WO2012157389A1 - DOCK-Aサブファミリー分子によるRac活性化を制御する低分子化合物及びその用途 - Google Patents

DOCK-Aサブファミリー分子によるRac活性化を制御する低分子化合物及びその用途 Download PDF

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WO2012157389A1
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phenylpyrazolidine
disease
arylidene
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宣規 福井
昭彦 錦見
金井　求
大輔 神田
貴士 齊藤
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国立大学法人九州大学
国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a low molecular weight compound having an action of suppressing activation of Rac via DOCK2, DOCK180, or DOCK5 belonging to DOCK-A subfamily, in particular, association of DOCK2, DOCK180, or DOCK5 with Rac It is related with the novel pharmaceutical use of the pyrazolidinedione derivative which has the effect
  • Immune response is essential for biological defense, while immune response causes immune-related diseases such as autoimmune diseases and allergic diseases, and also causes rejection at the time of transplantation. Such an inappropriate immune response is caused by immune cells such as lymphocytes infiltrating into the target tissue and being activated. For this reason, if it is possible to control the movement and activation of immune cells based on the structure and function of intracellular proteins, it is considered useful for the treatment and prevention of autoimmune diseases and rejection reactions. On the other hand, it is no exaggeration to say that the reason why “cancer” is “cancer” is its invasive ability and metastatic ability. Taking into account that the presence or absence of metastasis is one of the important factors that define the prognosis of cancer, controlling the movement, invasion and adhesion of cancer cells is the next-generation cancer treatment. It is considered to have an important meaning.
  • the immune response includes chemokine-stimulated lymphocyte migration, T cell receptor (TCR) recognition of homologous or self-peptide bound to major histocompatibility antigen (MHC), interaction with ligands of costimulatory and adhesion molecules,
  • TCR T cell receptor
  • MHC major histocompatibility antigen
  • cytokine release a complex cascade of intracellular signal transduction pathway activation and cellular responses resulting from intermolecular interactions such as cytokine release, which is the key to lymphocyte proliferation and tissue destruction.
  • TCR signaling pathway has been the target of drug discovery.
  • drugs such as calcineurin inhibitor cyclosporine and FK560 are effective in suppressing graft rejection. It has been developed as an agent.
  • FTY720 a functional antagonist of sphingosine 1-phosphate receptor, was developed as a novel immunosuppressive agent that inhibits the export of mature lymphocytes from thymus and secondary lymphoid tissues.
  • Non-Patent Document 1 Changes in cell polarity and remodeling of the cytoskeleton are essential for cell movement including lymphocyte migration (see, for example, Non-Patent Document 1 etc.), all of which are low, such as Rho, Rac, and Cdc42. It is known that it is controlled by molecular G protein (GTPase) (see, for example, Non-Patent Documents 2 to 5). Among these, particularly, Rac provides a driving force during cell movement by forming actin-rich projections called leaf-like processes (see Non-Patent Documents 3 and 6). For this reason, if Rac activation can be suppressed specifically in immune cells, it is expected that an immunosuppressant based on a new function can be discovered.
  • GTPase molecular G protein
  • Rh Ras-associated steatosis .
  • Rac itself consists of three isoforms and is a molecule that is ubiquitously expressed, making it unsuitable for drug discovery.
  • CDM family molecules In C. elegans, humans, and Drosophila, structurally homologous molecules such as CED5, DOCK180, and Myoblast city (MBC) have been identified. These molecules have been abbreviated as CDM family molecules, and all of them are considered to be involved in cytoskeleton reconstruction by functioning upstream of Rac (see, for example, Non-Patent Documents 7 to 12). ).
  • DOCK2 is a member of a CDM family molecule that is specifically expressed in immune cells such as hematopoietic cells in humans and mice (Non-patent Document 13), and about 1830 having SH3 domain, DHR-1 domain, and DHR-2 domain It consists of amino acids (human: 1831, mouse 1828).
  • DOCK2 is indispensable for lymphocyte migration by preparing a knockout mouse in which DOCK2 is deleted (see Non-Patent Document 14). Furthermore, DOCK2 is indispensable for Rac activation because DOCK2-deficient lymphocytes cannot detect active Rac even when stimulated with various chemokines, and DOCK2 regulates lymphocyte migration through Rac activation. It is thought that. Incidentally, Rac is “inactive” when GDP is bound, and “active” when GTP is bound, and functions as a “molecular switch” in signal transduction through the GDP / GTP exchange reaction. DOCK2 is believed to associate with Rac via its DHR-2 domain and catalyze the GTP / GDP exchange reaction.
  • DOCK180 is known to be involved in invasion and malignant transformation in glioblastoma and other cancers (see Non-Patent Documents 15 to 19).
  • JP 2004-177226 A JP 2004-226418 A Special table 2004-534072 gazette Special table 2007-506661 gazette
  • the present invention targets the above-mentioned DOCK2, DOCK180, or DOCK5, and suppresses Rac activation via DOCK2, DOCK180, or DOCK5, thereby causing a disease or pathology that develops or exacerbates in relation to Rac activation. It aims at providing the pharmaceutical composition for preventing or treating.
  • the present invention is based on a mechanism of action different from that of conventional immunosuppressive agents, which has a function of controlling immune response by targeting DOCK2 and suppressing activation of Rac via DOCK2.
  • the object is to provide a pharmaceutical composition. More specifically, the present invention relates to an immunosuppressive agent effective for suppressing transplant rejection in transplantation medicine, and to prevent or treat immune-related diseases such as autoimmune diseases and allergic diseases caused by an excessive immune response.
  • the purpose is to provide effective drugs.
  • the present invention targets DOCK180 or DOCK5, and suppresses RCK activation via DOCK180 or DOCK5, thereby suppressing cancer cell invasion, migration, and anchorage-independent growth. It aims at providing the pharmaceutical composition useful as an anticancer agent with the effect
  • DOCK2 is a molecule that activates Rac, which is important for the migration and activation of lymphocytes, neutrophils and plasmacytoid dendritic cells (pDC) (Non-patents) References 20 to 24), when heart transplantation was performed on knockout mice deficient in DOCK2, transplant rejection could be suppressed without administration of an immunosuppressant, and allograft hearts could be engrafted for a long time, and DOCK2 It was confirmed that the onset of autoimmune disease can be blocked by deficiency of (see Experimental Example 1). Based on this finding, DOCK2 is considered to be an excellent molecular target for developing drugs for preventing or treating immune-related diseases and for developing immunosuppressive drugs.
  • pDC plasmacytoid dendritic cells
  • the present inventors expressed DOCK2 full-length or its DHR-2 domain in mammalian cells or E. coli, and used an assay system to detect GTP-bound Rac activated by DOCK2, using the activity of Rac by DOCK2.
  • a lead compound that suppresses oxidization, and the lead compound suppresses migration and activation of lymphocytes and neutrophils in vitro, and in an in vivo test using an autoimmune model animal, the model animal It was confirmed that the onset of autoimmune diseases can be significantly suppressed.
  • an analog having a structure similar to that of the lead compound and having an action of suppressing Rac activation in the same manner as the lead compound was developed from the structural correlation with the lead compound.
  • the series of compounds targeted by the present invention is partly in common with the pyrazolidinedione derivatives described in Patent Documents 3 and 4, but conventionally, pyrazolidinedione derivatives have been used in immune cells via DOCK2. It is not known that it has an action of suppressing the activation of Rac and of course an action of suppressing an inappropriate immune response.
  • the present inventors have a series of compounds having the above-mentioned action, not only DOCK2, but also the action of suppressing Rac activation via DOCK180 or DOCK5, particularly the action of inhibiting the GEF activity of DOCK180 and DOCK5. They found that cancer cell invasion, migration, and anchorage-independent growth were suppressed.
  • the present invention has been developed by accumulating knowledge obtained through these studies, and includes the following aspects.
  • Z represents methine (C—H) or a nitrogen atom (N), and X represents a substituent represented by the following formula:
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n means an integer of 0-2. ].
  • the above-mentioned pyrazolidinedione derivative is a compound in which R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group or a methyl group in the general formula (1), (I-1) or (I-2) Rac activation inhibitor described in the above.
  • the Rac activation inhibitor of the present invention has an effect of inhibiting Rac activation by DOCK2, DOCK180 or DOCK5, and inhibits GEK activity of DOCK2, DOCK180 or DOCK5 as shown in Test Examples 4 and 9 described later. Therefore, it can also be called a DOCK2 inhibitor, a DOCK180 inhibitor, or a DOCK5 inhibitor.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease or condition associated with Rac activation (II-1) or a pyrazolidinedione derivative according to any one of (I-6) or (I-6)
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease or condition that develops or exacerbates in association with Rac activation comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • (II-2) The pharmaceutical composition according to (II-1), wherein the Rac activation is Rac activation via DOCK2, DOCK180 or DOCK5.
  • Z represents methine (C—H) or a nitrogen atom (N), and X represents a substituent represented by the following formula:
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n means an integer of 0-2.
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a patient suffering from or possibly suffering from a disease or condition that develops or exacerbates in relation to Rac activation Having a step of A method for preventing or treating a disease or condition associated with Rac activation.
  • the above-mentioned pyrazolidinedione derivative is a compound in which R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or a methyl group in the general formula (1), (III-1) or (III-2) ).
  • (III-8) The method according to any one of (III-1) to (III-6), wherein the disease or pathological condition is a disease or pathological condition that develops or worsens in association with Rac activation via DOCK2. .
  • the disease or pathological condition is a disease or pathological condition that develops or worsens in association with activation of Rac via DOCK180 or DOCK-5 (III-1) to (III-6) How to describe.
  • Z represents methine (C—H) or a nitrogen atom (N), and X represents a substituent represented by the following formula:
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n means an integer of 0-2.
  • the above pyrazolidinedione derivative is a compound in which R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or a methyl group in the general formula (1), (IV-1) or (IV-2) ) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the above-mentioned disease or pathological condition is a disease or pathological condition that develops or worsens in relation to Rac activation via DOCK2 (IV-1) to (IV-6) Zolidinedione derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • (IV-10) any one of (IV-1) to (IV-6), wherein the disease or condition is a disease or condition that develops or worsens in association with Rac activation via DOCK180 or DOCKDOC5
  • the disease or condition is a disease or condition that develops or worsens in association with Rac activation via DOCK180 or DOCKDOC5
  • DOCK180 or DOCKDOC5 DOCK180 or DOCKDOC5
  • V Use of a pyrazolidinedione derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of a pharmaceutical composition (V-1) Prevention or treatment of a disease or condition that develops or worsens in relation to Rac activation Formula (1) for the manufacture of a pharmaceutical composition for:
  • Z represents methine (C—H) or a nitrogen atom (N), and X represents a substituent represented by the following formula:
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n means an integer of 0-2.
  • V-3 The above pyrazolidinedione derivative is a compound in which R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or a methyl group in the general formula (1), (V-1) or (V-2) Use as described in).
  • (V-6) The use according to (V-1), wherein the pyrazolidinedione derivative represented by the general formula (1) is at least one selected from the group consisting of the following (a) to (p): : (A) 4- [3- (2-chlorophenyl) arylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (b) 4- [3- (2-chlorophenyl) propyl] -1-phenylpyrazolidine -3,5-dione (c) 4-[(2-chlorophenyl) benzylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (d) 4- [5- (2-chlorophenyl) penta-2,4 -Dienylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (e) 4- (3-phenylarylidene) -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (f) 4- [3-
  • (V-7) The use according to any one of (V-1) to (V-6), wherein the Rac activation is Rac activation via DOCK2, DOCK180, or DOCK5.
  • (V-8) The use according to any one of (V-1) to (V-6), wherein the disease or pathological condition is a disease or pathological condition that develops or exacerbates in relation to Rac activation via DOCK2. .
  • V-10) The disease or condition described above is a disease or condition that develops or exacerbates in association with activation of Rac via DOCK180 or DOCK 5.
  • V-1) to (V-6) Use to describe.
  • the compound (1) of the present invention inhibits the activation of Rac in immune cells indispensable for immune reaction by inhibiting the association between DOCK2 and Rac as shown in the test examples described later (Rac activation). Inhibitory action). For this reason, the compound (1) of the present invention prevents migration of immune cells such as lymphocytes, and inappropriate immune reactions (for example, excessive immune reactions such as autoimmune diseases and allergic diseases, as well as allograft rejection). Reaction) and the like. Therefore, the compound (1) of the present invention is used as an active ingredient of an inhibitor of Rac activation used for inhibiting the activation of Rac via DOCK2 in immune cells and in autoimmunity in vitro and in vivo. It is useful as an active ingredient of preventive or therapeutic agents for immune-related diseases such as diseases and allergic diseases, and further as an active ingredient of immunosuppressants.
  • the compound (1) of the present invention inhibits Rac activation in cancer cells by inhibiting association of DOCK180 or DOCK5 with Rac as shown in Test Examples described later (Rac activation inhibitory action). ), In particular, has an action of inhibiting the GEF activity of DOCK180 and DOCK5. For this reason, the compound (1) of the present invention can suppress cancer cell invasion, migration, and anchorage-independent growth, thereby suppressing the growth and metastasis of cancer cells. Therefore, the compound (1) of the present invention is used as an active ingredient of a Rac activation inhibitor used to inhibit Rac activation via DOCK180 or DOCK5 in cancer cells in vitro and in vivo. Moreover, it is useful as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent (anticancer agent) for malignant tumors.
  • a preventive or therapeutic agent anticancer agent
  • the test result of Test Example 1 is shown.
  • the upper image in (A) shows the same heart transplanted into a DOCK2-expressing mouse (described here as WT) and a DOCK2-deficient mouse (DOCK2-/-), and a section of the transplanted heart was stained with hematoxylin and eosin. Shows the tissue images observed.
  • the lower figure in (A) shows the survival time of transplanted heart of each mouse when FK506 in an amount that is hardly effective alone (3.2 mg / kg / day) is administered for 10 days after transplantation (FK506 (+) ) Vs. no administration (FK506 (-)).
  • the upper row of (B) shows the incidence of diabetes (above) for NOD, which is an autoimmune diabetes model mouse, when DOCK2 is expressed (DOCK2 +/-) and when DOCK2 is not expressed (DOCK2-/-).
  • the figure on the left is a comparison of the incidence of pancreatic insulitis (upper right figure).
  • the lower image in (B) shows a tissue image observed by staining a pancreatic section of each mouse (DOCK2 +/ ⁇ and DOCK2 ⁇ / ⁇ ) with hematoxylin and eosin.
  • the test result of Test Example 3 is shown.
  • (A) shows Trigger factor (TF) fusion DOCK2-DHR-2 and Tiam1 DH-PH expressed in E.
  • (A) shows that Rac activation in immune cells (T cells, B cells) induced by chemokines is inhibited by the presence of compound 6.
  • (B) shows that the migration response of immune cells (T cells, B cells) induced by chemokines is inhibited by compound 6 in a dose-dependent manner.
  • the result of Test Example 6 is shown.
  • (A) shows that Rac activation induced by stimulation to TCR is inhibited by the presence of Compound 6.
  • (B) shows that the presence of Compound 6 inhibits the mixed lymphocyte reaction in a dose-dependent manner.
  • the result of Test Example 7 is shown.
  • (A) shows that Rac activation of plasmacytoid dendritic cells (pDC) induced by CpG, a ligand of TLR9, is inhibited by the presence of compound 6.
  • (B) shows that the presence of compound 6 inhibits INF- ⁇ production in response to CpG in a dose-dependent manner, but does not inhibit IL-12 production.
  • the experimental technique of Test Example 8 and the results are shown. It has been shown that administration of Compound 6 significantly improves the clinical score of autoimmune encephalomyelitis (left figure) and the incidence of autoimmune encephalomyelitis (right figure). The result of Test Example 9 is shown.
  • (A) shows that invasion of extracellular matrix of glioblastoma cell line (LN-229) and lung cancer cell line (3LL) is inhibited by the presence of compound 6.
  • (B) shows that migration of LN229 strain is inhibited by the presence of compound 6.
  • (C) shows that the migration of 3LL strain is inhibited by the presence of compound 6.
  • the result of Test Example 10 is shown. 3 shows that anchorage-independent growth of 3LL strain is inhibited by the presence of compound 6.
  • the pharmaceutical composition (hereinafter, also simply referred to as “pharmaceutical composition”) is represented by the following general formula (1) having an action of inhibiting Rac activation via DOCK2, DOCK180, or DOCK5.
  • a pyrazolidinedione derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter collectively referred to as “the compound of the present invention”) is an active ingredient:
  • Z represents methine (C—H) or a nitrogen atom (N), and X represents a substituent represented by the following formula:
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • n means an integer of 0-2. ].
  • examples of the alkyl group represented by R 1 or R 2 include carbon numbers such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, and tert-butyl.
  • One to four alkyl groups can be mentioned. Preferred are methyl and ethyl groups having 1 to 2 carbon atoms, and more preferred are methyl groups.
  • examples of the halogen atom represented by R 1 or R 2 include a chlorine atom, a fluorine atom, a bromine atom, and an iodine atom. Although not particularly limited, preferred are a chlorine atom and a fluorine atom, and more preferred is a chlorine atom.
  • the position in the six-membered ring of R 1 and R 2 may be any of the meta position, the ortho position, and the para position, but is preferably the ortho position.
  • a preferred substituent for R 1 is a hydrogen atom
  • a preferred substituent for R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, or a methyl group; more preferably a halogen atom, with a chlorine atom being particularly preferred.
  • n may be any integer of 0, 1 and 2, but is preferably an integer of 1 or 2, more preferably an integer of 1.
  • a double line composed of a solid line and a broken line means both a saturated bond (single bond) and an unsaturated bond (double bond). That is, adjacent carbons may be bonded by a saturated bond or may be bonded by an unsaturated bond. However, when n is 1 or 2, if one of the carbons is a saturated bond, the remaining carbons are also a saturated bond, and if one of the carbons is an unsaturated bond, the remaining carbons are not. A saturated bond is preferred.
  • the compound (1) of the present invention includes tautomers represented by the following formulas (1-1) and (1-2):
  • the compound (1) of the present invention includes geometric isomers, and specifically may be in the state of cis isomer, trans isomer, or a mixture thereof, but is preferably cis isomer. Considering geometric isomers and tautomers, the compound (1) of the present invention may exist in the following state.
  • the compound (1) of the present invention also includes stereoisomers, specifically, optically pure enantiomers, enantiomeric mixtures, racemates, enantiomerically pure diastereomers, diastereomeric mixtures, epimeric It may be in a state.
  • Such isomers can be prepared and obtained by methods known to those skilled in the art. For example, by stereochemically controlled synthesis using chiral synthons or chiral reagents, by classical separation means such as chromatographic methods or crystallization methods, or other known methods such as enantiomerically pure chiral It can be obtained through the formation of diastereomeric salts by salt formation with acids or by chromatography using, for example, chiral ligand-modified chromatographic materials.
  • the pyrazolidinedione derivative represented by the general formula (1) can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the “pharmaceutically acceptable salt” has the biological effectiveness of the parent compound (salt-free compound) and is biologically non-toxic or biologically low in toxicity. Means an addition salt of an inorganic or organic acid or base.
  • Certain compounds of the present invention contain a basic functional group such as an amino group and can thus form pharmaceutically acceptable acid addition salts.
  • Such an acid addition salt comprises a parent compound represented by the formula (1) and an inorganic acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid; acetic acid, propionic acid, octanoic acid, decanoic acid in a suitable solvent.
  • Glycolic acid pyruvic acid, oxalic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, glutamic acid, aspartic acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, It can be prepared by reacting with an organic acid such as ethanesulfonic acid or p-toluenesulfonic acid.
  • certain compounds of the present invention can contain acidic functional groups such as hydroxyl groups, thus forming pharmaceutically acceptable base addition salts.
  • base addition salts include ammonium salts; alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts; or zinc salts.
  • the salt derived from the organic salt include primary, secondary and tertiary such as isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, lysine, arginine, N-ethylpiperidine, piperidine and the like. Examples include amines, substituted amines, and cyclic amines.
  • the compound (1) of the present invention may be solvated, for example, in a hydrated state, or in a non-solvated state. Furthermore, the thing of a different crystal state may be mixed.
  • the pyrazolidinedione derivative (1) of the present invention is not limited, but can be produced, for example, according to a known method described in Patent Documents 3 and 4, or a method obtained by appropriately modifying it.
  • the pyrazolidinedione derivative (1) of the present invention includes a pyrazolidinedione derivative represented by the formula (I) and an aromatic aldehyde represented by the formula (II).
  • the compound is allowed to react in a suitable solvent (eg ethanol or methanol, THF, etc.), optionally in the presence of a suitable base (eg pyridine, NMO, DIEA, TEA, proline, etc.) for several hours (eg 2-24 hours). It can be obtained by carrying out the reaction (Knoevenagel condensation) over a degree.
  • Suitable reaction conditions are not particularly limited, but examples include a method in which pyrazolidinedione derivative (I) and aromatic aldehyde compound (II) are stirred in THF in the presence of a catalytic amount of proline at room temperature for 24 hours. can do.
  • the pyrazolidinedione derivative represented by the formula (I) is reacted with a phenylhydrazine derivative represented by the formula (III) and a malonic acid derivative represented by the formula (IV) as shown in the following reaction formula 2.
  • a phenylhydrazine derivative represented by the formula (III) and a malonic acid derivative represented by the formula (IV) as shown in the following reaction formula 2.
  • the substituent represented by “LG 1 ” or “LG 2 ” is any suitable leaving group. Nonlimiting examples include halogen atoms, 1-hydroxy-pyrrolidine-2,5-dione, benzotriazol-1-ol, aliphatic or aromatic alkoxy groups.
  • a suitable method for preparing the pyrazolidinedione derivative (I) includes phenylhydrazine derivative (III) and monoethylmalonyl chloride (IV) in the presence of Et 3 N in a suitable solvent such as THF. Condensation or phenylhydrazine derivative (III) and dialkoxymalonate (IV) in a suitable solvent such as ethanol or methanol in the presence or absence of a suitable base (eg sodium ethoxide or sodium methoxide) Can be exemplified.
  • the pyrazolidinedione derivative represented by the formula (I) is a compound represented by the formula (V) produced from the phenylhydrazine derivative (III) and the malonic acid derivative (IV) as shown in the following reaction formula 3.
  • a suitable solvent such as ethanol or THF or DMF, sodium ethoxide or sodium methoxide, sodium hydroxide, K 2 CO 3, NaH, LDA, LiH, in the presence of a suitable base, such as DMS or DIEA, It can also be prepared by cyclization.
  • the pyrazolidinedione derivative (1) thus obtained can be easily isolated and purified from the reaction mixture by ordinary separation means such as column chromatography, recrystallization and the like.
  • (II) Rac activation inhibitor pharmaceutical composition for preventing or treating Rac activation-related diseases
  • the compound (1) of the present invention inhibits association between DOCK2 and Rac as shown in the test examples described later. Thus, it has an action (Rac activation inhibitory action) of inhibiting Rac activation in immune cells indispensable for an immune response.
  • the compound (1) of the present invention prevents migration of immune cells such as lymphocytes, and inappropriate immune reactions (for example, excessive immune reactions such as autoimmune diseases and allergic diseases, as well as allograft rejection) Reaction) and the like.
  • the compound (1) of the present invention is used as an active ingredient of a Rac activation inhibitor used to inhibit the activation of Rac via DOCK2 in immune cells in vitro and in vivo. It is useful as an active ingredient of preventive or therapeutic agents for immune-related diseases such as immune diseases and allergic diseases, and further as an active ingredient of immunosuppressive agents.
  • the compound (1) of the present invention inhibits Rac activation in cancer cells by inhibiting association of DOCK180 or DOCK5 with Rac as shown in Test Examples described later (Rac activation inhibitory action). )have.
  • the compound (1) of the present invention can inhibit cancer cell invasion, migration and anchorage-independent growth, and can suppress the growth and metastasis of cancer cells.
  • the compound (1) of the present invention is used as an active ingredient of an Rac activation inhibitor used to inhibit DOCK2-mediated activation of Rac in cancer cells in vitro and in vivo. It is useful as an active ingredient for preventive or therapeutic agents (anticancer agents) for malignant tumors, particularly solid cancers.
  • the present invention provides a Rac activation inhibitor comprising the compound (1) of the present invention as an active ingredient, and a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease or condition that develops or worsens in association with Rac activation.
  • the pharmaceutical composition specifically includes an immunosuppressive agent, an agent for preventing or treating an immune-related disease (anti-immune related disease agent), and an anti-cancer agent (hereinafter collectively referred to as these). Also referred to as “the preparation of the present invention”).
  • the preparation of the present invention may consist only of the above-mentioned compound (1) of the present invention, or may be combined with an arbitrary carrier or additive for a desired use (administration route and administration) by a conventionally known method. It may be a composition prepared in a form suitable for the method.
  • a formulation suitable for solid oral administration such as a tablet, a powder, a granule, a pill, a powder syrup, and a capsule (a hard capsule and a soft capsule);
  • Formulations suitable for injections and infusions with liquid, emulsion or lyophilized forms such as creams, ointments and gels; solutions, suspensions, emulsions Syrups, elixirs, sprays, aerosols and other liquid formulations, and the like.
  • a ratio of the compound (1) of the present invention to be blended in the preparation of the present invention for example, when it is used as an immunosuppressive agent or an anti-immune related disease agent, it exerts an action of inhibiting Rac activation in immune cells. It is not particularly limited as long as it is a ratio, preferably a ratio that exerts an action of inhibiting the migration of lymphocytes, more preferably a ratio that suppresses an immune reaction, for example, 0.001 to 99% by weight in 100% by weight of the preparation, It can be appropriately set and prepared in the range of preferably 0.01 to 50% by weight, more preferably 0.05 to 10% by weight.
  • this when this is used as an anticancer agent, it is a ratio that exerts an action of inhibiting Rac activation in cancer cells, preferably a ratio of exerting an action of inhibiting invasion, migration or proliferation of cancer cells.
  • a ratio of exerting an action of inhibiting invasion, migration or proliferation of cancer cells There is no particular limitation as long as it is, for example, 0.001 to 99% by weight, preferably 0.01 to 50% by weight, more preferably 0.05 to 10% by weight in 100% by weight of the preparation. be able to.
  • the preparation only needs to contain the compound (1) of the present invention in the above ratio, and other components can be blended within a range not hindering this effect.
  • Such other components include the Rac activation inhibitor of the present invention, or the pharmaceutical composition for Rac activity-related diseases (immunosuppressive agent, anti-immune related disease agent, anticancer agent), the purpose of administration (administration form) It can be appropriately selected according to the type of disease to be used, the weight, age, and degree of disease of the user.
  • such other ingredients include excipients, binders, dispersants, thickeners, lubricants, pH adjusters, solubilizers, and carriers commonly used in the manufacture of formulations.
  • flavor, a flavoring agent, a flavoring agent, a solvent, etc. are contained.
  • the immunosuppressive agent may contain other immunosuppressive agent in addition to the compound (1) of the present invention.
  • immunosuppressive agents include, but are not limited to, cyclosporine that is a calcineurin inhibitor, FK560, FTY720 that is a functional antagonist of sphingosine 1-phosphate receptor, and the like.
  • the anti-immune related disease agent may contain a component having an action of enhancing or assisting the immunosuppressive action in addition to the compound (1) of the present invention.
  • a component having an action of enhancing or assisting the immunosuppressive action include corticosteroids, methotrexate, azathioprine, cyclophosphamide, chlorambutylcyclosporine, tacrolimus, rapamycin and the like.
  • Preferred corticosteroids include prednisone, prednisolone, methylprednisolone, cortisone, hydrocortisone, fludrocortisone, dexamethasone, triamcinolone, budesonide, betamethasone and the like.
  • the anticancer agent in the preparation of the present invention is another anticancer agent, a component having an action of enhancing or assisting the anticancer action, or immunostimulation.
  • An agent may be contained.
  • the preparation of the present invention when the preparation of the present invention has the form of a composition for external use, the preparation may contain a component having an action of promoting penetration into the skin.
  • a component having an action of promoting penetration into the skin examples include alcohol, propylene glycol, vitamin E, menthol, laurocapram, and the like.
  • immune-related disease refers to any disease or disorder characterized in that pathological symptoms are induced in cells, tissues, organs, and multiple strains by an immune system response. Or any disease or disorder resulting from dysfunction of any part of the immune system.
  • Such diseases include rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, systemic juvenile rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, gastric ulcer, seronegative arthropathy, osteoarthritis, inflammatory bowel disease, Ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody syndrome, iridocyclitis / uveitis / optic neuritis, idiopathic pulmonary fibrosis, systemic vasculitis / Wegener's granulomatosis, sarcoidosis, orchitis / Surgical procedures to restore vasectomy, allergic / atopic disease, eczema, allergic contact dermatitis, allergic conjunctivitis, hypersensitivity pneumonia, transplantation, organ transplant rejection, graft versus host disease, systemic inflammatory response syndrome , Sepsis syndrome, Gram-positive bacterial sepsis, Gram-negative bacterial
  • autoimmune disease includes organ- or tissue-specific autoimmune diseases, systemic autoimmune diseases and diseases exhibiting autoimmune-type symptoms, and in particular, Graves' disease, Hashimoto's disease, Glandular autoimmune syndrome, insulin-dependent diabetes, insulin-resistant diabetes, immune infertility, autoimmune Addison's disease, pemphigus vulgaris, deciduous pemphigus, herpes zoster, autoimmune alopecia, vitiligo vulgaris , Autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune thrombocytopenic purpura, pernicious anemia, myasthenia gravis, Guillain-Barre syndrome, stiff man syndrome, acute rheumatic fever, sympathetic eyes Inflammation, Goodpasture syndrome, autoimmune uveitis, temporal arteritis, Behcet's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, autoimmune
  • Organ- or tissue-specific autoimmune diseases include Graves' disease, Hashimoto's disease, multigland autoimmune syndrome, insulin-dependent diabetes, insulin-resistant diabetes, immune infertility, autoimmune Addison's disease, pemphigus vulgaris, deciduous leaves Pemphigus vulgaris, herpes zoster, autoimmune alopecia, vitiligo vulgaris, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune thrombocytopenic purpura, pernicious anemia, myasthenia gravis , Guillain-Barre syndrome, Stiff-Man syndrome, acute rheumatic fever, sympathetic ophthalmitis, Goodpasture syndrome, autoimmune uveitis, temporal arteritis, Behcet's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, primary bile Cirrhosis, autoimmune hepatitis, autoimmune ovitis, fibromyalgia, polymyositis,
  • Systemic autoimmune diseases include systemic lupus erythematosus, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, scleroderma, systemic necrotizing vasculitis, Wegener's granulomatosis, CREST syndrome, antiphospholipid antibody syndrome and Sjogren's syndrome It is.
  • the autoimmune diseases targeted by the present invention also include “diseases showing autoimmune symptoms”.
  • the disease means any disease that is not considered an autoimmune disease despite an increase in autoantibody concentration. Examples include, but are not limited to, eosinophilic gastroenteritis, atypical local dermatitis, cardiomyopathy, and post-infection syndrome such as post-infection endocardial myocarditis.
  • the malignant tumor targeted by the present invention is a tumor that invades or metastasizes and increases in various parts of the body and is life-threatening, and cancer is also referred to as a malignant neoplasm.
  • Malignant tumors include hematopoietic cell malignancies (leukemia, lymphoma [Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma], multiple myeloma), brain tumor, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, gastric cancer.
  • colon cancer colon cancer (colon, rectum, anus and its accompanying tissues), liver cancer, hepatocellular carcinoma, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer (pancreatic cancer), adrenal cancer, gastrointestinal stromal tumor, mesothelioma Tumors (pleura, peritoneum, pericardium, etc.), head and neck cancer, laryngeal cancer, oral cancer, oral cavity cancer, gingival cancer, tongue cancer, buccal mucosa cancer, salivary gland cancer, sinus cancer, maxillary sinus cancer, frontal sinus cancer, Ethmoid sinus cancer, sphenoid sinus cancer, thyroid cancer, kidney cancer, lung cancer, osteosarcoma, prostate cancer, testicular cancer (testicular cancer), renal cell cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, skin cancer (" Mole ”and dysplastic nevi), anal cancer and the like.
  • the therapeutically effective amount of compound (1) of the invention is about 5 to about 500 mg per day for mammals, preferably humans. In another embodiment of this invention, the therapeutically effective amount of compound (1) of this invention is about 5 to about 250 mg per day. In another embodiment of this invention, the therapeutically effective amount of compound (1) of this invention is about 5 to about 100 mg per day. And in another embodiment of this invention the therapeutically effective amount of compound (1) of this invention is about 5 to about 50 mg per day. Furthermore, in another embodiment of this invention, the therapeutically effective amount of compound (1) of this invention is less than about 50 mg per day.
  • Production Example 4 A known method for the preparation of 4- [5- (2-chlorophenyl) penta-2,4-dienylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (compound 8) (Rekha, S .; Sunil KG Tetrahedron, 2010 , 66, 2284-2292) using the (2E, 4E) -5- (2-chlorophenyl) penta-2,4-dienal synthesized according to the method of Production Example 1, (3), to give the title compound 8 Synthesized.
  • Production Example 7 4- [3- (2-Fluorophenyl) arylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (Compound 11) is a known process (Laihia, K .; Kolehmainen, E .; Manttari, P .; Using (E) -3- (2-fluorophenyl) acrylaldehyde synthesized by Kauppinen, R. Magn. Reson. Chem., 1993, 31, 512-515), according to the method of Production Example 1 (3) The title compound 11 was synthesized.
  • Production Example 8 A known method for the preparation of 4- [3- (2-bromophenyl) arylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (compound 12) (Shu-Yu, Z .; Yong-Qiang, T .; Chun -An, F .; Ming, Y .; Fu-Min, Z. Org. Lett., 2009, 50, 4178-4181) using (E) -3- (2-bromophenyl) acrylaldehyde The title compound 12 was synthesized according to the method of Production Example 1 (3).
  • Production Example 10 A known process for the preparation of 4- [3- (3-chlorophenyl) arylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (compound 14) (Laihia, K .; Kolehmainen, E .; Manttari, P. Magn. Using the (E) -3- (3-chlorophenyl) acrylaldehyde synthesized in Reson. Chem., 1991, 29, 1109-1113), the title compound was synthesized according to the method of Production Example 1 (3). .
  • Production Example 11 Production of 4- [3- (4-chlorophenyl) arylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (Compound 15) (E) -3- (4) synthesized by a known method (Omori, K .; Onzuka, K .; Fuse, K .; Miyata, H. (Ube Industry, Ltd., Japan) Jpn. Kokai Tokkyo Koho, 2000204057) The title compound 15 was synthesized according to the method of Production Example 1 (3) using -chlorophenyl) acrylaldehyde.
  • Production Example 12 Preparation of 4- [3- (3-hydroxyphenyl) arylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5-dione (Compound 16) 3-, synthesized by a known method (Kim, J .; Lee, S .; Kwon, M .; Park, Y .; Choi, S .; Kwon, B. Synth. Commun., 2004, 34, 1223-1228) The title compound was synthesized according to the method of Production Example 1 (3) using (3-hydroxylphenyl) propenal.
  • Production Example 14 A known method for the preparation of 4- [3- (2-chlorophenyl) arylidene] -1- (2-pyridinyl) pyrazolidine-3,5-dione (compound 18) (Houille, O .; Fretz, H .; Hilpert, K. Riederer, M .; Giller, T .; Valdenaire, O.
  • Production Example 15 4- (3-Phenylarylidene) -1- (2-pyridinyl) pyrazolidine-3,5-dione (Compound 19), a known process (Houille, O .; Fretz, H .; Hilpert, K .; Riederer, M .; Giller, T .; Valdenaire, O. WO 2005/002574 A1) using 1-pyridin-2-yl-pyrazolidine-3,5-dione synthesized according to the method of Production Example 1 (3) The title compound was synthesized.
  • DOCK2 is a protein having a SH3 domain, a DHR-1 domain, and a DHR-2 domain, consisting of 1828 amino acids in mice and 1831 amino acids in humans. It is an activated guanine nucleotide exchange factor (GEF). DOCK2 is expressed specifically in immune system tissues and is said to be a master molecule that activates Rac in immune cells such as lymphocytes. It is known that a signal from a chemokine receptor is transmitted via DOCK2 and Rac is activated, whereby actin fibers in the cytoskeleton are reconstructed to cause differentiation, migration, and activation of immune cells.
  • GEF activated guanine nucleotide exchange factor
  • DOCK2 knockout mouse in which the DOCK2 gene is deleted is prepared, and a DOCK2 expressing mouse (hereinafter referred to as “WT” or “DOCK2 +/-”) and a DOCK2-deficient mouse (hereinafter referred to as “ For each of the DOCK2-/-”), the heart of allogeneic mice was transplanted, and the engraftment state of the transplanted heart was measured with or without administration of an immunosuppressant (FK506).
  • NOD mice which are model mice for type I diabetes
  • NOD mice with DOCK2 loci +/ ⁇ or ⁇ / ⁇ were prepared to develop diabetes and pancreatic insulitis. The presence or absence of onset was evaluated.
  • Stage 0 No lymphocyte infiltration into the islet
  • Stage 2 Lymphocyte infiltration is seen in less than 25% of the islets
  • Stage 3 Lymphocyte infiltration is seen in 25-50% of pancreatic islets
  • Stage 4 Lymphocyte infiltration is seen in more than 50% of the islets.
  • Test Example 2 Search for Compound that Inhibits DOCK2-Rac1 Interaction Based on the results of Test Example 1, a compound that inhibits the interaction between DOCK2 and Rac is used as an active ingredient of an immunosuppressant, and prevention or treatment of autoimmune diseases. It is thought that it can be an active ingredient of the agent. Therefore, targeting 9,392 compounds, (a) searching for compounds that inhibit the interaction with DOCK2-Rac, (b) searching for compounds that inhibit DOCK2 Rac activation, and (c) impairing viability The search for compounds that inhibit lymphocyte migration was sequentially performed.
  • TF-DOCK2-DHR2-SBP 50 ⁇ l, concentration 60 ⁇ g / ml in TBST
  • TBST TBST / 1 mM EDTA
  • a test compound derived from the library or DMSO (carrier) 50 ⁇ l, 200 ⁇ M in TBST / 1 mM EDTA was added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • GST-Rac1 or GST-Cdc42 (50 ⁇ l, 50 ⁇ g / ml in TBST / 1 mM EDTA) was added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. The wells were then washed 4 times with 150 ⁇ l TBST / 1 mM EDTA. Next, peroxidase-labeled anti-GST antibody (50 ⁇ l, TBST / 1 mM EDTA) was added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. The wells were then washed 4 times with 150 ⁇ l TBST / 1 mM EDTA.
  • peroxidase substrate 50 ⁇ l, 0.4 mg / ml o-phenylenediamine and 0.01% H 2 O 2 , pH 5.0 dissolved in 0.1 M citrate buffer
  • peroxidase substrate 50 ⁇ l, 0.4 mg / ml o-phenylenediamine and 0.01% H 2 O 2 , pH 5.0 dissolved in 0.1 M citrate buffer
  • absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using a Multiskan Bichromatic plate reader (Labsystems).
  • the well added with GST-Cdc42 was used as a blank and subtracted from the absorbance of each well.
  • a well containing only DMSO instead of the test compound was used as a control.
  • the inhibition rate of the test compound was calculated by the following equation.
  • Inhibition rate (%) ⁇ [(Absorbance when DMSO is added) ⁇ (absorbance when test compound is added)] / absorbance when DMSO is added ⁇ ⁇ 100 From the above screening test, 131 compounds having an action of inhibiting the interaction of DOCK2-Rac were obtained from 9,392 compounds.
  • the cells migrated to the lower chamber were collected, and PE-labeled anti-Thy1.2 antibody (53-2-1, BD Pharmingen) and FITC-labeled anti-B220 antibody (RA-6B2, eBiosciences).
  • the percentage (%) of migrated cells was calculated by dividing the number of Thy1.2 + cells (T cells) and B220 + cells (B cells) in the lower chamber by the number of cells in Transwells.
  • one compound that inhibits lymphocyte migration was obtained from 31 compounds having an action of inhibiting Rac activation of DOCK2 without impairing lymphocyte viability.
  • Test Example 3 Selective Inhibitory Activity of DOCK2-Rac1 Interaction of Compound 6 (E) -4- [3- (2-chlorophenyl) arylidene] -1-phenylpyrazolidine-3,5- obtained in Test Example 2 With respect to dione (compound 6), the selective inhibitory activity of DOCK2-Rac1 interaction was evaluated by the following method.
  • HEK293T cells are cultured in 12-well plates and expressed in DOCK2, Tiam1 and Trio (DH-D1 / PH-D1 domain) using polyethylenimine Vector was introduced. After 24 hours, the medium was exchanged with 100 ⁇ M compound 6 or an equal volume of DMSO (500 ⁇ l) and cultured for 1 hour, followed by Rac activity at the cellular level using a Rac activation assay kit (Millipore 17-283).
  • Test Example 4 Inhibition of GEK activity of DOCK2, DOCK180, and DOCK5 by Compound 6
  • the inhibitory effect of DOCK2, DOCK180, and DOCK5 on GEF activity was examined by the method described in Test Example 2- (2).
  • As a sample for evaluating the inhibitory effect of DOCK2 on GEF activity 0, 1, 3, 10, 30, 50, 100, 150, 300 ⁇ M of compound 6 was added to SUMO-DOCK2 DHR-2 DlobeA (with a SUMO tag, lobe A recombinant protein of DOCK2 DHR2 domain lacking A) and GST-Rac1 were adjusted to 0.1 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively.
  • SUMO-DOCK180 DHR-2 DlobeA (with SUMO tag, lobe A was added to 0, 1, 3, 10, 30, 50, and 100 ⁇ M of compound 6.
  • the deleted recombinant protein of DOCK180 DHR2 domain) and GST-Rac1 were adjusted to 0.1 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively.
  • SUMO-DOCK2 DHR-2 DlobeA (lobe A having SUMO tag) was added to 0, 1, 3, 10, 30, 50, 100 ⁇ M of compound 6.
  • the deficient recombinant protein of DOCK5 DHR2 domain) and GST-Rac1 were adjusted to 0.1 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively.
  • Test Example 5 Inhibition of Rac activation and lymphocyte migration by compound 6 From mouse spleen, Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-095-130) or B cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-090-862) Used to isolate T cells and B cells, respectively.
  • the isolated cells (1-2 ⁇ 10 7 cells) were suspended in 200 ⁇ l of HBSS (Invitrogen) and cultured at 37 ° C. for 1 hour in the presence of 100 ⁇ M compound 6 or an equal amount of DMSO.
  • chemokine [1 ⁇ g / ml SLC (CCL21) for T cells, 1 ⁇ g / ml BLC (CXCL13) for B cells], and incubate for a specified time, and Rac activation assay kit (Millipore 17-283) was used to examine Rac activation.
  • the migration test was performed by the method described in Test Example 2- (3), and SLC was used as a T cell chemotaxis factor and BLC was used as a B cell chemotaxis factor.
  • FIG. 5 (A) it was confirmed that Rac activation in immune cells (T cells, B cells) induced by chemokines is inhibited by the presence of compound 6. Further, as shown in FIG. 5 (B), it was confirmed that the migration response of immune cells (T cells, B cells) induced by chemokines was inhibited by compound 6 in a dose-dependent manner. In addition, since the viability of immune cells (T cells, B cells) was maintained even in the presence of Compound 6, it was confirmed that Compound 6 was not cytotoxic.
  • TCR-mediated Rac activation by compound 6 and inhibition of T cell proliferation response T cells were isolated from mouse spleen using Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-095-130). Isolated cells (1 ⁇ 2 x 10 7 cells) were suspended in HBSS of 200 [mu] l, anti-CD3 ⁇ antibody (Becton Dickinson, 145-2C11) and added to a 10 [mu] g / ml, and allowed to stand on ice for 20 minutes . The cells were washed 3 times with ice-cold HBSS, resuspended in 200 ⁇ l of HBSS, and cultured at 37 ° C.
  • B cells derived from B6 mice (3 ⁇ 10 5 / well) were cultured for 84 hours in the presence of various concentrations of test compounds or DMSO (solvent) together with spleen cells derived from irradiated B10.BR mice. After culturing by adding during the latter 16 hours [3 H] thymidine (0.037MBq) of culture, the cells using a cell harvester to recover on a glass fiber filter paper, the counts per minute in a liquid scintillation counter It was measured.
  • Test Example 7 Inhibition of CpG-induced Rac activation and IFN- ⁇ production in pDC by compound 6
  • Mouse bone marrow cells were differentiated into pDC by culturing in the presence of Flt3 ligand.
  • the obtained cells (1-2 ⁇ 10 7 cells) were suspended in 200 ⁇ l of HBSS and cultured at 37 ° C. for 1 hour in the presence of 100 ⁇ M compound 6 or an equal amount of DMSO.
  • PDC was treated for 15 minutes in the presence of Compound 6 or DMSO (solvent), and then stimulated with 3 ⁇ M CpG-A for 24 hours.
  • concentrations of IFN- ⁇ (R & D systems) and IL-12ILp40 (Thermo Fisher Scientific) in the cell culture supernatant were measured using an ELISA kit.
  • EAE autoimmune encephalomyelitis
  • CFA CFA
  • Mycobacterium tuberculosis added
  • Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 Mimotopes
  • 100 ⁇ g per mouse subcutaneously in B6 mice, 500 ng pertussis toxin (Calbiochem) per mouse intraperitoneally on days 0 and 2 was administered respectively.
  • autoimmune encephalomyelitis was induced: 0: asymptomatic, 1: relaxation of the tail, 2: incomplete hind limb paralysis, 3: complete hind limb paralysis, 4: incomplete forelimb paralysis, 5: limb paralysis, 6: death.
  • CPYPP was dissolved in DMSO to a final concentration of 5 mg / ml, and 100 ⁇ l of the mouse was injected intraperitoneally on the 0th, 3rd, 6th, and 9th days.
  • the control group was injected with 100 ⁇ l of DMSO alone.
  • Test Example 9 Inhibition of Cancer Cell Invasion and Migration by Compound 6 The effect of Compound 6 on the invasion of extracellular matrix of glioblastoma cell line (LN-229) and lung cancer cell line (3LL) was examined.
  • the effect of compound 6 on the migration of LN-229 strain was examined by wound healing assay.
  • the LN-229 strain (1 ⁇ 10 5 cells) was suspended in DMEM supplemented with 200 ⁇ l of 10% FCS and cultured overnight on a glass bottom dish to form a cell monolayer.
  • a wound portion formed by rubbing a 200 ⁇ l chip linearly on a single layer was photographed over time.
  • the distance of cell migration was determined by measuring the width of the wound.
  • the effect of compound 6 on the migration of 3LL strain was examined by the Transwell test.
  • a 3LL strain suspended in DMEM (serum-free) with a Transwell chamber (pore size 8.0 ⁇ m) equilibrated in DMEM for 30 minutes in a 24-well plate containing 500 ⁇ l of DMEM with 10% FCS per well was put into a chamber and cultured at 7 ° C. under 5% CO 2 for 10 hours.
  • FIG. 9 (A) it was revealed that Compound 6 effectively inhibits the invasion of cancer cell lines in both LN-229 and 3LL lines. Further, as shown in FIGS. 9B and 9C, it was confirmed that migration of LN-229 strain (B) and 3LL strain (C) was inhibited by compound 6 in a dose-dependent manner.
  • Test Example 10 Inhibition of anchorage-independent growth of cancer cells by compound 6 The inhibitory effect of compound 6 on the growth of anchorage-independent cancer cells was performed using a soft agar assay.
  • the 3LL strain (1 ⁇ 10 5 ) was suspended in DMEM containing 0.3% agarose and 10% FCS, and layered on a base agar formed in a 6-well plate with DMEM containing 0.7% agar and 10% FCS. After culturing at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment for 10 days, the cells were stained with 0.005% crystal violet for 1 hour at room temperature, and the number of colonies formed was counted.
  • Test Example 11 Inhibition of GEK activity of DOCK2 by analog of compound 6 Analog of compound 6 (14 compounds) produced by the method described in Production Example 1 (Compound 5) and Production Examples 3 to 15 (Compounds 7 to 19) In the same manner as in Test Example 4, the inhibitory action of DOCK2 on GEF activity was evaluated, and the IC 50 value was determined. Further, a cis isomer (Compound 20) was isolated from Compound 6 and its inhibitory activity was also examined. The measurement was performed using both buffer A and buffer B described in Test Example 2- (2), and the IC 50 value was determined for each.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of CpG-A.

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Abstract

　DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化を抑制する作用を有する、下式で示されるピラゾリジンジオン誘導体の新規医薬用途を提供する。具体的にはRac活性関連疾患、例えば自己免疫疾患などの各種免疫関連疾患や悪性腫瘍の予防または治療剤、並びに免疫抑制剤としての医薬用途を提供する。〔式（１）中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式（２）で示される置換基を意味し：Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕。

Description

DOCK-Aサブファミリー分子によるRac活性化を制御する低分子化合物及びその用途
　本発明はDOCK-Aサブファミリーに属するDOCK2、DOCK180、またはDOCK5を介したRacの活性化を抑制する作用を有する低分子化合物の用途、詳細には、DOCK2、DOCK180、またはDOCK5とRacとの会合を阻害し、Racの活性化を阻止する作用を有するピラゾリジンジオン誘導体の新規医薬用途に関する。より詳細には、本発明は、当該ピラゾリジンジオン誘導体の、自己免疫疾患などの各種免疫関連疾患の予防または治療剤、免疫抑制剤、並びに抗癌剤としての医薬用途に関する。
　免疫応答は生体防御に必須であるが、一方免疫応答は、自己免疫疾患やアレルギー疾患といった免疫関連疾患を引き起こしたり、また移植時に拒絶反応を引き起こす原因となる。このような不適切な免疫応答は、リンパ球などの免疫細胞が標的組織に浸潤し、活性化されることによって引き起こされる。このため、細胞内のタンパク質の構造と機能に基づいて、免疫細胞の運動や活性化を制御することができれば、自己免疫疾患や拒絶反応の治療や予防に役立つと考えられる。一方、「がん」が「がん」たる所以は、その浸潤能や転移能にあると言っても過言ではない。転移の有無が、がんの予後を規定する重要な因子のひとつとなっていることを考慮すると、がん細胞の運動や浸潤、接着を制御することは、「次世代のがん治療」において重要な意味を持つと考えられる。
　免疫応答には、ケモカイン刺激によるリンパ球遊走、T細胞受容体（TCR）による主要組織適合抗原（MHC）に結合した同種または自己ペプチドの認識、副刺激分子や接着分子のリガンドとの相互作用、及びリンパ球の増殖や組織破壊の鍵となるサイトカイン放出といった、分子間の相互作用に起因する細胞内シグナル伝達経路の活性化と細胞応答からなる複雑なカスケードが関与している。従来は、TCRシグナル経路が創薬のターゲットとされており、その結果、カルシニューリン阻害剤（calcineurin inhibitor）であるサイクロスポリン及びFK560等といった薬剤が、移植片拒絶を抑制するのに有効な免疫抑制剤として開発されている。最近では、スフィンゴシン 1-リン酸受容体の機能的アンタゴニストであるFTY720が、胸腺や２次リンパ系組織から成熟リンパ球の移出を阻害する新規な免疫抑制剤として開発された。
　リンパ球の遊走を始めとする細胞の運動には、細胞極性の変化と細胞骨格の再構築が必須であり（例えば、非特許文献１等参照）、これらはいずれもRho、Rac、Cdc42といった低分子Ｇタンパク質（GTPase）によって制御されていることが知られている（例えば、非特許文献２～５等参照）。この中でも特にRacは、葉状突起と呼ばれるアクチンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動力を提供している（非特許文献３及び６参照）。このため、免疫細胞特異的にRacの活性化を抑制することができれば、新しい機能に基づく免疫抑制剤が創薬できると期待される。また、Racの活性化は、乳がん、グリオーマ、白血病等、多くのがんにおいて悪性化と相関することが知られており、がん治療においても重要なターゲットとなる。しかしながら、Rac自身は３つのアイソフォームからなり、またユビキタスに発現する分子であるため、創薬のターゲットとするには不適切である。
　線虫、ヒト、及びショウジョウバエにおいて、CED5、DOCK180、Myoblast city（MBC）という構造上相同性を示す分子が同定されている。これらの分子は頭文字をとってCDMファミリー分子と称されており、いずれもRacの上流で機能することで細胞骨格の再構築に関与すると考えられている（例えば、非特許文献７～１２参照）。DOCK2は、ヒトやマウスにおいて造血細胞等の免疫細胞に特異的に発現するCDMファミリー分子の一員であり（非特許文献１３）、SH3ドメイン、DHR-1ドメイン及びDHR-2ドメインを有する約1830個（ヒト：1831個、マウス1828個）のアミノ酸から構成されている。本発明者らは、当該DOCK2を欠損させたノックアウトマウスを作製することで、この分子（DOCK2）がリンパ球の遊走に不可欠であることを明らかにしている（非特許文献１４参照）。さらにDOCK2欠損リンパ球では種々のケモカインで刺激しても活性型Racは検出できないことから、DOCK2はRacの活性化に不可欠であり、DOCK2はRacの活性化に介してリンパ球の遊走を制御していると考えられる。ちなみに、Racは、GDPが結合している時は「不活性型」、GTPが結合している時は「活性型」となり、GDP／GTP交換反応によりシグナル伝達において「分子スイッチ」として機能する。DOCK2は、そのDHR-2ドメインを介してRacと会合し、GTP／GDP交換反応を触媒していると考えられている。
　また、DOCK180はグリオブラストーマやその他のがんにおいて、浸潤や悪性化に関与していることが知られている（非特許文献１５～１９参照）
特開2004-177226号公報 特開2004-226418号公報 特表2004-534072号公報 特表2007-506661号公報
Cell 84, 359-369, 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5027-5031, 1995 Science 279, 509-514 1998 J. Cell Biol. 141, 1147-1157, 1998 Science 287, 1037-1040, 2000 Cell 103, 227-238, 2000 Mol. Cell. Biol. 16, 1770-1776, 1996 J. Cell Biol. 138, 589-603, 1997 Nature 392, 501-504, 1998 Genes Dev. 12, 3331-3336, 1998 Genes Dev. 12, 3337-3342, 1998 Nature Cell Biol. 2, 131-136, 2000 DNA Res. 3, 321-329 Nature, 412, 826-831, 2001 Cancer Res. 67: 7203-7211, 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA　 109: 3018-3023, 2012 J Clin Invest. 121:4670-4684, 2011 Histopathology. 59:1163-1172, 2011 Tumour Biol. 31:59-67, 2010 Immunity, 19, 119-129, 2003 J. Cell Biol. 174, 647-652, 2006 Blood, 111, 2973-2976, 2008 J. Exp. Med. 207, 721-730, 2010 J. Exp. Med. 202, 1121-1130, 2005
　本発明は、前述するDOCK2、DOCK180、またはDOCK5を標的とし、DOCK2、DOCK180、またはDOCK5を介したRacの活性化を抑制することによって、当該Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。
　その一態様として、本発明は、DOCK2を標的とし、DOCK2を介したRacの活性化を抑制することによって免疫応答を制御する機能を備えた、従来の免疫抑制剤とは異なる作用機序に基づく医薬組成物を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、移植医療において移植片拒絶を抑制するために有効な免疫抑制剤、並びに過剰な免疫応答によって生じる自己免疫疾患やアレルギー疾患等の免疫関連疾患を予防または治療するために有効な薬剤を提供することを目的とする。
　また他の態様として、本発明は、DOCK180またはDOCK5を標的とし、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化を抑制することによって、がん細胞の浸潤、遊走、及び足場非依存的な増殖を抑制する作用を備えた、抗がん剤として有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、今までDOCK2がリンパ球、好中球および形質細胞様樹状細胞（pDC）の遊走や活性化に重要なRacを活性化させる分子であることを実証するとともに（非特許文献２０～２４参照）、DOCK2を欠損させたノックアウトマウスに心臓移植を行ったところ、免疫抑制剤を投与しなくても移植片拒絶が抑制でき、同種移植心臓が長期にわたり生着できること、またDOCK2の欠損により自己免疫疾患の発症をブロックできることを確認した（実験例１参照）。かかる知見から、DOCK2は免疫関連疾患を予防または治療する薬剤を開発するうえで、また免疫抑制剤を開発するうえで、格好の分子標的になると考えられる。
　そこで、本発明者らは、DOCK2の全長またはそのDHR-2ドメインを哺乳類細胞または大腸菌で発現させ、DOCK2により活性化されたGTP結合型Racを検出するアッセイ系を用いて、DOCK2によるRacの活性化を抑制するリード化合物を取得し、当該リード化合物が、リンパ球や好中球の遊走や活性化をin vitroで抑制すること、さらに自己免疫モデル動物を用いたin vivo試験において、当該モデル動物の自己免疫疾患の発症を有意に抑制できることを確認した。さらに、かかるリード化合物との構造相関から、当該リード化合物と類似の構造を有し、かつリード化合物と同様にRac活性化を抑制する作用を有するアナログを開発した。
　かかる本発明が対象とする一連の化合物は、特許文献３及び４に記載されているピラゾリジンジオン誘導体と一部共通するものの、従来、ピラゾリジンジオン誘導体に、DOCK2を介した免疫細胞におけるRacの活性化を抑制する作用があることは勿論、不適切な免疫応答を抑制する作用があることについては知られていない。
　さらに本発明者らは、上記作用を有する一連の化合物に、DOCK2のみならず、さらにDOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化を抑制する作用、特にDOCK180及びDOCK5のGEF活性を阻害する作用があり、がん細胞の浸潤、遊走、足場非依存的な増殖を抑制することを見出した。
　本発明は、これらの研究で得られた知見の積み重ねにより開発されたものであり、下記の態様のものが含まれる。
　（Ｉ）Rac活性化阻害剤
（I-1）．一般式（１）で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするRac活性化阻害剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕。
　（I-2）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ1が水素原子である化合物である、（I-1）に記載するRac活性化阻害剤。
　（I-3）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ2が水素原子、ハロゲン原子、水酸基、またはメチル基である化合物である、（I-1）または（I-2）に記載するRac活性化阻害剤。
　（I-4）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、ｎが１である化合物である、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載するRac活性化阻害剤。
　（I-5）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｚがメチンである化合物である、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するRac活性化阻害剤。
　（I-6）．一般式（１）で示されるピラゾリジンジオン誘導体が、下記（a）～（p）からなる群から選択される少なくとも１つである、（I-1）に記載するRac活性化阻害剤：
（a）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（b）4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（c）4‐[(2‐クロロフェニル)ベンジリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（d）4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（e）4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（f）4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（g）4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（h）4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（i）4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（j）4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（k）4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（l）4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（m）4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（n）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（o）4-(3-フェニルアリリデン)-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（p）(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
　なお、本発明のRac活性化阻害剤は、DOCK2、DOCK180またはDOCK5によるRac活性化を阻害する作用を有するとともに、後述する試験例４及び９に示すようにDOCK2、DOCK180またはDOCK5のGEF活性を阻害する作用を有することから、DOCK2阻害剤、DOCK180阻害剤、またはDOCK5阻害剤、ということもできる。
　（II）Rac活性化に関連する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物
（II-1）（I-1）乃至（I-6）のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物。（II-2）上記Rac活性化が、DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化である、（II-1）に記載する医薬組成物。
　（II-3）上記疾患または病態が、DOCK2を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（II-1）または（II-2）に記載する医薬組成物。
　（II-4）上記疾患または病態が、免疫関連疾患、または生体移植に対する拒絶反応である、（II-3）に記載する医薬組成物。
　（II-5）上記医薬組成物が免疫抑制剤である（II-4）に記載する医薬組成物。
　（II-6）上記疾患または病態が、DOCK180またはDOCK 5を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（II-1）または（II-2）に記載する医薬組成物。
　（II-7）上記疾患または病態が、悪性腫瘍である（II-6）に記載する医薬組成物。
　（II-8）上記悪性腫瘍が固形がんである（II-7）に記載する医薬組成物。
　（II-9）上記医薬組成物が抗がん剤である（II-7）または（II-8）に記載する医薬組成物。
　（III）Rac活性化に関連する疾患または病態を予防または治療する方法
（III-1）一般式（１）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕
で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を、Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態に罹患しているか、その罹患する可能性のある患者に投与する工程を有する、
Rac活性化に関連する疾患または病態を予防または治療する方法。
　（III-2）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ1が水素原子である化合物である、（III-1）に記載する方法。
　（III-3）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ2が水素原子、ハロゲン原子、水酸基、またはメチル基である化合物である、（III-1）または（III-2）に記載する方法。
　（III-4）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、ｎが１である化合物である、（III-1）乃至（III-3）のいずれかに記載する方法。
　（III-5）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｚがメチンである化合物である、（III-1）乃至（III-4）のいずれかに記載する方法。
　（III-6）．一般式（１）で示されるピラゾリジンジオン誘導体が、下記（a）～（p）からなる群から選択される少なくとも１つである、（III-1）に記載する方法：
（a）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（b）4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（c）4‐[(2‐クロロフェニル)ベンジリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（d）4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（e）4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（f）4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（g）4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（h）4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（i）4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（j）4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（k）4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（l）4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（m）4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（n）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（o）4-(3-フェニルアリリデン)-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（p）(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
　（III-7）上記Rac活性化が、DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化である、（III-1）乃至（III-6）のいずれかに記載する方法。
　（III-8）上記疾患または病態が、DOCK2を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（III-1）乃至（III-6）のいずれかに記載する方法。
　（III-9）上記疾患または病態が、免疫関連疾患、または生体移植に対する拒絶反応である、（III-8）に記載する方法。
　（III-10）免疫抑制方法である（III-9）に記載する方法。
　（III-11）上記疾患または病態が、DOCK180またはDOCK 5を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（III-1）乃至（III-6）のいずれかに記載する方法。
　（III-12）上記疾患または病態が、悪性腫瘍である（III-11）に記載する方法。
　（III-13）上記悪性腫瘍が固形がんである（III-12）に記載する方法。
　（III-14）抗がん療法である（III-12）または（III-13）に記載する方法。
　（IV）ピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩の用途
（IV-1）Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態に罹患しているか、その罹患する可能性のある患者について、当該疾患または病態を予防または治療するために使用される、一般式（１）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕
で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-2）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ1が水素原子である化合物である、（IV-1）に記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-3）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ2が水素原子、ハロゲン原子、水酸基、またはメチル基である化合物である、（IV-1）または（IV-2）に記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-4）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、ｎが１である化合物である、（IV-1）乃至（IV-3）のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-5）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｚがメチンである化合物である、（IV-1）乃至（IV-4）のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-6）．一般式（１）で示されるピラゾリジンジオン誘導体が、下記（a）～（p）からなる群から選択される少なくとも１つである、（IV-1）に記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩：
（a）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（b）4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（c）4‐[(2‐クロロフェニル)ベンジリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（d）4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（e）4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（f）4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（g）4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（h）4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（i）4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（j）4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（k）4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（l）4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（m）4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（n）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（o）4-(3-フェニルアリリデン)-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（p）(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
　（IV-7）上記Rac活性化が、DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化である、（IV-1）乃至（IV-6）のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-8）上記疾患または病態が、DOCK2を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（IV-1）乃至（IV-6）のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-9）上記疾患または病態が、免疫関連疾患、または生体移植に対する拒絶反応である、（IV-8）に記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-10）上記疾患または病態が、DOCK180またはDOCK 5を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（IV-1）乃至（IV-6）のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-11）上記疾患または病態が、悪性腫瘍である（IV-10）に記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（IV-12）上記悪性腫瘍が固形がんである（IV-11）に記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
　（V）ピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩の医薬組成物調製のための使用
（V-1）Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物の製造のための、一般式（１）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕
で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩の使用。
　（V-2）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ1が水素原子である化合物である、（V-1）に記載する使用。
　（V-3）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ2が水素原子、ハロゲン原子、水酸基、またはメチル基である化合物である、（V-1）または（V-2）に記載する使用。
　（V-4）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、ｎが１である化合物である、（V-1）乃至（V-3）のいずれかに記載する使用。
　（V-5）上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｚがメチンである化合物である、（V-1）乃至（V-4）のいずれかに記載する使用。
　（V-6）一般式（１）で示されるピラゾリジンジオン誘導体が、下記（a）～（p）からなる群から選択される少なくとも１つである、（V-1）に記載する使用：
（a）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（b）4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（c）4‐[(2‐クロロフェニル)ベンジリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（d）4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
（e）4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（f）4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（g）4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（h）4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（i）4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（j）4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（k）4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（l）4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（m）4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
（n）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（o）4-(3-フェニルアリリデン)-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
（p）(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
　（V-7）上記Rac活性化が、DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化である、（V-1）乃至（V-6）のいずれかに記載する使用。
　（V-8）上記疾患または病態が、DOCK2を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（V-1）乃至（V-6）のいずれかに記載する使用。
　（V-9）上記疾患または病態が、免疫関連疾患、または生体移植に対する拒絶反応である、（V-8）に記載する使用。
　（V-10）上記疾患または病態が、DOCK180またはDOCK 5を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である（V-1）乃至（V-6）のいずれかに記載する使用。
　（V-11）上記疾患または病態が、悪性腫瘍である（V-10）に記載する使用。
　（V-12）上記悪性腫瘍が固形がんである（IV-11）に記載する使用。
　本発明の化合物（１）は、後述する試験例で示すようにDOCK2とRacとの会合を阻害することにより、免疫反応に必要不可欠な免疫細胞におけるRacの活性化を阻害する作用（Rac活性化阻害作用）を有している。このため、本発明の化合物（１）は、リンパ球などの免疫細胞の遊走を阻止し、不適切な免疫反応（例えば、自己免疫疾患やアレルギー疾患などの過剰な免疫反応、並びに同種移植片拒絶反応など）を抑制することが可能である。従って、本発明の化合物（１）は、in vitro及びin vivoにおいて、免疫細胞におけるDOCK2を介したRacの活性化を阻害するために使用されるRac活性化阻害剤の有効成分として、また自己免疫疾患やアレルギー疾患などの免疫関連疾患の予防または治療剤の有効成分として、さらに免疫抑制剤の有効成分として有用である。
　また本発明の化合物（１）は、後述する試験例で示すようにDOCK180またはDOCK5とRacとの会合を阻害することにより、がん細胞におけるRacの活性化を阻害する作用（Rac活性化阻害作用）、特にDOCK180及びDOCK5のGEF活性を阻害する作用を有している。このため、本発明の化合物（１）は、がん細胞の浸潤、遊走、並びに足場非依存的な増殖を阻止することにより、がん細胞の増殖及び転移を抑制することが可能である。従って、本発明の化合物（１）は、in vitro及びin vivoにおいて、がん細胞におけるDOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化を阻害するために使用されるRac活性化阻害剤の有効成分として、また悪性腫瘍の予防または治療剤（抗がん剤）の有効成分として有用である。
DOCK2のドメイン構造とRacを活性化する機序を示す概略図である。 試験例１の試験結果を示す。（Ａ）の上段の画像は、DOCK2を発現したマウス（ここではWTと記載）とDOCK2欠損マウス（DOCK2-/-）に、同種心臓を移植し、その移植心臓の切片をヘマトキシリン・エオジン染色して観察した組織画像を示す。（Ａ）の下段の数値は、各マウスの移植心臓の生着日数を、単独ではほとんど効果のない量(3.2 mg/kg/day)のFK506を移植後10日間投与した場合（FK506(＋)）と投与しなかった場合（FK506(－)）とで対比したものである。（Ｂ）の上段は、自己免疫性糖尿病モデルマウスであるNODを対象に、DOCK2を発現した場合（DOCK2＋/-）とDOCK2を発現しない場合(DOCK2-/-)について、糖尿病の発症率（上左図）と膵島炎の発症率（上右図）を対比したものである。（Ｂ）の下段の画像では、各マウス（DOCK2＋/-とDOCK2-/-）の膵臓切片をヘマトキシリン・エオジン染色して観察した組織画像を示す。 試験例３の試験結果を示す。(Ａ)は、大腸菌で発現させたTrigger factor（TF）融合DOCK2-DHR-2およびTiam1 DH-PHを化合物６の存在下で処理した後、GST融合Rac1を結合したビーズを加え、4℃で1時間反応させ、SDS-PAGEにて結合を調べた結果を示す。（Ｂ）は、DOCK2、Tiam1または Trio（DH-D1/PH-D1ドメイン）を導入したHEK293T細胞において、化合物６がDOCK2によるRac活性化を選択的に阻害することを示す。 試験例４の結果を示す。（Ａ）はDOCK2, DOCK180, DOCK5のGEF活性阻害効果を示す。また（Ｂ）は、化合物６がDOCK2-DHR2かRac1のいずれと会合するかについて、STD-NMR法により調べた結果を示す。 試験例５の結果を示す。（Ａ）は、ケモカインによって誘導される免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞）におけるRac活性化が、化合物６の存在により阻害されることを示す。（Ｂ）は、ケモカインによって誘導される免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞）の遊走応答が、化合物６により用量依存的に阻害されることを示す。 試験例６の結果を示す。（Ａ）は、TCRに対する刺激で誘導されるRac活性化が、化合物６の存在により阻害されることを示す。（Ｂ）は、化合物６の存在により、混合リンパ球反応が用量依存的に阻害されることを示す。 試験例７の結果を示す。（Ａ）はTLR9のリガンドであるCpGで誘導される形質細胞様樹状細胞(pDC)のRac活性化が、化合物６の存在により阻害されることを示す。（Ｂ）は、化合物６の存在により、CpGに応答したINF-αの産生は用量依存的に阻害されるものの、IL-12の産生は阻害されないことを示す。 試験例８の実験手法とその結果を示す。化合物６の投与により、自己免疫脳脊髄炎の臨床スコア（左図）ならびに自己免疫脳脊髄炎の発症率（右図）が顕著に改善することを示している。 試験例９の結果を示す。（Ａ）はグリア芽腫細胞株（LN-229株）および肺がん細胞株（3LL）の細胞外マトリクスへの浸潤が化合物６の存在により阻害されることを示す。（Ｂ）は、化合物６の存在により、LN229株の遊走が阻害されることを示す。（Ｃ）は、化合物６の存在により、3LL株の遊走が阻害されることを示す。 試験例１０の結果を示す。3LL株の足場非依存的な増殖が、化合物６の存在により阻害されることを示す。
（Ｉ）ピラゾリジンジオン誘導体またその薬学的に許容される塩
　本発明が対象とするRac活性化阻害剤、並びにRac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物（以下、これを単に「医薬組成物」ともいう）は、いずれもDOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化を阻害する作用を有する下記一般式（１）で表されるピラゾリジンジオン誘導体またその薬学的に許容される塩（以下、これらを総称して「本発明の化合物」という）を有効成分とする：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕。
　一般式（１）中、Ｒ１またはＲ２として表されるアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等の炭素数１～４のアルキル基を挙げることができる。好ましくは炭素数１～２のメチル基及びエチル基、より好ましくはメチル基を挙げることができる。
　一般式（１）中、Ｒ１またはＲ２として表されるハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を挙げることができる。特に制限されないが、好ましくは塩素原子及びフッ素原子であり、より好ましくは塩素原子である。
　一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２の六員環における位置は、メタ位、オルト位、パラ位のいずれでもよいが、好ましくはオルト位である。
　なお、Ｒ１として好ましい置換基は水素原子であり、Ｒ２として好ましい置換基は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、またはメチル基；より好ましくはハロゲン原子であり、なかでも塩素原子が好適である。
　一般式（１）において、ｎは０、１及び２のいずれの整数であってもよいが、好ましくは１または２の整数、より好ましくは１の整数である。
　一般式（１）中、実線と破線からなる二重線は、飽和結合（一重結合）と不飽和結合（二重結合）の両方を意味する。つまり、隣接する炭素同士が飽和結合で結合していてもよいし、また不飽和結合により結合していてもよい。但し、ｎが１または２の場合、一方の炭素同士が飽和結合であれば、残りの炭素同士も飽和結合であり、また一方の炭素同士が不飽和結合であれば、残りの炭素同士も不飽和結合であることが好ましい。
　本発明の化合物（１）には、下式（1-1）及び（1-2）で示される互変異性体も含まれる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式中、Ｚ、Ｘ、及びＲ１は前記と同じ。）
　さらに本発明の化合物（１）には幾何異性体が含まれ、具体的にはシス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物の状態であってもよいが、好ましくはシス異性体である。幾何異性体と互変異性体を考慮すると本発明の化合物（１）は、下記の状態で存在していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Ｚ、Ｘ、及びＲ１は前記と同じ。）
　さらに本発明の化合物（１）には立体異性体も含まれ、具体的には光学的に純粋なエナンチオマー、エナンチオマー混合物、ラセミ体、エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、エピマーの状態であってもよい。
　このような異性体は、当業者に公知の方法により調製取得することができる。例えばキラルシントン若しくはキラル試薬を用いて立体化学的に制御された合成により、またクロマトグラフィー法、若しくは結晶化法などの古典的分離手段によって、またはその他の公知の方法、例えばエナンチオマー的に純粋なキラル酸との塩形成によるジアステレオマー塩の形成を介して、あるいは、例えばキラルリガンド変性クロマトグラフ材料を使用したクロマトグラフィーによって得ることができる。
　一般式（１）で示されるピラゾリジンジオン誘導体は、薬学的に許容される塩の形で用いることができる。本発明において「薬学的に許容される塩」とは、親化合物（塩フリーの化合物）の生物学的有効性を備えており、生物学的に無毒性か、若しくは生物学的に毒性の低い無機または有機の酸または塩基の付加塩を意味する。
　本発明のある種の化合物は、アミノ基等の塩基性官能基を含み、このため薬学的に許容される酸付加塩を形成することができる。このような酸付加塩は、適当な溶媒中、式（１）で示される親化合物と、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、桂皮酸、サリチル酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機酸と反応させることによって調製することができる。
　また本発明のある種の化合物は、水酸基等の酸性官能基を含むことができ、このため薬学的に許容される塩基付加塩を形成することができる。このような塩基付加塩としては、アンモニウム塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩やカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；または亜鉛塩などを挙げることができる。有機塩から導かれる塩としては、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジンなどの第一級、第二級および第三級アミン類、置換アミン類、及び環状アミン類等を例示することができる。
　さらに本発明の化合物（１）は、溶媒和、例えば水和された状態であってもよいし、また溶媒和されていない状態であってもよい。さらに異なる結晶状態のものが混在したものであってもよい。
　一般式（１）で表されるピラゾリジンジオン誘導体の具体例として、4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（製造例１：化合物6）、4-[3-
(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例１：化合物5)、4‐[(2‐クロロフェニル)ベンジリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン(製造例３：化合物7)、4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン(製造例４：化合物8)、4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例５：化合物9)、4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例６：化合物10)、4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例７：化合物11)、4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例８：化合物12)、4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例９：化合物13)、4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例１０：化合物14)、4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(製造例１１：化合物15)、4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（製造例１２：化合物16）、4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（製造例１３：化合物17）、4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン（製造例１４：化合物18）、4-(3-フェニルアリリデン)-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン（製造例１５：化合物19）、(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（製造例２：化合物20）を挙げることができる。好ましくは化合物6、7、8、10、14、15、16、17、18、19、及び20であり、より好ましくは化合物6、7、及び20である。
　本発明のピラゾリジンジオン誘導体（１）は、制限はされないが、例えば特許文献３及び４に記載されている公知の方法、あるいはそれを適切に変更した方法に従って製造することができる。
　具体的には、下記反応式１に示すように、本発明のピラゾリジンジオン誘導体（１）は、式（Ｉ）で示されるピラゾリジンジオン誘導体と式（II）で示される芳香族アルデヒド化合物とを、適切な溶媒（例えばエタノールまたはメタノール、ＴＨＦ等）中で任意に、適切な塩基（例えばピリジン、NMO、DIEA、TEA、プロリン等）の存在下で数時間（例えば、２～２４時間程度）に渡り反応（Knoevenagel縮合）させることによって取得することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記と同じ。）
　好適な反応条件は、特に制限されないが、ピラゾリジンジオン誘導体（Ｉ）と芳香族アルデヒド化合物（II）とをＴＨＦ中、触媒量のプロリンの存在下で、室温で24時間攪拌する方法を例示することができる。
　なお、式（Ｉ）で示されるピラゾリジンジオン誘導体は、下記反応式２に示すように、式（III）で示されるフェニルヒドラジン誘導体と式（IV）で示されるマロン酸誘導体とを反応させることによって調製することができる。式（IV）中、「LG1」または「LG2」で示される置換基は任意の適切な脱離基である。制限はされないが、ハロゲン原子、１－ヒドロキシ－ピロリジン－２，５－ジオン、ベンゾトリアゾール－１－オル、脂肪族又は芳香族アルコキシ基を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中、Ｚ、及びＲ１は前記と同じ。ＬＧ１及びＬＧ２は脱離基を意味する。）
　ピラゾリジンジオン誘導体（Ｉ）を調製するための好適な方法としては、フェニルヒドラジン誘導体（III）とモノエチルマロニルクロリド（IV）との、THF等の適切な溶媒中Et3N存在下での縮合、又はフェニルヒドラジン誘導体（III）とジアルコキシマロネート（IV）とのエタノール又はメタノール等の適切な溶媒中、適切な塩基（例えばナトリウムエトキシドまたはナトリウムメトキシド）の存在下または非存在下での縮合を例示することができる。
　また式（Ｉ）で示されるピラゾリジンジオン誘導体は、下記反応式３に示すように、フェニルヒドラジン誘導体（III）とマロン酸誘導体（IV）から生成される、式（V）で示される化合物を、エタノールやTHF若しくはDMF等の適切な溶媒中、ナトリウムエトキシド又はナトリウムメトキシド、水酸化ナトリウム、K2CO3、NaH、LDA、LiH、DMS若しくはDIEA等の適切な塩基の存在下で、環状化させることによって調製することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中、Ｚ、Ｒ１、ＬＧ１及びＬＧ２は前記と同じ。）
　より詳細には、後述する製造例において説明する方法に従って製造することができる。
　斯くして得られるピラゾリジンジオン誘導体（１）は、通常の分離手段、例えばカラムクロマトグラフィー、再結晶等により反応混合物から容易に単離精製することができる。
　（II）Rac活性化阻害剤、Rac活性化関連疾患の予防または治療用医薬組成物
　上記本発明の化合物（１）は、後述する試験例で示すようにDOCK2とRacとの会合を阻害することにより、免疫反応に必要不可欠な免疫細胞におけるRacの活性化を阻害する作用（Rac活性化阻害作用）を有している。その結果、本発明の化合物（１）は、リンパ球などの免疫細胞の遊走を阻止し、不適切な免疫反応（例えば、自己免疫疾患やアレルギー疾患などの過剰な免疫反応、並びに同種移植片拒絶反応など）を抑制することが可能である。
　このため、本発明の化合物（１）は、in vitro及びin vivoにおいて、免疫細胞におけるDOCK2を介したRacの活性化を阻害するために使用されるRac活性化阻害剤の有効成分として、また自己免疫疾患やアレルギー疾患などの免疫関連疾患の予防または治療剤の有効成分として、さらに免疫抑制剤の有効成分として有用である。
　また本発明の化合物（１）は、後述する試験例で示すようにDOCK180またはDOCK5とRacとの会合を阻害することにより、がん細胞におけるRacの活性化を阻害する作用（Rac活性化阻害作用）を有している。その結果、本発明の化合物（１）は、がん細胞の浸潤、遊走及び足場非依存的な増殖を阻止し、がん細胞の増殖や転移を抑制することが可能である。
　このため、本発明の化合物（１）は、in vitro及びin vivoにおいて、がん細胞におけるDOCK2を介したRacの活性化を阻害するために使用されるRac活性化阻害剤の有効成分として、また悪性腫瘍、特に固形がんの予防または治療剤（抗がん剤）の有効成分として有用である。
　ゆえに本発明は、上記本発明の化合物（１）を有効成分とするRac活性化阻害剤、及びRac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物を提供する。なお、当該医薬組成物には、具体的には免疫抑制剤、または免疫関連疾患の予防または治療剤（抗免疫関連疾患剤）、および抗がん剤が包含される（以下、これらを総称して、「本発明の製剤」ともいう）。
　本発明の製剤は、上記本発明の化合物（１）だけからなるものであってもよいし、または、任意の担体や添加剤と組み合わせて、従来公知の方法で所望の用途（投与経路及び投与方法）に適した形態に調製した組成物であってもよい。本発明の製剤の形態としては、制限されないが、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤、粉末シロップ剤およびカプセル剤（硬カプセルおよび軟カプセル）などの固体状の経口投与に適した製剤；液状、乳液状または凍結乾燥された形状を有する注射剤や点滴剤に適した製剤；クリーム、軟膏およびジェルなどのペースト状またはゲル状の外用剤に適した製剤；液剤、懸濁剤、乳液剤、シロップ、エリキシル剤、噴霧剤およびエアゾールなどの液体状の製剤、等とすることができる。
　本発明の製剤に配合する本発明の化合物（１）の割合としては、例えばこれを免疫抑制剤、または抗免疫関連疾患剤として使用する場合、免疫細胞においてRac活性化を阻害する作用を発揮する割合、好ましくはリンパ球の遊走を阻害する作用を発揮する割合、より好ましくは免疫反応を抑制する割合であれば特に制限されず、例えば、製剤１００重量％中、０.００１～９９重量％、好ましくは０．０１～５０重量％、より好ましくは０．０５～１０重量％の範囲で適宜設定調製することができる。また、例えばこれを抗がん剤として使用する場合、がん細胞においてRac活性化を阻害する作用を発揮する割合、好ましくはがん細胞の浸潤、遊走または増殖を阻害する作用を発揮する割合であれば特に制限されず、例えば、製剤１００重量％中、０.００１～９９重量％、好ましくは０．０１～５０重量％、より好ましくは０．０５～１０重量％の範囲で適宜設定調製することができる。
　当該製剤は、本発明の化合物（１）を上記割合で含むものであればよく、この効果を妨げない範囲で他成分を配合することもできる。かかる他成分は、本発明のRac活性化阻害剤、またはRac活性関連疾患用医薬組成物（免疫抑制剤、または抗免疫関連疾患剤、抗がん剤）の使用目的、投与経路（投与形態）、使用対象疾患の種類、使用対象者の体重、年齢及び疾患の程度などに応じて適宜選択することができる。例えば、制限されないが、かかる他成分には、賦形剤、結合剤、分散剤、増粘剤、滑沢剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤などの一般に製剤の製造に使用される担体のほか、抗生物質、抗菌剤、殺菌剤、防腐剤、ビルダー、漂白剤、酵素、キレート剤、消泡剤、着色料（染料、顔料など）、柔軟剤、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、香料、矯味剤、矯臭剤、溶媒などが含まれる。
　本発明の製剤のうち免疫抑制剤は、上記本発明の化合物（１）に加えて、他の免疫抑制剤を含有していてもよい。かかる免疫抑制剤としては、制限はされないが、例えばカルシニューリン阻害剤（calcineurin inhibitor）であるサイクロスポリンやFK560、スフィンゴシン 1-リン酸受容体の機能的アンタゴニストであるFTY720などを例示することができる。
　また本発明の製剤のうち、抗免疫関連疾患剤は、上記本発明の化合物（１）に加えて、免疫抑制作用を増強または補助する作用を有する成分を含有していてもよい。かかる成分としては、コルチコステロイド、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド、クロラムブチルシクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン等を例示することができる。ここで好ましいコルチコステロイドとしては、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、ベタメタゾン等が挙げられる。
　また本発明の製剤のうち、抗がん剤は、上記本発明の化合物（１）に加えて、他の抗がん剤、抗がん作用を増強または補助する作用を有する成分、または免疫賦活剤を含有していてもよい。
　また本発明の製剤が、外用組成物の形態を有する場合、当該製剤には、皮膚への浸透を促進する作用を有する成分を配合することもできる。かかる成分としては、アルコール、プロピレングリコール、ビタミンＥ，メントール、ラウロカプラム等を例示することができる。
　本発明において、「免疫関連疾患」という用語は特に断りのない限り、免疫系の応答により細胞、組織、器官や複数の系統において病的症状が誘発されることを特徴とする全ての疾患若しくは障害、又は、免疫系の任意部分の機能不全に起因する全ての疾患若しくは障害を意味する。かかる疾患には、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性若年性慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性脈管炎／ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除を戻す手術処置、アレルギー性／アトピー性疾患、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏反応性肺炎、移植、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性菌敗血症、真菌性敗血症、好中球減少に伴う発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌症、外傷／出血、やけど、電離放射線暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、慢性関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性疾患、サルコイドーシス、クローン病、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ、アトピー性疾患、超過敏反応、結膜炎、子宮内膜症、じんましん、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の器官又は組織の移植片拒絶反応、腎臓移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、同種移植片拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植片拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、任意の器官又は組織の異種移植片拒絶反応、同種移植片拒絶反応、抗受容器超過敏反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、重症筋無力症、抗体による細胞傷害、III型超過敏反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経炎、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症及び皮膚症状症候群）、多発神経炎、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、皮膚症状症候群、抗リン脂質抗体症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性白斑、脈管炎、心筋梗塞における心臓切開後の症候群、IV型過敏症、接触皮膚炎、過敏反応性肺炎、同種移植片拒絶反応、細胞内有機体による肉芽腫、薬物過敏、代謝性／特発性、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α－１－アンチトリプシン欠損症、橋本病、骨粗鬆症、視床下部－脳下垂体－副腎系の評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、家族性血球食細胞性リンパ組織球症、皮膚状態、脱毛、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒、子癇前症、OKT3療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば無気力、貧血及び悪液質等を含むが、これらに制限されない）及び慢性サリチル酸中毒が含まれる。
　また本発明において、「自己免疫疾患」という用語は、器官又は組織特異的自己免疫疾患、全身性自己免疫疾患及び自己免疫型の症状を示す疾患を含むものとし、特に、グレーブス病、橋本病、多腺性自己免疫症候群、インスリン依存性糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病、免疫性不妊、自己免疫性アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、尋常性白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、スティフ・マン症候群、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、側頭動脈炎、ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、線維筋痛症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎、高安動脈炎、脂肪織炎、類天疱瘡、原因不明の脈管炎、ＡＮＣＡ陰性の脈管炎、ＡＮＣＡ陽性の脈管炎、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、強皮症、全身性壊死性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ＣＲＥＳＴ症候群、抗リン脂質抗体症候群、シェーグレン症候群、好酸球性胃腸炎、異型局所皮膚炎、心筋症、感染後症候群及び感染後心内膜心筋炎等の自己免疫疾患を含むものとする。
　器官又は組織特異的自己免疫疾患には、グレーブス病、橋本病、多腺性自己免疫症候群、インスリン依存性糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病、免疫性不妊、自己免疫性アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、尋常性白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、スティフ・マン症候群、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、側頭動脈炎、ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、線維筋痛症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎、高安動脈炎、脂肪織炎、類天疱瘡、原因不明の脈管炎、ＡＮＣＡ陰性の脈管炎及びＡＮＣＡ陽性の脈管炎が含まれる。
　また全身性自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、強皮症、全身性壊死性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ＣＲＥＳＴ症候群、抗リン脂質抗体症候群及びシェーグレン症候群が含まれる。
　なお、本発明が対象とする自己免疫疾患には、「自己免疫型の症状を示す疾患」も含まれる。当該疾患は、自己抗体濃度は上昇するにも関わらず自己免疫疾患であるとは見なされない全ての疾患を意味する。例えば、好酸球性胃腸炎、異型局所皮膚炎、心筋症、及び、感染後心内膜心筋炎等の感染後症候群等が挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明が対象とする悪性腫瘍は、浸潤または転移し、身体の各所で増大することで生命を脅かす腫瘍であり、がんはまたは悪性新生物ともいう。悪性腫瘍には、造血細胞悪性腫瘍（白血病、リンパ腫［ホジキン病、非ホジキンリンパ腫］、多発性骨髄腫）、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道癌、胃癌、虫垂癌、大腸癌（大腸、直腸、肛門およびその付随組織）、肝癌、肝細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓がん（膵がん）、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫（胸膜、腹膜、心膜など）、頭頚部癌、喉頭癌、口腔癌、口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌、甲状腺癌、腎臓がん、肺癌、骨肉腫、前立腺癌、精巣腫瘍（睾丸がん）、腎細胞癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、皮膚癌（「ほくろ」と形成異常母斑を含む）、肛門癌等が含まれる。
　本発明のある実施形態において、本発明の化合物（１）の治療上有効な量は、哺乳動物、好ましくはヒト１日当たり約５～約５００ｍｇである。本発明の別の実施形態において、本発明の化合物（１）の治療上有効な量は、１日当たり約５～約２５０ｍｇである。また、本発明の別の実施形態において、本発明の化合物（１）の治療上有効な量は、１日当たり約５～約１００ｍｇである。そして、本発明の別の実施形態において、本発明の化合物（１）の治療上有効な量は、１日当たり約５～約５０ｍｇである。更に、本発明の別の実施形態において、本発明の化合物（１）の治療上有効な量は、１日当たり約５０ｍｇ未満である。
　以下に、本発明の化合物（１）の製造例及び試験例を挙げて、本発明を一層明らかにするが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例１
4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物5)の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（１） (N'-フェニルヒドラジノカルボニル)酢酸エチルエステル(化合物Ｖ)、および(N-フェニルヒドラジノカルボニル)酢酸エチルエステル(化合物Ｖ')の合成（Houille, O.; Fretz, H.; Hilpert, K.; Riederer, M.; Giller, T.; Valdenaire, O., WO 2005/002574 A1）
  Et3N(25.9ml、186mmol)を、THF(300ml)に溶解した－10℃のフェニルヒドラジン溶液(17.5ml、177mmol)に添加し、撹拌した。これに、－10℃の条件で塩化メチルマロニル(22.9ml、181mmol)を30分間以上かけて滴下し、次いで反応液を室温まで温めて撹拌した。１日後、反応液に水を入れて反応を停止し、得られた生成物をEtOAcで抽出した。次いで回収した有機相を、水及び塩水で繰り返し洗浄した。Na2SO4を用いて有機相を脱水し、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた粗生成物をCH2Cl2およびヘキサンで再結晶し、標記化合物ＶとＶ'の混合物を黄色の固形物として取得した(26.6g、収率68%、化合物Ｖ：Ｖ’＝3:1混合物)。なお、化合物ＶとＶ’とは分離できなかった。
　1H-NMR(500MHzおよびCDCl3)
　1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.72 (s), 7.29-7.23 (m), 6.99-6.79 (m), 6.20 (s, 1 H, major isomer), 5.99 (s, 1 H, minor isomer), 4.28 (q, J = 7 Hz, 2 H, major isomer), 4.16 (q, J = 7 Hz, 2 H, minor isomer), 3.53 (s, 2 H, minor isomer), 3.45 (s, 2 H, major isomer), 1.35 (t, J = 7 Hz, 3 H, major isomer), 1.27 (t, J = 7 Hz, 3 H, minor isomer)。
　（２）1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（化合物Ｉ）の合成（Holzer, W.; Hallak, L. Heterocycles2004, 63, 1311-1334.）
　EtOH(10ml)に溶解した1Mの中のNaOH溶液を、（１）で調製した化合物ＶとＶ’の混合物(1.0g、4.5 mmol)の中に添加し、反応混合物を室温で30分間撹拌した。その後、AcOHを添加し、H2Oを添加した後、生成物をCH2Cl2で抽出した。回収した有機相を、水と塩水で繰り返し洗浄し、Na2SO4を用いて脱水した。次いで溶媒を減圧下で蒸発させて標題の化合物Iを黄色の固形物として取得した(462mg、収率58%)。
　1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.56 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.44 (t, J = 15.9 Hz, 2 
H ), 7.26 (m, 1H), 3.45 (s, 2 H)。
　（３） 4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物6)の合成
  THF(140ml)に溶解した化合物Ｉの溶液(6.28g、35.6 mmol)に、3-(2-クロロフェニル)プロペナール(5.0g、30.0 mmol)（Dong, H.; Shen, M.; Redford, J. E.; Stokes, B. J.;Pumphrey, A. L.; Driver, T. G. Org. Lett., 2007, 9, 5191-5194）、およびプロリン(35mg、0.3 mmol)を添加した。その混合液を、室温で１日間撹拌した後、得られた反応混合物を減圧下で蒸発処理に供した。斯くして得られた粗生成物を、THFとヘキサンで再結晶し、赤い固形物として標題の化合物6(6.80g、収率70%、E：Z=1:1混合)を取得した。
　1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ 8.45 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 8.31 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 7.89-7.80 (m, 5 H), 7.68-7.66 (m, 4 H), 7.45-7.41 (m, 5 H), 7.36-7.29 (m, 5 H), 7.23-7.20 (m, 2 H)。
　（４）4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物5):の合成
　Pd/C(10mol%、4.3mg)を、室温でEtOH(1.0ml)に溶解した化合物6(13mg、40.0μmol)の溶液に添加し、また、水素ガスを１気圧の条件で加えた。次いで溶液を45分間撹拌し、その後、反応液をセライトパットを用いてろ過し、溶媒を蒸発させた。斯くして得られた粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ(溶離剤: ヘキサン/EtOAc、1/1)に供し、淡黄色固形物として標題の化合物5(10.4mg、収率79%)を取得した。
　m.p. 107-108 oC (decomposition);
　IR (KBr) νmax 3196, 3071, 2931, 2868, 1680, 1597, 1507, 1356, 749 cm-1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ7.57 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.40（t, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.30 (d, J = 6.1 Hz, 1 H), 7.23-7.04 (m, 4 H), 3.28 (t, J = 6.1 Hz, 1 H), 2.79-2.64 (m, 2H) (2.78 (t, J = 7.8 Hz, 1.5 H), 2.66 (t, J = 7.5 Hz, 0.5 H, enol)), 2.11-2.03 (m, 2 H), 1.90-1.82 (m, 2 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3)・172.3, 166.6, 138.9, 135.3, 133.9, 130.3, 129.5, 129.4, 128.4, 127.5, 126.8, 126.0, 118.8, 46.8, 35.6, 33.1, 27.2, 25.9; 
MS (ESI-MS) 329 [M+H+], 351 [M+Na+]; 
HRMS (ESI-MS) calcd. for C18H18ClN2O2 + [M+H+] 329.1057, found 329.1058。
　製造例２
(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（化合物20）の製造
　標題の化合物20は、製造例１（３）で合成した化合物６（E/Z混合、200mg、616μmol)をクロロホルムで５回洗浄することにより、赤い固形物として単離された (90mg、278μmol)。
m.p. 186-187 oC (decomposition);
IR (KBr) νmax 3160, 3064, 2845, 1677, 1616, 1499, 1378, 1300, 1165, 753 cm-1;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.31 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 7.88 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.86 (s, 1H), 7.83 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.44 (t, J = 8.0 Hz, 3 H), 7.34 (t, J = 5.4 Hz, 2 H), 7.23-7.21 (m, 1 H);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ165.2, 160.3, 156.0, 150.4, 147.2, 136.5, 135.7, 133.1, 132.0, 130.4, 129.3, 128.2, 127.3, 125.7, 124.9, 118.7;
MS (ESI-MS) 325 [M+H+], 347 [M+Na+];
HRMS (ESI-MS) calcd. for C18H13ClN2NaO2 + [M+Na+] 347.0563, found 347.0566。
　製造例３
4‐[(2‐クロロフェニル)ベンジリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン (化合物7)の製造
　Aldrich社から入手した2‐クロロベンズアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って標題の化合物７を合成した。
orange solid (収率32%, E/Zmixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (d, J = 7 Hz, 1 H), 8.13 (s, 2 H), 7.75 (s, 4 H), 7.66 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.63 (t, J = 8 Hz, 2 H), 7.52-7.43 (m, 7 H), 7.22 (s, 3 H) ; 
MS (ESI-MS) 321 [M+Na+]。
　製造例４
4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン (化合物8)の製造
　既知法(Rekha, S.; Sunil K. G. Tetrahedron, 2010, 66, 2284-2292)に従って合成した(2E,4E)-5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4‐ジエナールを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物８を合成した。
orange solid (収率37%, E/Z mixture): 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.83 (m, 1 H), 7.72-7.64 (m, 3 H ), 7.46-7.40 (m, 3 H), 7.12-7.07 (m, 1 H); 
MS (ESI-MS) 351 [M+H+], 373 [M+Na+]。
　製造例５
4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物9)の製造
　Aldrich社から入手したシンアムアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物９を合成した。
orange solid (収率67%, E/Z mixture): 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.53 (d, J = 9 Hz,1 H), 8.48 (d, J = 7 Hz, 2 H), 8.31 (dd, J = 15.3, 10.4 Hz, 1 H), 8.07-8.05 (m, 2 H), 7.80 (d, J = 10 Hz, 1 H), 7.67 (dd, J = 15.0, 8 Hz, 5 H) 7.60-7.58 (m, 2 H), 7.52 (t, J = 8 Hz, 4 H), 7.46-7.43 (m, 9 H) ; 
MS (ESI-MS) 291 [M+H+]。  
　製造例６
4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物10)の製造
　既知法（Lian, S. Z.; Shilei, Z.; Hexin, X.; Wei, W. Org. Lett., 2009, 11, 1627-1630）で合成した(E)-3-(2-ヒドロキシフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物10を合成した。
red solid (収率33%, E/Zmixture): 
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.5 (s, 1 H), 8.49-8.31 (m, 1 H), 7.84-7.77 (m, 5 H), 7.60-7.57 (m, 1 H), 7.49-7.46 (m, 2 H), 7.35-7.32 (m, 2H), 7.22 (s, 1 H), 6.97-6.94 (m, 2 H);MS (ESI-MS) 307 [M+H+]。
　製造例７
4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物11)の製造
　既知法（Laihia, K.; Kolehmainen, E.; Manttari, P.; Kauppinen, R. Magn. Reson. Chem., 1993, 31, 512-515）で合成した(E)-3-(2-フルオロフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物11を合成した。
red solid (収率42%, E/Z mixture): 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.48 (dd, J = 16.6, 10.9 Hz, 1 H), 8.35 (dd, J = 16.6, 10.9 Hz, 2 H), 7.82-7.76 (m, 4 H), 7.66 (d, J = 7.5 Hz, 5 H), 7.60-7.55 (m, 4 H), 7.45-7.42 (m, 7 H), 7.22-7.11 (m, 8 H); 
MS (ESI-MS) 331 [M+Na+]。
　製造例８
4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物12)の製造
　既知法 (Shu-Yu, Z.; Yong-Qiang, T.; Chun-An, F.; Ming, Y.; Fu-Min, Z. Org. Lett., 2009, 50, 4178-4181)で合成した(E)-3-(2-ブロモフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物12を合成した。
red solid (収率27%, E/Zmixture): 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.42 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 8.28 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 7.87-7.76 (m, 5 H), 7.68-7.62 (m, 5 H), 7.46-7.42 (m, 4 H), 7.38-7.34 (m, 2 H); 
MS (ESI-MS) 391 [M+Na+]。
　製造例９
4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物13)の製造
　既知法(Jie, L.; Jin, Z.; Hualiang, J.; Wei, W.; Jian, L. Asian. J. Chem., 2009, 4, 1712-1716) で合成した(E)-3-(2-メチルフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物13を合成した。
red solid (収率54%, E/Z mixture): 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.40 (dd, J = 15.3, 11.9 Hz, 1 H), 8.27 (dd, J = 15.3, 11.9 Hz, 2 H), 8.02-7.91 (m, 3 H), 7.86-7.80 (m, 5 H), 7.76-7.65 (m, 11 H), 7.61-7.59 (m, 2 H), 7.45-7.42 (m, 8 H), 7.34-7.28 (m, 4 H), 7.20-7.03 (m, 2 H), 2.48 (s, 6 H), 2.43 (s, 3 H); 
MS (ESI-MS) 305 [M+H+], 327 [M+Na+]。
　製造例１０
4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物14)の製造
　既知法（Laihia, K.; Kolehmainen, E.; Manttari, P. Magn. Reson. Chem., 1991, 29, 1109-1113）で合成した(E)-3-(3-クロロフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物を合成した。
orange solid (収率26%, E/Z mixture): 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.32 (dd, J = 17.4, 12.8 Hz, 1 H), 7.83-7.81 (m, 3 H), 7.67-7.60 (m, 5 H), 7.54-7.50 (m, 6 H), 7.40-7.38 (m, 4 H), 7.16-7.08 (m, 2 H);
MS (ESI-MS) 325 [M+H+], 347 [M+Na+]。
　製造例１１
4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物15)の製造 
　既知法（Omori, K.; Onzuka, K.; Fuse, K.;  Miyata, H.(Ube Industry, Ltd., Japan) Jpn. Kokai Tokkyo Koho, 2000204057) で合成した(E)-3-(4-クロロフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物15を合成した。orange solid (収率58%, E/Z mixture): 
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.31 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 8.12 (s, 1 H), 7.78 (s, 4 H), 7.68 (t, J = 7 Hz, 4 H), 7.65-7.54 (m, 8 H), 7.45-7.35 (m, 4 H), 7.15 (d, J = 7.4 Hz, 2 H);
MS (ESI-MS) 325 [M+H+], 347 [M+Na+]。
　製造例１２
4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物16)の製造 
  既知法（Kim, J.; Lee, S.; Kwon, M.; Park, Y.; Choi, S.; Kwon, B. Synth. Commun., 2004, 34, 1223-1228）で合成した3-(3-ヒドロキシルフェニル)プロペナールを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率　26%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.78 (s, 2 H), 8.30 (dd, J = 16.1, 9.2 Hz, 1 H), 8.81 (s, 1 H), 7.94-7.13 (m, 24 H);
MS (ESI-MS) 307 [M+H+]。
　製造例１３
4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物17)の製造 
  既知法（Fujisawa, T.; Mori, T.; Tsuge, S.; Sato, T. Tetrahedron Lett., 1983, 24, 1543-1546）で合成した3-(4-ヒドロキシルフェニル)-プロペナールを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率　75%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.33 (s, 2 H), 8.13 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H),7.96 (s, 1 H), 7.72-7.54 (m, 14 H), 7.42 (t, J = 7 Hz, 4 H), 7.17-7.16 (m, 2 H), 6.87 (d, J = 8 Hz, 4 H);
MS (ESI-MS) 307 [M+H+]。
　製造例１４
4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン（化合物18）の製造
　既知法（Houille, O.; Fretz, H.; Hilpert, K.; Riederer, M.; Giller, T.; Valdenaire, O. WO 2005/002574 A1）で合成した1-ピリジン-2-イル-ピラゾリジン-3,5-ジオンを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率　46%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.44-8.33 (m, 3 H), 7.92-7.77 (m, 4 H), 7.46-7.44 (m, 1 H), 7.37-7.32 (m, 2 H), 7.12-7.09 (m, 1 H)。
　製造例１５
4-(3-フェニルアリリデン)-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン（化合物19）の製造
　既知法（Houille, O.; Fretz, H.; Hilpert, K.; Riederer, M.; Giller, T.; Valdenaire, O. WO 2005/002574 A1）で合成した1-ピリジン-2-イル-ピラゾリジン-3,5-ジオンを用いて、製造例１の（３）の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率　25%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.40 (dd, J = 15.3, 11.6 Hz, 1 H), 8.35-8.33 (m, 1 H), 7.82-7.77 (m, 2 H), 7.68 (s, 2 H), 7.44 (s, 3 H), 7.37 (d, J = 15.6 Hz, 1 H), 7.10 (t, J = 6 Hz, 1 H), 3.75 (s, 1 H), 1.85 (s, 1 H)。
　試験例１　
　DOCK2は、図１に示すように、SH3ドメイン、DHR-1ドメイン及びDHR-2ドメインを有する、マウスでは1828、ヒトでは1831アミノ酸残基からなるタンパク質であり、DHR-2ドメインを介してRacを活性化するグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）である。DOCK2は、免疫系組織に特異的に発現しており、リンパ球などの免疫細胞においてRacを活性化させるマスター分子であるといわれている。ケモカイン受容体からのシグナルがDOCK2を介して伝わり、Racを活性化することにより、細胞骨格のアクチン繊維が再構築されて免疫細胞の分化、遊走、活性化が起こることが知られている。
　ここでは、DOCK2遺伝子を欠損させたDOCK2ノックアウトマウス（DOCK2欠損マウス）を作製し、DOCK2を発現するマウス（以下、「WT」または「DOCK2+/-」と表記する）とDOCK2欠損マウス（以下、「DOCK2-/-」ともいう）のそれぞれについて、同種マウスの心臓を移植し、免疫抑制剤（FK506）の投与下または非投与下で、移植心臓の生着状態を測定した。また、I型糖尿病のモデルマウスであるNODマウスにDOCK2-/-マウスを８世代戻し交配した後、DOCK2遺伝子座が+/-もしくは-/-となるNODマウスを作製し、糖尿病及び膵島炎の発症の有無について評価した。
　（１）試験方法
（a）DOCK2ノックアウトマウスの作製
　非特許文献１４（Nature, 412, 826-831, 2001）に記載する方法に従って、DOCK2ノックアウトマウス（DOCK2欠損マウス：DOCK2-/-マウス）を作製した。
　（b）アロ心臓移植試験について
　非特許文献２０（J Exp Med 202, 1121-1130, 2005）に記載する方法に従って、アロ心臓移植試験を行った。具体的には、まずドナーとレシピエントのマウスを、ケタミンとキシラジンで麻酔をかけた。ドナーマウスから心臓を取り出し、レシピエントマウスに移植するまでの間、氷冷した生理的食塩水の中に保管した。次いでその心臓を、ドナーの大動脈及び肺動脈をそれぞれレシピエントの腹大動脈及び下大静脈に端側吻合することによって、レシピエントマウスに異種移植した。少なくとも84％は技術的に成功した。移植片の生着は毎日触診することによって判断した。明白に心拍が停止した段階で拒絶が生じたと判断し、開腹して肉眼で確認した。
　（c）自己免疫糖尿病を発症試験について
　I型糖尿病のモデルマウスであるNODマウスとDOCK2-/-マウスを８世代戻し交配した後、DOCK2遺伝子座が+/-もしくは-/-となるNODマウスを作製した。これらのマウス（4～5ヶ月齢）より尿を採取し、尿糖検査用試験紙を用いて尿糖を測定し、陽性と判定されたものを糖尿病発症動物として、DOCK2+/-およびDOCK2 -/-についてそれぞれの発症率を求めた。また、これらのマウス（3～5ヶ月齢）より採取した膵臓のパラフィン包埋切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。マウス1匹あたり15～25個の膵島を観察し、それらへのリンパ球浸潤率をもとに次の様にステージ分類し、その平均値を指標として用いた。
ステージ0：膵島へのリンパ球浸潤なし、
ステージ2：膵島の25%未満にリンパ球の浸潤が見られる、
ステージ3：膵島の25～50%未満にリンパ球の浸潤が見られる、
ステージ4：膵島の50%以上にリンパ球の浸潤が見られる。
　（２）試験結果
  結果を図２に示す。
（a）アロ心臓移植試験
　図２（Ａ）に示すように、同種心臓を移植したWTマウスにおける移植心臓の生着日数(median survival time; MST)は、単独使用ではほとんど効果のない量のFK506 (3.2 mg/kg/day for 10 days after transplantation)の投与下で１３日、非投与下で７日であったのに対して、同種心臓を移植したDOCK2欠損マウス（DOCK2-/-）のMSTは、投与下で１００日以上、FK506非投与下でも６０日と、DOCK2を欠損させることで、移植心臓の長期生着が可能になることが確認された。
　（b）自己免疫糖尿病を発症試験
　図２（Ｂ）に示すようDOCK2+/- NODマウスは、自己免疫糖尿病及び膵島炎を発症したのに対して、DOCK2欠損マウス（DOCK2-/-）NODマウスでは殆ど発症しなかった。このことから、DOCK2を欠損させることにより、自己免疫疾患の発症を抑制することができることが確認された。
　これらの結果から、DOCK2の働き、特にDOCK2からRacへの信号伝達を阻害することにより、同種移植片拒絶や自己免疫疾患など、不適切な免疫反応を抑制することが可能になると考えられる。
　試験例２　DOCK2－Rac1相互作用を阻害する化合物の探索
　試験例１の結果から、DOCK2とRacとの相互作用を阻害する化合物は、免疫抑制剤の有効成分として、また自己免疫疾患の予防または治療剤の有効成分になり得ると考えられる。そこで、9,392個の化合物を対象として、（a）DOCK2-Racとの相互作用を阻害する化合物の探索、（b）DOCK2のRac活性化を阻害する化合物の探索、及び（c）生存性を損なわずにリンパ球の遊走を阻害する化合物の探索を、順次行った。
　（1）DOCK2-Racとの相互作用を阻害する化合物の探索
　ELISAを用いて、ライブラリーからDOCK2-Rac間の相互作用を阻害する化合物を探索した。まず、96-ウエルのポリスチレン・プレートの各ウエルを、50 mM炭酸塩緩衝液（pH 9.6
）に溶解したstreptavidin（250 ng/well）を用いて4℃で一晩処理してコートした。各ウエルを、TBST（20 mMトリス塩酸、150 mM NaCl、0.1%のTween-20、pH7.5）に溶解した５%のスキムミルク150μlで、室温で１時間処理してブロッキングした。次いで、ウエルをTBST 150μlで4回洗浄した。TF-DOCK2-DHR2-SBP（50μl、TBST中の濃度60μg/ml）を、各ウエルに添加し、室温で１時間培養した。その後、ウエルを、1 mM EDTAを添加したTBST（TBST/1 mM EDTA）150μl で4回洗浄した。各ウエルに、ライブラリー由来の被験化合物またはDMSO（担体）（50μl、TBST/1 mM EDTA中に200μM）を添加して、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウエルにGST-Rac1あるいはGST-Cdc42（50μl、TBST/1 mM EDTA中に50μg/ml）を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ウエルを、TBST/1 mM EDTA 150μlで4回洗浄した。次いで各ウエルにペルオキシダーゼを標識した抗GST抗体(50μl、TBST/1 mM EDTA)を添加して、室温で１時間インキュベートした。その後、ウエルを、TBST/1 mM EDTA 150μlで4回洗浄した。各ウエルに、ペルオキシダーゼの基質（50μl、0.1 Mのクエン酸塩緩衝液に溶解した0.4 mg/mlのo-フェニレンジアミンおよび0.01%のH2O2、pH 5.0）を添加し、室温で30～60分間インキュベートした。次いで、Multiskan Bichromatic plate reader (Labsystems)を用いて、波長450nmの吸光度を測定した。GST-Cdc42を添加したウエルをブランクとして各ウエルの吸光度から差し引いた。また被験化合物の代わりにDMSOのみを加えたウエルをコントロールにした。被験化合物の阻害率（DOCK2-Rac間の相互作用を阻害する割合）は、下式により計算した。
[数１]
阻害率（％）
＝｛[(DMSOを加えた際の吸光度)－(被験化合物を加えた際の吸光度)]／DMSOを加えた際の吸光度｝x 100
　以上のスクリーニング試験により、9,392個の化合物の中から、DOCK2-Racの相互作用を阻害する作用を有する化合物を131個取得した。
　（2）DOCK2のRac活性化を阻害する化合物の探索
　反応バッファーＡ（20 mM MES-NaOH、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、0.4 mg/mlのBSA、20μM GDP、pH 7.0）もしくは反応バッファーＢ（20 mM MES-NaOH, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.2 mg/ml BSA, 20 mM GDP, pH 7.0）の中で希釈したGEFを、室温で30分間、被験化合物またはDMSO（溶媒）の存在下で遮光しながらインキュベートした。DMSOの最終濃度は、反応バッファーAを用いた系では３％、反応バッファーBを用いた系では１％になるように調整した。次に、GDPとRac（15μM）を混合して氷上で30分間静置することにより作製したGDP-Rac（100μl）と、3.6μM mant-GTPを反応バッファーに加え、30℃で8分間平衡化させた。平衡化後、前処理したGEF (50μl)を添加し30℃で反応させた。反応中のmant-GTP蛍光強度の変化を、Molecular Devices XS-N蛍光光度分光計を用いてモニターした（励起波長：360 nm、発光波長：440 nm）。得られた測定値について、反応開始時（0秒）での蛍光強度が0となるよう補正した値を算出した。そして、GraphPad Prism5（GraphPad software）を用いて、算出した補正値をy軸に、時間（t）をx軸にとってプロットした際の近似曲線（双曲線）を求め、t=0～10秒における傾きをグアニンヌクレオチド交換反応の初速度とした。IC50は、溶媒（DMSO）のみを加えた時の反応初速度を100%として計算した。
　かかる試験により、DOCK2-Rac間の相互作用を阻害する作用を有する131個の化合物の中からDOCK2のRac活性化を阻害する作用を有する化合物を31個取得した。
　（3）生存性を損なわずにリンパ球の遊走を阻害する化合物の探索
（3-1）生存性試験
　マウス脾細胞（1 x 106個）を0.5% BSA/RPMI-1640培地（100μl）に懸濁し、100μMの被験化合物もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養したものに、等量の0.4% Trypan blue/PBSを加え、光学顕微鏡で観察した。トリパンブルー陰性細胞を生細胞として、細胞100個あたりの生細胞の割合を求めた。1時間培養後の生細胞の割合が80%以上であったものを、生存性に影響しない化合物とした。
　（3-2）リンパ球の遊走阻害の評価
　Transwellを用いた走化性解析を行った。具体的には、まず細胞(1×107/ml)を、被験化合物またはDMSOを配合した0.5％BSA含有RPMI-1640(Transwell培地)中で37 ℃で1時間培養した。24-ウエルプレートに、ケモカインと被験化合物を所定量添加したTranswell培地を加えた後、ウエルにTranswells（コーニング、5μm孔径）をセットし、前培養した細胞（1×10６/100μl）を））ロードした。37℃で2時間インキュベートした後、下層のチャンバーに移動した細胞を集め、PE標識-抗Thy1.2抗体(53-2-1、BD Pharmingen)、およびFITC標識-抗B220抗体（RA-6B2、eBiosciences）で染色した。移動した細胞の割合（％）は、下層チャンバー中のThy1.2+細胞(T細胞)とB220+細胞(B細胞)の数を、Transwellsに入れた細胞の数で割ることで算出した。
　かかる試験により、DOCK2のRac活性化を阻害する作用を有する31個の化合物の中からリンパ球の生存性を損なうことなく、リンパ球の遊走を阻害する化合物を1個取得した。
　当該化合物は、下記に示す(E)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（以下、この化合物を「化合物6」という）であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　試験例３　化合物６のDOCK2－Rac1相互作用の選択的阻害活性
　試験例２で取得した(E)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン（化合物６）について、下記の方法によりDOCK2－Rac1相互作用の選択的阻害活性を評価した。
　（１）DOCK2 DHR-2またはTiam DH-PHとGST融合Rac1との会合に対する阻害作用（pull-down assay）
　大腸菌で発現させたTrigger factor（TF）融合DOCK2-DHR-2およびTiam1 DH-PHを、化合物存在下、氷上で1時間前処理したものに、GST融合Rac1を結合したビーズを加え、4℃で1時間反応させた。ビーズを3回洗浄した後、SDS-PAGEでタンパク質を分離し、CBBで染色した。染色したバンドの濃度をデンシトメトリーにより測定した。
 　結果を図３（Ａ）に示す。この結果から、化合物６は、Tiam DH-PHとGST融合Rac1との会合を全く阻害しないのに対して、DOCK2 DHR-2とGST融合Rac1との会合を用量依存的に阻害した。このことから、化合物６は、DOCK2のDHR-2との会合を介したRacのGEF活性化を選択的に阻害することが判明した。
　（２）様々なRac GEFsを発現するHEK293T細胞におけるRac活性化に対する阻害作用
　HEK293T細胞を、12穴プレートで培養し、polyethylenimineを用いてDOCK2、Tiam1および Trio（DH-D1/PH-D1ドメイン）発現ベクターを導入した。24時間後に、100μMの化合物６もしくは等量のDMSOを含む培養液（500μl）に交換して1時間培養した後、Rac activation assay kit (Millipore 17-283)を用いて、細胞レベルでのRac活性化を検討した。
　結果を図３（Ｂ）に示す。化合物６の存在下で培養することにより、DOCK2を導入した細胞におけるRac活性化は顕著に阻害されたが、古典的なGEFであるTiam1やTrioによるRac活性化には影響が見られなかった。この結果から、化合物６は細胞レベルにおいてもDOCK2のGEF活性を選択的に阻害することが判明した。
　試験例４　化合物６によるDOCK2、DOCK180、及びDOCK5のＧＥＦ活性阻害
　DOCK2、DOCK180、及びDOCK5のGEF活性阻害効果を、試験例２-(２)に記載した方法で検討した。DOCK2のGEF活性阻害効果を評価するためのサンプルとして、0, 1, 3, 10, 30, 50, 100, 150, 300μMの化合物６に対しSUMO-DOCK2DHR-2 DlobeA(SUMOタグを有する、lobe Aを欠損したDOCK2 DHR2ドメインの組み換えタンパク質)とGST-Rac1が、それぞれ0.1μM , 10μMとなるようにそれぞれ調整した。また、DOCK180のGEF活性阻害効果を評価するためのサンプルとして、0, 1, 3, 10, 30, 50, 100μMの化合物６に対しSUMO-DOCK180DHR-2 DlobeA(SUMOタグを有する、lobe Aを欠損したDOCK180 DHR2ドメインの組み換えタンパク質)とGST-Rac1が、それぞれ0.1μM , 10μMとなるようにそれぞれ調整した。さらに、DOCK5のGEF活性阻害効果を評価するためのサンプルとして、0, 1, 3, 10, 30, 50, 100μMの化合物６に対しSUMO-DOCK2DHR-2 DlobeA(SUMOタグを有する、lobe Aを欠損したDOCK5 DHR2ドメインの組み換えタンパク質)とGST-Rac1が、それぞれ0.1μM , 10μMとなるようにそれぞれ調整した。
　化合物がDOCK2-DHR2と会合するのか、それともRac1と会合するのかについて、STD-NMR法により検討した。すなわち、NMRスペクトルはBruker BioSpin Avance600 NMRスペクトロメータ(共鳴周波数600.03 MHz)を使用し、10 mM MgCl2が入った10 mM Tris-d11-2HCl, p2H 8.0の重水バッファー中で測定した。これらのサンプルそれぞれに対して、選択的飽和パルスをタンパク質シグナル上の-0.2 ppmとタンパク質のシグナルが存在しない-30 ppmにそれぞれ２秒間照射し、スペクトルを比較した。
　結果を図４に示す。図４（Ａ）に示す結果から化合物６は、in vitroにおけるDOCK2のGEF活性を容量依存的に阻害し、50%阻害濃度(IC50)は、それぞれ、バッファーＡ中で測定した場合46.8±7.1μMであり、バッファーＢ中で測定した場合22.8±2.4μMであった。同様に、DOCK180およびDOCK5のGEF活性も用量依存的に阻害し、バッファーＢ中で測定したIC50はそれぞれ33.6±3.6μMおよび31.6±2.5μMであった。
　また図４(Ｂ)に示すように、タンパク質シグナル照射時にSUMO-DOCK2DHR-2 DlobeA のサンプルでは化合物６のシグナル強度が減少したのに対し、Rac1のサンプルではシグナル強度の減少は観察されなかった。すなわち化合物６がDOCK2-DHR2に特異的に会合していることが判明した。これらの結果から、化合物６はDOCK2-DHR2に結合することにより、DOCK2のGEF活性を阻害していることが示された。
　試験例５　化合物６によるRac活性化とリンパ球遊走の阻害
　マウス脾臓より、Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-095-130)もしくはB cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-090-862)を用いて、それぞれT細胞、B細胞を単離した。単離した細胞（1～2 x 107個）を200μlのHBSS (Invitrogen)に懸濁し、100μMの化合物６もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養した。培養後、ケモカイン[T細胞の場合は1μg/ml SLC (CCL21)、B細胞の場合は1μg/ml BLC (CXCL13)]を加えて所定の時間培養し、Rac activation assay kit (Millipore 17-283)を用いて、Rac活性化を検討した。遊走試験は、試験例２-(３)に記載した方法で行い、T細胞の走化性因子としてSLCを、B細胞の走化性因子としてBLCをそれぞれ用いた。
　図５（Ａ）に示すように、ケモカインによって誘導される免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞）におけるRac活性化が、化合物６の存在により阻害されることが確認された。また、図５（Ｂ）に示すように、ケモカインによって誘導される免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞）の遊走応答が、化合物６により用量依存的に阻害されることが確認された。なお、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞）は化合物６の存在によっても生存性が維持されていたことから、化合物６には細胞毒性はないことが確認された。
　試験例６　化合物６によるTCRを介したRac活性化とT細胞増殖応答の阻害
　マウス脾臓より、Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-095-130)を用いてT細胞を単離した。単離した細胞（1～2 x 107個）を200 μlのHBSSに懸濁し、抗CD3ε抗体（Becton Dickinson, 145-2C11）を10μg/mlとなるように加え、氷上で20分間静置した。細胞を氷冷したHBSSで3回洗浄した後、200μlのHBSSに再懸濁し、100μMの化合物6もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養した。培養後、抗ハムスター抗体（Becton Dickinson, G94-56）を10μg/mlとなるように加え、所定の時間37℃で保温し、Rac activation assay kit (Millipore 17-283)を用いて、Rac活性化を検討した。
　B6マウス由来のT細胞(3×105/well)を、放射線照射されたB10.BRマウス由来の脾臓細胞とともに、種々濃度の被験化合物またはDMSO（溶媒）の存在下で84時間培養した。培養の後半16時間の間[3H]チミジン(0.037MBq)を添加して培養した後、セルハーベスターを用いて細胞をガラス繊維ろ紙の上に回収し、１分間あたりのカウントを液体シンチレーションカウンターで測定した。
　図６（Ａ） に示すように、TCRに対する刺激で誘導されるRac活性化が、化合物６の存在により阻害されることが確認された。また、図６（Ｂ）に示すように、化合物６の存在により、混合リンパ球反応が用量依存的に阻害されることが明らかになった。このことから、化合物６はTCRの下流でもDOCK2によるRacの活性化を阻害することにより、Ｔ細胞の活性化を抑制することが判明した。
　試験例７　化合物６によるpDCにおけるCpG誘導Rac活性化とIFN-α産生の阻害
　マウス骨髄細胞をFlt3リガンド存在下で培養することにより、pDCに分化させた。得られた細胞（1～2 x 107個）を200 μlのHBSSに懸濁し、100μMの化合物６もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養した。培養後、3μMのCpG-A〔ODN D19、ggTGCATCGATGCAgggggG（配列番号１）、上流側の小文字はリン酸ジエステルで、下流側の小文字はホスホロチオエートで、それぞれ基本骨格が修飾されていることを示す〕を加えて、所定の時間37℃で保温し、Rac activation assay kit (ミリポア17-283)を用いてRac活性化を検討した。
　pDCを化合物6もしくはDMSO(溶媒)存在下で15分間処理した後、3μM のCpG-Aで24時間刺激した。細胞培養上清中の、IFN-α（R&D systems）とIL-12 p40(Thermo Fisher Scientific) の濃度をELISAキットによって測定した。
　図７（Ａ）に示すように、CpGで誘導されるpDCのRac活性化が、化合物６の存在により阻害されることが確認された。また図７（Ｂ）に示すように、化合物６の存在により、CpGに応答したINF-αの産生は用量依存的に阻害されたが、IL-12の産生は阻害されなかった。これまでに、CpG刺激で誘導されるINF-α産生はDOCK2依存的で、IL-12産生はDOCK2非依存的であることが明らかになっている。これらのことから、pDCにおけるCpGに応答したシグナル伝達経路において、化合物６がDOCK2の活性を特異的に阻害していることが示された。
　試験例８　化合物６による自己免疫脳脊髄炎の改善
　自己免疫脳脊髄炎（EAE）を誘導するために、0日目にCFA（5 mg/ml 結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を添加）中で乳化したミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG)ペプチド35-55（Mimotopes）を、B6マウスの皮下に１匹あたり100μgを、0日目および2日目に腹腔内に１匹あたり500ngの百日咳毒素(Calbiochem)をそれぞれ投与した。
　自己免疫脳脊髄炎誘導の有無は、次の臨床スコアシステムを使用した:
０：無症状、１：尾が弛緩、２：後肢不完全麻痺、３：後肢完全麻痺、４：前肢不完全麻痺、５：四肢麻痺、６：死。
 スコアリングは、25日間、毎日行った。CPYPPを、最終濃度5 mg/mlになるようにDMSOに溶解し、0、 3、 6、 9日目に 100μlを上記マウスに腹腔内注射した。対照群には、DMSOのみを100μl注射した。
　図８に示すように、化合物６の投与により、自己免疫脳脊髄炎の臨床スコアならびに発症率が顕著に低下した。このことから、化合物６がマウス個体レベルで自己免疫疾患を阻害することが判明し、免疫抑制剤として有効であることが示された。同様の結果は、CPYPPを最終濃度4 mg/mlになるように0.5%メチルセルロースに溶解し、連日250μlを上記マウスに経口投与した場合にも認められた（データ省略）。
　試験例９　化合物６によるがん細胞浸潤および遊走の阻害
　グリア芽腫細胞株（LN-229）ならびに肺がん細胞株（3LL）の細胞外マトリクスへの浸潤に対する化合物６の効果を検討した。
　DMEMで30分間平衡化させたマトリゲル（BD）の上部チャンバーに、DMEM（無血清）に懸濁したLN-229株もしくは3LL株を500μl、下部チャンバーに10% FCSを加えたDMEMを750μl入れ、37℃、5% CO2下で22時間培養した。チャンバーを外して培養液を除いた後、綿棒を用いて浸潤しなかった細胞を除去し、残った細胞（マトリゲルに浸潤した細胞）をDiff-quick（Sysmex）を用いて染色した。染色後、メスを用いてインサートを切り取り、プレパラートに封入し、光学顕微鏡下で計数した。
　LN-229株の遊走に対する化合物６の効果に関しては、創傷治癒試験（wound healing assay）により検討した。LN-229株（1 x 105個）を200μlの10% FCSを加えたDMEMに懸濁し、ガラスボトムディッシュ上で一晩培養し、細胞単層を形成させた。単層上を、200μlのチップを直線状に擦過することにより形成した創傷部を経時的に撮影した。創傷部の幅を測定することにより細胞遊走の距離を求めた。また、3LL株の遊走に対する化合物６の効果に関しては、Transwell試験により検討した。10% FCSを加えたDMEMを1ウエルあたり500μl入れた24穴プレートに、あらかじめDMEMで30分間平衡化させたTranswellチャンバー（孔径8.0 μm）をセットし、DMEM（無血清）に懸濁した3LL株を100μlをチャンバーに入れ、7℃、5% CO2下で10時間培養した。
　結果を図９に示す。図９（Ａ）からわかるように、化合物６は、LN-229株および3LL株のいずれにおいても、がん細胞株の浸潤を効果的に阻害することが明らかになった。また、図９(Ｂ)および(Ｃ)にそれぞれ示すように、LN-229株（Ｂ）および3LL株（Ｃ）の遊走は化合物６により用量依存的に阻害されることが確認された。これらのことから、化合物６はがん細胞の浸潤や遊走を阻害する能力を有することが明らかになった。
　試験例１０　化合物６によるがん細胞の足場非依存的な増殖の阻害
　足場非依存的ながん細胞の増殖に対する化合物６の抑制効果を、ソフトアガーアッセイを用いて行った。3LL株（1 x 105個）を0.3%アガロース、10% FCSを含むDMEMに懸濁し、0.7%寒天、10% FCSを含むDMEM により6ウエルプレート中に形成させたベースアガー上に重層した。37℃、5%CO2環境下で10日間培養した後、0.005%クリスタルバイオレットで室温1時間の反応により細胞を染色し、形成されたコロニーの数を計数した。
　結果を図１０に示す。化合物６の濃度依存的に形成される細胞コロニーの数が減少しており、化合物６が、がん細胞の特徴のひとつである足場非依存的な増殖を抑制することが示された。これらの結果から、化合物６は抗がん剤の有効成分として有用である可能性が示唆された。
　試験例１１　化合物６のアナログによるDOCK2のGEF活性阻害
　製造例1（化合物5）及び製造例3～15（化合物7～19）に記載する方法で製造した、化合物６のアナログ（14化合物）を対象として、試験例４と同様にして、DOCK2のＧＥＦ活性に対する阻害作用を評価し、IC50値を求めた。また、化合物6からシス体（化合物20）を単離し、その阻害活性も合わせて検討した。測定は、試験例２－（２）で記載したバッファーＡおよびバッファーＢの両方を用いて行い、それぞれについてIC50値を求めた。
　結果を表１に示す。この結果からわかるように、いずれのアナログもDOCK2のGEF活性に対する阻害作用を備えており、化合物６と同様に、不適切な免疫反応を抑制し、免疫抑制剤や免疫関連疾患の予防また治療剤の有効成分として有用であると考えられる。また、この結果から、これら化合物６のアナログには、化合物６と同様にDOCK180及びDOCK5のGEF活性に対する阻害作用も備えていることが強く推察される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
配列番号１は、CpG-Aの塩基配列を示す。

Claims (15)

  1. 　一般式（１）で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするRac活性化阻害剤：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕。
  2. 　上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ1が水素原子である化合物である、請求項１に記載するRac活性化阻害剤。
  3. 　上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｒ2が水素原子、ハロゲン原子、水酸基、またはメチル基である化合物である、請求項１または２に記載するRac活性化阻害剤。
  4. 　上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、ｎが１である化合物である、請求項１乃至３のいずれかに記載するRac活性化阻害剤。
  5. 　上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式（１）中、Ｚがメチンである化合物である、請求項１乃至４のいずれかに記載するRac活性化阻害剤。
  6. 　一般式（１）で示されるピラゾリジンジオン誘導体が、下記（a）～（p）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載するRac活性化阻害剤：
    （a）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （b）4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （c）4‐[(2‐クロロフェニル)ベンジリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
    （d）4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
    （e）4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （f）4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （g）4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （h）4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （i）4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （j）4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （k）4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （l）4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （m）4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
    （n）4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
    （o）4-(3-フェニルアリリデン)-1-(２-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
    （p）(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物。
  8. 　上記Rac活性化が、DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化である、請求項７に記載する医薬組成物。
  9. 　上記疾患または病態が、DOCK2を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である、請求項７または８に記載する医薬組成物。
  10. 　上記疾患または病態が、免疫関連疾患、または生体移植に対する拒絶反応である、請求項９に記載する医薬組成物。
  11. 　上記医薬組成物が免疫抑制剤である、請求項９に記載する医薬組成物。
  12. 　上記疾患または病態が、DOCK180またはDOCK 5を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である、請求項７または８に記載する医薬組成物。
  13. 　上記疾患または病態が悪性腫瘍である、請求項１２に記載する医薬組成物。
  14. （III-1）一般式（１）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕
    で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を、Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態に罹患しているか、その罹患する可能性のある患者に投与する工程を有する、
    Rac活性化に関連する疾患または病態を予防または治療する方法。
  15. 　Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態に罹患しているか、その罹患する可能性のある患者について、当該疾患または病態を予防または治療するために使用される、一般式（１）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     〔式中、Ｚはメチン（C-H）または窒素原子（N）を示し、Ｘは下式で示される置換基を意味し：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、または炭素数１～４のアルキル基を示す。ｎは０～２の整数を意味する。〕
    で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
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