状況に応じて、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＮＲ６基が含まれ、状況に応じて、３個から７個の炭素原子が含まれている飽和または不飽和炭素環が含まれ、状況に応じて、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ４）フェニル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、ハロ、または（Ｃ１〜Ｃ４）アシルで置換され；
Ａｒは、１，３−ベンゾジオキソリルフルオレニル、ピリジル置換されたピリジル、インドリル、フラニル、置換されたフラニル、状況に応じてＣＨ２またはＣｌで置換されたチエニル、チアゾリル、シクロペンチル、１−メチルシクロペンチル、シクロヘキセニル（テトラヒドロフェニル）、シクロヘキシル（ヘキサヒドロフェニル）、ナフチル、置換されたナフチル、ジヒドロナフチル、テトラヒドロナフチル、またはデカヒドロナフチルであり；
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはアセチルであり；
Ｒ７およびＲ８は、別々に、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシル、ハロ、−ＯＨ、Ｏ−Ｙ−Ａｒ、または−ＮＲ９−Ｙ−Ａｒであり；ならびに、
Ｒ９は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはアセチルである。
あるいは、式（ＩＩ）の化合物の塩が提供される。
好ましくは、好ましい実施形態によっては、ＲｈｏＧＴＰａｓｅの阻害因子として使用される、式（ＩＩａ）の化合物またはその塩が提供される：
Figure 2009508809
式中、
Ｒ１からＲ２は、別々に、Ｈ、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ’、または−Ｘ−Ｙ−Ｘ’であり、式中、
Ｘは−ＣＲ７Ｒ８であり；
Ｘ’は−ＣＨＲ７Ｒ８であり；
Ａｌｋは、ハロ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、またはアセチルで状況に応じて置換された、直鎖または分岐している、Ｃ２〜Ｃ１８の飽和または不飽和炭化水素鎖であり；
Ｙは、２個から８個の炭素原子長さのアルキレン鎖であり、これには状況に応じて、ＮＲ６基が含まれ；
Ｒ６は、Ｈ、または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；ならびに
Ｒ７およびＲ８は、別々に、Ｈ、または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである；
あるいは、式（ＩＩａ）の化合物の塩が提供される。
好ましい実施形態によっては、ＲｈｏＧＴＰａｓｅの阻害因子として使用される、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩が提供される：
Figure 2009508809
式中、
Ｒ１０からＲ１２は、別々に、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、分岐している（Ｃ３〜Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ＮＯ２、またはＮＨ２である；
あるいは、式（ＩＩＩ）の化合物の塩が提供される。
好ましい実施形態によっては、ＲｈｏＧＴＰａｓｅの阻害因子として使用される、式（ＩＩＩａ）の化合物またはその塩が提供される：
Figure 2009508809
式中、
Ｒ１０からＲ１２は、別々に、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、または分岐している（Ｃ３〜Ｃ４）アルキルである；
あるいは、式（ＩＩＩａ）の化合物の塩が提供される。
好ましい実施形態によっては、ＲｈｏＧＴＰａｓｅの阻害因子として使用される、式（ＩＶ）の化合物またはその塩が提供される：
Figure 2009508809
あるいは、式（ＩＶ）の化合物の塩が提供される。
好ましい実施形態の医薬組成物には、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの化合物、あるいは、Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミンの疾患を阻害する薬学的に許容される量が、薬学的に許容される担体と組み合わせて含まれる。
好ましい実施形態の医薬組成物には、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの化合物、あるいは、Ｎ−６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミン（例えば、式ＩＶ、化合物２３７６６）が少なくとも１重量％含まれる。
好ましい実施形態の医薬組成物には、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの化合物、あるいは、Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミン（例えば、式ＩＶ、化合物２３７６６）が含まれており、さらに、薬学的活性のある化合物が含まれる。例えば、さらに別の薬学的活性のある化合物は、細胞増殖を阻害するために有用な化合物であり得る。例えば、さらに別の薬学的活性のある化合物は、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、毒素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物であり得る。
好ましい実施形態の薬学的組み合わせには、少なくとも１重量％の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの化合物、あるいは、Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミン（例えば、式ＩＶ、化合物２３７６６）が、第２の薬学的化合物と組み合わせられて、含まれる。
別の実施形態においては、好ましい実施形態の薬学的組み合わせには、少なくとも１重量％のＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅを調節する活性のある化合物が含まれ、これにはさらに、さらに別のガン処置用の薬学的物質が、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わせて含まれる。
好ましい実施形態の医薬組成物には、ガンを予防する量のＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅを調節する活性のある化合物が、薬学的に許容される担体と組み合わせられて、含まれる。
好ましい実施形態の薬学的方法には、Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミンを、そのような処置が必要な被験体に、治療量の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの化合物、あるいは上記の組み合わせと共に投与する工程が含まれる。
Ｒａｃは、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅとして知られているタンパク質のファミリーの最も重要なメンバーの１つである。このタンパク質のファミリーは、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性の重要な調節因子として作用する、ＧＴＰと呼ばれる低分子代謝産物に結合する。これにより、その最初の増殖と分化から、その移動および分裂、最後にはその死に至るまでの、細胞の寿命のあらゆるものにまたがる多種多様の細胞性の機能を、Ｒａｃは調節することができる。これらは、遺伝子発現に重要であり、細菌感染に対して致死性の反応を生じる先天性の免疫細胞の能力、治癒プロセスの間に創傷を覆う皮膚細胞の能力、新しい血管を作る血管細胞の能力、ガン細胞の転移する能力、および脳内に適切な接続を生じさせ、作成するニューロンの能力において重要な役割を担っている。
Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの不活性な形態はＧＤＰ結合形態である。不活性なＧＤＰ結合形態の三次元構造が本明細書中で提供され、これには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧＴＰ結合形態と比較すると立体構造上の差が含まれる。
本実施形態は、ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに対応する結晶タンパク質に関する。好ましくは、結晶タンパク質は、三次元Ｘ線回折構造の決定を可能にするために十分な量である。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに対応する結晶タンパク質の構造座標は、以下の表１または表２に示される。
１つの実施形態においては、式（ＩＩａ）
Figure 2009508809
 または式（ＩＩａ）の化合物の塩と複合体を形成したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶構造が得られる。式中、Ｒ１からＲ２は、Ｈ、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ’、および−Ｘ−Ｙ−Ｘ’からなる群より別々に選択され；式中、Ｘは、−ＣＲ７Ｒ８であり；Ｘ’は−ＣＨＲ７Ｒ８であり；ＡｌｋはＣ２〜Ｃ１８の置換されているか、または未置換の炭化水素鎖であり；Ｙは、Ｃ２〜Ｃ８の置換されているか、または未置換のアルキレン鎖であり；Ｒ６は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；Ｒ７およびＲ８は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群より別々に選択される。１つの実施形態においては、式ＩＩａの化合物は、式（ＶＩ）
Figure 2009508809
 である。式ＩＶの化合物と複合体を形成したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶構造においては、式ＩＶの化合物は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ−５６、Ｌｙｓ−５、Ｖａｌ−７、Ｓｅｒ−７１、Ｉｌｅ−３６、Ｔｙｒ−６４、Ａｒｇ−６８、およびＰｒｏ−７３のいずれかと接触する。
複数の実施形態は、タンパク質を調製し、結晶化させるための方法に関する。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶は、当業者に公知の多数の技術によって成長させることができ、これには、回分晶析、蒸気拡散（シッティングドロップまたはハンギングドロップのいずれかによる）、または微小透析が含まれる。いくつかの場合には、結晶のシーディングが、Ｘ線品質の結晶を得るために必要である。したがって、結晶の標準的なミクロシーディングおよび／またはマクロシーディングが使用される場合がある。最初の結晶は、約４℃から約２０℃で、ハンギングドロップによって数時間から数ヶ月間、成長させることができる。その後、結晶は、最初の結晶に由来するマクロシーディングによって続けて成長させることができる。
一旦、好ましい実施形態の結晶を成長させると、Ｘ線回折データを集めることができる。例えば、Ｘ線回折データを集めるためのＭＡＲイメージプレート検出器を使用することができる。結晶は、通常の線源（例えば、密封された管、または回転陽極）の中で生じさせられたＸ線を使用することによるか、あるいは、シンクロトロン放射源を使用して、特性決定することができる。以下の実施例においては、回折データは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹ）で測定した。
特性決定の方法としては、歳差撮影法（ｐｒｅｃｅｓｓｉｏｎ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ）、振動撮影法（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ）、ラウエ回折撮影法、および回折計のデータの回収が挙げられるが、これらに限定はされない。以下に説明されるように、重原子誘導体は、１ｍＭのＮａ２ＯｓＣｌ６が含まれている安定化溶液の中に結晶を約１２時間、１０ｍＭのＫＡｕ（ＣＮ）２が含まれている安定化溶液の中に約１２時間、１０ｍＭのＰｂ（ＯＡｃ）２が含まれている安定化溶液の中に約１時間、および１０ｍＭのＵＯ２（ＮＯ３）２が含まれている安定化溶液の中に約４時間浸すことによって得ることができる。
タンパク質自体、さらには、結晶構造から導かれた情報を、タンパク質の活性を分析し、修飾するために、さらには、触媒ドメインと相互作用する化合物を同定するために使用することができる。一旦、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが含まれている結晶の三次元構造が決定されると（例えば、表１または表２の座標を参照のこと）、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性についての可能性のある調節因子を、ドッキングプログラム（ｄｏｃｋｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ）、例えば限定されないが、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、またはＡＵＴＯＤＯＣＫ［Ｄｕｎｂｒａｃｋ ら、１９９７、前出］などを使用するコンピューターによるモデル化の使用によって、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅについての可能性のある調節因子を同定するために試験することができる。この手順には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに対して可能性のある調節因子をコンピューターによってフィットさせて、可能性のある調節因子の形状および化学構造が、いかにうまくＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結合領域に結合するかを解明することが含まれ得る。コンピューターによるプログラムはまた、２つの結合パートナーの誘引、排斥、および立体障害を推定するためにも使用することができる。一般的には、よりきっちりとフィットすればするほど立体障害は少なく、引力はより大きくなり、可能性のある調節因子はより強力である。なぜなら、これらの特性は、より強力な結合定数と一致するからである。さらに、可能性のある薬物の設計において特異性が高ければ高いほど、薬物が他のタンパク質と十分には相互作用しないであろうという可能性がより高くなる。これによっては、他のタンパク質との望ましくない相互作用が原因で起こる可能性がある副次的な影響は最小となるであろう。
「コンピューターで読み取ることができる媒体」は、本明細書中で使用される場合は、コンピューターによって直接読み取り、アクセスすることができる任意の媒体を意味する。例えば、その結果、媒体は、上記のコンピューターシステムでの使用に適している。この媒体としては、磁気記録媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク記録媒体、および磁気テープなど；光学記録媒体、例えば光学ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなど；電気記録媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭなど；ならびに、これらのカテゴリーの複合型、例えば磁気／光学記録媒体などが挙げられるが、これらに限定はされない。
「コンピューターシステム」は、本明細書中で使用される場合は、原子座標データを分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記録手段を意味する。本発明のコンピューターをベースとするシステムの最小のハードウェア手段には、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記録手段が含まれる。望ましくは、モニターが、構造データを視覚化するために提供される。データ記録手段はＲＡＭである場合も、また、本発明のコンピューターで読み取ることができる媒体にアクセスするための手段である場合もある。そのようなシステムの例は、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴまたはＩＢＭ ＯＳ／２オペレーティングシステムをベースとする、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｓｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ｒｕｎｎｉｎｇ Ｕｎｉｘによって利用することができるマイクロコンピューターワークステーションである。
いくつかの実施形態は、ＧＴＰａｓｅ阻害因子の同定または設計方法に関する。これらの方法には、表１または表２のデータの少なくとも一部にアクセスする工程、および上記データを利用して１つ以上の化合物をモデル化する工程が含まれ得る。モデル化には、例えば、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧＴＰａｓｅ活性化部位との化合物の相互作用をモデル化することにより、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合する化合物の可能性を予測することが含まれ得る。この方法にはさらに、データを、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅとリガンドとの間での１つ以上の相互作用を同定するために利用することが含まれ得る。例えば相互作用として、リガンドとタンパク質との間での１つ以上の水素結合；リガンドとタンパク質の間での１つ以上の静電気的相互作用；１つ以上の疎水性相互作用；リガンドとタンパク質との間での１つ以上の共有結合；タンパク質原子の位置での１つ以上の変化；例えば、リガンド結合するアミノ酸側鎖；その位置が複合体の中で柔軟性を維持することができるものに対して十分に定義されている１つ以上の原子；１つ以上の水素結合ネットワーク；タンパク質／酵素の触媒機構に重要である１つ以上の相互作用；水素結合ネットワークまたはリガンドの存在下で起こる相互作用に対する１つ以上の構造変化；リガンドと、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性を妨害するかもしくは妨げるタンパク質との間での１つ以上の相互作用；リガンドと、集めたデータに基づくタンパク質との間での１つ以上の重要な相互作用力；タンパク質への結合を促進する既存のリガンドに対する１つ以上の修飾を挙げることができる。既存のリガンドに対する修飾としては、例えば静電気的相互作用のための力を付加すること、立体相互作用を低下させること、疎水性相互作用を増大させること、および相互作用の表面積を増大させることを挙げることができる。また、これらの方法には、上記の相互作用、または相互作用の改善を含めるための、化合物（単数または複数）のモデル化も含まれ得る。
いくつかの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化を妨げる化合物を同定することによる、阻害因子を設計する方法に関し、これには、表１または表２のデータにアクセスすることが含まれる場合も、また含まれない場合もある。通常、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化を妨げる化合物は、以下の機構の１つ以上によって作用する：Ｍｇ２＋のＴｈｒ３５結合を阻害する、アミノ酸残基６０〜６４が含まれているループの立体構造の変化を阻害する、Ａｌａ５９がＭｇ２＋を置換することを阻害する、ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣに結合することを阻害する、ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣから解離することを阻害する、スイッチＩのアミノ酸の中での立体構造の変化を阻害する、または、スイッチＩＩのアミノ酸の中での立体構造の変化を阻害する。
Ｒａｃ−１上のスイッチＩとスイッチＩＩの間の領域に結合することによってＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅを阻害する新規の化合物を設計することができる。いくつかの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を同定する方法に関する。この方法には、表１または表２の座標の１つ以上にアクセスする工程、および上記の表において、リガンド（ＤＲＧ）の原子座標の１つ以上の約５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、または１オングストローム以内の位置を占めている化合物を同定する工程が含まれる。例えば、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子は、表１または表２に提供されるようなアミノ酸Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３、ならびにＭｇ２＋イオンの原子座標の１つ以上から、約５から約２．５オングストローム、約４．５から約３オングストローム、約３．５から約２．６オングストローム、または約３．２から約２．６オングストロームの間の位置を占めている化合物として同定することができる。例えば、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子は、表１または表２に提供されるようなアミノ酸Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３、ならびにＭｇ２＋イオンの原子座標の１つ以上との、疎水性接触、ファンデルワールス接触、水素結合の形成、塩橋の形成、あるいは、他の物理的相互作用に関係している化合物として同定することができる。別の例においては、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子は、表１または表２のいずれかに提供されるようなアミノ酸Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３の原子座標の１つ以上から、約２から約１オングストローム、約１．７から約１．２オングストローム、または約１．６から約１．３オングストロームの間の位置を占めている化合物として同定することができる。例えば、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子は、表１または表２に提供されるようなアミノ酸Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３の原子座標の１つ以上に共有結合する化合物として同定することができる。この方法には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの原子と阻害因子の原子との間の距離を特定する工程、および阻害因子の原子を別の原子で、または官能基と置換して修飾された相互作用を生じさせる工程が含まれ得る。例えば、修飾された相互作用は、リガンドとＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅとの間の距離を短くすることができ、これによって、例えば、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合、または静電気的相互作用を可能とすることができる。したがって、いくつかの態様は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を同定する方法に関係し得る。この方法には、リガンドとＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅとの間での１つ以上の相互作用を同定する工程；およびリガンドとサブユニットの間での相互作用を修飾するために、リガンド上の置換基を変化させる工程が含まれる。それについての置換基を修飾することができる例示的なリガンドは、ＮＳＣ２３７６６である。
なおいくつかの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合する可能性が最も高い化合物を同定するために、１つ以上の化合物のセットをスクリーニングする方法に関する。この方法には、（ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧＴＰａｓｅ活性化部位中の、１つ以上の化合物のそれぞれについてのドッキングエネルギーをコンピューターによって決定する工程であって、ここでは、個々のそれぞれのドッキングエネルギーは、上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する上記化合物の結合の可能性を示す工程；および、（ｂ）上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する結合の可能性が最も高いことが示された１つ以上の化合物を選択する工程が含まれ得る。
また、いくつかの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性部位に結合する可能性がある化合物を同定する方法に関する。この方法には、（ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位の中での、１つ以上の化合物のそれぞれについてのドッキングエネルギーをコンピューターによって決定する工程であって、ここでは、個々のそれぞれのドッキングエネルギーは、上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する上記化合物の結合の可能性を示す工程；および、（ｂ）上記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する結合の可能性が最も高いことが示された１つ以上の化合物を選択する工程が含まれる。
いくつかの実施形態は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧＴＰａｓｅ活性を阻害するように、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合する化合物をスクリーニングする方法に関する。このような方法には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合する候補化合物の可能性を予想する工程が含まれ得る。例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのスイッチＩとスイッチＩＩの間に存在している領域である。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、スイッチＩの少なくとも１つのアミノ酸と、スイッチＩＩの少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸３０〜３９から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸５６〜７４から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、およびＡｓｐ３８から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲＡｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６およびＬｅｕ７０から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｌｅｕ７０、およびＳｅｒ７１から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、およびＬｅｕ７０から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、またはＡｓｐ３８から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７０から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。別の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択される少なくとも１つのアミノ酸と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択される少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。上記のような例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位にはまた、Ｍｇ２＋原子も含まれ得る。
タンパク質の特定の部位に結合する候補化合物の可能性を予想するための方法は当該分野では公知であり、これら公知の方法のうちで任意のものを、本明細書中に提供される技術に従って使用して、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化を阻害するようにＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合するそれらの能力について化合物を評価することができる。本明細書中で提供される場合は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性の阻害は、Ｍｇ２＋のＴｈｒ３５結合を阻害すること、アミノ酸残基６０〜６４が含まれているループの中での立体構造の変化を阻害すること、Ａｌａ５９がＭｇ２＋を置換することを阻害すること、ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣに結合することを阻害すること、ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣから解離することを阻害すること、スイッチＩのアミノ酸の中での立体構造の変化を阻害すること、またはスイッチＩＩのアミノ酸の中での立体構造の変化を阻害することによって、行うことができる。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの単独での、またはＮＳＣ２３７６６との複合体における三次元原子構造（表１または２を参照のこと）と、公知のモデル化方法を使用することによって、上記に記載されたような、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合するそれらの能力について候補化合物をスクリーニングすることができる。
Ｒａｃ−１ ＧＴＰ活性化部位に結合する可能性がある化合物の能力は、公知のドッキングプログラム、例えばＨａｍｍｅｒｈｅａｄ、ＦｌｅｘＸ、ＭＣＤＯＣＫ、ＩＣＭ−ｄｏｃｋ、ＱＸＰ、ＧＯＬＤ、ＣＨＡＲＭＭ、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、またはＡＵＴＯＤＯＣＫ、例えばＷａｌｔｅｒｓら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，第３巻、Ｎｏ．４（１９９８），１６０−１７８、およびＤｕｎｂｒａｃｋら、Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ，２，（１９９７），２７−４２を参照のこと）などを使用するコンピューターによるモデル化を使用することにより試験することができる。この手順には、上記に記載されるように、活性化部位の残基によって形成されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対して可能性のあるリガンドをコンピューターによってフィットさせて、可能性のあるリガンドの形状および化学構造が、いかにうまく対応する活性部位に適合するかを解明することが含まれ得る。当該分野で使用されるこのドッキング法は、任意の多種多様のアルゴリズムおよび最適化を使用して機能させることができるが、一般的には、これらの方法は、タンパク質の結合部位（例えば、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位）の中での化合物のフィットの良さを示すことによって機能する。フィットの良さは、例えば、タンパク質結合部位との化合物のドッキングエネルギーとして表すことができる。このような場合には、ドッキングエネルギーは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合する化合物の可能性についての定量的指標であり得る。ドッキングエネルギーなどのフィットの良さは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位への結合についての、可能性のあるリード化合物として候補化合物を評価するための便利な基準となり得る。例えば、２つ以上の化合物が、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合するそれらの能力についてモデル化される場合には、閾値またはカットオフを使用して、可能性のあるリード化合物としてさらに試験することができる２つ以上の化合物のサブセットを同定することができる。閾値は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰ活性化部位に対する結合の可能性が最も高い化合物についての示される割合であり得、この場合、そのような示される割合は、最高で１％、最高で２％、最高で３％、最高で４％、最高で５％、最高で６％、最高で７％、最高で８％、最高で９％、または最高で１０％であり得る。別の閾値は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の既知の結合因子に対する比較であり得る；例えば、閾値は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合するＮＳＣ２３７６６の能力に従って設定することができる。一例として、ＮＳＣ２３７６６よりも容易にＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合すると予想される化合物は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性を阻害すると予想される化合物として同定することができる。
いくつかの例示的なドッキング法において、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の説明が作成される。タンパク質結合部位についての様々なタイプの説明が当該分野では公知であり、例えば、結合部位の格子ベースでのフィールドの説明である。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の説明は、通常、結合部位中の原子の三次元座標に基づく。結合部位中の原子の三次元座標は、表１または表２から得ることができる。ここでは、表１または表２から選択される原子は、上記の例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の中の原子から選択される。これには通常、スイッチＩの少なくとも１つのアミノ酸と、スイッチＩＩの少なくとも１つのアミノ酸が含まれるであろう。別の例においては、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の説明には、ＮＳＣ２３７６６原子の位置から指定される距離の中にタンパク質原子が含まれ得る。ここでは、指定される距離は、表１および表２において利用することができる原子座標にしたがって決定されるように、例えば、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、または２０Åであり得る。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の説明にはまた、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の中で観察される任意の水分子が含まれ得る。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の中での水分子の存在は、表１または表２に提供される原子座標にしたがって決定することができる。含まれる原子の数、および使用される説明のタイプは、使用されるドッキング法、ならびに所望される精度対コンピューターの効率の程度にしたがって決定することができる。
Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の説明は、表１または表２に提供される原子座標にしたがって決定することができるが、当業者は、本発明の実施形態には、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の説明において原子の相対的な位置についての重要ではないバリエーションもまた含まれ得ることを理解するであろう。例えば、活性化部位の説明の原子と、表１または表２に提供される原子座標上の対応する原子の間にある標準偏差（ＲＭＳＤ）は、活性化部位の説明の全ての原子について計算された場合、あるいは、活性部位の説明に使用される原子のサブセットにしたがって計算された場合には、通常、６．０Å以下、５．５Å以下、５．０Å以下、４．５Å以下、４．０Å以下、３．５Å以下、３．０Å以下、２．５Å以下、２．０Å以下、１．７Å以下、１．５Å以下、１．４Å以下、１．３Å以下、１．２Å以下、１．１Å以下、１．０Å以下、０．９Å以下、０．８Å以下、０．７Å以下、０．６Å以下、０．５Å以下、０．４Å以下、０．３Å以下、０．２Å以下、または０．１Å以下であろう。原子のサブセットが、活性化部位の説明の原子と、表１または表２に提供される原子座標の対応する原子との間でのＲＭＳＤを計算するために使用される場合には、原子のサブセットは、通常、上記に記載された例示的なＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の中に提供されるものである。具体的には、ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の例示的なセットには、スイッチＩのアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、スイッチＩＩのアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、およびＡｓｐ３８から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６およびＬｅｕ７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｌｅｕ７０、およびＳｅｒ７１から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、およびＬｅｕ７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、またはＡｓｐ３８から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の原子の別の例示的なセットには、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる。上記のような、ＲＭＳＤの計算に使用されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位原子の別の例示的なセットには、Ｍｇ２＋原子もまた含まれ得る。上記ような例示的な原子のセットにおいては、原子は、選択されたアミノ酸のすべての原子から選択することができ、選択されたアミノ酸の骨格原子のみから選択することができ、または、選択されたアミノ酸のα炭素原子のみから選択することもできる。
表１および表２において、本明細書中に記載されるＸ線結晶構造によっては、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの不活性な形態であるＧＤＰ結合型の、これまでは知られていなかった三次元構造の原子座標が報告される。ＧＤＰ結合形態のこの三次元構造は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化に関与しているスイッチ機構または立体構造の変化を分子レベルで理解するために、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性な形態またはＧＴＰ結合形態（ＰＤＢ ＩＤ＃１ＭＨ１）と比較された。
いずれの構造についても、全てのＣαの重ね合わせ後に計算した標準偏差（ｒｍｓｄ）は、０．９５Åである。いずれの構造も、アミノ酸残基３０から４０にまたがるポリペプチドの外側まで十分に重ね合わさった。この領域は、通常、スイッチＩ領域と呼ばれる。２つの構造の間での別の主要な相違は、Ｍｇ２＋イオンが座標に配置される（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）方法である。Ｒａｓが含まれる他のＧＴＰ結合タンパク質と同様に、ＲａｃのＧＴＰ結合形態においては、Ｍｇ２＋イオンは、Ｔｈｒ３５のヒドロキシル側鎖によって座標に配置される。これはまた、γ−リン酸と水素結合を形成する。γ−リン酸がＲａｃのＧＤＰ結合形態の中には存在しないことにより、Ｔｈｒの立体構造の変化が生じ、ここでは、溶媒の中にＲａｃ／ＧＤＰが突き出る。このＴｈｒ３５の立体構造の変化によっては、ＲａｃのスイッチＩ領域の立体構造の変化が生じる。例えば、Ｐｒｏ２９のψ角は、２つの立体構造の間では１５０°異なる。以下の表３には、両方のＲａｃ−１構造の重ね合わせの後の、スイッチＩの残基についてのＣαの距離の変化が列挙される。
いくつかの例示的なドッキング法においては、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の中での化合物の立体構造が計算される。タンパク質結合部位の中でのリガンドの立体構造を計算するための様々な方法は、ドッキング法で知られている。これらには、活性部位の外側および内側の化合物の最適な立体構造（単数または複数）を決定することが含まれる。これらにはまた、原子が結合部位に適合する（立体的に、化学的に、電気的に、またはそれらの組み合わせで）ように、活性部位の中に原子を組み立てることが含まれ得る。任意のそのような方法は、本明細書中に提供されるドッキング法において行うことができる。
任意の様々な候補化合物を、本明細書中に提供されるモデル化方法において使用することができる。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合する候補化合物の能力を予想するための方法は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合する複数の化合物の能力を評価し、比較することにおいて、複数の候補化合物を試験するために使用することができる。多数の例示的な公共の、および市販されている化学構造のライブラリー、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＳＤ）、ＭＤＬ（ＵＳ）社によるＣｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＡＣＤ）、ＺＩＮＣ（Ｉｒｗｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｉｃｈｅｔ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．（２００５）４５：１７７−８２）、さらには、公的に入手することができる化合物についての様々な電子カタログ、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ，ＵＳ）カタログ、ＣｏｍＧｅｎｅｘカタログ（Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）、およびＡｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）などを利用することができる。そのようなライブラリーは、本明細書中に記載されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位と相互作用する能力を有しているものを同定するために、多くの化合物のコンピューターに基づくドッキングを可能にするために使用することができる。
いくつかの場合において、候補化合物が、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位との相互作用によるＲＡＣ特異的ＧＥＦタンパク質の接近をブロックする可能性があるかどうかを決定することができる方法を使用することができる。以下の理論に限定されることは意図されないが、本発明での観察に基づいて、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅをＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位のＲＡＣ特異的ＧＥＦの結合によって活性化させることができ、したがって、化合物によるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対するＲＡＣ特異的ＧＥＦの接近をブロックすることによって、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの阻害活性を増大させることができると主張される。タンパク質−タンパク質相互作用をブロックする可能性を予想するための方法、例えばタンパク質−タンパク質相互作用の立体的遮断の決定などは当該分野で公知であり、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターによるモデル化方法、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターを使った手作業による試験方法、あるいは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の結合についての候補化合物の手作業によるモデル化および設計と組み合わせて使用することができる。
いくつかの場合において、候補化合物がＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位からのＲＡＣ特異的ＧＥＦタンパク質の解離をブロックする可能性があるかどうかの決定を行うことができる方法を使用することができる。以下の理論に限定されることは意図されないが、本発明での観察に基づいて、Ｒａｃ−１からＧＥＦが解離するまでは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位へのＧＥＦの結合によって、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅは完全には活性化されず、したがって、化合物によるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位からのＧＥＦの解離をブロックすることにより、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害活性を増大させることができると主張される。タンパク質−タンパク質相互作用を促進するする可能性を予想するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターによるモデル化方法、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターを使った手作業による試験方法、あるいは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の結合についての候補化合物の手作業によるモデル化および設計と組み合わせて使用することができる。
いくつかの場合において、候補化合物がＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５のＭｇ２＋への結合を阻害する可能性があるかどうかを決定することができる方法を使用することができる。以下の理論に限定されることは意図されないが、本発明での観察に基づいて、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化には、Ｔｈｒ３５のＭｇ２＋に対する結合が含まれること、したがって、化合物によってＭｇ２＋に対するＴｈｒ３５の結合をブロックすることにより、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害活性を増大させることができると主張される。アミノ酸−イオン相互作用をブロックする可能性を予想するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターによるモデル化方法、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターを使った手作業による試験方法、あるいは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の結合についての候補化合物の手作業によるモデル化および設計と組み合わせて使用することができる。
いくつかの場合において、候補化合物は、アミノ酸残基６０〜６４が含まれているループの中での立体構造の変化を阻害する可能性があるかどうかを決定することができる方法を使用することができる。以下の理論に限定されることは意図されないが、本発明での観察に基づいて、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化には、アミノ酸残基６０〜６４が含まれているループの中での立体構造の変化が含まれ、したがって、化合物によってそのような立体構造の変化をブロックすることにより、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの阻害活性を増大させることができると主張される。タンパク質構造エレメントの立体構造変化の可能性を予想するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターによるモデル化方法、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターを使った手作業による試験方法、あるいは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の結合についての候補化合物の手作業によるモデル化および設計と組み合わせて使用することができる。
いくつかの場合において、候補化合物が、Ａｌａ５９がＭｇ２＋を置換することを阻害する可能性があるかどうかを決定することができる方法を使用することができる。以下の理論に限定されることは意図されないが、本発明での観察に基づいて、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化には、Ａｌａ５９が、ＧＤＰをＧＴＰで交換する際にＭｇ２＋を置換することが含まれ、したがって、化合物によってＡｌａ５９がＭｇ２＋を置換することをブロックすることにより、ＧＤＰからＧＴＰへの交換の阻害を増大させることによって化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの阻害活性を増大させることができると主張される。アミノ酸−イオン相互作用をブロックする可能性を予想するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターによるモデル化方法、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターを使った手作業による試験方法、あるいは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の結合についての候補化合物の手作業によるモデル化および設計と組み合わせて使用することができる。
いくつかの場合において、候補化合物が、スイッチＩのアミノ酸、具体的には配列番号１のアミノ酸３０〜３９、例えば、アミノ酸Ｇｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、およびＡｓｐ３８の中での立体構造の変化を阻害する可能性があるかどうかを決定することができる方法を使用することができる。以下の理論に限定されることは意図されないが、本発明での観察に基づいて、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化には、スイッチＩのアミノ酸の中での立体構造の変化が含まれ、したがって、化合物によってそのような立体構造の変化をブロックすることにより、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの阻害活性を増大させることができると主張される。タンパク質構造エレメントの立体構造変化の可能性を予想するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターによるモデル化方法、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターを使った手作業による試験方法、あるいは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の結合についての候補化合物の手作業によるモデル化および設計と組み合わせて使用することができる。
いくつかの場合において、候補化合物が、スイッチＩＩのアミノ酸の中での立体構造の変化を阻害する可能性があるかどうかを決定することができる方法を使用することができる。以下の理論に限定されることは意図されないが、本発明での観察に基づいて、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化には、スイッチＩＩのアミノ酸の中でのわずかな立体構造の変化が含まれ、したがって、化合物によってそのような立体構造の変化をブロックすることにより、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの阻害活性を増大させることができると主張される。タンパク質構造エレメントの立体構造変化の可能性を予想するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターによるモデル化方法、本明細書中に提供されるかもしくは当該分野で公知であるコンピューターを使った手作業による試験方法、あるいは、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の結合についての候補化合物の手作業によるモデル化および設計と組み合わせて使用することができる。
また、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位のコンピューターを使った手作業による試験が行われる場合もある。ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，（１９８５），８４９−８５７）−様々な官能基を有している分子とタンパク質表面との間での可能性のある相互作用を決定するプログラム−のようなプログラムの使用もまた、その部位についてのリガンドの部分的な構造を予想するために、結合部位を分析するために使用される場合がある。コンピューターによるプログラムは、候補化合物と本明細書中に記載されるＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位の誘引、排斥、および立体障害を推定するためにも使用することができる。一般的には、よりきっちりとフィットすればするほど立体障害は少なく、引力はより大きくなり、可能性のある調節因子はより強力である。なぜなら、これらの特性は、より強力な結合定数と一致するからである。さらに、可能性のあるリガンドの設計において特異性が高ければ高いほど、リガンドが他のタンパク質と十分には相互作用しないであろうという可能性がより高くなる。これによっては、他のタンパク質との望ましくない相互作用が原因で起こる可能性がある副次的な影響は最小となる傾向があるであろう。
可能性のある結合化合物が設計または選択されると、次いで、これらを活性についてスクリーニングすることができる。結合化合物をスクリーニングするための例示的な方法は本明細書中に提供され、これには、Ｍａｃｈｅｒｌａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５、および「［３．２．０］複素環式化合物およびそのアナログを用いる方法」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ［３．２．０］ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）と題された、２００４年６月１８日に提出された米国特許公開番号２００５／００４９２９４が含まれるが、これに限定はされない。これらはいずれも、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。結果として、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合すると予想された候補化合物を評価する方法もまた、本明細書中に提供される。ここでは、この方法には、上記の方法にしたがってＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に結合すると予想された候補化合物を提供する工程、およびＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅまたはその断片を候補化合物と接触させる工程、および候補化合物がＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅまたはその断片に結合したかどうかを決定する工程が含まれる。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性を阻害すると予想された候補化合物を評価する方法もまた、本明細書中に提供される。ここでは、この方法には、上記の方法にしたがってＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合すると予想された候補化合物を提供する工程、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅを候補化合物と接触させる工程、および候補化合物がＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性を阻害するかどうかを決定する工程が含まれる。
本明細書中に記載されるＮＳＣ２３７６６分子は、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子の新規のクラスに属し、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化を妨げることによって作用する。Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと複合体を形成するＮＳＣ２３７６６の共晶構造により、ＮＳＣ２３７６６が、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのスイッチＩの残基であるＶａｌ３６、ならびに、スイッチＩＩの残基であるＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３と、多数のファンデルワールス相互作用を形成することができることが明らかである。水素結合には、Ｌｅｕ７０のカルボニルと、Ｓｅｒ７１の側鎖酸素が関係していることが明らかにされた。Ｌｅｕ６７のカルボニル、Ｇｌｎ７４の側鎖、Ａｓｐ５７のカルボニル、およびＳｅｒ７１のカルボニルが関係している、さらなる可能性のある水素結合が同定された。
これらの観察に基づいて、改良された阻害因子を、Ｌｅｕ７０のカルボニル、Ｓｅｒ７１の側鎖酸素、Ｌｅｕ６７のカルボニル、Ｇｌｎ７４の側鎖、Ａｓｐ５７のカルボニル、およびＳｅｒ７１のカルボニルと水素結合することができる部分の立体構造を有するように、ＮＳＣ２３７６６に付加するか、あるいはＮＳＣ２３７６６を修飾することによって作成することができる。ＮＳＣ２３７６６が結合していないＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶構造においては、ＤＭＳＯ分子がＡｌａ５９のアミド主鎖基と特異的に相互作用していることもまた観察された。したがって、ＮＳＣ２３７６６へのさらなる付加または修飾には、Ａｌａ５９のアミド主鎖基と水素結合することができる部分が含まれ得る。水素結合ドナーとして付加させることができる例示的な部分としては、アミン、アミド、およびヒドロキシル部分が挙げられ、水素結合のアクセプターとして付加させることができる例示的な部分としては、ヒドロキシル、カルボニル、およびエーテル部分が挙げられる。
さらに、共晶の観察に関しては、改良された阻害因子を、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのスイッチＩの残基であるＶａｌ３６、ならびに、スイッチＩＩの残基であるＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３とのファンデルワールス相互作用ならびに／あるいは疎水性相互作用が改善されている部分の立体構造を有するように、ＮＳＣ２３７６６に対して付加させること、またはＮＳＣ２３７６６を修飾することによって作成することができる。付加させることができる例示的な疎水性部分としては、アルキル部分、置換されたアルキル部分、アリール部分、および置換されたアリール部分が挙げられる。
Ｒａｓスーパーファミリーのメンバー、好ましくは、ＲａｃのＧＴＰａｓｅ活性に影響を与える方法および組成物、そのような組成物には、ＧＴＰａｓｅ活性を調節する化合物が含まれ、加えて、Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅを認識する化合物をスクリーニングする工程が含まれる化合物の使用、ならびにＲａｃが含まれるＲａｓスーパーファミリーのＧＴＰａｓｅに関連しているかまたは関係する生理学的症状を処置する方法が記載される。別の実施形態には、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、およびＲａｃ３からなる群より選択されるＲｈｏ ＧＴＰａｓｅに対する結合が含まれる。好ましくは、別の実施形態には、Ｒａｃ１であるＲｈｏ ＧＴＰａｓｅに対する結合が含まれる。好ましい実施形態はまた、そのような化合物またはその誘導体を、例えば、治療用ツール、診断用ツール、および研究用ツールとして使用する方法にも関する。
Ｒａｓスーパーファミリーのメンバー、好ましくは、ＲａｃのＧＴＰａｓｅ活性に影響を与える方法および組成物が記載される。そのような組成物には、ＧＴＰａｓｅ活性を調節する化合物が含まれる。好ましくは、ＧＴＰａｓｅ活性が関係している適応症は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、脳虚血、脳血管痙攣、神経変性、脊髄損傷、乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、脳腫瘍、または肺ガン、血栓疾患、喘息、緑内障、骨粗鬆症、および勃起不全からなる群より選択される。
好ましい実施形態はまた、Ｒａｃを調節する物質を試験するおよび／または同定するための方法にも関する。これは、Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅの作用を調節するＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅ調節活性のある化合物の能力に対するそれらの効果を測定することによる。
本明細書中で使用される場合は、用語「ＲａｓまたはＲａｓスーパーファミリーのタンパク質」には、ＧＴＰに結合する／ＧＴＰを加水分解する単量体タンパク質の大きなファミリーが含まれる。Ｒａｓファミリーには、ＧＴＰａｓｅのＲａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、Ａｒｆ、およびＲａｎサブファミリーが含まれる。
用語「Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ」または「ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅ」はＲａｓスーパーファミリーのサブファミリーを意味し、これは、ＧＴＰに結合し、これを加水分解することによって作用する、低分子である膜結合型のＲａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質である。Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅは分子スイッチとして機能して、不活性なＧＤＰ結合型の立体構造と、活性のあるＧＴＰ結合型の立体構造の間を循環している。これには、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、ＴＣ１０、ＲｈｏＧ、ＲｈｏＤ、Ｃｈｐ、ＷＲＣＨ１、ＴＣＬ、およびＲＩＦが含まれる。
Ｒａｓ関連タンパク質のタンパク質またはポリペプチド配列には、天然のもの、合成のもの、半合成のもの、または組み換え体を問わず任意の供給源に由来する、具体的には、哺乳動物であり、これには、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマが含まれ、好ましくはヒトである任意の種に由来するそのバリアントまたは断片が含まれる。
用語「Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅ」あるいは「Ｒａｃタンパク質またはポリペプチド」は、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、および／またはＲａｃ３を意味する。
１つの実施形態は、ガンを有している被験体に対して、本明細書中で定義されるＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅ調節活性のある化合物の有効量を投与することにより、ガン細胞の増殖を減少させるための方法が提供される。
別の実施形態は、異常な細胞増殖に関連する疾患処置用の医薬組成物の調製用に、本明細書中で定義されるＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅ調節活性のある化合物の有効量の使用が提供される。
それらの細胞増殖阻害活性の理由から、好ましい実施形態の化合物は、様々な症状の様々な疾患を処置するために適している。これに関して、「処置」または「処置する」には、治療的処置と予防的処置の両方が含まれる。したがって、これらの化合物は、疾患の極めて初期段階で、または早い段階の発症の前に、または転移を含む有意な進行後にも使用することができる。用語「処置」または「処置する」は、具体的には、患者の負担の軽減、例えば、細胞増殖速度の低下、罹患している増殖性細胞の破壊、腫瘍塊または腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の進行の遅延、ならびに完全な腫瘍の抑制を示す。
異常な細胞増殖が関係している疾患の典型的な例としては、例えば、ガンおよび再狭窄が挙げられる。好ましい実施形態の化合物は、ガン、例えば固形腫瘍またはリンパ系腫瘍などの処置に特に適している。具体的な例としては、白血病、前立腺ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、肺ガン、乳ガン、肝臓ガン、頭頸部ガン、結腸ガン、膀胱ガン、非ホジキンリンパ腫、および黒色腫が挙げられる。
好ましい実施形態の活性のある化合物は、様々な経路にしたがって投与することができるが、通常は、注射、例えば局所注射または全身的な注射（単数または複数）などによって投与することができる。腫瘍内注射は、既存のガンを処置するために好ましい。しかし、他の投与経路、例えば筋肉内、静脈内、皮内、皮下などを同様に使用することができる。さらに、注射を必要に応じて繰り返して行うことができるが、化合物の効力の観点から、注射が制限されることが必要であろうと考えられる。
薬理学的に許容される形態における複合体の安全であり有効な量が患者に投与される場合には、そのような標的細胞は、動物またはヒト患者の中に配置させることができると意図される。一般的には、好ましい実施態様の有用な医薬組成物には、選択された活性のある化合物の誘導体が適量で、例えば、約０．００１％から約１０％（ｗ／ｗ）で含まれ、これは、薬理学的または生理学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水などの中に希釈される。そのような状況下で患者または動物に投与される投与経路と最終的な物質の量は、意図される用途に応じて様々であり、以下の実施例を考慮して当業者に明らかであろう。
選択される任意の組成物は、細胞に対する毒性が低いか、または非毒性でなければならない。任意の所定の化合物についての毒性は、使用される化合物の濃度によって変化し得る。選択される化合物が体によって代謝されるかまたは排泄されるかどうか、およびこの代謝または排泄が、害を及ぼすほどには毒性ではない様式で行われるかどうかもまた有益である。
本実施例は、本明細書中で主張される方法において使用される化合物のタイプの説明である。リストは排他的ではない。特許請求の範囲の基準に適合する上記化合物の誘導体もまた、活性のある化合物が選択される場合には考慮されることが好ましい。
化合物は、化合物の治療有効濃度が体の罹患している細胞と接触するように投与されることが好ましい。好ましい実施形態の状況において動物、特にヒトに投与される用量は、合理的な時間の間、動物の治療応答に影響を与えるために十分であることが好ましい。用量は、使用される特定の化合物の強さ、および動物の症状、ならびに、処置される動物の体重によって決定されるであろう。特定の化合物の投与に付随する可能性がある何らかの有害な副作用の存在、性質、および程度によってもまた、特定の患者に使用される用量の大きさ、および特定の投与経路が決定されるであろう。一般的には、好ましい実施形態の化合物は、低用量で治療的に有効である。一般的に有用な用量範囲は、約０．００１ｍＭ以下から約１００ｍＭ以上である。好ましくは、有効量の範囲は、約０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９ｍＭから、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍＭまでである。したがって、化合物は、一般的には低用量で投与されるであろう。
化合物は、薬学的に許容される担体の中で投与することができる。薬学的に許容される担体は当業者には周知である。担体の選択は、特定の化合物によって、さらには、組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定されるであろう。したがって、好ましい実施形態の医薬組成物には、多種多様の適切な製剤が存在する。
化合物は、経口で、局所に、非経口で、吸入または噴霧によって、膣に、直腸に、または舌下に、単位用量製剤で投与することができる。用語「注射による投与」には、静脈内注射、関節内注射、筋肉内注射、皮下注射、および非経口注射、ならびに注入技術の使用が含まれるが、これらに限定はされない。皮膚への投与には、局所塗布または経皮投与が含まれ得る。１つ以上の化合物を、１つ以上の非毒性の薬学的に許容される担体、および所望される場合には他の有効成分と組み合わせて、存在させることができる。
経口での使用のために意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該分野で公知の任意の適切な方法にしたがって調製することができる。そのような組成物には、希釈剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤からなる群より選択される１つ以上の物質を、口当たりのよい調製物を提供するために含めることができる。錠剤には、錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された有効成分が含まれる。これらの賦形剤は、例えば不活性な希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど；造粒剤および崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸など；および結合剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどであり得る。錠剤はコーティングされないままとすることができ、またこれらは、消化管の中での崩壊および吸収を遅らせる公知の技術によってコーティングすることもでき、それによって、より長い時間にわたる持続的な作用が提供される。例えば、時間遅延材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどを使用することができる。これらの化合物はまた、固体の迅速に放出される形態に調製することもできる。
経口での使用のための製剤はまた、有効成分が不活性な固体の希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどと混合される硬ゼラチンカプセルとして、あるいは、有効成分が水または油性の媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油などと混合される軟ゼラチンカプセルとして提示することもできる。
水性懸濁液の製造に適している賦形剤と混合された活性のある物質が含まれている水性懸濁液もまた使用することができる。このような賦形剤は、懸濁剤であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアカシアゴムである；分散剤または湿潤剤は、天然のホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキサイドの脂肪酸との縮合産物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレンなど、またはエチレンオキサイドの長鎖脂肪族アルコールアルコールとの縮合産物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなど、または脂肪酸に由来する部分的なエステルとヘキシトールとのエチレンオキサイドの縮合産物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなど、または脂肪酸に由来する部分的なエステルとヘキシトール無水物とのエチレンオキサイドの縮合産物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタンなどであり得る。水性懸濁液にはまた、１種類以上の保存剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸、１つ以上の着色剤、１種類以上の香味剤、および１種類以上の甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンなども含めることができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適している、分散させることができる粉末および顆粒によって、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤、および１種類以上の保存剤と混合させられた有効成分が提供される。適切な分散剤もしくは湿潤剤、および懸濁剤は、すでに上記に記載されたものによって例示される。さらに別の賦形剤、例えば甘味剤、香味剤、および着色剤などもまた、存在し得る。
化合物はまた、非水性の液体製剤、例えば植物性油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはピーナッツ油など、または鉱油、例えば液体パラフィンなどの中に有効成分を懸濁させることによって製剤化することができる油性懸濁液などの形態とすることもできる。油性懸濁液には、増粘剤、例えば蜜ロウ、硬パラフィン、またはセチルアルコールなどを含めることができる。甘味剤、例えば、上記のものなど、および香味剤を添加して、口当たりのよい経口用調製物を提供することができる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸などの添加によって保存することができる。
好ましい実施形態の化合物はまた、当業者に公知の方法を使用して経皮的に投与することもできる。例えば、状況に応じて浸透促進剤が含まれている、適切な揮発性溶媒中の有効成分の溶液または懸濁液は、当業者に公知のさらに別の添加物、例えば、マトリックス材料および殺菌剤と混合することができる。滅菌後、得られた混合物は、投与形態になるように、公知の手順にしたがって製剤化することができる。加えて、乳化剤および水での処理の際には、有効成分の溶液または懸濁液を、ローション剤または軟膏となるように製剤化することができる。
経皮送達システムを処理するための適切な溶媒は当業者に公知であり、これには、低級アルコール、例えばエタノールまたはイソプロピルアルコールなど、低級ケトン、例えばアセトン）など、低級カルボン酸エステル、例えば酢酸エチルなど、極性エーテル、例えばテトラヒドロフランなど、低級炭化水素、例えばヘキサン、シクロヘキサン、またはベンゼンなど、あるいはハロゲン化炭化水素、例えばジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロトリフルオロエタン、またはトリクロロフルオロエタンなどが含まれる。適切な溶媒にはまた、低級アルコール、低級ケトン、低級カルボン酸エステル、極性エーテル、低級炭化水素、ハロゲン化炭化水素から選択される１種類以上の物質の混合物が含まれ得る。
経皮送達システムについての適切な浸透促進物質は当業者に公知であり、これには例えば、モノヒドロキシアルコールまたはポリヒドロキシアルコール、例えばエタノール、プロピレングリコール、もしくはベンジルアルコールなど、飽和または不飽和Ｃ８〜Ｃ１８脂肪族アルコール、例えばラウリルアルコールもしくはセチルアルコールなど、飽和または不飽和Ｃ８〜Ｃ１８脂肪酸、例えば、ステアリン酸など、２４個までの炭素が含まれている飽和または不飽和脂肪酸エステル、例えば酢酸、カプロン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、もしくはパルミチン酸の、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはモノグリセリンエステルなど、あるいは合計で約２４個までの炭素が含まれている飽和または不飽和ジカルボン酸のジエステル、例えば、アジピン酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソブチル、セバシン酸ジイソプロピル、マレイン酸ジイソプロピル、またはフマル酸ジイソプロピルが含まれる。さらに別の浸透を促進する物質としては、ホスファチジル誘導体、例えばレシチンまたはセファリンなど、テルペン、アミド、ケトン、尿素およびそれらの誘導体、ならびに、エーテル、例えばジメチルイソソルビドおよびジエチレングリコールモノエチルエーテルなどが挙げられる。浸透を促進する適切な製剤にはまた、モノヒドロキシもしくはポリヒドロキシアルコール、飽和もしくは不飽和Ｃ８〜Ｃ１８脂肪族アルコール、飽和もしくは不飽和Ｃ８〜Ｃ１８脂肪酸、２４個までの炭素が含まれている飽和もしくは不飽和脂肪酸エステル、合計で２４個までの炭素が含まれている飽和もしくは不飽和ジカルボン酸のジエステル、ホスファチジル誘導体、テルペン、アミド、ケトン、尿素およびそれらの誘導体、ならびにエーテルから選択される１種類以上の物質の混合物も含まれ得る。
経皮送達システムに適している結合物質は当業者に公知であり、これには、ポリアクリレート、シリコン、ポリウレタン、ブロックポリマー、スチレンブタジエンコポリマー、ならびに、天然ゴムおよび合成ゴムが含まれる。セルロースエーテル、誘導されたポリエチレン、およびケイ酸塩もまた、マトリックス成分として使用することができる。さらに別の添加剤、例えばビスコース樹脂または油などを、マトリックスの粘性を高めるために添加することができる。
好ましい実施形態の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態とすることもできる。油相は、植物性油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油など、または鉱油、例えば液体パラフィンなど、あるいはそれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然ゴム、例えばアカシアゴムまたはトラガカントガム、天然のホスファチド、例えばダイズ豆、レシチン、および脂肪酸に由来するエステルもしくは部分的なエステルなど、およびヘキシトール無水物、例えば、モノオレイン酸ソルビタンなど、ならびに、エチレンオキサイドとの上記の部分的なエステルと縮合産物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどであり得る。エマルジョンにはまた、甘味剤および香味剤が含まれ得る。シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはスクロースなどを用いて製剤化することができる。そのような製剤はまた、鎮痛剤、保存剤、ならびに、香味剤および着色剤を含めることができる。
化合物はまた、直腸用の坐剤の形態、または、薬剤の膣投与で投与することもできる。これらの組成物は、薬物を、適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができる。賦形剤は、常温では固体であるが、直腸温度または膣温度では液体であり、したがって、直腸または膣の中で溶解して薬物を放出する。そのような物質としては、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
有効成分について本明細書中で開示される使用の全てのレジメンについて、毎日の経口投与レジメンは、全体重の約０．０１から約２００ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。好ましくは、毎日の経口投与レジメンは、全体重の約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、または５から約１０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、および非経口注射が含まれる注射による投与、および注入技術の使用についての一日量は、全体重の０．０１から２００ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。好ましくは、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、および非経口注射が含まれる注射による投与、および注入技術の使用についての一日量は、全体重の約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、または５から約１０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。毎日の膣への投与レジメンは、全体重の０．０１から２００ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。毎日の局所投与レジメンは、１日に１回から４回で投与される、０．０１から２００ｍｇが好ましいであろう。膣投与および局所投与についての濃度は、０．１から２００ｍｇ／Ｋｇの一日量を維持するために必要な濃度であることが好ましいであろう。好ましくは、毎日の経口投与レジメンは、全体重の約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、または５から約１０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。毎日の吸入による投与レジメンは、全体重の０．０１から１０ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。好ましくは、全体重の毎日の吸入による投与レジメンは、約０．０１、０．０５、０．１、０．５から約１、２、３、４、５、または１０ｍｇ／Ｋｇが好ましいであろう。
特定の投与方法が様々な要因に応じて変化するであろうことは、当業者に明らかであろう。これらの全ては、治療薬を投与する際に日常的に考慮される。しかし、任意の所定の患者についての特異的な用量レベルが様々な要因に応じて変化し、これには、使用される特異的な化合物の活性、患者の年齢、患者の体重、患者の全体的な健康状態、患者の性別、患者の食事療法、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の併用、および治療を受ける症状の重篤度が含まれることもまた、理解されるであろう。定義された日数の間投与される、最適な処置の経過、すなわち処置の態様、および有効成分もしくは薬学的に許容されるその塩の１日の投与回数を、通常の処置試験を使用して当業者が確認できることは、当業者にはさらに明らかであろう。
好ましい実施形態の別の態様は、ＧＴＰａｓｅが関係している生物学的経路、特に病理学的症状、例えば細胞増殖（例えば、ガン）、増殖の制御、形態形成、ストレス・ファイバーの形成、およびインテグリンによって媒介される相互作用、例えば胚発生、腫瘍細胞の増殖、および転移など、プログラムされた細胞死、ホメオスタシス、白血球のホーミングおよび活性化、骨吸収、血餅退縮、ならびに機械的ストレスに対する細胞の応答などの調節に関係する。したがって、好ましい実施形態は、Ｒａｃポリペプチドの活性を調節する方法の全ての態様に関する。この方法には、有効量の有効成分、Ｒａｃポリペプチドの活性を調節する化合物の有効量、またはその組み合わせを投与する工程が含まれる。調節されるＲａｃの活性としては、ＧＴＰの結合、ＧＤＰの結合、ＧＥＦの結合、ＧＴＰａｓｅ活性、インテグリンの結合、受容体もしくはエフェクター様分子（例えば、インテグリン、成長因子受容体、チロシンキナーゼ、ＰＩ−３Ｋ、ＰＩＰ−５Ｋなど）へのＲａｃのカップリングまたは結合を挙げることができる。Ｒａｃを増加させること、減少させること、アンタゴナイズすること、または促進することにより、活性を調節することができる。Ｒａｃの調節は、ＧＴＰの加水分解、Ｒａｃ−ＧＥＦへの結合についてのアッセイなどによって測定することができる。有効量は、投与されるとＲａｃ活性を調節する任意の量である。活性は、細胞、組織、生物体全体において、インサイチュで、インビトロで（試験管内で、固体支持体上で、など）、インビボで、あるいは任意の所望される環境下で調節することができる。
有効成分またはその誘導体による腫瘍形成性の形質転換活性の調節は、様々な公知の手順にしたがって測定することができる。化合物は、有効成分の腫瘍形成性の形質転換活性に対するその効果を決定するために、該方法の間の任意の時点（例えば、細胞の前処理の間；ＧＥＦの添加後など）で添加することができる。様々な細胞株もまた使用することができる。
Ｒａｃによって媒介されるシグナル伝達についての他のアッセイは、例えば、米国特許第５，１４１，８５１号；同第５，４２０，３３４号；同第５，４３６，１２８号；および同第５，４８２，９５４号に記載されている手順のような、当該分野で公知の手順にしたがって行うことができる。これらの全ては、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。加えて、相互作用、例えば有効成分とＧタンパク質との間での結合を阻害するペプチド、例えば、Ｒａｃなどを同定することができる。
好ましい実施形態はまた、ＲａｃＧＴＰａｓｅまたはその生物学的に活性な断片の活性を調節するか、あるいは、有効成分またはその生物学的に活性な断片と、それに結合するＧＴＰａｓｅまたはその生物学的に活性な断片との間での結合を調節する物質を試験し、同定する方法にも関する。この方法には、有効成分とＲａｃ ＧＴＰａｓｅを、試験される物質と接触させる工程、およびその後、有効成分とＧＴＰａｓｅとの間での結合の存在もしくは量、または有効成分の活性を検出する工程が含まれる。
調節によって、物質の添加が活性または結合に影響を与えることを意味する。結合または活性の調節は、様々な方法で影響を受け得、これには、それを阻害すること、ブロックすること、妨げること、増加させること、増強させること、または促進することが含まれる。結合または活性の影響は、例えば、競合的である場合、非競合的である場合、アロステリックである場合、立体的に妨害される場合、物質とＧＥＦもしくはＧＴＰａｓｅとの間での架橋による場合であり得る特異的な方法によって行われる必要はない。物質は、有効成分またはＧＴＰのいずれかに対して作用することができる。物質は、アゴニストであっても、アンタゴニストであっても、また、部分的なアゴニストもしくはアンタゴニストであってもよい。結合の存在または量は、様々な方法において、例えばグアニンヌクレオチド交換、ＧＴＰ加水分解、腫瘍形成性の形質転換など、例えば有効成分によって促進されるかまたは阻害される活性についてアッセイすることによって、例えば直接または間接的に決定することができる。このようなアッセイは上記および下記に記載され、当該分野でも公知である。物質は、天然および合成が含まれる様々な供給源から得ることができ、および／また調製することができる。これには、例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物、有機分子、核酸、無機分子、またはそれらの混合物が含まれ得る。
物質は、同時に添加することができ、また、連続して添加することもできる。例えば、物質を有効成分に添加することができ、その後、得られた混合物を、さらにＧＴＰａｓｅと混合することができる。この方法は、単離された成分に対して液体の中で、マトリックス（例えば、濾紙、ニトロセルロース、アガロース）上で、細胞内で、組織切片上などで行うことができる。
この方法はさらに、上記の方法にしたがって同定されている物質を得るまたは生産することに関する。好ましい実施形態はまた、そのような方法にしたがって同定された産物にも関する。
したがって、好ましい実施形態はまた、Ｒａｃによって媒介されるシグナル伝達が関係している疾患および病理学的症状、例えばガン、異常な細胞増殖が関係している疾患などの処置および予防にも関する。例えば、好ましい実施形態は、ガンを処置する方法に関する。この方法には、処置が必要な被験体に対して、疾患を処置するために有効な化合物の量を投与する工程が含まれる。この場合、化合物は有効成分である、疾患の処置は、その発症を遅らせること、疾患の進行を遅らせること、疾患の臨床的および病理学的兆候を改善する、または遅らせることを意味し得る。同様に、この方法はまた、炎症、および／または好中球の化学走化能力が関係している疾患を処置することにも関する。調節因子化合物、または化合物の混合物は、合成のものであっても、自然界に存在しているものであっても、また組み合わせであってもよい。調節因子化合物には、アミノ酸、ヌクレオチド、炭化水素、脂質、多糖類などが含まれ得る。調節因子化合物は、好ましくは、Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅの調節因子である。疾患を処置するためには、化合物または混合物は、当業者に明らかであるような薬学的に許容される担体および他の賦形剤が含まれている医薬組成物となるように、製剤化することができる。そのような組成物には、特にガンの治療のために、有効量の他の化合物をさらに含めることができる。
これらのデータに基づき、１つの実施形態は、腫瘍の処置のための改良された方法である。この方法には、薬学的に有効な量の有効成分またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル、有効成分のアナログ、またはそれらの薬学的に供される塩もしくはエステル、あるいはそれらの組み合わせを投与する工程が含まれる。
記載される組成物および調製物には、好ましくは、少なくとも０．１％の有効成分が含まれる。組成物および調製物の割合は、もちろん様々であり得、これには、投与される量の約２重量％から６０重量％が含まれ得る。好ましくは、組成物および調製物の割合には、投与される量の約２、５、１０、または１５重量％から、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０重量％が含まれ得る。そのような薬学的に有用な組成物および調製物の中の活性のある化合物の量は、適切な投与量が得られる量である。
有効成分は塩を形成し、これもまた、好ましい実施形態の範囲に含まれる。本明細書中での有効成分の化合物との言及には、他で明記されない限りは、その塩についての言及も含まれると理解される。用語「塩（単数または複数）」は、本明細書中で使用される場合は、無機および／または有機酸および塩基を用いて形成させられた、酸性の塩および／または塩基性の塩を示す。加えて、有効成分に、例えば、アミンまたはピリジン、またはイミダゾール環であるが、これらに限定はされない塩基性部分と、例えば、カルボン酸であるが、これに限定はされない酸性部分の両方が含まれる場合は、両性イオン（「内塩」）を形成させることができ、これは、本明細書中で使用される場合は用語「塩（単数または複数）」に含まれる。薬学的に許容される（すなわち、非毒性の生理学的に許容される）塩が好ましいが、他の塩もまた、例えば、調製の間に使用され得る単離または精製工程において有用である。有効成分の化合物の塩は、例えば、有効成分の化合物を一定量、例えば等量の酸または塩基と、その中で塩が沈殿する媒体の中、または後に凍結乾燥が行われる水性媒体の中で反応させることによって形成させることができる。
例えば、アミン、またはピリミジン、またはイミダゾール環であるが、これらに限定はされない塩基性部分が含まれている有効成分は、様々な有機酸および無機酸とともに塩を形成することができる。例示的な酸付加塩としては、酢酸塩、例えば酢酸またはトリハロ酢酸、例えばトリフルオロ酢酸などと共に形成させられたもの、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸を用いて形成されたもの）、臭化水素酸塩（臭化水素を用いて形成されたもの）、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸を用いて形成されたもの）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸を用いて形成されたもの）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（例えば、硫酸を用いて形成させられたもの）、スルホン酸塩（例えば、本明細書中に記載されるもの）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、例えばトシラートなど、ウンデカン酸塩などが挙げられる。
例えば、カルボン酸であるが、これに限定はされない酸性部分が含まれている有効成分は、様々な有機塩基および無機塩基と共に塩を形成することができる。例示的な塩基性の塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩、リチウム塩、およびカリウム塩など、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩など、有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、例えばベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロ−アビエチル）エチレンジアミンを用いて形成された、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミン、ならびに、アミノ酸、例えばアルギニン、リジンなどとの塩が挙げられる。塩基性の窒素が含まれている基は、例えば、ハロゲン化低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、および硫酸ジアミル）、長鎖のハロゲン化物（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、ハロゲン化アラルキル（例えば、臭化ベンジルおよび臭化フェネチル）などの物質を用いて四級化させることができる。
好ましい実施形態の化合物のプロドラッグおよび溶媒もまた、本明細書中で意図される。用語「プロドラッグ」は、本明細書中で使用される場合は、被験体に投与されると、代謝プロセスまたは化学的プロセスによって化学変換を受けて、有効成分の化合物ならびに／あるいはその塩および／または溶媒和物を生じる化合物を示す。有効成分の溶媒和物は、好ましくは、水和物である。
有効成分およびその塩は、それらの互変異性体の形態（例えば、アミドまたはイミノエーテルとして）存在し得る。そのような互変異性体形態は全て、好ましい実施形態の一部として本明細書中で意図される。
本発明の化合物の全ての立体異性体、例えばこれは、任意の置換基の上にある不斉炭素が原因で存在し得、これには、鏡像異性体形態（これは、不斉炭素が存在しない場合でさえ存在する可能性がある）とジアステレオマー形態が含まれる、が想定され、好ましい実施形態の範囲に含まれる。好ましい実施形態の化合物についての個々の立体異性体には、例えば、実質的に他の異性体が含まれない場合があり、または、例えば、ラセミ体として混在している場合も、あるいは、全ての他の、または他の選択された立体異性体と混在している場合もある。好ましい実施形態のキラル中心は、ＩＵＰＡＣ １９７４ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓによって定義されているような、ＳまたはＲ立体配置を有することができる。
好ましい実施形態の化合物が塩の形態で存在する場合には、これらは、好ましくは薬学的に許容される塩である。このような塩としては、薬学的に許容される酸付加塩、薬学的に許容される塩基付加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、およびアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、無機酸ならびに有機酸の塩が挙げられる。適切な無機酸の代表的な例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。適切な有機酸の代表的な例としては：ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、グリセロリン酸塩、ケトグルタル酸塩などが挙げられる。金属塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩の例としては、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム。トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基の例としては、リジン、アルギニン、グアニジン、ジエタノールアミン、コリンなどが挙げられる。
薬学的に許容される塩は、有効成分を１から４等量の塩基、例えば水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、水素化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムと、溶媒、例えばエーテル、ＴＨＦ、メタノール、ｔ−ブタノール、ジオキサン、イソプロパノール、エタノールの中で反応させることによって調製される。溶媒の混合物を使用することができる。有機塩基、例えばリジン、アルギニン、ジエタノールアミン、コリン、グアニジン（ｇｕａｎｄｉｎｅ）およびそれらの誘導体などもまた使用することができる。あるいは、酸付加塩は、利用できるかどうかにはかかわらず、酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、葉酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、サリチル酸、ヒドロキシナフトエ酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、コハク酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、酒石酸の、溶媒、例えば酢酸エチル、エーテル、アルコール、アセトン、ＴＨＦ、ジオキサンの中での処理によって調製することができる。溶媒の混合物もまた使用することができる。
上記で示されるように、好ましい実施形態のさらなる目的は、上記で定義された式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの少なくとも１つの化合物と、薬学的に許容されるビヒクルまたは支持体が含まれている医薬組成物に関する。
化合物は様々な形態に製剤化することができ、これには、固体および液体の形態、例えば、錠剤、ゲル剤、シロップ剤、散剤、エアゾールなどが含まれる。
好ましい実施形態の組成物には、生理学的に許容される希釈剤、増量剤、潤滑剤、賦形剤、溶媒、結合剤、安定剤などが含まれ得る。組成物の中で使用することができる希釈剤としては、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、セルロース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、粉砂糖、ならびに、持続放出錠剤のためのヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が挙げられるが、これらに限定はされない。組成物において使用することができる結合剤としては、デンプン、ゼラチン、および増量剤、例えばスクロース、グルコース、デキストロース、およびラクトースなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
組成物において使用することができる天然ゴムおよび合成ゴムとしては、アルギン酸ナトリウム、ガティガム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびビーガムが挙げられるが、これらに限定はされない。組成物において使用することができる賦形剤としては、微結晶セルロース、硫酸カルシウム、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、およびスクロースが挙げられるが、これらに限定はされない。使用することができる安定剤としては、多糖類、例えばアカシア、寒天、アルギン酸、グアーガム、およびトラガカントなど、両性物質（ａｍｐｈｏｔｓｉｃｓ）、例えばゼラチンなど、ならびに、合成および半合成のポリマー、例えばカルボマー樹脂、セルロースエーテル、およびカルボキシメチルキチンなどを挙げることができるが、これらに限定はされない。
使用することができる溶媒としては、リンガー溶液、水、蒸留水、水中の５０％のジメチルスルホキシド、プロピレングリコール（高品質のもの、または水中のもの）、リン酸緩衝化生理食塩水、平衡化塩溶液、グリコール、および他の従来使用されている液体を上げることができるが、これらに限定はされない。
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの化合物が投与される投与量および投与レジメンは、投与形態、投与形式、処置される症状、および処置される特定の患者に応じて様々であろう。したがって、最適な治療の濃度は、日常的に行われる実験を通じて、その時間と場所で決定されることが最良であろう。
好ましい実施形態の化合物はまた、経腸的に使用することもできる。経口では、好ましい実施形態の化合物は、１００μｇから１００ｍｇ／日／ｋｇ体重の割合で、適切に投与される。好ましくは、経口では、好ましい実施形態の化合物は、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μｇから約１、５、１０、２５、５０、７５、１００ｍｇ／日／ｋｇ体重の割合で適切に投与される。必要な用量は、１回または複数回で投与することができる。経口投与については、適切な形態は、例えば、錠剤、ゲル剤、エアゾール、丸剤、糖衣錠、シロップ剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液剤、散剤、および顆粒剤である。好ましい投与方法は、１ｍｇから約５００ｍｇの活性のある物質が含まれている適切な形態を使用することからなる。好ましくは、投与方法は、約１、２、５、１０、２５、または５０ｍｇから約１００、２００、３００、４００、５００ｍｇの活性のある物質が含まれている適切な形態を使用することからなる。
好ましい実施形態の化合物はまた、静脈内もしくは筋肉内への注入または注射のための溶液剤あるいは懸濁剤の形態で、非経口的に投与することもできる。その場合には、好ましい実施形態の化合物は、一般的には、約１０μｇから１０ｍｇ／日／ｋｇ体重の割合で投与される。好ましい投与方法は、１ｍｌあたりおよそ０．０１ｍｇから１ｍｇの活性のある物質が含まれている溶液剤または懸濁剤を使用することからなる。好ましくは、好ましい実施形態の化合物は、一般的には、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｇから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／日／ｋｇ体重の割合で投与される。好ましい投与方法は、１ｍｌあたり、およそ０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、または０．５ｍｇから０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ｍｇの活性のある物質が含まれている溶液剤または懸濁剤を使用することからなる。
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、またはＩＶの化合物は、様々な腫瘍を処置する（化学的予防のために、および治療的の両方）ための他の公知の抗腫瘍薬と実質的に同様の様式で使用することができる。好ましい実施形態の化合物については、投与される抗腫瘍薬の用量は、単回投与であるか、複数回投与であるか、または一日量であるかは問わず、もちろん、使用される特定の化合物に応じて異なるであろう。これは、化合物の様々な効力、選択される投与経路、レシピエントの大きさ、腫瘍のタイプ、および患者の症状の性質の理由による。投与される投与量は、決定的な境界とされるわけではないが、これは通常は有効量であるか、または、その所望される薬理学的効果および生理学的効果を得るための活性のある薬物の代謝による放出の際に、投与製剤から生産される薬理学的に活性な遊離の形態の分子的基盤と等量であろう。ガン処置の分野の腫瘍学者は、過度の実験を行うことなく、好ましい実施形態の化合物の効果的な投与のために適切なプロトコールを、例えば、抗腫瘍特性を有していることが明らかになっている化合物についての初期に公開された実験を参照することによって、確定することができるであろう。
好ましい実施形態は、Ｔ細胞が関係している障害の処置方法に関する。Ｔ細胞が関係している障害としては、細胞媒介性過敏症、例えば遅延型過敏症およびＴ細胞媒介性細胞傷害性など、および移植拒絶；自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、炎症性筋炎、混合型結合組織病、および結節性多発性動脈炎など、および他の血管炎；免疫不全症候群、これには原発性免疫不全、例えば胸腺形成不全症、重症複合型免疫不全疾患、およびＡＩＤＳなどが含まれるが、これらに限定はされない；白血球減少症；白血球の反応性（炎症性）の増殖、これには白血病、急性非特異的リンパ節炎、および慢性非特異的リンパ節炎が含まれるが、これらに限定はされない；白血球の新生物性の増殖、これにはリンパ系新生物、例えば前駆体Ｔ細胞新生物、例えば、急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、末梢Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞新生物、これには末梢Ｔ細胞リンパ腫、特定されていない成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫が含まれる、菌状息肉腫、およびセザリー症候群（Ｓｚａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、およびホジキン病などが含まれるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、皮膚の疾患に関して使用することができる。皮膚の疾患としては、色素沈着およびメラニン形成細胞の障害、これには白斑、染み、肝斑、黒子、母斑細胞母斑、形成異常母斑、および悪性黒色腫が含まれるが、これらに限定はされない；良性の上皮腫瘍、これには脂漏性角化症、黒色表皮症、線維上皮性ポリープ、上皮嚢胞、角化棘細胞腫、および付属器（付属器官）の腫瘍が含まれるが、これらに限定はされない；前ガン状態および悪性の上皮腫瘍、これには光線性角化症、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、およびメルケル細胞ガンが含まれるが、これらに限定はされない；真皮の腫瘍、これには良性の線維性組織球腫、隆起性皮膚線維肉腫、黄色腫、および真皮の血管腫瘍が含まれるが、これらに限定はされない；皮膚に対する細胞性の移動の腫瘍、これには組織球増殖症Ｘ、菌状息肉腫（ガン性のＴ細胞リンパ腫）、および肥満細胞症が含まれるが、これらに限定はされない；表皮の成熟の障害、これには魚鱗癬が含まれるが、これに限定はされない；急性炎症性皮膚病これには蕁麻疹、急性の湿疹、および多形性紅斑が含まれるが、これらに限定はされない；慢性的な炎症性皮膚病これには乾癬、扁平苔癬、および紅斑性狼瘡が含まれるが、これらに限定はされない；水疱形成性（水疱性）疾患、これには天疱瘡、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、および非炎症性水疱形成疾患：表皮水疱症およびポルフィリン症が含まれるが、これらに限定はされない；表皮の付属器の障害、これには尋常性座瘡が含まれるが、これに限定はされない；脂肪織炎、これには、結節性紅斑および硬結性紅斑が含まれるが、これらに限定はされない；ならびに、感染および侵入、例えばいぼ、伝染性軟属腫、膿痂疹、表在性真菌感染、ならびに、節足動物による咬傷、刺傷、および侵入が挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、骨髄細胞から生じる障害に関して使用することができる。正常な骨髄の中では、骨髄系（多核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｅｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ））は、細胞構成要素のおよそ６０％を構成し、赤血球系が２０〜３０％を占める。リンパ球、単球、細網細胞、血漿細胞、および巨核球は、あわせて１０〜２０％を構成する。リンパ球は、正常な成人の骨髄の５〜１５％を占める。骨髄においては、赤血球（赤血球）、マクロファージ（単芽球）、血小板（巨核球）、多形核白血球（骨髄芽球）、およびリンパ球（リンパ芽球）の前駆体が１つの顕微鏡視野で見ることができるように、複数の細胞のタイプが添加され、混合される。加えて、幹細胞が様々な細胞系統について存在し、さらには、様々な系統の方向付けされた前駆細胞についての前駆体幹細胞も存在する。様々なタイプの細胞およびそれぞれの段階が当業者に公知であり、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第５版，Ｓｅｌｌら、Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９９６）に見ることができ、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる。したがって、好ましい実施形態は、これらの細胞によって生じる障害に関する。これらの障害としては、造血幹細胞；方向付けされたリンパ球様前駆細胞；リンパ球様細胞、これにはＢ細胞およびＴ細胞が含まれる；方向付けされた骨髄前駆細胞、これには、単球、顆粒球、および巨核球が含まれる；ならびに、方向付けされた赤血球前駆細胞が関係している疾患が挙げられるが、これらに限定はされない。これらには白血病、これにはＢ−リンパ性白血病、Ｔ−リンパ性白血病、未分化白血病が含まれる；赤白血病、巨核芽球性白血病、単球性；［白血病には、分化しているものと分化していないものが含まれる］；慢性および急性リンパ芽球性白血病、慢性および急性リンパ球性白血病、慢性および急性骨髄性白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、慢性および急性の骨髄性白血病、骨髄単球性白血病；慢性および急性の骨髄芽球性白血病、慢性および急性の骨髄性白血病、慢性および急性の前骨髄球性白血病、慢性および急性の骨髄性白血病、単球−マクロファージ系統の血液学的悪性腫瘍、例えば若年性慢性骨髄性白血病など；二次性急性骨髄性白血病、推定される血液学的疾患；不応性貧血；再生不良性貧血；反応性皮膚血管内皮腫症（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｍａｔｏｓｉｓ）；樹状細胞の中での発現の変化が関係している線維症、全身性硬化症、Ｅ−Ｍ症候群、伝染性毒性オイル症候群（ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｔｏｘｉｃ ｏｉｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、好酸球性筋膜炎、限局性強皮症、ケロイド、および線維性結腸疾患が含まれる疾患；血管腫様の悪性線維性組織球腫；ガン腫、これには原発性の頭頸部扁平上皮細胞ガンが含まれる；肉腫、これにはカポジ肉腫が含まれる；線維腺腫および葉状腫瘍、これには、乳房の線維腺腫が含まれる；間質腫瘍；葉状腫瘍、これには、組織球腫が含まれる；赤芽球症；神経線維腫症；血管内皮の疾患；脱髄、特に古い病変の中のもの；グリオーシス、血管原性浮腫、血管の疾患、アルツハイマー病およびパーキンソン病；Ｔ細胞リンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫が挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、脾臓が関係している障害に関して使用することができる。脾臓が関係している障害としては、脾腫、これには非特異的急性脾炎、鬱血性脾腫、および脾梗塞が含まれる；新生物、先天性奇形、および破裂が挙げられるが、これらに限定はされない。脾腫を伴う障害としては感染、例えば非特異的脾炎、感染性単核症、結核症、腸チフス、ブルセラ症、サイトメガロウイルス、梅毒、マラリア、ヒストプラズマ症、トキソプラズマ症、黒熱病、トリパノソーマ症、住血吸虫症、リーシュマニア症、およびエキノコックス症など；部分的な高血圧に関係する鬱血状態、例えば肝臓の肝硬変、門脈および脾静脈の血栓症、および心臓麻痺など；リンパ造血性疾患、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫／白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、溶血性貧血、および血小板減少性紫斑病など；免疫学的炎症症状、例えば関節リウマチ、および全身性エリテマトーデスなど；沈着症、例えばゴーシェ病、ニーマン・ピック病、およびムコ多糖症など；ならびに、他の症状、例えばアミロイドーシス、原発性新生物および嚢胞および二次性新生物が挙げられる。
好ましい実施形態の化合物は、血管が関係している障害に関して使用することができる。血管が関係している障害としては、損傷に対する血管細胞壁の応答、例えば内皮細胞の機能障害、および内皮細胞の活性化、および内膜肥厚など；血管の疾患、これには先天性異常、例えば動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、および高血圧性血管疾患、例えば高血圧などが含まれるが、これらに限定はされない；炎症性疾患−脈管炎、例えば巨細胞（一時的な）動脈炎、高安動脈炎、結節性多発性動脈炎（古典的）、川崎症候群（粘膜皮膚リンパ節症候群）、顕微鏡的多発性血管炎（顕微鏡的多発性動脈炎、過敏症、または白血球崩壊性血管炎（ｌｅｕｋｏｃｙｔｏｃｌａｓｔｉｃ ａｎｇｌｉｔｉｓ））、ヴェーゲナー肉芽腫症、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、他の障害に付随する血管炎、および感染性動脈炎など；レイノー病；動脈瘤および切開、例えば腹部大動脈瘤、梅毒性（梅毒）動脈瘤、および動脈瘤解離（解離性血腫）など；静脈およびリンパ管の障害、例えば静脈瘤、血栓性静脈炎、および静脈血栓症など、上大静脈の閉塞（上大静脈症候群）、下大静脈の閉塞（下大静脈症候群）、ならびに、リンパ管炎およびリンパ水腫など；腫瘍（これには、良性の腫瘍および腫瘍様の症状、例えば血管腫、リンパ管腫、グロムス腫瘍（グロムス血管腫）、血管拡張、および細菌性血管腫症が含まれる、および、中悪性度の（ぎりぎりの低悪性度の）腫瘍、例えばカポジ肉腫および血管内皮腫（ｈｅｍａｎｇｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、および悪性腫瘍、例えば血管肉腫および血管周囲細胞腫など；ならびに、血管疾患における治療的介入の病理、例えばバルーン血管形成、および関連する技術、および血管の交換、例えば、冠動脈バイパス移植手術などが挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、赤血球が関係している障害に関して使用することができる。赤血球が関係している障害としては、貧血、例えば、溶血性貧血、これには遺伝性球状赤血球症、赤血球酵素の欠損が原因である溶血性貧血が含まれる：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損、鎌状赤血球病、サラセミア症候群、発作性夜間血色素尿症、免疫性溶血性貧血、および赤血球に対する外傷が原因で生じる溶血性貧血；および赤血球生産低下による貧血、これには巨赤芽球性貧血、例えば、ビタミンＢ１２欠損による貧血が含まれる：悪性貧血、および葉酸欠乏性貧血、鉄欠乏性貧血、慢性疾患の貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆、および骨髄損傷の他の形態が挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、Ｂ細胞が関係している障害に関して使用することができる。Ｂ細胞が関係している障害としては前駆Ｂ細胞新生物、例えば、リンパ芽球性白血病／リンパ腫などが挙げられるが、これらに限定はされない。末梢Ｂ細胞新生物としては、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、血漿細胞新生物、多発性骨髄腫、および関連疾患、リンパ形質細胞性リンパ腫（ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴｏｍａ）、およびヘアリー細胞白血病が挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、血小板数の減少が関係している障害に関して使用することができる。血小板数の減少が関係している疾患である、血小板減少症としては、特発性血小板減少性紫斑病、これには急性特発性血小板減少性紫斑病、薬物によって誘導された血小板減少症、ＨＩＶに関連する血小板減少症、および血栓性微小血管症が含まれる：血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症症候群が挙げられる。
好ましい実施形態の化合物は、前駆Ｔ細胞新生物が関係している障害に関して使用することができる。前駆Ｔ細胞新生物が関係している障害としては、前駆Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫が挙げられる。末梢Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞新生物が関係している障害としては、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病、大型顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫、およびセザリー症候群、末梢Ｔ細胞リンパ腫、特定されていない血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫（ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫４ａ）、腸症型腸管Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ならびに未分化大細胞リンパ腫が挙げられる。
好ましい実施形態の化合物は、骨の障害に関して使用することができる。骨形成細胞としては、骨幹細胞、骨芽細胞、および骨細胞が挙げられる。骨の障害は複雑である。なぜなら、これらはその発達の段階のいずれかの間に骨格に対して影響を与え得るからである。したがって、障害は様々な兆候を有し得、これらは、体の１つの骨、複数の骨、または全ての骨に関係し得る。そのような障害としては、先天性奇形、軟骨形成不全症、および致死性小人症、異常なマトリックスが関係している疾患（例えば、Ｉ型コラーゲン疾患、骨粗鬆症、ページェット病、くる病、骨軟化症、代謝回転の速い（ｈｉｇｈ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ）骨形成異常症、代謝回転の遅い（ｌｏｗ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ）無形成性疾患、骨壊死、化膿性骨髄炎、結核性骨髄炎、骨腫、類骨骨腫、骨芽細胞腫、骨肉腫、骨軟骨腫、軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、軟骨肉腫、線維性骨皮質欠損、線維性骨異形成、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、巨細胞腫、および転移性腫瘍が挙げられる。
好ましい実施形態の化合物は、扁桃腺が関係している障害に関して使用することができる。扁桃腺が関係している障害としては、扁桃腺炎、扁桃周囲膿瘍、扁平上皮細胞ガン、呼吸困難、過形成、濾胞過形成、反応性リンパ過形成、非ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞リンパ腫が挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、肝臓が関係している障害に関して使用することができる。肝臓が関係している障害としては、肝損傷；黄疸および胆汁鬱血、例えばビリルビンおよび胆汁の形成など；肝不全および肝硬変、例えば肝硬変、門脈圧亢進症、これには腹水症、門脈体静脈シャント、および脾腫が含まれる；感染性疾患、例えばウイルス性肝炎、これにはＡ〜Ｅ型肝炎感染、および他の肝炎ウイルスによる感染が含まれる、臨床病理症候群、例えば、キャリア状態、無症候性の感染、急性ウイルス性肝炎、慢性ウイルス性肝炎、および劇症肝炎など；自己免疫性肝炎、薬剤−および毒素によって誘導される肝疾患、例えばアルコール性肝疾患など；代謝の先天性異常および小児の肝臓疾患、例えば血色素症、ウィルソン病、α．１−抗トリプシン欠損、および新生児肝炎など；肝内胆管疾患、例えば、続発性胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、および胆道系の異常など；循環障害、例えば肝臓への血流の損傷、これには肝動脈の損傷、および門静脈の鬱血、および血栓症が含まれる、肝臓からの血流の損傷、これには受動性鬱血、および中心性壊死、および肝臓紫斑病が含まれる、肝静脈からの流出の閉塞、これには肝静脈血栓症（バッド・キアリ症候群）および静脈閉塞疾患が含まれる；妊娠に関係する肝疾患、例えば子癇前症および子癇、妊娠による急性脂肪肝、および妊娠による肝内胆汁うっ滞；臓器または骨髄移植による肝合併症、例えば、骨髄移植後の薬物毒性、移植片対宿主病、および肝臓拒絶、ならびに肝臓の同種移植片に対する非免疫学的損傷など；腫瘍および腫瘍状の症状、例えば結節性過形成、腺腫および悪性腫瘍、これには肝臓の原発性ガンおよび転移性腫瘍が含まれる、が挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、結腸が関係している障害に関して使用することができる。結腸が関係している障害としては、先天性異常、例えば閉鎖症および狭窄、メッケル憩室症、先天性巨大結腸−ヒルシュスプリング病；腸炎、例えば下痢および赤痢など、感染性腸炎、これにはウイルス性胃腸炎、細菌性腸炎、壊死性腸炎、抗生物質が関係している結腸炎（偽膜性大腸炎）、ならびに、コラーゲン蓄積大腸炎およびリンパ球性大腸炎、混合型腸炎症疾患、これには寄生虫および原生動物が含まれる、後天性免疫不全症候群、移植、薬物によって誘導される腸の損傷、放射線性腸炎、好中球減少性腸炎（盲腸炎）、および便流変更性大腸炎が含まれる；特発性炎症性腸疾患、例えばクローン病、および潰瘍性大腸炎など；結腸の腫瘍、例えば非新生物性のポリープ、腺腫、家系症候群、結腸直腸ガン発症、結腸直腸ガン、およびカルチノイド腫瘍などが挙げられるが、これらに限定はされない。
好ましい実施形態の化合物は、肺が関係している障害に関して使用することができる。肺が関係している障害としては、先天性異常；肺拡張不全；血管を起源とする疾患、例えば肺奇形および浮腫、これには血流学的な肺浮腫、および微小血管の損傷によって引き起こされる浮腫が含まれる、成人呼吸窮迫症候群（びまん性肺胞損傷）、肺塞栓症、出血、および梗塞、ならびに肺高血圧および血管硬化症など；慢性閉塞性肺疾患、例えば肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、および気管支拡張症など；びまん性間質性（浸潤性、限局性）疾患、例えば塵肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増多症（好酸球の肺への浸潤）、閉塞性細気管支炎症性器質化肺炎、びまん性肺出血症候群、これには、グッドパスチャー症候群、特発性肺ヘモジデリン沈着症、および他の出血症候群が含まれる、膠原血管病における肺障害、ならびに肺胞タンパク症など；治療による合併症、例えば薬物によって誘導される肺疾患、放射線によって誘導される肺疾患、および肺移植など；腫瘍、例えば気管支ガン、これには腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞上皮ガン、神経内分泌腫瘍、例えば、気管支カルチノイド、混合型腫瘍、および転移性腫瘍などが含まれる；肋膜の病状、これには炎症性の胸膜滲出、非炎症性の胸膜滲出、気胸、および胸膜腫瘍、これには単発性線維性腫瘍（胸膜線維症）、および悪性中皮腫が含まれる、が挙げられるが、これらに限定はされない。
活性のある化合物は、被験体（例えばヒト）への投与に適している医薬組成物の中に取り込ませることができる。そのような組成物には、通常、核酸分子、タンパク質、調節因子、または抗体と、薬学的に許容される担体が含まれる。
本明細書中で使用される場合は、語句「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延剤などが含まれるように意図される。薬学的活性のある物質についてのそのような媒体および物質の使用は当該分野では周知である。任意の従来の媒体または物質が活性のある化合物と不適合である場合を除き、そのような媒体は、好ましい実施形態の組成物の中で使用することができる。補助活性のある化合物もまた、組成物の中に取り込ませることができる。好ましい実施形態の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下など、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口投与、皮内投与、または皮下投与に使用される溶液剤または懸濁剤には、以下の成分、滅菌の希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グルセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など；抗菌剤、例えばベンジルアルコール、またはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など、緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩など、ならびに、弾力性を調製するための物質、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどを含めることができる。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムなどを用いて調整することができる。非経口用の調製物は、硝子製もしくはプラスチック製の、アンプル、使い捨ての注射器、または多用量のバイアルの中に入れることができる。
１つの実施形態において、活性のある化合物は、体からの迅速な排泄に対して化合物を防御するであろう担体とともに、例えば、制御放出製剤、これにはインプラントおよびマイクロカプセル化させられた送達システムが含まれる、として調製される。生体分解性の、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。そのような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。これらの物質はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよび、Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（リポソームが含まれている）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
投与を容易にするため、および投与量を均一にするために、単位投与量形態で経口用組成物または非経口用組成物を製剤化することが、特に有効である。「単位投与量形態」は、本明細書中で使用される場合は、処置される被験体についての単位投与量として適している、物理的に個別の単位を意味する。個々の単位には必要な薬学的担体と組み合わせて所望される治療効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性のある化合物が含まれる。好ましい実施形態の単位投与量形態についての詳細は、活性のある化合物、および得られる特定の治療効果の特有の特性、ならびに、個体の処置のためのそのような活性のある化合物を配分する分野における固有の限界によって、および直接依存して決定される。
本明細書中で使用される場合は、用語「治療有効量」は、医薬組成物の個々の有効成分、または患者にとっての大きな利点、例えば、慢性的な症状の治癒、またはそのような症状の治癒速度の増大、あるいは、異常な症状の軽減などを示すために十分である方法の合計量を意味する。これには、治療的処置と予防的処置の両方が含まれる。したがって、化合物を疾患の極めて初期の段階で、または発症後早い段階で、あるいは、有意な進行の後に使用することができる。単独で投与される個々の有効成分について適用される場合には、この用語は、その成分のみについて言及する。混合物に適用される場合には、この用語は、一緒に投与されるか、連続して投与されるか、または同時に投与されるかにはかかわらず、治療効果を生じる有効成分の合計量を意味する。
処置方法または好ましい実施形態の使用の実施においては、好ましい実施形態の１種類、２種類、またはそれ以上の有効成分の治療有効量が、ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅに関係する疾患または障害に罹患している被験体に対して、あるいは、そのような疾患または障害を有している組織に対して投与される。好ましい実施形態の有効成分は、単独で、または他の公知の治療薬と組み合わせてのいずれかで、好ましい実施形態の方法にしたがって投与することができる。１種類以上の他の治療薬と同時に投与される場合には、好ましい実施形態の有効成分は、他の処置（単数または複数）と同時に、または連続してのいずれかで投与することができる。連続的に投与される場合には、かかりつけの医師が、他の治療と併用される好ましい実施形態の有効成分を投与する適切な順序を決定するであろう。
一般的には、有効成分の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、約０．００１から５０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．０１から１０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．０１から５００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．０１から２５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．０１から１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．００１から６０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、なおより好ましくは、約１から１０ｍｇ／ｋｇ、２から９ｍｇ／ｋｇ、３から８ｍｇ／ｋｇ、４から７ｍｇ／ｋｇ、または５から６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
当業者には、特定の要因が被験体を効果的に処置するために必要な投与量に影響を及ぼし得、これには、疾患または障害の重篤度、事前の処置、全体的な健康状態、および／または被験体の年齢、ならびに他の疾患の存在が含まれるが、これらに限定はされないことは明らかであろう。さらに、治療有効量での被験体の処置には、１回の処置が含まれ得、また、好ましくは、一連の処置が含まれ得る。好ましい例においては、被験体は、約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、約１から１０週間の間にわたって、好ましくは、２から８週間にわたって、より好ましくは、３から７週間にわたって、なおより好ましくは、約４、５、もしくは６週間にわたって、１週間に１回処置される。処置に使用される有効投与量は、特定の処置の経過の始めから終わりまでで、増大させることも、また減少させることもできることも、理解されるであろう。投与量の変更は、本明細書中に記載されるような診断アッセイの結果を生じ、その結果から明らかになるであろう。
好ましい実施形態において、Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅの発現または活性を調節する１つ以上のさらなる物質が含まれる。物質は例えば、低分子であり得る。例えば、そのような低分子としては、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、１モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量を有している有機化合物もしくは無機化合物（すなわち、ヘテロ有機（ｈｅｔｅｒｏｏｒｇａｎｉｃ）化合物および有機金属化合物が含まれる）、１モルあたり約５，０００グラム未満の分子量を有している有機もしくは無機化合物、１モルあたり約１，０００グラム未満の分子量を有している有機もしくは無機化合物、１モルあたり約５００グラム未満の分子量を有している有機もしくは無機化合物、ならびに、そのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態が挙げられるが、これらに限定はされない。
１つの実施形態において、さらなる物質は、プレニル化阻害因子であり得る。これは、例えば、米国特許第６，６４９，６３８号、同第５，４２０，２４５号、同第５，５７４，０２５号；同第５，５２３，４３０号；同第５，６０２，０９８号；同第５，６３１，４０１号；同第５，７０５，６８６号；同第５，２３８，９２２号；同第５，４７０，８３２号；および同第６，１９１，１４７号に開示されているものであり、これらは全て、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
別の実施形態においては、さらなる物質には、米国特許第６，５７２，８５０号；同第６，４５８，７８３号；同第６，４２３，７５１号；同第６，３８７，９２６号；同第６，２４２，４３３号；同第６，１９１，１４７号；同第６，１６６，０６７号；同第６，１５６，７４６号；同第６，０８３，９７９号；同第６，０１１，０２９号；同第５，９２９，０７７号；同第５，９２８，９２４号；同第５，８４３，９４１号；同第５，７８６，１９３号；同第５，６２９，３０２号；同第５，６１８，９６４号；同第５，５７４，０２５号；同第５，５６７，８４１号；同第５，５２３，４３０号；同第５，５１０，５１０号；同第５，４７０，８３２号；同第５，４４７，９２２号；同第６，５９６，７５３号；同第６，５８６，４６１号；同第６，５８６，４４７号；同第６，５７９，８７７号；同第６，５７６，６３９号；同第６，５４５，０２０号；同第６，５３９，３０９号；同第６，５３５，８２０号；同第６，５２８，５２３号；同第６，５１１，８００号；同第６，５００，８４１号；同第６，４９５，５６４号；同第６，４９２，３８１号；同第６，４５８，９３５号；同第６，４５１，８１２号；同第６，４４１，０１７号；同第６，４４０，９８９号；同第６，４４０，９７４号；同第６，４３２，９５９号；同第６，４２６，３５２号；同第６，４１０，５４１号；同第６，４０３，５８１号；同第６，３９９，６１５号；同第６，３８７，９４８号；同第６，３８７，９０５号；同第６，３８７，９０３号；同第６，３７６，４９６号；同第６，３７２，７４７号；同第６，３６２，１８８号；同第６，３５８，９６８号；同第６，３２９，３７６号；同第６，３１６，４６２号；同第６，２９４，５５２号；同第６，２７７，８５４号；同第６，２６８，３９４号；同第６，２６５，３８２号；同第６，２６２，１１０号；同第６，２５８，８２４号；同第６，２４８，７５６号；同第６，２４２，４５８号；同第６，２３９，１４０号；同第６，２２８，８６５号；同第６，２２８，８５６号；同第６，２２５，３２２号；同第６，２１８，４０１号；同第６，２１４，８２８号；同第６，２１４，８２７号；同第６，２１１，１９３号；同第６，１９４，４３８号に記載されているような、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ（ＦＰＴａｓｅ）、プレニル−プロテイントランスフェラーゼ、またはゲラニルゲラニル−プロテイントランスフェラーゼの１種類以上の阻害因子が含まれ、これらは、具体的に、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
「ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害因子」または「ＦＰＴ阻害因子」または「ＦＴＩ」は、本明細書中では、（ｉ）ＦＰＴを強力に阻害する（しかし、一般的には、ゲラニルゲラニルプロテイントランスフェラーゼＩは阻害しない）、および（ｉｉ）ｒａｓの細胞内ファルネシル化をブロックする化合物として、定義される。ＦＰＴは、Ｒａｓタンパク質のカルボキシ末端付近に存在しているシステイン残基上のイソプレニル脂質部分の付加を触媒する。これは、Ｒａｓ膜結合およびＲａｓによって誘導される腫瘍形成性形質転換の両方に不可欠な翻訳後プロセシング経路の最初の工程である。多数のＦＰＴ阻害因子が報告されており、これには、様々なペプチド模倣物阻害因子、さらには他の低分子阻害因子が含まれる。
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子は、一般的には、２つのクラス：ファルネシルジホスフェートのアナログとファルネシルトランスフェラーゼについてのタンパク質基質に分けられる。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子は、米国特許第５，７５６，５２８号、同第５，１４１，８５１号、同第５，８１７，６７８号、同第５，８３０，８６８号、同第５，８３４，４３４号、および同第５，７７３，４５５号に記載され、これらは全て、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。中でも、Ｒａｓ関連タンパク質のファルネシル部分の転移を阻害するために有効であることが示されているファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子は、Ｌ−７３９，７４９（Ｃ−Ａ−Ａ−Ｘ配列のペプチド模倣アナログ）、Ｌ−７４４，８３２（Ｃ−Ａ−Ａ−Ｘ配列のペプチド模倣アナログ）、ＳＣＨ４４３４２（１−（４−ピリジルアセチル）−４−（８−クロロ−５，６−ジヒドロ−ＩＩＨベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−１１−イーデン（ｙｈｄｅｎｅ））ピペリジン）、ＢＺＡ−５Ｂ（ベンゾジアゼピンペプチド模倣物）、ＦＴＩ−２７６（Ｃ−Ａ−Ａ−Ｘペプチド模倣物）、およびＢ１０８６（Ｃ−Ａ−Ａ−Ｘペプチド模倣物）である。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子（ＦＴＩ）の投与は、当業者に公知の標準的な方法によって、最も好ましくは、ＦＴＩが含まれている錠剤の投与によって行われ、、１日あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にほぼ入ると予想される。
別の実施形態において、さらに別の物質には、米国特許第５，４７０，８３２号（Ｇｉｂｂｓ ＆ Ｇｒａｈａｍ）、ここでその全体が引用により本明細書中に組み入れられる、に記載されているようなゲラニルゲラニルプロテイントランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の１種類以上の阻害因子が含まれる。これらの化合物は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の投与量で個体に投与することができる。あるいは、ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）阻害因子、および／またはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害因子（ＧＧＴ）が含まれるイソプレニル化の１種類以上の阻害因子が患者に投与される。
別の実施形態において、さらに別の物質には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来するトキシンＡおよびＢ、ならびにＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉの致死性の毒素（ＬＴ）のような、１種類以上の毒素が含まれる。加えて、Ｒａｃ１およびＲａｃ２は、ＲｈｏがＣ３酵素、これはボツリヌス毒素の１種である、およびブドウ球菌毒素ＥＤＩＮによって特異的にＡＤＰリボシル化されると阻害され得る（Ｎａｒｕｍｉｙａ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｏｒｉｉ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，５，９−１９，１９９３；Ｓｅｋｉｎｅ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，８６０２−８６０５，１９８９）。これらは全てそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
低分子物質の適切な用量は、当業者である医師、獣医師、または研究者の能力の範囲内である多数の要因に依存することが理解される。低分子の用量（単数または複数）は、例えば、処置される被験体および試料の身元（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさ、および症状に応じて、さらには、適用可能である場合には組成物が投与される経路、ならびに、好ましい実施形態の核酸またはポリペプチドに対して低分子が有することを、施術者が所望する効果に応じて、変化するであろう。例示的な用量としては、被験体または試料の重量１キログラムあたりミリグラムまたはマイクログラム量の低分子（例えば、１キログラムあたり約１マイクログラムから１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラムから１キログラムあたり約５ミリグラム、または１キログラムあたり約１マイクログラムから１キログラムあたり約５０マイクログラム）が挙げられる。低分子の適切な用量が、調節される発現または活性に関する低分子の効力に応じて変化することが、さらに理解される。このような適切な用量は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定することができる。これらの低分子の１種類以上が動物（例えば、ヒト）に対して、好ましい実施形態のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために投与される場合には、医師、獣医師、または研究者は、例えば、最初は比較的低用量を処方することができ、続いて、適切な応答が得られるまで用量が増大させることができる。加えて、任意の特定の動物被験体についての特異的な用量レベルが、使用される特異的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および被験体の食事療法、投与のタイミング、投与経路、排出速度、何らかの薬物の併用、ならびに、調節される発現または活性の程度が含まれる様々な要因に応じて異なるであろうことが理解される。
以下に開示される実施例は、好ましい実施形態を記載しており、その範囲を限定するようには意図されない。変更またはバリエーションを、本発明の教示から逸脱することなく本明細書中に記載される好ましい実施形態に対して行うことができることは、当業者に明らかである。
組み換え体タンパク質の生産。Ｎ末端ＤＨ／ＰＨモジュール、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、およびＰＡＫ１のｐ２１結合ドメイン（ＰＢＤ）（残基５１〜１３５）が含まれている組み換え体Ｔｒｉｏ（残基１２２５〜１５３７）を、ｐＥＴ発現システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用することによってＮ末端Ｈｉｓ６タグ化融合タンパク質として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の中で発現させた。Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ、ＰＡＫ１（ＰＢＤ）、およびＷＡＳＰ（ＰＢＤ）を、ｐＧＥＸ−ＫＧベクターを使用することによってＧＳＴ融合体として、大腸菌ＤＨ５α株の中で発現させた。Ｎ末端タグ化ＧＳＴまたはＨｉｓ６融合タンパク質は、グルタチオン−、またはＮｉ２＋−アガロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。グルタチオンビーズ上のＧＳＴ−Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅを、５０ｍＭのＴｒｉｏ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＤＴＴが含まれている緩衝液で洗浄することによって、結合したグアニンヌクレオチドまたはＭｇ２＋を溶出した。
インビトロでの複合体形成アッセイ。約０．５μｇのＨｉｓ６タグ化Ｔｒｉｏを、０．５μｇのＥＤＴＡで処理したＧＳＴ融合Ｃｄｃ４２またはＲａｃ１とともに、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１％のウシ血清アルブミン、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０μｌの懸濁したグルタチオン−アガロースビーズが含まれている結合緩衝液の中でインキュベートした。約０．７５μｇのＧＳＴタグ化Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎを、ヌクレオチドが含まれていないＨｉｓ６タグ化Ｃｄｃ４２またはＲａｃ１（０．２５μｇ）とともに、１０μｌの懸濁したグルタチオン−アガロースビーズを含む結合緩衝液の中でインキュベートした。４℃で３０分間の、定速の攪拌下でのインキュベーションの後、グルタチオンビーズを結合緩衝液で２回洗浄した。ＧＳＴ融合体が結合したビーズと一緒に沈殿したＨｉｓ６タグ化タンパク質の量を、抗Ｈｉｓウェスタンブロッティングによって検出した。
インビトロでのグアニンヌクレオチド交換アッセイ。これらのためには、ｍａｎｔ−ＧＤＰとともにロードした２００ｎＭのＲａｃ１を、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭａＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、および０．５ｍＭのＧＴＰが含まれている交換緩衝液の中で、２００ｎＭのＴｒｉｏの非存在または存在する条件下で、２５℃でインキュベートした。交換反応の過程の間のｍａｎｔ−ＧＤＰの蛍光の変化を、Ｃａｒｙ Ｅｌｌｉｐｓｅ蛍光分光計（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．）によって３６０ｎｍの励起波長と４４０ｎｍの放射波長でモニターした。
細胞培養。ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞を、１０％のウシ血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）の中で増殖させた。ＲＷＰＥ−１細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと０．０５ｍｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物を補充したケラチノサイト−無血清培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）の中で増殖させた。ＰＣ−３細胞は、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）の中で培養した。
内因性のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性のアッセイ。ＧＳＴ−またはＨｉｓ６−ＰＡＫ１（ＰＢＤ）およびＧＳＴ−ＷＡＳＰ（ＰＢＤ）を大腸菌の中で発現させ、グルタチオン−またはＮｉ２＋−アガロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞を、１０ｃｍの皿の中で対数期で増殖させ、０．５％の血清培地の中で、または指示された別の方法で２４時間枯渇させ、その後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のＮＰ−４０、１０％のグリセロール、および１×プロテアーゼ阻害因子カクテル（Ｒｏｃｈ）が含まれている緩衝液の中で溶解させた。溶解物を明澄化させ、タンパク質濃度を正規化した。等量のタンパク質が含まれている細胞溶解物を、１０μｇのＧＳＴ−またはＨｉｓ６−融合プローブとともに、定速回転下で４℃で４０分間インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で２回洗浄し、結合したＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを抗Ｒａｃ１（Ｕｐｓｔａｔｅ）または抗Ｃｄｃ４２（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ウェスタンブロッティングによって検出した。ウェスタンブロットの定量は、ＬＡＳ−１０００発光画像分析装置（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。
免疫蛍光。１００μＭの２３７６６の存在下、または非存在下の条件での一晩の血清枯渇後、カバーガラス上で増殖させたＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、１０ｎＭのＰＥＧＦで０分間、５分間、または１０分間処理した。細胞を、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１％のＴｒｉｏｎ Ｘ−１００で２０分間透過処理した。細胞のアクチンを、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのＴＲＩＴＣ標識ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で、室温で４０分間染色した。アクチンと細胞の形態学的変化を蛍光顕微鏡によって視覚化した。
細胞増殖アッセイ。野生型と、ＲａｃＬ６１−または種々のＧＥＦ−でトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、５％のウシ血清の中で増殖させた。細胞を１ウェルあたり５×１０４個の細胞で６ウェルプレートの中に２連に分け、血球計を用いて４日間、毎日カウントした。前立腺ＰＣ−３細胞の増殖速度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。２００μｌの５％のＦＢＳ培地中の１，５００個の細胞／ウェルを９６ウェルプレートの中に配置し、通常の条件下で増殖させた。培養物を、２０μｌの混合したＭＴＳ／ＰＭＳ溶液の添加によって、０日、１日、２日、３日、４日、または５日目にアッセイし、その後、３７℃で１時間インキュベーションした。吸光度を、自動マイクロプレートリーダー上で４９０ｎｍの波長で測定した。
足場非依存性の増殖。前立腺上皮細胞ＲＷＰＥおよびＰＣ−３（１．２５×１０３個／ウェル）を、公開されているプロトコール（Ｑｉｕ ら、１９９７，これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）にしたがって、様々な用量の化合物２３７６６の存在下、または非存在の条件下で、０．３％のアガロースの中で増殖させた。軟寒天の中に形成されたコロニーの数を、１０日後にカウントした。
細胞浸潤アッセイ。細胞浸潤アッセイを、製造業者の説明書にしたがって８．０ミクロンの孔サイズのＰＥＴ膜（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、６．４ｍｍのＢｉｏｃｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤チャンバーを使用して行った。簡単に説明すると、５×１０４個の細胞を０．５ｍｌの無血清培養培地の中に再懸濁させ、上部チャンバーに添加した。培養培地中の１０％のウシ胎児血清を、下部チャンバーの中の化学誘引物質として使用した。細胞を一晩インキュベートした後、Ｍａｔｒｉｇｅｌを通過した細胞の数をカウントした。
（結果）
Ｒａｃ１特異的阻害因子の仮想スクリーニング。Ｒａｃ１−Ｔｉａｍ１複合体の三次元（３Ｄ）構造の中では、Ｒａｃ１のＴｒｐ５６は、Ｔｉａｍ１の残基Ｈｉｓ１１７８、Ｓｅｒ１１８４、Ｇｌｕ１１８３、およびＩｌｅ１１９７と、Ｒａｃ１のＬｙｓ５、Ｖａｌ７、Ｔｈｒ５８、およびＳｅｒ７１によって形成されるポケットの中に埋もれている（Ｗｏｒｔｈｙｌａｋｅら、２０００、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。Ｔｒｉｐ５６の周辺の構造特性に基づいてＲａｃ１特異的阻害因子を同定するために、可能性のある阻害因子結合ポケットを、Ｒａｃ１−Ｔｉａｍ１単量体の中のＴｒｐ５６の６．５Å以内にある、Ｌｙｓ５、Ｖａｌ７、Ｔｒｐ５６、およびＳｅｒ７１が含まれるＲａｃ１の残基を用いて作成した。３Ｄデータベースの検索を、その立体構造が結合ポケットにフィットする化合物を同定するために行った。スクリーニングプロセスの間に化合物の柔軟性を考慮するために、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｗｅａｋアルゴリズムによって迅速な立体構造上柔軟な３Ｄの検索が可能である、プログラムＵＮＩＴＹ（Ｈｕｒｓｔ，１９９４，これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を適用した。
次に、ＵＮＩＴＹプログラムによって得られた低分子のヒットを、プログラムＦｌｅｘＸ、タンパク質結合部位に対してリガンドを迅速かつ柔軟にドッキングさせることができる、エネルギー最小化モデリングソフトウェアを使用することによってＴｒｐ５６が含まれているＲａｃ１の予想される結合ポケットにドッキングさせる（Ｒａｒｅｙら、１９９６、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。ドッキング手順の後、化合物を、プログラムＣｓｃｏｒｅを使用して、結合ポケットに結合するそれらの予想された能力に基づいてランク付けした。Ｃｓｃｏｒｅは、タンパク質−リガンド複合体の個々のスコアリング機能をいかにうまく行うかに基づいて、比較的コンセンサスなスコアを生じる（Ｃｌａｒｋら、２００２、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。
化合物ＮＣＩ ２３７６６は、Ｒａｃ１−ＧＥＦ相互作用を特異的に阻害する。化合物ＮＣＩ ２３７６６が含まれる仮想スクリーニングによる化合物は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＰｒｏｇｒａｍからのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得た。また、化合物ＮＣＩ ２３７６６は、本明細書中に示すように合成することもできる。
Figure 2009508809
 合成図式１
合成図式１は、合成図式２の反応条件に厳密にしたがう。合成図式２においては、ＮＨＲ１Ｒ２は化合物１０である。ＮＨＲ１Ｒ２は、好ましい実施形態に含まれるように変化させることができる。ＮＨＲ１Ｒ２は市販され得るか、または、標準的な化学合成方法を使用して合成することもできる。ＮＨＲ１Ｒ２と化合物９または９ａの間での反応は、ハロ芳香族環上での標準的なアミノ化反応である。
本明細書中に記載される合成図式は、標準的なテキストの中に記載および引用される標準的な化学的方法を使用して行うことができる。当業者は、同等であるかまたは同様の機能を行うことが既知である、当該分野で公知である他の試薬に置き換えることができる。出発物質は市販されている試薬であり、反応は好ましくは、他に明記されている場合を除き、標準的な温度および圧力の反応条件下で標準的な研究室用のガラス製品の中で行われる。
Figure 2009508809
 合成図式２
（実験）
一般論：
原材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａｃｒｏｓ，ＦｉｓｃｈｅｒまたはＭａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。全ての溶媒はＡＣＳ等級またはそれ以上とした。反応は、必要に応じて乾燥窒素雰囲気下で行った。溶媒の「減圧下での」除去は、Ｂｕｃｈｉ装置を使用した、２５〜５０℃で４５Ｔｏｒｒでの回転蒸発を意味する。減圧乾燥は高真空下で行った。全てのＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎ−Ｇｅｍｉｎｉ ３００分光光度計を使用して、１Ｈ ＮＭＲについては３００ＭＨｚで、参照としてＣＨＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）またはＤＭＳＯ（２．５ｐｐｍ）を使用して、および１３Ｃ ＮＭＲについては７５ＭＨｚで、参照としてＣＤＣｌ３（７７．０ｐｐｍ）またはＤＭＳＯ（３９．４３）を使用して記録した。
メチル３−｛［４−（アセチルアミノ）フェニル］アミノ｝ブト−２−エノエート（３）：ＭｅＯＨ（０．７５Ｌ）中の４−アミノアセトニトリル（２）（２５３ｇ、１．６８ｍｏｌ）とメチルアセトアセテート（２１５ｇ、１．８５ｍｏｌ）の懸濁液を加熱して還流した。得られた溶液を１６時間還流させたまま維持し、その後、５℃に冷却した。得られたオフホワイトの沈殿を濾過し、ＭＴＢＥ（３×２００ｍＬ）で洗浄し、ブテノエート３（１９５ｇ、４７％の収率）を得た。元の液体を減圧下で濃縮し、濾過して、３の第２の生成物を淡いピンク色の固形物（１４１ｇ、３４％の収率、８１％の全体的な収率）として得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．２２（ｓ，１Ｈ），９．９７（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，２Ｈ），７．１１（ｄ，２Ｈ），４．６５（ｓ，１Ｈ），３．５６（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．９４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１６９．６４，１６８．０７，１５９．３３，１３６．４８，１３３．５５，１２４．５２，１１９．４４，８４．４７，４９．７７，２３．８１，１９．６８．
Ｎ−（４−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−６−イル）アセトアミド（４）：フェニルエーテル（１Ｌ）を２５５℃に加熱した。ブテノエート３（３３４ｇ、１．３５ｍｏｌ）を、温度を２４５〜２６０℃に維持しながら、注意深く少量ずつ（ｐｏｒｔｉｏｎｗｉｓｅ）添加した。添加の完了後、黄−オレンジ色の懸濁液をさらに１５分間、２５５℃に維持した。混合物をゆっくりと４０℃に冷却し、固形物を濾過によって回収し、ＥｔＯＡｃ（３×５００ｍＬ）、続いてＭｅＯＨ（３×５００ｍＬ）で洗浄し、ヒドロキシキノリン４を黄−オレンジ色の固形物（２５６ｇ、８８％の収率）として得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１１．５２（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），１０．０７（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ），７．４２（ｄ，１Ｈ），５．８４（ｓ，１Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，１Ｈ）．
Ｎ−（４−メトキシ−２−メチルキノリン−６−イル）アセトアミド（５）：硫酸ジメチル（２９４ｇ、２．３３ｍｏｌ）を、トルエン（１．５Ｌ）中のヒドロキシキノリン４（２８７ｇ、１．３３ｍｏｌ）の懸濁液に加え、混合物を６時間還流した。室温に冷却した後、得られた暗黄色の固形物を濾過によって回収し、トルエンで洗浄した。乾燥固体を水（２．５Ｌ）の中に溶解させ、３５％のＮａＯＨ水溶液（２９０ｇ）を使用してｐＨを１４に調整した。得られた黄褐色の沈殿を濾過によって回収し、多量の水で洗浄し、６０℃で減圧下で乾燥させて、メトキシキノリン５を明るい褐色の固形物（２５９ｇ、８５％の収率）として得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．１８（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），２．５５（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１６８．３６，１６０．９９，１５８．０７，１４４．８６，１３５．８７，１２８．２７，１２２．７８，１１９．２６，１０８．８０，１０１．２０，５５．６９，２５．０８，２３．９７．
２−メチルキノリン−４，６−ジアミン（７）：酢酸アンモニウム（１．３ｋｇ）を融解させ、メトキシキノリン５（２５６ｇ、１．１１ｍｏｌ）を添加した。暗色の溶液を１３５℃で４時間還流した。ＬＣ／ＭＳが５（Ｍ＋１＝２３１）の中間体６（Ｍ＋１＝２１６）への変換を示した後に、反応混合物を３７％のＨＣｌ（２．１Ｌ）および水（８００ｍＬ）の中に注いだ。混合物を１０時間還流し、その後、一晩かけて室温に冷却した。ＬＣ／ＭＳは、全ての中間体６のジアミノキノリン７（Ｍ＋１＝１７４）への変換を示した。混合物を５℃に冷却し、得られたジヒドロクロライド塩を濾過によって回収した。塩を水（１．５Ｌ）の中に、７５℃で溶解した。チャコール（１３ｇ、Ｄａｒｃｏ Ｇ−６０、−１００メッシュ）を暗色の溶液に加え、混合物を４５分間還流し、Ｃｅｌｉｔｅを通じて濾過した。黄色の濾液を冷却し、３５％のＮａＯＨ水溶液（１ｋｇ）を使用してｐＨを１４に調整した。得られた沈殿を濾過によって回収し、大量の水で洗浄し、減圧下で６０℃で乾燥させて、ジアミノキノリン７をオフホワイトの固形物（１３６ｇ、７１％の収率）として得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ７．４１（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｍ，２Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），６．０３（ｂｒ，ｓ，２Ｈ），５．０５（ｂｒ，ｓ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１５３．４２，１４９．４６，１４４．２８，１４２．０９，１２８．８４，１２０．５９，１１８．６０，１０２．１５，１０１．１１，２４．４２．
Ｎ−６−（２−クロロ−６−メチルピリミジン−４−イル）−２−メチルキノリン−４，６−ジアミン（９）：ジアミノキノリン７（７２．０ｇ、０．４１６ｍｏｌ）と２，４−ジクロロ−６−メチルピリミジン（８）（６７．８ｇ、０．４１６ｍｏｌ）を、エチレングリコール（１Ｌ）の中に懸濁した。３７％のＨＣｌ（３５ｍＬ、０．４３ｍｏｌ）の添加によって黄色の溶液を得、これを５０℃に加熱して、４．５時間維持した。混合物を冷水（１Ｌ）で稀釈し、これによって粘性の高い白色のペースト様の沈殿を得、混合物を、Ｃｅｌｉｔｅを通して濾過した。Ｃｅｌｉｔｅと、生成物および２置換された副生成物を含む固形を水（４Ｌ）の中でスラリー状にし、Ｃｅｌｉｔｅと不溶性の副生成物を濾過によって除去した。濾液のｐＨを、１ＮのＮａＯＨ水溶液（１Ｌ）を使用して１４に調整し、これによって、濾過によって取り除いた生成物の沈殿が生じた。湿り気のある生成物をエバポレータ（ｒｏｔｏｖａｐ）フラスコに移し、トルエン（３×１．５Ｌ）を用いた共沸水除去によって減圧下で乾燥させた。生成物９をオフホワイトの固形物（３３．４ｇ、２７％の収率；Ｎｏｔｅｂｏｏｋ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａ１３４−１３７）として得た。９の別のバッチ（７．４ｇ、１７％の収率；Ｎｏｔｅｂｏｏｋ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａ１３４−１３７）を、上記のような７の反応（２５．０ｇ、０．１４４ｍｏｌ）と回収によって同様に得た；ＭＳ［Ｍ＋１］＝３００，３０２；１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１６７．５１，１６２．５８，１５９．２２，１５７．６１，１５１．０５，１４５．９９，１３３．１７，１２８．９６，１２５．３９，１１７．３８，１１４．２３，１０２．４５，１０２．２６，２４．６８，２３．１９．
ＣＨＭＣ−１：エチレングリコール（５００ｍＬ）中の中間体９（３２．７ｇ、０．１０９ｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（２０．０ｍＬ、０．１１５ｍｏｌ）の懸濁液を９０℃に加熱し、金色の溶液を得た。２−アミノ−５−ジエチルアミノペンタン（３２．０ｍＬ、０．１６５ｍｏｌ）を添加し、混合物を１１０℃に加熱し、５．５時間維持した。混合物を室温に冷却し、ＥｔｏＡｃ（７５０ｍＬ）と１ＮのＮａＯＨ水溶液（５００ｍＬ）を添加して、粘性の高い白色のペースト様の沈殿を得た。固体をＣｅｌｉｔｅを通した濾過によって除去し、濾液の層を分離した。水層を、１ＮのＮａＯＨ（３００ｍＬ）を使用して２回塩基性化し、ＥｔＯＡｃ（７５０ｍＬ）を使用して戻し抽出した。混合した有機層をブライン（３×７５０ｍＬ）で洗浄し、Ｃｅｌｉｔｅを通して濾過し、減圧下で溶媒を除去して、茶色の油（４４ｇ）を得た。ヘプタンをこの油に添加し、数日間静置し、その後、溶媒をデカントした。この油を、別のバッチからの１２ｇの粗油とともに、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＥｔ３（７：３：０．５）を使用したシリカゲル（１．５ｋｇ）フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。
化合物を、複合体形成アッセイにおいて、ＧＥＦとのＲａｃ１の結合相互作用を阻害するそれらの能力について試験した。
図１は、Ｒａｃ１−Ｔｒｉｏ相互作用の阻害因子としてのＮＳＣ２３７６６の同定を示す。図１の上段のパネルにおいては、ＴｒｉｏＮとのＲａｃ１の相互作用に対する仮想スクリーニングによって予想した化合物のパネルの阻害作用を、複合体形成アッセイにおいて試験した。０．５μｇの（Ｈｉｓ）６タグ化ＴｒｉｏＮをＧＳＴ単独で、またはヌクレオチドを含まないＧＳＴ−Ｒａｃ１（２μｇ）と共に、１ｍＭの示したＮＣＩ化合物と１０μｌの懸濁したグルタチオン−アガロースビーズの存在下、または非存在下でインキュベートした。４℃で数分間のインキュベーションの後、ビーズが結合した（Ｈｉｓ）６−ＴｒｉｏＮを抗Ｈｉｓウェスタンブロッティングによって検出した。図１の下段のパネルにおいては、ＩｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎへのＣｄｃ４２の結合に対する化合物の効果を同様に決定した。約１μｇのＧＳＴ、またはＧＳＴタグ化Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎを、ヌクレオチドを含まない（Ｈｉｓ）６タグ化Ｃｄｃ４２（０．２５μｇ）とともに、同様の条件下でインキュベートした。データは、４回の別々の実験による結果の代表的なものである。
この目的のために、Ｒａｃ１を特異的に活性化させるが、Ｃｄｃ４２は活性化させないＴｒｉｏおよびＴｉａｍ−１（Ｇａｏら、２００１、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）、ならびにＩｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ、Ｃｄｃ４２特異的ＧＥＦ（Ｋａｒｎｏｕｂら、２００１、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を使用して、１ｍＭの個々の化合物の存在下におけるそれらのそれぞれの基質に対する結合活性をアッセイした。ＴｒｉｏとＴｉａｍ−１は、ＧＳＴ−Ｒａｃ１と一緒に共沈したが、ＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｃｄｃ４２とは共沈しなかった。化合物２３７６６の阻害作用は、Ｒａｃ１とそのＧＥＦとの間での相互作用に対して特異的に向けられていると思われる。なぜなら、これは、Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎに対するＣｄｃ４２の結合、さらには、ＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦに対するＲｈｏＡの結合も妨害しないからである（図１）。さらに、化合物２３７６６のＲａｃ１に対する阻害作用は用量依存性ある（図２）。
図２は、ＮＳＣ２３７６６によるＲａｃ１とのＧＥＦ相互作用の用量依存性の特異的阻害を示す。図２Ａにおいては、０．５μｇの（Ｈｉｓ）６タグ化ＴｒｉｏＮを、ＧＳＴ単独で、またはヌクレオチドを含まないＧＳＴ融合Ｃｄｃ４２もしくはＲａｃ１（２μｇ）とともに、様々な濃度のＮＳＣ２３７６６と１０μｌの懸濁させたグルタチオン−アガロースが含まれている結合緩衝液の中でインキュベートした。４℃で３０分のインキュベーションの後、ビーズが結合した（Ｈｉｓ）６−ＴｒｉｏＮを、抗Ｈｉｓウェスタンブロッティングによって検出した。ブロットを、濃度測定分析によって定量した。結果は、３回の測定の代表的なものである。図２Ｂにおいては、Ｃｏｓ−７細胞溶解物の中で発現させたｍｙｃタグ化Ｔｉａｍ１を（Ｈｉｓ）６−Ｒａｃ１とともに、漸増濃度のＮＳＣ２３７６６の存在下でインキュベートした。Ｔｉａｍ１とのＲａｃ１の会合を、抗ｍｙｃ免疫沈降の後で抗Ｈｉｓブロットによって試験した。図２Ｃにおいては、ＡＵタグ化ＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦをＣｏｓ−７溶解物の中で発現させ、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ＲｈｏＡと共に、様々な濃度のＮＳＣ２３７６６の存在下でインキュベートした。ＲｈｏＡが結合したＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦを、グルタチオンアガロースビーズによる親和性による沈殿後に抗ＡＵ抗体でプローブした。図２Ｄにおいては、ＧＴＰγＳとともにロードした（Ｈｉｓ）６−Ｒａｃ１を、ＧＳＴ−ＢｃｒＧＡＰまたはＧＳＴ−ＰＡＫ１（ＰＢＤ）と共に、２００μＭのＮＳＣ２３７６６の存在下、または非存在下でインキュベートし、ＧＳＴＢｃｒＧＡＰまたはＧＳＴ−ＰＡＫ１との相互作用を、グルタチオンアガロースビーズによる親和性による沈殿後に抗Ｈｉｓブロットによってプローブした。
化合物２３７６６がＲａｃ１のＧＥＦによって刺激されるヌクレオチド交換を阻害できるかどうかを決定するために、Ｒａｃ１のｍａｎｔＧＤＰ解離アッセイを、漸増用量の化合物２３７６６の存在下で行った。図３においては、ＮＳＣ２３７６６は、ＧＥＦによって刺激されるＲａｃ１ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換を特異的に阻害することにおいて有効であった。図３Ａにおいては、ＮＳＣ２３７６６は、Ｒａｃ１のＴｒｉｏＮによって触媒されるＧＤＰ／ＧＴＰ交換を、用量依存性の様式で阻害した。ｍａｎｔ−ＧＤＰとともにロードした２００ｎＭのＲａｃ１を、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、および０．５ｍＭのＧＴＰが含まれている交換緩衝液の中で、１００ｎＭのＴｒｉｏｎの存在下または非存在下（トップライン）で、２５℃でインキュベートした。漸増濃度のＮＳＣ２３７６６を、示したように交換緩衝液に加えた。図３Ｂにおいては、ＮＳＣ２３７６６は、Ｃｄｃ４２のＩｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎによって刺激されるＧＤＰ／ＧＴＰ交換に対しては効果を有していなかった。ｍａｎｔ−ＧＤＰとともにロードした２００ｎＭのＣｄｃ４２を、２００μＭのＮＳＣ２３７６６が含まれているか、もしくはＮＳＣ２３７６６が含まれていない、Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎの存在下または非存在下（トップライン）で、交換緩衝液の中でインキュベートした。図３Ｃにおいては、ＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦによって触媒されるＲｈｏＡの交換反応を、２００μＭのＮＳＣ２３７６６の存在下、または非存在下で、同様に行った。
図３Ａに示すように、漸増濃度で、化合物２３７６６は、Ｔｒｉｏによって触媒されるｍａｎｔＧＤＰ／ＧＴＰ交換を用量依存性の様式でブロック可能である。一方、化合物２３７６６は、同様の用量では、Ｃｄｃ４２のＩｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎによって刺激されるｍａｎｔＧＤＰ／ＧＴＰ交換（図３Ｂ）にも、ＲｈｏＡのＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦによって刺激されるｍａｎｔＧＤＰ／ＧＴＰ交換に対してもほとんど効果がない。これらの結果は、インビトロでは化合物、例えば２３７６６は、そのＧＥＦによるＲａｃ１の相互作用および活性化を特異的に阻害できることを示している。
インビボでのＲａｃ１活性に対する化合物２３７６６の阻害作用。線維芽細胞中では、Ｒａｃを、血清とＰＤＧＦを含む様々な刺激によって活性化する（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９５、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。これらの状況でのＲａｃの活性化は、１種類以上のＲａｃ特異的ＧＥＦ、例えばＴｉａｍ１によって媒介されると予想される。化合物２３７６６がどのようにインビボでＲａｃ活性に影響を与えるかを評価するために、１０％のウシ血清の中で増殖させたＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、様々な濃度の化合物２３７６６で一晩処理し、細胞の中の内因性Ｒａｃ１の活性化状態を、プローブとしてＲａｃ１−ＧＴＰと特異的に複合体を形成することができるＧＳＴ−ＰＡＫ（ＰＢＤ）ドメイン）を使用して検出する。図４は、ＮＳＣ２３７６６が細胞内でのＲａｃ１の活性化を特異的に阻害することにおいて有効であることを示している。図４Ａにおいては、ＮＳＣ２３７６６での処理を用いた、または処理を用いない、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中の内因性Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、およびＲｈｏＡの活性化状態を、エフェクタープルダウンアッセイによって検出した。１０％の血清の存在下での８０％の細胞集密度で、１００ｍｍの皿の中のＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、示した用量のＮＳＣ２３７６６で１２時間処理した。同様の量のＲａｃ１、Ｃｄｃ４２、またはＲｈｏＡが含まれている細胞溶解物を、アガロースで固定したＧＳＴ−ＰＡＫ１、ＧＳＴ−ＷＡＳＰ、またはＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｉｎと共にインキュベートし、共沈物について、抗Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、またはＲｈｏＡウェスタンブロット分析を行って、ＧＴＰが結合したＲｈｏタンパク質の量を明らかにした。図４Ｂにおいては、ＰＤＧＦによって刺激されるＲａｃ１の活性化に対するＮＳＣ２３７６６の阻害作用を、ＧＳＴ−ＰＡＫ１プルダウンアッセイによって決定した。様々な用量のＮＳＣ２３７６６を含むＤＭＥＭ培地中の血清を枯渇させたＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、１０ｎＭのＰＤＧＦで２分間処理した。図４Ｃにおいては、ＮＳＣ２３７６６は、ＰＤＧＦによって刺激される葉状仮足の形成を阻害した。５０μＭのＮＳＣ２３７６６の存在下または非存在下での一晩の血清枯渇の後、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を１０ｎＭのＰＤＧＦで、示した時間の間処理した。細胞を固定し、ローダミンで標識したファロイジンで染色した。
図４Ａに示すように、化合物２３７６６は、血清によって誘導されるＲａｃ１の活性化を強く阻害する。密度計による分析によって、化合物２３７６６のＩＣ５０が、これらの条件下では約４０μＭであることを明らかにする。一方、化合物２３７６６の阻害作用は、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅの中でもＲａｃに対して特異的であるようである。なぜなら、血清刺激下でのこれらの細胞中のＣｄｃ４２の活性化状態は、化合物２３７６６の存在によっては影響を受けないからである。興味深いことに、この試薬での処理によっては、細胞中のＲｈｏＡ−ＧＴＰのレベルのわずかな増大が導かれ、これは、Ｒａｃ１がＲｈｏＡ活性とカウンター反応する（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅａｃｔ）ことができることを示唆するこれまでの報告と一致する。化合物２３７６６がＰＤＧＦでの刺激によってＲａｃ１の活性化に影響を与えることができるかどうかを試験するために、化合物の存在下、または非存在下にある血清を枯渇させたＮＩＨ ３Ｔ３細胞を１０ｎＭのＰＤＧＦで２分間取り組み、細胞溶解物を、活性なＲａｃ１−ＧＴＰ種についてアッセイした。化合物２３７６６が存在しない条件下でのＰＤＧＦによって刺激されるＲａｃ活性と比較すると、５０μＭの２３７６６で処理した細胞は、ＧＴＰに結合したＲａｃの有意な減少を示し（図４Ｂ）、１００μＭの２３７６６の存在によって、細胞中のＲａｃ１−ＧＴＰの基底レベルよりも低いレベルが導かれる。したがって、インビトロでのＲａｃ１−ＧＥＦ相互作用の結果と一致して、化合物２３７６６は、インビボでＲａｃ１活性を特異的に阻害することができる。
ＰＤＧＦはＲａｃを活性化させ、線維芽細胞の中でのＲａｃによって媒介される膜ラッフルおよび葉状仮足を誘導する（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９５；Ｒｉｄｌｅｙら、１９９２，それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。Ｒａｃ１によって媒介される形態学的変化を阻害する化合物２３７６６の能力を評価するために、化合物２３７６６の非存在下、または化合物２３７６６の存在下での、ＰＤＧＦによって誘導されるアクチンの細胞骨格構造を試験した。図４Ｃに示すように、１０ｎＭのＰＤＧＦは、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の中での膜ラッフルおよび葉状仮足の形成を強力に刺激する。しかし、１００μＭの２３７６６の存在下では、ＰＤＧＦは、５分で、細胞の縁に葉状仮足を誘導することにおいてかろうじて有効であったにすぎず、化合物２３７６６で処理されなかった対照細胞が有意な葉状仮足構造を示す場合、１０分では完全に効果はない。これらの結果は、化合物２３７６６がＲａｃによって媒介されるアクチンの再生を阻害することにおいて有効であることを示唆している。
化合物２３７６６は、血清またはＴｒｉｏによって誘導される細胞増殖を特異的に阻害する。Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅの活性化は細胞増殖の調節に重要である。ドミナントネガティブなＲａｃの過剰発現は細胞増殖を遅らせる（Ｚｈｅｎｇら、１９９５ｂ、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。逆に、恒常的に活性なＲａｃは、線維芽細胞の増殖速度を増大させる（Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒら、１９９５、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。化合物２３７６６はＮＩＨ ３Ｔ３細胞の中でＲａｃ活性を低下させることができるので、正常なＮＩＨ ３Ｔ３細胞、および恒常的に活性なＲａｃ１であるＬ６１Ｌａｃ１を発現しているＮＩＨ ３Ｔ３細胞の増殖特性に対するその効果を試験した。
図５は、ＮＳＣ２３７６６がＲａｃ ＧＥＦによって刺激される細胞増殖および形質転換を特異的に阻害することを示している。図５Ａにおいては、野生型（ＷＴ）またはＬ６１Ｒａｃ１を発現しているＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、１００μＭのＮＳＣ２３７６６の存在下（−−−）または非存在下（−）で、５％の血清の中で増殖させた。細胞を、６ウェルプレートの中に、１ウェルあたり５×１０４個の細胞の密度で、３連に分けた。ＧＴＰが結合したＬ６１Ｒａｃ１およびＬ６１Ｒａｃ１を発現している細胞の内因性Ｒａｃ１を、漸増濃度のＮＳＣ２３７６６での１２時間の処理後に、ＧＳＴ−ＰＡＫ１プルダウンによってプローブした。図５Ｂにおいては、ＷＴまたはＧＥＦ（Ｔｉａｍ１、ＬｂｃまたはＶａｖ）を発現しているＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、１００μＭのＮＳＣ２３７６６の存在下（−−−）または非存在下（−）で、５％の血清の中で増殖させ、細胞数を１日に１回の細胞のカウントによって決定した。図５Ｃにおいては、ＧＳＴ、Ｌ６１Ｒａｃ１、またはＴｉａｍ１でトランスフェクトした細胞を、５０μＭのＮＳＣ２３７６６で、２日ごとに処理した。それぞれの細胞の病巣の数を、トランスフェクションの１４日後に定量した。図５Ｄにおいては、Ｔｉａｍ１を発現しているＮＩＨ ３Ｔ３細胞の安定なトランスフェクタントを、１００μＭのＮＳＣ２３７６６の存在下で、または非存在下で、０．３％の軟寒天培地の中で１４日間培養した。コロニーの数および形態を、顕微鏡下で調べた。
化合物２３７６６が存在しない条件下、または存在下での細胞の増殖速度の比較は、化合物２３７６６は野生型ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の増殖を遅らせるが、一方、Ｒａｃ１Ｌ６１を発現している細胞の増殖速度に対しては効果がないことを示している（図５Ａ）。ＧＴＰが結合したＧＳＴ−Ｒａｃ１Ｌ６１のレベルは、化合物での処理を用いた場合、または用いなかった場合にも変化しないままであったが、内因性のＲａｃ活性は、化合物２３７６６の存在によって有意に低下した（データは示さない）。これらの結果は、化合物２３７６６の細胞増殖に対する阻害作用が、細胞のＲａｃ活性を阻害するその能力と相関していることを示唆している。
Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅを直接活性化させるそれらの能力の理由から、Ｄｂ１ファミリーのＧＥＦは細胞増殖の強力な刺激因子である。化合物２３７６６は、Ｒａｃ特異的ＧＥＦであるＴｒｉｏによって誘導される細胞増殖を阻害できるが、Ｒｈｏ特異的ＧＥＦであるＬｂｃ、Ｃｄｃ４２特異的ＧＥＦであるＩｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ、または複数のＲｈｏタンパク質を活性化させるＧＥＦであるＶｅｖによって刺激される細胞増殖は阻害し得ない（図５Ｂ）。したがって、化合物２３７６６は、ＧＥＦによって誘導されるＲａｃの活性化によって引き起こされる細胞増殖を特異的に阻害することにおいて有効である。
化合物２３７６６によるＰＣ−３腫瘍細胞の表現形の反転。Ｒａｃ１活性の評価には、ガン細胞の過増殖および浸潤特性が関係している。次に、化合物２３７６６の効果を、前立腺ガン細胞株ＰＣ−３の増殖および浸潤能力に対して試験した。ＰＣ−３細胞は、前立腺ガンの患者の骨転移に由来する悪性前立腺ガン細胞である（Ｋａｉｇｈｎら、１９７９、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。これらは、形質転換性であり高度に浸潤性である（Ｌａｎｇら、２００２、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。ＰＴＥＮ腫瘍サプレッサーのｍＲＮＡは、これらの細胞の中では検出不可能である（Ｂａｓｔｏｌａら、２００２、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。ＰＴＥＮの消失は、以前から、ＰＩＰ３レベルの有意な上昇の理由から、Ｒａｃ１の過剰な活性化と相関付けられている（Ｌｉｌｉｅｎｔａｌら、２０００、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。ＰＣ−３細胞の中での内因性Ｒａｃ１の活性をＧＳＴ−ＰＡＫ（ＰＢＤ）でプローブすることによって調べる場合には、正常な前立腺上皮ＲＷＰＥ−１細胞のものよりも約１００％高いレベルのＧＴＰが結合したＲａｃが観察される（図５Ａ）。線維芽細胞から得られた結果と一致して、化合物２３７６６は、ＰＣ−３細胞の中でのＲａｃ１活性を阻害することができる（図６Ａ）。低いＲａｃ１活性と関係して、化合物２３７６６で処理したＰＣ−３細胞の増殖速度は、用量依存性の様式で化合物２３７６６によって阻害される（図６Ａ）。これらの結果は、化合物２３７６６が、Ｒａｃ１活性のダウンレギュレーションによってＰＣ−３腫瘍細胞の増殖を効率よく阻害できることを示唆している。
図６は、ＮＳＣ２３７６６が、ＰＣ−３前立腺ガン細胞の増殖、足場依存性増殖、および浸潤を阻害したことを示している。図６Ａにおいては、ＰＣ−３細胞を、示した濃度のＮＳＣ２３７６６を補充した５％のウシ血清の中で増殖させた。細胞を、９６ウェルの中に、１ウェルあたり１．５×１０３個の細胞で、３連に分けた。細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ細胞増殖アッセイキットを使用して、様々な日にアッセイした。図６Ｂにおいては、ＰＣ−３およびＲＷＰＥ−１前立腺上皮細胞（１．２５×１０３細胞／ウェル）を、様々な用量のＮＳＣ２３７６６の中で０．３％のアガロースの中で増殖させ、軟寒天の中に形成されたコロニーの数を、プレーティングの１２日後に定量した。図６Ｃにおいては、ＰＣ−３細胞を、２５μＭのＮＳＣ２３７６６の非存在下、または存在下で、３７℃で２４時間、浸潤チャンバーの中においた。Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスを通じて浸潤した細胞を、ギムザ（Ｇｉｅｍａｓａ）染色によって視覚化した。
ＰＣ−３細胞が過剰なＲａｃ１活性を含むと仮定すると、軟寒天上で増殖するＰＣ−３細胞の能力と、その足場依存性増殖特性に対する化合物２３７６６の効果を試験することができる。図６Ｂは、ＰＣ−３細胞が、正常な前立腺上皮ＲＷＰＥ−１細胞が増殖できない条件下で、軟寒天上に置かれてから１０日に容易にコロニーを形成することを示している。化合物２３７６６は、ＰＣ−３細胞のコロニー形成活性を効率よくブロックする。およそ１０％および１％のコロニー形成活性が、それぞれ、２５μＭおよび５０μＭの化合物２３７６６での細胞の処理後に残存する。さらに、処理した細胞のコロニーの大きさは、未処理細胞のコロニーの大きさよりもはるかに小さいように思える（図６Ｂ）。ＰＣ−３細胞は、高い浸潤活性を有していることが報告されている（Ｌａｎｇら、２００２、これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。これは、マトリゲル浸潤アッセイにおいて明らかである。同様の条件下では、ＲＷＰＥ−１細胞は非浸潤性である。２５μＭの用量では、化合物２３７６６は、ＰＣ−３細胞の浸潤を有意に阻害する（図６Ｃ）。
まとめると、これらの結果は、有効成分がＰＣ−３腫瘍細胞のＲａｃ１活性をダウンレギュレートできることを示しており、これによって、おそらく増殖、足場依存性増殖、および浸潤の表現形の反転が生じるであろう。
ＮＣＩ２３７６６と複合体を形成したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶構造
方法
タンパク質の精製：Ｈｉｓ６タグ化Ｒａｃ−１ドメイン（配列番号１の残基１から１８５）を発現している大腸菌ＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地の中で、６００ｎｍで０．８〜１．０の光学密度になるまで増殖し、０．５ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導した。回収した細胞を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２の中で、フレンチプレス（の中で溶解した。溶解物を、１６．２５０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）の中で１６，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって明澄化した。明澄化した溶解物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ）の中の５ｍＭのイミダゾールで予め平衡化させておいたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に通過させた。カラムを緩衝液Ａ中の２０ｍＭのイミダゾールで洗浄した。ベースラインに達した後、Ｈｉｓ６タグ化Ｒａｃ１を、緩衝液Ａ中の２５０ｍＭのイミダゾールを用いてカラムから溶出させ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールに対して透析し、トロンビン（Ｓｉｇｍａ）で一晩消化した。消化されたタンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールで平衡化させたＳｏｕｒｃｅ−１５Ｑ（Ｓｉｇｍａ）に通過させた。配列番号１の残基１から１８５が含まれているＲａｃ−１ドメインポリペプチドをフロースルーの中に回収した。その後、フロースルーを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）サイズ排除カラムに通過させた。Ｒａｃ−１に対応するピークをプールし、２２．５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化の試みに使用した。
結晶化：Ｒａｃ１・ＧＤＰの結晶を、２０％のＰＥＧ８０００、５％のエチレングリコール、１５％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＮＳＣ２３７６６の中で、ハンギングドロップ法を使用して２０℃で成長させた。複合体の結晶は一晩で現れ、２〜３日後にはそれらの最大サイズに達した。結晶を、１８％のＰＥＧ８０００、３．５％のエチレングリコール、１０．７％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴ，１４．３ｍＭのＮＳＣ２３７６６が含まれているドロップに移し、２５％のＰＥＧ８０００、５％のエチレングリコール、１５％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴが含まれているレザーバー全体に平衡化させた。２２時間の平衡化の後、結晶をマウントし、液体窒素の中で瞬時に凍結させた。
Ｘ線データの回収および構造解析：１．３５Åの解像度に設定した完全で余剰な回折データを、ＨＫＬ２０００ ｓｕｉｔｅを用いて組み立て、規模を設定した、１００Ｋの温度でのＡＤＳＣ Ｑｕａｎｔｕｍ ４ ＣＣＤ検出器上で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹ）光線Ｘ２６Ｃで回収した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ １９９７および２００３）。Ｒａｃ／ＮＳＣ２３７６６の結晶は、非対称単位あたり１つの複合体と、ａ＝４１．８Å、ｂ＝４０．０Å、ｃ＝５２．１Å、γ＝１０５．８３°の単位格子の大きさを有している、空間基Ｐ２１に属する。Ｒａｃ／ＮＳＣ２３７６６構造は、プログラムＭＯＬＲＥＰ（Ｖａｇｉｎ ＆ Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ １９９７）の研究モデルとしてのＲａｃ・ＧＤＰ（Ｋ．Ｓｋｏｗｒｏｎｅｋ ＆ Ｎ．Ｎａｓｓａｒ，非公開の観察）の座標を使用した分子の配置によって解析した。実際のモデルは、１．３５Åの解像データに対してＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ １９９７）の中のＴＬＳ基（Ｗｉｎｎ ２００３）を使用して精緻化した。精緻化の際には、Ｉｌｅ３６、Ｔｒｐ５６、Ｔｙｒ６４、Ａｒｇ６８、およびＰｒｏ７３によって形成される疎水性ポケットの中の余分な密度を、電子密度において明らかにした。この余分な密度はＲａｃの一部ではなく、金属イオンまたは水分子には対応しない。続いて、ＮＳＣ２３７６６分子をこの密度でモデル化し、実験データに対して精緻化した。
表１は、上記で解析し、部分的に精緻化したＲａｃ／ＮＳＣ２３７６６構造の原子座標を示す。表２は、１５．１／２０．５の結晶学的残余（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅｓｉｄｕａｌ）Ｒ／Ｒｆｒｅｅと、良好な立体化学を有している、１．５０Åの解像度へのさらなる精緻化を示す。
いくつかの残基の側鎖は、電子密度においてはほとんど分解されないことに留意すべきである。これらは、通常、原子座標リストの中のアラニンに短縮される（例えば、表１または表２）。
加えて、本明細書中に示される手順またはそれらに対する他の詳細な補足に関する情報は、引用により本明細書中に具体的に組み入れられる、引用される参考文献に記載されている。
改良またはバリエーションを、本発明の新規の教示から逸脱することなく本明細書中に記載される好ましい実施形態に対して行うことができることは、当業者に明らかである。全てのこのような改良およびバリエーションは、本明細書中に取り込まれ、特許請求の範囲内であるように意図される。
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（参考文献）
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図１は、Ｒａｃ１−Ｔｒｉｏ相互作用の阻害因子としてのＮＳＣ２３７６６の同定を示す。 図２は、ＮＳＣ２３７６６による、ＧＥＦのＲａｃ１との相互作用の用量依存的特異的阻害を示す。 図３は、ＮＳＣ２３７６６がＧＥＦによって刺激されたＲａｃ１ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換を特異的に阻害することにおいて有効であったことを示す。 図４は、ＮＳＣ２３７６６が細胞内でＲａｃ１の活性化を特異的に阻害することにおいて有効であったことを示す。 図５は、ＮＳＣ２３７６６が、Ｒａｃ ＧＥＦによって刺激された、細胞増殖および形質転換を特異的に阻害したことを示す。 図６は、ＰＣ−３前立腺ガン細胞の増殖、足場非依存性増殖、および浸潤を阻害したことを示す。

Claims (92)

  1. 哺乳動物のＲｈｏファミリーのタンパク質によって媒介される適応症を処置するための方法であって、そのような処置が必要な被験体に対して、以下の式（ＩＩａ）を有している少なくとも１種類の化合物または式（ＩＩａ）の化合物の、塩の安全であり有効な量を投与する工程が含まれる、方法：
    Figure 2009508809
     （式中：
    Ｒ１からＲ２は、Ｈ、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ’、および−Ｘ−Ｙ−Ｘ’からなる群より別々に選択され；式中、
    Ｘは、−ＣＲ７Ｒ８であり；
    Ｘ’は−ＣＨＲ７Ｒ８であり；
    ＡｌｋはＣ２〜Ｃ１８の置換されているか、または未置換の炭化水素鎖であり；
    Ｙは、Ｃ２〜Ｃ８の置換されているか、または未置換のアルキレン鎖であり；
    Ｒ６は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；ならびに
    Ｒ７およびＲ８は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群より別々に選択される。）
  2. 前記Ａｌｋが、ハロ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、ヒドロキシ、またはアセチルで置換される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＹがＮＲ６基で置換される、請求項１に記載の方法。
  4. 哺乳動物のＲｈｏファミリーのタンパク質によって媒介される適応症を処置するための方法であって、そのような処置が必要な被験体に対して、以下の式（ＩＩＩ）を有している少なくとも１種類の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物の塩の、安全であり有効な量を投与する工程が含まれる、方法：
    Figure 2009508809
     （式中：
    Ｒ１０からＲ１２は、Ｈ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、分岐した（Ｃ３〜Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ＮＯ２、およびＮＨ２からなる群より別々に選択される。）
  5. Ｒ１０からＲ１２が、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、または分岐している（Ｃ３〜Ｃ４）アルキルからなる群より別々に選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 哺乳動物のＲｈｏファミリーのタンパク質によって媒介される適応症を処置するための方法であって、そのような処置が必要な被験体に対して、以下の式（ＩＶ）を有している少なくとも１種類の化合物またはその薬学的に許容される塩の、安全であり有効な量を投与する工程が含まれる、方法：
    Figure 2009508809
  7. 前記化合物が、Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミンである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記哺乳動物のＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅが、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、ＲｈｏＤ、ＲｈｏＥ／Ｒｎｄ３、Ｒｎｄ１／Ｒｈｏ６、Ｒｎｄ２／Ｒｈｏ７、ＲｈｏＧ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、Ｃｄｃ４２、ＴＣ１０、ＴＴＦ／ＲｈｏＨ、ＲｈｏＬ、Ｃｈｐ、ＷＲＣＨ１、ＴＣＬ、ＲＩＦ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅが、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｃ３、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅがＲａｃ１である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記化合物が、Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅとの相互作用を通じてＲｈｏ調節経路と相互作用する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅが、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、およびＲａｃ３からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅがＲａｃ１である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記適応症が、白血病、前立腺ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、肺ガン、乳ガン、肝臓ガン、頭頸部ガン、結腸ガン、膀胱ガン、非ホジキンリンパ腫、および黒色腫からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  15. 前記適応症が異常な細胞増殖である、請求項１に記載の方法。
  16. 前記適応症がガン細胞の増殖である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記適応症が、高血圧、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、脳虚血、脳血管痙攣、神経変性、脊髄損傷、乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、脳腫瘍、または肺ガン、血栓疾患、喘息、緑内障、骨粗鬆症、および勃起不全からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  18. Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミンと薬学的に許容される担体が含まれている、医薬組成物。
  19. Ｎ６−（２−（（４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル）アミノ）−６−メチル−４−ピリミジニル）−２−メチル−４，６−キノリンジアミン化合物が、少なくとも１重量％である、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. さらに別の薬学的有効成分が含まれている、請求項１８に記載の医薬組成物。
  21. 前記第２の薬学的有効成分が、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害因子、プレニル−プロテイントランスフェラーゼ阻害因子、ゲラニルゲラニル−プロテイントランスフェラーゼ阻害因子、毒素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 空間基Ｐ２１と、ａ＝約４１．８オングストローム、ｂ＝約４０．０オングストローム、ｃ＝約５２．１オングストローム、およびβ＝約１０５．９３°の単位格子を有している、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶。
  23. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが、以下の式（ＩＩａ）を有している化合物または式（ＩＩａ）の化合物の塩と複合体を形成する、請求項２２に記載の結晶：
    Figure 2009508809
     （式中：
    Ｒ１からＲ２は、Ｈ、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ’、および−Ｘ−Ｙ−Ｘ’からなる群より別々に選択され；式中、
    Ｘは、−ＣＲ７Ｒ８であり；
    Ｘ’は−ＣＨＲ７Ｒ８であり；
    ＡｌｋはＣ２〜Ｃ１８の置換されているか、または未置換の炭化水素鎖であり；
    Ｙは、Ｃ２〜Ｃ８の置換されているか、または未置換のアルキレン鎖であり；
    Ｒ６は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；ならびに
    Ｒ７およびＲ８は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群より別々に選択される。）
  24. 前記結晶が、表１の原子構造座標を特徴とする三次元構造を有している、結晶Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ。
  25. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが、以下の式（ＩＩａ）を有している化合物または式（ＩＩａ）の化合物の塩と複合体を形成する、請求項２４に記載の結晶：
    Figure 2009508809
     （式中：
    Ｒ１からＲ２は、Ｈ、−Ｘ−Ａｌｋ、−Ｘ−Ａｌｋ−Ｘ’、および−Ｘ−Ｙ−Ｘ’からなる群より別々に選択され；式中、
    Ｘは、−ＣＲ７Ｒ８であり；
    Ｘ’は−ＣＨＲ７Ｒ８であり；
    ＡｌｋはＣ２〜Ｃ１８の置換されているか、または未置換の炭化水素鎖であり；
    Ｙは、Ｃ２〜Ｃ８の置換されているか、または未置換のアルキレン鎖であり；
    Ｒ６は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；
    Ｒ７およびＲ８は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群より別々に選択される。）
  26. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが含まれている結晶を作成する方法であって、前記結晶Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅには、配列番号１の配列のアミノ酸残基１から１８５が含まれ；ここでは、前記結晶は、５．０オングストロームより高い解像度での原子座標の決定のためのＸ線を効率よく回折し；前記結晶は、空間基Ｐ２１と、ａ＝約４１．８オングストローム、ｂ＝約４０．０オングストローム、ｃ＝約５２．１オングストローム、およびβ＝約１０５．９３°の単位格子を有しており、
    前記方法には、２０％のＰＥＧ ８０００、５％のエチレングリコール、１５％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＮＳＣ２３７６６が含まれている緩衝液を使用して、２０℃で、ハンギングドロップ法によって結晶を成長させる工程；ならびに、
    １８％のＰＥＧ ８０００、３．５％のエチレングリコール、１０．７％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴ、１４．３ｍＭのＮＳＣ２３７６６が含まれている液滴の中で、２５％のＰＥＧ ８０００、５％のエチレングリコール、１５％のＤＭＳＯ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液が含まれているレザーバー上で、結晶を平衡化させる工程
    が含まれる、方法。
  27. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定する方法であって：
    （ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅが含まれている複合体の結晶を得る工程；
    （ｂ）結晶の原子座標を得る工程；および
    （ｃ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定するために、原子の座標と１つ以上の分子モデル化技術を使用する工程
    が含まれる、方法。
  28. ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ Ｔｒｐ−５６、Ｌｙｓ−５、Ｖａｌ−７、Ｓｅｒ−７１、Ｉｌｅ−３６、Ｔｙｒ−６４、Ａｒｇ−６８、およびＰｒｏ−７３の構造座標によって定義される結合ポケットが含まれている分子または分子複合体；または
    ｂ）前記分子または分子複合体のホモログであって、約１．５オングストロームは超えない前記アミノ酸の骨格原子による標準偏差を有している結合ポケットが含まれているホモログ、
    と会合する化学物質の能力を評価するための方法であって、
    （ｉ）化学物質と分子または分子複合体の結合ポケットとの間でフィッティング操作を行うために、コンピューターによる手段を使用する工程；および
    （ｉｉ）化学物質と結合ポケットとの間での結合を定量するために、前記フィッティング操作の結果を分析する工程、
    が含まれる、方法。
  29. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性を阻害するための化合物であって、その活性部位は、空間基Ｐ２１と、ａ＝約４１．８オングストローム、ｂ＝約４０．０オングストローム、ｃ＝約５２．１オングストローム、およびβ＝約１０５．９３°の単位格子を有しているＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶による三次元構造を示す、化合物。
  30. ＧＤＰに結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶。
  31. 結晶Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅであって、ここでは、前記結晶は、表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３の原子と比較して、６Å以下、５Å以下、４Å以下、３Å以下、２Å以下、１Å以下の標準偏差を有している原子座標を有していることを特徴とする三次元構造を有する、結晶Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ。
  32. 表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３の原子が、ペプチド骨格原子である、請求項３１に記載の結晶。
  33. 表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３の原子と比較して、６Å以下、５Å以下、４Å以下、３Å以下、２Å以下、１Å以下の標準偏差を有している原子座標。
  34. 表１または表２のアミノ酸３０〜３９および５９〜７３の原子がペプチド骨格原子である、請求項３３に記載される座標。
  35. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの三次元構造を特性決定する方法であって：
    （ａ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶を得る工程；および
    （ｂ）結晶化されたＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの原子座標を得る工程
    が含まれる、方法。
  36. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合させられたリガンドの三次元構造を特性決定する方法であって：
    （ａ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合させられたリガンドの結晶を得る工程；および
    （ｂ）結晶化されたリガンドとＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの原子座標を得る工程
    が含まれる、方法。
  37. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定する方法であって：
    （ａ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの結晶を得る工程；および
    （ｂ）結晶化されたＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの原子座標を得る工程；および
    （ｃ）ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用する物質を同定するために、原子座標と１つ以上の分子モデル化技術を使用する工程
    が含まれる、方法。
  38. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を設計する方法であって、表１または表２のデータの少なくとも一部にアクセスする工程、および前記データを利用してＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに対する１つ以上の化合物の結合をモデル化する工程が含まれる、方法。
  39. 前記モデル化工程が、化合物のＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位との相互作用をモデル化することによって、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合する化合物の可能性を予想する工程が含まれる、請求項１に記載の方法。
  40. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅとリガンドとの間での１つ以上の相互作用を同定するために、前記データを利用する工程がさらに含まれる、請求項１に記載の方法。
  41. 前記１つ以上の相互作用が、リガンドとタンパク質との間での１種類以上の水素結合；リガンドとタンパク質との間での１種類以上の静電気的相互作用；１種類以上の疎水性相互作用；リガンドとタンパク質との間での１種類以上の共有結合；タンパク質原子の位置、例えば、リガンド結合するアミノ酸側鎖の中での１つ以上の変化；その位置が柔軟性を維持することができる立体構造に明確に定義される、原子のうちの１つ以上の変化；１つ以上の水素結合ネットワーク；水素結合ネットワークへの１つ以上の構造変化、Ｍｇ２＋との相互作用への１つ以上の構造変化、ＧＤＰとの相互作用への１つ以上の構造変化、およびＧＴＰとの相互作用への１つ以上の構造変化からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を同定する方法であって、請求項４０に記載される１つ以上の相互作用が含まれるデータを得る工程、およびＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅと相互作用するように化合物をモデル化する工程が含まれ、ここでは、化合物には、請求項４０に記載される１つ以上の相互作用、または請求項４０に記載される１つ以上の相互作用の改善が含まれる、方法。
  43. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ阻害因子を設計する方法であって、ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＸ線結晶構造の座標を得る工程、およびＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる、方法。
  44. Ｍｇ２＋のＴｈｒ３５結合を阻害する化合物を同定する工程が含まれる、請求項４３に記載の方法。
  45. アミノ酸残基６０〜６４が含まれているループの中での立体構造の変化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
  46. Ｍｇ２＋を置換することによりＡｌａ５９を阻害する化合物を同定する工程が含まれる、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記化合物がＡｌａ５９に水素結合する、請求項４６に記載の方法。
  48. ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣに結合することを阻害する化合物を同定する工程が含まれる、請求項４３に記載の方法。
  49. ＲＡＣ特異的ＧＥＦがＲＡＣから解離することを阻害する化合物を同定する工程が含まれる、請求項４３に記載の方法。
  50. スイッチＩのアミノ酸の中での立体構造の変化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる、請求項４３に記載の方法。
  51. スイッチＩＩのアミノ酸の中での立体構造の変化を阻害する化合物を同定する工程が含まれる、請求項４３に記載の方法。
  52. 前記化合物が、Ｌｅｕ７０またはＳｅｒ７１、あるいは両方に対する水素結合として同定される、請求項４３に記載の方法。
  53. 前記化合物が、Ｌｅｕ６７、Ｇｌｎ７４、Ａｓｐ５７、またはＳｅｒ７１、あるいはそれらの組み合わせに対する水素結合として同定される、請求項４３に記載の方法。
  54. 前記化合物が、Ｖａｌ３６、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、またはＰｒｏ７３、あるいはそれらの組み合わせとファンデルワールス接触しているとして同定される、請求項４３に記載の方法。
  55. プロテアソーム阻害因子を同定する方法であって、表１または表２の座標の１つ以上にアクセスする工程、および表１または表２のリガンドの座標の１つ以上の、約１．０から２．０オングストロームまたは約２．５から５．０オングストローム以内の範囲の位置を占めている化合物を同定する工程が含まれる、方法。
  56. 前記化合物は、表１〜５の少なくとも１つのリガンドの１つ以上の座標の、約１．２から１．７オングストローム、または約２．６から３．５オングストローム以内の位置を占めている、請求項５５に記載の方法。
  57. プロテアソーム阻害因子を同定する方法であって：
    （ａ）リガンドとＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅとの間での１つ以上の相互作用を同定する工程；および
    （ｂ）前記リガンドとサブユニットとの間での相互作用を修飾するために、前記リガンド上の置換基を変化させる工程
    が含まれる、方法。
  58. リガンドがＮＳＣ２３７６６である、請求項５７に記載の方法。
  59. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅに結合する可能性がもっとも高い化合物を同定するために、１つ以上の化合物のセットをスクリーニングする方法であって、
    （ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位の中での、１つ以上の化合物のそれぞれについてのドッキングエネルギーをコンピューターによって決定する工程であって、ここでは、個々のそれぞれのドッキングエネルギーは、前記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する前記化合物の結合の可能性を示す工程；および、
    （ｂ）閾値を上回る前記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する結合の可能性を有していると示された１つ以上の化合物を選択する工程、
    が含まれる、方法。
  60. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位に結合する可能性がある化合物を同定する方法であって、
    （ａ）Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅの活性化部位の中での、１つ以上の化合物のそれぞれについてのドッキングエネルギーをコンピューターによって決定する工程であって、ここでは、個々のそれぞれのドッキングエネルギーは、前記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する前記化合物の結合の可能性を示す工程；および、
    （ｂ）閾値を上回る前記Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ活性化部位に対する結合の可能性を有していると示された１つ以上の化合物を選択する工程、
    が含まれる、方法。
  61. 前記活性化部位が、表１または表２のタンパク質原子の１つ以上を含む、請求項５９〜６０のいずれかに記載の方法。
  62. 表１または表２に提供される原子座標の原子と比較して、６．０Å以下、５．５Å以下、５．０Å以下、４．５Å以下、４．０Å以下、３．５Å以下、３．０Å以下、２．５Å以下、２．０Å以下、１．７Å以下、１．５Å以下、１．４Å以下、１．３Å以下、１．２Å以下、１．１Å以下、１．０Å以下、０．９Å以下、０．８Å以下、０．７Å以下、０．６Å以下、０．５Å以下、０．４Å以下、０．３Å以下、０．２Å以下、または０．１Å以下の標準偏差を有している、原子座標。
  63. 前記活性化部位が、表１または表２に提供される原子座標の原子と比較して、６．０Å以下、５．５Å以下、５．０Å以下、４．５Å以下、４．０Å以下、３．５Å以下、３．０Å以下、２．５Å以下、２．０Å以下、１．７Å以下、１．５Å以下、１．４Å以下、１．３Å以下、１．２Å以下、１．１Å以下、１．０Å以下、０．９Å以下、０．８Å以下、０．７Å以下、０．６Å以下、０．５Å以下、０．４Å以下、０．３Å以下、０．２Å以下、または０．１Å以下の標準偏差を有する原子座標を有しているタンパク質原子を含む、請求項５９に記載の方法。
  64. 表１または表２に提供される原子座標の原子が、スイッチＩのアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、スイッチＩＩのアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子を含む、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  65. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅ（配列番号１を参照のこと）のアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  66. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、およびＡｓｐ３８から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  67. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  68. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７４から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  69. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  70. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６およびＬｅｕ７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  71. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｌｅｕ７０、およびＳｅｒ７１から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  72. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、およびＬｅｕ７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  73. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｔｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸３０〜３９から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  74. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｔｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ｐｈｅ３７、またはＡｓｐ３８から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸５６〜７０から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  75. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧｌｙ３０、Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｐｒｏ３４、Ｖａｌ３６、およびＰｈｅ３７から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  76. 表１または表２に提供される原子座標の原子に、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｈｒ３５およびＶａｌ３６から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子と、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＴｒｐ５６、Ａｌａ５９、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ７１、およびＰｒｏ７３から選択されるアミノ酸に由来する少なくとも１つの原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標または請求項６３に記載の方法。
  77. 表１または表２に提供される原子座標の原子にＭｇ２＋原子が含まれる、請求項６２に記載の原子座標。
  78. 前記原子が、選択されたアミノ酸の全ての原子、選択されたアミノ酸の骨格原子のみ、および選択されたアミノ酸のα炭素原子のみからなる群より選択される、請求項６２に記載の原子座標。
  79. 前記活性化部位の中での前記化合物の立体構造を決定する工程がさらに含まれる、請求項６３に記載の方法。
  80. 前記ドッキングエネルギーを決定する工程に、さらに、前記活性化部位の格子に基づく受容体のフィールドの説明を作成する工程が含まれる、請求項６３に記載の方法。
  81. 前記ドッキングエネルギーを決定する工程に、さらに、前記活性化部位の中での前記化合物の最適な立体構造を決定する工程が含まれる、請求項６３に記載の方法。
  82. 前記ドッキングエネルギーを決定する工程に、さらに、前記活性化部位の中に前記化合物の原子を組み立て、それによって前記活性化部位に適合させる工程が含まれる、請求項６３に記載の方法。
  83. 請求項６２に記載される原子座標が含まれている、コンピューターで読み取ることができる媒体。
  84. 表１または表２のタンパク質原子の原子座標が含まれている、請求項８３に記載のコンピューターで読み取ることができる媒体。
  85. 表１または表２のリガンドについての原子座標が含まれている、コンピューターで読み取ることができる媒体。
  86. リガンドがＮＳＣ２３７６６である、請求項８５に記載のコンピューターで読み取ることができる媒体。
  87. ＧＤＰが結合したＲａｃ−１ ＧＴＰａｓｅについての原子座標の少なくとも一部が含まれている、コンピューターで読み取ることができる媒体。
  88. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸１〜１８５が含まれている、請求項８７に記載のコンピューターで読み取ることができる媒体。
  89. Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのＧＤＰ以外のリガンドの原子座標の少なくとも一部がさらに含まれている、請求項８７に記載のコンピューターで読み取ることができる媒体。
  90. 座標が、Ｒａｃ−１ ＧＴＰａｓｅのアミノ酸１〜１８５についての座標に満たない、請求項８７または請求項８８に記載のコンピューターで読み取ることができる媒体。
  91. 請求項６２に記載される座標が含まれている、コンピューターシステム。
  92. プロテアソーム／リガンド複合体についての構造を作成すること、および／またはそれについての合理的な薬物の設計を行うことができる、請求項９１に記載のコンピューターシステム。
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