JP7008328B2 - 免疫制御剤 - Google Patents

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Description

本発明は、新規の免疫制御の方法論、それに基づいて製造された免疫制御剤及びその用途に関する。より具体的には、コレステロール３－硫酸によるＤｅｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ２（ＤＯＣＫ２）阻害を介した免疫制御のメカニズムに立脚した、免疫抑制、免疫特権部位の形成及びその解除のための方法論、それに基づいて製造された免疫制御剤及びその用途に関する。本願は、２０１５年１１月２０日に、日本に出願された特願２０１５－２２８１９０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
眼、脳、妊娠中の子宮等の特定の器官において、免疫に媒介される炎症や同種異系移植片拒絶が顕著に抑制されることが古くから知られており、この現象は免疫特権と呼ばれている（例えば、非特許文献１を参照）。また、癌組織が免疫特権を示すことが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。しかしながら、免疫特権の実体は不明であった。
Niederkorn J. Y., See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege., Nat Immunol., 7(4), 354-359, 2006. Joyce J. A. and Fearon D. T., T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment., Science, 348(6230), 74-80, 2015.
免疫チェックポイント分子を標的とした抗体療法は、現在最も期待を集めている癌治療法の一つであるが、これが効果的に作用するためにも、癌の免疫回避機構（免疫特権）を解除する必要がある。
また、免疫特権の実体を明らかにし、人為的に組織や細胞に免疫特権を付与することが可能になれば、移植や再生医療において他家移植可能な組織を作製する医療技術につながる。
したがって、本発明は、免疫特権の実体を明らかにし、新たな免疫制御剤を提供することを目的とする。より詳細には、炎症性疾患の治療薬、癌免疫を賦活化する医薬品、免疫特権を付与した、他家移植可能な組織を作製する医療技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ２（ＤＯＣＫ２）によるＲａｃ活性化の制御剤を有効成分として含有する、免疫制御剤。
［２］ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の前記制御剤が、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である、［１］に記載の免疫制御剤。
Figure 0007008328000001
 ［式（１）中、Ｒ１は、直鎖状であっても分岐鎖状であっても環状であってもよく、置換されていてもよい炭素数３～１２のアルキル基又は置換されていてもよい炭素数６～１２の芳香族基を表す。］
［３］ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の前記制御剤が、コレステロール３－硫酸又はその塩に対する特異的結合物質である、［１］に記載の免疫制御剤。
［４］前記特異的結合物質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール３－硫酸又はその塩に対する結合活性を有するタンパク質である、［３］に記載の免疫制御剤。
［５］ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の前記制御剤が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール３－硫酸又はその塩に対する結合活性を有するタンパク質の発現ベクターである、［１］に記載の免疫制御剤。
［６］ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の前記制御剤が、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質の発現ベクター、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤である、［１］に記載の免疫制御剤。
［７］ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の前記制御剤が、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール－３硫酸の硫酸基を除去する活性を有するタンパク質、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール－３硫酸の硫酸基を除去する活性を有するタンパク質の発現ベクター、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤である、［１］に記載の免疫制御剤。
本発明によれば、新たな免疫制御剤を提供することができる。
主な生体内ステロイドの構造と生合成経路を示す図である。 実験例１の結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例２の結果を示すグラフである。 実験例２において、様々な濃度の各種ステロイド化合物の存在下でＲａｃ活性化能を測定した結果を示すグラフである。 実験例２において、５０μＭの各種ステロイド化合物の存在下でＲａｃ活性化能を比較した結果を示すグラフである。 実験例３の結果を示すグラフである。 実験例４において、ＧＳＴ－Ｒａｃビーズに結合したＤＯＣＫ２－ＤＨＲ－２をウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。 実験例５において、野生型及びＤＯＣＫ２欠損マウス由来のＴ細胞のＣＣＬ２１に対する遊走能を比較した結果を示すグラフである。 実験例５において、Ｔ細胞の遊走に対するコレステロール３－硫酸の阻害効果を検討した結果を示すグラフである。 実験例６において、リンパ球の遊走に対する、各種ステロイド化合物の効果を検討した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例７において、好中球のｆＭＬＰへの化学遊走性に対するコレステロール３－硫酸の効果を検討した実験結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例８の結果を示すグラフ及び写真である。 （ａ）は、実験例９において、対照のＧＦＰのみ又はＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子とＧＦＰを発現したストローマ細胞上でのＴ細胞の遊走性を示すタイムラプス画像である。（ｂ）は、実験例９において、対照のＧＦＰのみ又はＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子とＧＦＰを発現したストローマ細胞上でのＴ細胞の遊走性を比較した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１０において、ウエスタンブロット法によりＳｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質を検出した結果を示す写真である。（ｂ）は、野生型マウス（＋／＋）及びＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）の各組織におけるＳｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を検出した結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１１におけるコレステロール－３硫酸の定量結果を示すグラフである。 実験例１１において、マウスの眼球におけるコレステロール－３硫酸の局在を測定した質量分析顕微鏡画像及び光学顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例１２における、マウスの眼球切片の光学顕微鏡写真である。（ｂ）及び（ｄ）は、実験例１２において、マウスの前眼房に浸潤した炎症細胞の総数を計測した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例１２において、マウスの眼球切片を、好中球のマーカーであるＧｒ１に対する抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例１３における、マウスの眼球切片の光学顕微鏡写真である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例１３において、マウスの結膜に浸潤した炎症細胞の総数を計測した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１０の結果を示す写真である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１１の結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１２の結果を示す写真である。 発明者らが今回明らかにした、生体におけるコレステロール－３硫酸の作用を説明する模式図である。
免疫応答は、生体にとって感染に対する必須の防御機構であり、免疫細胞は、種々の感染源に迅速に対処すべく生体内を常にパトロールしている。このように絶えず動き回るという特徴は、免疫細胞で独自に進化したものである。
ＤＯＣＫ２は、免疫細胞に特異的に発現し、免疫応答を制御するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）であり、低分子量Ｇタンパク質の一種であるＲａｃを活性化し、葉状突起と呼ばれるアクチンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動力を提供している。
ＤＯＣＫ２は、ＤＯＣＫファミリータンパク質に特有のＤＨＲ－２ドメインを持ち、このドメインを介して、Ｒａｃに結合しているＧＤＰをＧＴＰに変換することで、Ｒａｃを活性化する。
後述するように、発明者らは、免疫特権の実体がコレステロール－３硫酸（以下、「Ｃ３Ｓ」という場合がある。）であることを明らかにした。図２２は、発明者らが今回明らかにした、生体におけるコレステロール－３硫酸の作用を説明する模式図である。免疫細胞の遊走、浸潤には、ＤＯＣＫ２の働きが必要である。コレステロール－３硫酸は、ＤＯＣＫ２の機能を阻害し、免疫細胞の動きを抑制し、免疫特権部位の形成、癌細胞による免疫回避等に寄与している。
［ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤］
本実施形態の免疫制御剤は、ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤（ＤＯＣＫ２制御剤）を有効成分として含有する。本明細書において、Ｒａｃ活性化の制御とは、Ｒａｃ活性化の阻害、Ｒａｃ活性化の促進又はＲａｃ活性化の維持を意味する。また、例えば、「Ｒａｃの活性化の阻害」とは、Ｒａｃの活性化を完全に阻害すること及びＲａｃの活性化を一部阻害すること（Ｒａｃの活性化を抑制すること）を意味する。本実施形態の免疫制御剤としては、例えば、ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインに対する特異的結合物質、Ｒａｃに対する特異的結合物質、コレステロール３－硫酸に対する特異的結合物質、コレステロール３－硫酸の合成や分解を担う酵素の阻害剤等であって、ＤＯＣＫ２によるＲａｃの活性化を制御するものが挙げられる。特異的結合物質については後述する。
実施例において後述するように、例えば、コレステロール３－硫酸は、ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の特異的且つ強力な阻害剤である。
［コレステロール３－硫酸及びその誘導体］
１実施形態において、ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤は、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である。すなわち、１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物（以下、「コレステロール３－硫酸又はその誘導体」という場合がある。）を有効成分として含有する免疫制御剤を提供する。式（１）中、Ｒ１は、直鎖状であっても分岐鎖状であっても環状であってもよく、置換されていてもよい炭素数３～１２のアルキル基又は置換されていてもよい炭素数６～１２の芳香族基を表す。
Figure 0007008328000002
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）において、Ｒ１が１，５－ジメチル－ｎ－ヘキシル基であるコレステロール３－硫酸が、免疫特権部位を形成する分子実体であることを見出した。本明細書において、免疫特権部位とは、免疫細胞の浸潤が阻害された部位を意味する。免疫特権部位では、免疫細胞が浸潤しないため、免疫応答や炎症作用が抑制されている。
コレステロール３－硫酸は、ステロイド骨格を有する化合物であり、生体内に存在することが知られている。しかしながら、その生理機能は未解明であり、コレステロールの血中レザバーである可能性等が指摘されていた。
上記式（１）で表される化合物は、ＤＯＣＫ２を阻害することにより、免疫細胞の細胞運動を阻害する。その結果、上記式（１）で表される化合物が存在する部位には免疫細胞が浸潤することができず、免疫特権部位が形成されるものと考えられる。
上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、免疫特権部位を形成することができる。したがって、本実施形態の免疫制御剤は、免疫特権部位生成剤であるということもできる。あるいは、本実施形態の免疫制御剤は、免疫抑制剤であるということもできる。コレステロール３－硫酸は、もともと生体内に存在する化合物であることから、本実施形態の免疫制御剤は生体に投与しても副作用が少ないと考えられる。
上記式（１）で表される化合物において、Ｒ１は分岐鎖状のアルキル基又は置換されていてもよい炭素数６～１２の芳香族基であることが好ましい。また、Ｒ１の置換基としては、水酸基、アシル基、リン酸基、カルボキシル基、アミノ基、ニトロ基、チオール基、アセトアミド基、ハロゲン原子等が挙げられるが、Ｒ１は置換されていないことが好ましい。また、Ｒ１の炭素数は６～１０であることがより好ましく、７～９であることが更に好ましい。
上記式（１）において、Ｒ１としては、例えば１，５－ジメチル－ｎ－ヘキシル基、フェニル基、パラ－メトキシフェニル基、オルト－ブチルフェニル基、オルト－２－メチルブチルフェニル基等が挙げられる。上記式（１）におけるＲ１が１，５－ジメチル－ｎ－ヘキシル基である場合、上記式（１）で表される化合物は、下記式（２）で表されるコレステロール３－硫酸である。
Figure 0007008328000003
本実施形態の免疫制御剤において、上記式（１）で表される化合物は、フリー体であってもよく、薬学的に許容される塩であってもよく、フリー体の溶媒和物であってもよく、薬学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。
薬学的に許容される塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。より具体的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩；アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩；グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
本実施形態の免疫制御剤を、例えば、徐放製剤として移植臓器の組織内に投与することにより、拒絶反応を抑制することができる。あるいは、本実施形態の免疫制御剤を、過剰な免疫応答により生じる、慢性関節リウマチ、ぶどう膜炎、多発性硬化症等の免疫疾患の患者に投与することにより、免疫疾患を治療することができる。
［コレステロール３－硫酸又はその塩に対する特異的結合物質］
１実施形態において、ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤は、コレステロール３－硫酸又はその塩に対する特異的結合物質である。すなわち、１実施形態において、本発明は、コレステロール３－硫酸又はその塩に対する特異的結合物質を有効成分として含有する免疫制御剤を提供する。コレステロール３－硫酸の塩としては、上記式（１）で表される化合物の塩と同様のものが挙げられる。
本実施形態の免疫制御剤は、生体内のコレステロール３－硫酸に結合してその機能を阻害することができる。あるいは、本実施形態の免疫制御剤は、コレステロール３－硫酸を吸着し、その生体内濃度を低下させることができる。その結果、コレステロール３－硫酸の存在により形成された免疫特権を除去することができる。したがって、本実施形態の免疫制御剤は、免疫特権除去剤であるということもできる。あるいは、本実施形態の免疫制御剤は、免疫回避除去剤であるということもできる。特異的結合物質とコレステロール３－硫酸との解離定数Ｋｄは、例えば１０－７Ｍ以下であることが好ましく、１０－８Ｍ以下であることがより好ましく、１０－９Ｍ以下であることが更に好ましい。
本実施形態の免疫制御剤により、免疫特権が除去されると、当該領域に免疫細胞が浸潤し、免疫応答が活性化される。したがって、本実施形態の免疫制御剤は、免疫促進剤であるということもできる。
実施例において後述するように、発明者らは、癌組織にはコレステロール３－硫酸が局在しており、免疫特権部位が形成されていることを見出した。したがって、本実施形態の免疫制御剤を用いて、癌組織の免疫特権を除去することにより、癌組織における免疫応答を促進し、癌を治療することができる。
本明細書において、特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に抗原を免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。ここで、抗原としてコレステロール３－硫酸又はその塩を用いるとよい。抗原はハプテン化されていてもよい。
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。また、上記の抗体又は抗体断片は、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したものであってもよい。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。コレステロール３－硫酸又はその塩に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution ofligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、コレステロール３－硫酸又はその塩に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
特異的結合物質は、上記の他にも、例えば、対象物質に対する結合性を指標として、化合物ライブラリー等からスクリーニングしたものであってもよい。
上記の特異的結合物質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール３－硫酸又はその塩に対する結合活性を有するタンパク質（以下、「配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体」という場合がある。）であってもよい。本明細書において、１若しくは数個とは、例えば１～２０個、例えば１～１０個、例えば１～５個、例えば１～３個を意味する。
ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインはＡローブ、Ｂローブ及びＣローブと呼ばれる領域からなる。配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒトＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質のアミノ酸配列である。より詳細には、Ｂローブは配列番号１の第１～第１４１番目のアミノ酸からなり、Ｃローブは配列番号１の第１４２～第４２７番目のアミノ酸からなる。
実施例において後述するように、発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質がコレステロール３－硫酸と特異的に結合することを見出した。したがって、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその変異体は、コレステロール３－硫酸に対する特異的結合物質として使用することができる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその変異体は、例えばポリエチレングリコール等の化合物を結合させることにより、血中安定性を向上させたものであってもよい。
［配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター］
１実施形態において、ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール３－硫酸又はその塩に対する結合活性を有するタンパク質の発現ベクターである。すなわち、１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール３－硫酸又はその塩に対する結合活性を有するタンパク質の発現ベクターを有効成分として含有する免疫制御剤を提供する。
本実施形態の発現ベクターを生体に投与することにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその変異体を発現させることができる。発現ベクターから発現した、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその変異体は、上述したように、コレステロール３－硫酸又はその塩に対する特異的結合物質として機能する。したがって、本実施形態の免疫制御剤は、免疫特権除去剤であるということもできる。あるいは、本実施形態の免疫制御剤は、免疫回避除去剤であるということもできる。あるいは、本実施形態の免疫制御剤は、免疫促進剤であるということもできる。
発現ベクターとしては、投与対象の細胞中で配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその変異体を発現可能なものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
発現ベクターにおいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその変異体の発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ｔｋプロモーター等が挙げられる。
発現ベクターは、更に、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
［ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ２Ｂ ｍｅｍｂｅｒ １ ｉｓｏｆｏｒｍ ｂ（ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂ）タンパク質、その発現ベクター、発現阻害物質、阻害剤］
１実施形態において、ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質の発現ベクター、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤である。
すなわち、１実施形態において、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質（以下、「ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の変異体」という場合がある。）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質の発現ベクター、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤を有効成分として含有する免疫制御剤を提供する。
である。ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質は、コレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有する酵素である。したがって、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体を生体に投与することにより、コレステロール３－硫酸を生成させて、免疫特権部位を生成することができる。
したがって、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権部位生成剤であるということもできる。あるいは、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体を有効成分とする免疫制御剤は、免疫抑制剤であるということもできる。ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体は、例えばポリエチレングリコール等の化合物を結合させることにより、血中安定性を向上させたものであってもよい。
本実施形態の免疫制御剤は、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とするものであってもよい。発現ベクターとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。本実施形態の発現ベクターを生体に投与することにより、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体を発現させることができる。発現ベクターから発現した、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体は、上述したように、コレステロール３－硫酸を生成させて、免疫特権部位を生成することができる。
したがって、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権部位生成剤であるということもできる。あるいは、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とする免疫制御剤は、免疫抑制剤であるということもできる。
ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とする免疫制御剤は、例えば、再生医療技術により作製された移植臓器に組み込んで発現させることにより、移植臓器に免疫特権部位を生成し、拒絶反応を抑制することができる。
あるいは、本実施形態の免疫制御剤を、過剰な免疫応答により生じる、慢性関節リウマチ、ぶどう膜炎、多発性硬化症等の免疫疾患の患者に投与することにより、免疫疾患を治療することができる。
本実施形態の免疫制御剤は、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とするものであってもよい。本明細書において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸をまとめて「発現阻害物質」という場合がある。これらのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を生体に投与することにより、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害することができる。その結果、コレステロール３－硫酸の生成を抑制し、免疫特権部位の生成を阻害することができる。
したがって、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権部位生成抑制剤であるということもできる。あるいは、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤は、免疫促進剤であるということもできる。
ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤を、例えば全身投与又は癌組織に局所投与して、癌組織の免疫特権を除去することにより、癌組織における免疫応答を促進し、癌を治療することができる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１～２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０～９５℃で約１分程度変性させた後、３０～７０℃で約１～８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
ヒトＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡのセンス鎖の具体的な塩基配列としては、例えば配列番号４～７に記載の塩基配列等が挙げられる。
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
ヒトＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害するｓｈＲＮＡの具体的な塩基配列としては、例えば配列番号８～１０に記載の塩基配列等が挙げられる。
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に約２０塩基の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ、非コードＲＮＡ：タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、他の遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。特定の塩基配列を有するｍｉＲＮＡを生体に投与することにより、ヒトＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を阻害することができる。
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
本実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
本実施形態の免疫制御剤は、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤を有効成分とするものであってもよい。ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤は、低分子化合物であることが好ましい。ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤を生体に投与することにより、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の活性を阻害することができる。その結果、コレステロール３－硫酸の生成を阻害し、免疫特権部位の生成を阻害することができる。
したがって、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権部位生成抑制剤であるということもできる。あるいは、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤を有効成分とする免疫制御剤は、免疫促進剤であるということもできる。
ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤を有効成分とする免疫制御剤を、例えば全身投与又は癌組織に局所投与して、癌組織における免疫特権生成を抑制することにより、癌組織における免疫応答を促進し、癌を治療することができる。
［ｓｔｅｒｙｌ－ｓｕｌｆａｔａｓｅ（ＳＴＳ）タンパク質、その発現ベクター、発現阻害物質、阻害剤］
１実施形態において、ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール－３硫酸の硫酸基を除去する活性を有するタンパク質、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール－３硫酸の硫酸基を除去する活性を有するタンパク質の発現ベクター、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤である。
すなわち、１実施形態において、本発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール－３硫酸の硫酸基を除去する活性を有するタンパク質、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール－３硫酸の硫酸基を除去する活性を有するタンパク質の発現ベクター、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤を有効成分として含有する免疫制御剤を提供する。
配列番号３に記載のアミノ酸配列は、ヒトＳＴＳタンパク質のアミノ酸配列である。ＳＴＳタンパク質は、ステロイド骨格に付加された硫酸基を除去する活性を有する酵素である。したがって、ＳＴＳタンパク質又はその変異体を生体に投与することにより、コレステロール３－硫酸の硫酸基を除去し、コレステロールを生成することができる。その結果、コレステロール３－硫酸の生体内濃度を低下させることができる。その結果、コレステロール３－硫酸の存在により形成された免疫特権を除去することができる。
したがって、ＳＴＳタンパク質又はその変異体を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権除去剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質又はその変異体を有効成分とする免疫制御剤は、免疫回避除去剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質又はその変異体を有効成分とする免疫制御剤は、免疫促進剤であるということもできる。ＳＴＳタンパク質又はその変異体は、例えばポリエチレングリコール等の化合物を結合させることにより、血中安定性を向上させたものであってもよい。
ＳＴＳタンパク質又はその変異体を有効成分とする免疫制御剤を、例えば全身投与又は癌組織に局所投与して、癌組織の免疫特権を除去することにより、癌組織における免疫応答を促進し、癌を治療することができる。
本実施形態の免疫制御剤は、ＳＴＳタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とするものであってもよい。発現ベクターとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。本実施形態の発現ベクターを生体に投与することにより、ＳＴＳタンパク質又はその変異体を発現させることができる。発現ベクターから発現した、ＳＴＳタンパク質又はその変異体は、上述したように、コレステロール３－硫酸をコレステロールに変換し、コレステロール３－硫酸の生体内濃度を低下させることにより、コレステロール３－硫酸の存在により形成された免疫特権を除去することができる。
したがって、ＳＴＳタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権除去剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とする免疫制御剤は、免疫回避除去剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とする免疫制御剤は、免疫促進剤であるということもできる。
ＳＴＳタンパク質又はその変異体の発現ベクターを有効成分とする免疫制御剤を、例えば全身投与又は癌組織に局所投与して、癌組織の免疫特権を除去することにより、癌組織における免疫応答を促進し、癌を治療することができる。
本実施形態の免疫制御剤は、ＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とするものであってもよい。これらのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を生体に投与することにより、ＳＴＳタンパク質の発現を阻害することができる。その結果、コレステロール３－硫酸からの硫酸基の除去を抑制し、コレステロール３－硫酸の生体内濃度を上昇させて免疫特権部位を生成又は維持することができる。
したがって、ＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権部位生成剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権維持剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤は、免疫回避維持剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤は、免疫抑制剤であるということもできる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸については上述したものと同様である。
ヒトＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡのセンス鎖の具体的な塩基配列としては、例えば配列番号１１～１４に記載の塩基配列等が挙げられる。
ヒトＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｈＲＮＡの具体的な塩基配列としては、例えば配列番号１５～１７に記載の塩基配列等が挙げられる。
ＳＴＳタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を有効成分とする免疫制御剤を、例えば、上述したコレステロール３－硫酸又はその誘導体とともに、徐放製剤として移植臓器の組織内に投与することにより、免疫特権部位を生成させやすくし、拒絶反応を抑制することができる。
本実施形態の免疫制御剤は、ＳＴＳタンパク質の阻害剤を有効成分とするものであってもよい。ＳＴＳタンパク質の阻害剤は、低分子化合物であることが好ましい。ＳＴＳタンパク質の阻害剤を生体に投与することにより、ＳＴＳタンパク質の活性を阻害することができる。その結果、コレステロール３－硫酸からの硫酸基の除去を抑制し、コレステロール３－硫酸の生体内濃度を上昇させて免疫特権部位を生成又は維持することができる。
したがって、ＳＴＳタンパク質の阻害剤を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権部位生成剤であるということもできる。
あるいは、ＳＴＳタンパク質の阻害剤を有効成分とする免疫制御剤は、免疫特権維持剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質の阻害剤を有効成分とする免疫制御剤は、免疫回避維持剤であるということもできる。あるいは、ＳＴＳタンパク質の阻害剤を有効成分とする免疫制御剤は、免疫抑制剤であるということもできる。
ＳＴＳタンパク質の阻害剤としては、例えば、６６７ ＣＯＵＭＡＴＥ、ＳＴＸ２１３、ＫＷ－２５８１、ＳＴＸ６８１、ＹＭ５１１等が挙げられる。
［医薬組成物］
上述した免疫制御剤は、それ自体を投与してもよいし、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。
医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、例えば注射剤、軟膏、貼付剤等の非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
医薬組成物が注射剤である場合、注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
免疫制御剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。
免疫抑制剤の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．１～１００ｍｇ、例えば１～５０ｍｇ、例えば１～２０ｍｇ等が挙げられる。
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．０１～３０ｍｇ、例えば０．１～２０ｍｇ、例えば０．１～１０ｍｇ程度を静脈注射又は局所注射により投与することが挙げられる。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、コレステロール－３硫酸若しくはその誘導体、コレステロール－３硫酸若しくはその誘導体に対する特異的結合物質、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現阻害物質、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤、ＳＴＳタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＴＳタンパク質の発現阻害物質、又はＳＴＳタンパク質の阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える免疫制御方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、コレステロール－３硫酸若しくはその誘導体、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＴＳタンパク質の発現阻害物質、又はＳＴＳタンパク質の阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、移植臓器の拒絶反応の抑制方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、コレステロール－３硫酸若しくはその誘導体に対する特異的結合物質、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現阻害物質、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤、又はＳＴＳタンパク質若しくはその変異体の発現ベクターの有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、免疫の制御のためのコレステロール－３硫酸若しくはその誘導体、コレステロール－３硫酸若しくはその誘導体に対する特異的結合物質、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現阻害物質、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤、ＳＴＳタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＴＳタンパク質の発現阻害物質、又はＳＴＳタンパク質の阻害剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、免疫制御剤を製造するためのコレステロール－３硫酸若しくはその誘導体、コレステロール－３硫酸若しくはその誘導体に対する特異的結合物質、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の発現阻害物質、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂタンパク質の阻害剤、ＳＴＳタンパク質若しくはその変異体の発現ベクター、ＳＴＳタンパク質の発現阻害物質、又はＳＴＳタンパク質の阻害剤の使用を提供する。
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（コレステロール３－硫酸によるグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性の阻害効果の選択性の検討）
図１は、主な生体内ステロイドの構造と生合成経路を示す図である。コレステロール３－硫酸（図中、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｓｕｌｆａｔｅと示す。）は、ＳＵＬＴ２Ｂ１ｂ酵素の働きによって、コレステロールの３位の炭素に硫酸基が付与されて生合成される。一方、ＳＴＳ酵素の働きによって、コレステロール３－硫酸の硫酸基が除去され、コレステロールが生成される。
コレステロール３－硫酸によるＤＯＣＫ２のＧＥＦ活性の阻害効果の選択性を検討した。ＤＯＣＫ２、Ｔｒｉｏ及びＴｉａｍは、いずれもＲａｃを活性化するＧＥＦである。段階希釈したコレステロール３－硫酸の存在下で、Ｄｏｃｋ２タンパク質、Ｔｒｉｏタンパク質及びＴｉａｍタンパク質によるＲａｃの活性化能をインビトロＧＥＦアッセイによって測定した。インビトロＧＥＦアッセイでは、ＧＥＦの働きによってＲａｃに結合すると蛍光強度が増大する性質を持つ標識ＧＴＰ（商品名、「Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬ－ＧＴＰ」、インビトロジェン社）を利用した。
より具体的には、まず、ＤＯＣＫ２のＢローブ及びＣローブからなるＤＨＲ－２ドメイン、Ｔｒｉｏタンパク質及びＴｉａｍタンパク質のＤＨ－ＰＨドメインに相当するポリペプチド断片を、それぞれＮ端にＨｉｓｔｉｄｉｎｅ－ＳＵＭＯタグを融合したリコンビナントタンパク質として、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターを用いて大腸菌Ａｒｃｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓ ＤＥ３株に発現させた（０．５ｍＭ ＩＰＴＧ存在下で１６℃、一晩発現誘導）。続いて、回収した大腸菌をリン酸バッファー（ＰＢＳ）－０．５ｍＭ ＥＤＴＡ－５ｍＭ ２－メルカプトエタノールに懸濁して超音波破砕後、その上清からＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムを用いてそれぞれのタンパク質を精製した。
一方、ＲａｃはＮ端にＧＳＴタグを融合したリコンビナントタンパク質としてｐＧＥＸ－６Ｐ－１発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３株に発現させた（０．５ｍＭ ＩＰＴＧ存在下で２５℃、一晩発現誘導）。回収した大腸菌をＰＢＳ－１ｍＭ ＥＤＴＡ－５ｍＭ ２－メルカプトエタノールに懸濁して超音波破砕後、その上清からＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ アフィニティーカラムを用いて精製した。
次いで、反応液Ａ（２０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ－１５０ｍＭ ＮａＣｌ－１０ｍＭ ＭｇＣｌ２－２０μＭ ＧＤＰ、ｐＨ７．０）中で、調製した各ＧＥＦ（ＤＨＲ－２ドメイン又はＤＨ－ＰＨドメイン）を、ＤＭＳＯに溶解させた所定濃度のコレステロール３－硫酸又はＤＭＳＯ単独（対照）の存在下で遮光しながら室温で２０分間インキュベートしてＧＥＦの前処理物を準備した。なお、全てのサンプルにおいてＤＭＳＯの濃度が３％（最終的な反応液中では濃度１％）になるように調整した。
一方、調製したＲａｃを反応液Ａに濃度１５μＭで添加し、そのまま氷上で３０分間静置することによりＧＤＰ－Ｒａｃ複合体を形成させた。
このようにして調製した１００μＬのＧＤＰ－Ｒａｃ複合体を含む反応液Ａに、３．６μＭとなるようにＢｏｄｉｐｙ－ＦＬ－ＧＴＰを加え、３０℃で３分間平衡化させた。平衡化後、前処理した５０μＬのＧＥＦを添加し３０℃で反応させた。
反応中のＢｏｄｉｐｙ－ＦＬ－ＧＴＰ蛍光強度の変化を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＥｎｓｐｉｒｅ蛍光光度分光機を用いてモニターした（励起波長：４８８ｎｍ、発光波長：５１４ｎｍ）。得られた測定値について、反応開始時点（０秒）での蛍光強度が０となるよう補正した値を算出した。
そして、ソフトウエア（商品名「ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５」、ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて、算出した補正値をｙ軸に、時間（ｔ）をｘ軸にとってプロットした際の近似曲線を求め、ｔ＝０～１０秒における傾きをグアニンヌクレオチド交換反応の初速度とした。溶媒（ＤＭＳＯ）のみを加えた対照の反応初速度を１００％として、ＧＥＦ活性（％活性）及びＩＣ５０値を計算した。
図２は、実験結果を示すグラフである。その結果、コレステロール３－硫酸は、ＤＯＣＫ２特異的にＲａｃ活性化能を阻害することが明らかとなった。ＤＯＣＫ２に対するコレステロール３－硫酸の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は６．７μＭであった。一方、Ｔｒｉｏ及びＴｉａｍに対するコレステロール３－硫酸のＩＣ５０は３００μＭ超であり、これらのタンパク質のＧＥＦ活性には全く影響しなかった。
［実験例２］
（コレステロール３－硫酸によるＤＯＣＫ２の活性阻害の検討）
ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質によるＲａｃ活性化に対する各種ステロイド化合物の効果を検討した。
ステロイド化合物としては、コレステロール３－硫酸（以下、「Ｃ３Ｓ」という場合がある。）、コレステロール、コレステロール３－酢酸（以下、「Ｃ３Ａ」という場合がある。）、プレグネノロン３－硫酸（以下、「ＰＲＥＧ３Ｓ」という場合がある。）、デヒドロエピアンドロステロン（以下、「ＤＨＥＡ」という場合がある。）、デヒドロエピアンドロステロン３－硫酸（以下、「ＤＨＥＡ３Ｓ」という場合がある。）、エストロン３－硫酸（以下、「Ｅｓｔｒｏｎｅ３Ｓ」という場合がある。）、エストリオール３－硫酸（以下、「Ｅｓｔｒｉｏｌ３Ｓ」という場合がある。）、エストラジオール３－硫酸（以下、「Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ３Ｓ」という場合がある。）を用いた。
より具体的には、上述したものと同様にして調製したＤＯＣＫ２－ＤＨＲ－２ドメインタンパク質を、ＤＭＳＯに溶解させた所定濃度の各種ステロイド化合物及びＤＭＳＯのみ（対照）の存在下で遮光しながら室温で２０分間インキュベートしてＧＥＦの前処理物を準備した。全てのサンプルにおいてＤＭＳＯの濃度が３％（最終的な反応液中では濃度１％）になるように調整した。次いで、上述したものと同様にして調製したＲａｃ及びＢｏｄｉｐｙ－ＦＬ－ＧＴＰを用いたインビトロＧＥＦアッセイによって、ＤＨＲ－２ドメインによるＲａｃ活性化を測定した。
図３（ａ）はコレステロール３－硫酸の存在下でＲａｃ活性化能を測定した結果を示す時間経過曲線であり、（ｂ）はコレステロールの存在下でＲａｃ活性化能を測定した結果を示す時間経過曲線であり、（ｃ）はコレステロール３－酢酸の存在下でＲａｃ活性化能を測定した結果を示す時間経過曲線である。また、図４は、様々な濃度の各種ステロイド化合物の存在下でＲａｃ活性化能を測定した結果を示すグラフである。また、図５は、５０μＭの各種ステロイド化合物の存在下でＲａｃ活性化能を比較した結果を示すグラフである。図５中、「＊＊」は、ｔ－検定で有意差ｐ＜０．０１を表す。
その結果、コレステロール３－硫酸のみが、ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質によるＲａｃ活性化をＩＣ５０値１０μＭ以下で特異的に阻害することが明らかになった。表１に、ＤＯＣＫ２ＤＨＲ－２によるＲａｃ活性化に対する各種ステロイド化合物のＩＣ５０値を示す。
Figure 0007008328000004
［実験例３］
（ＥＬＩＳＡ法によるＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインとコレステロール３－硫酸との特異的結合の検出）
ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質と、各種ステロイド化合物との結合をＥＬＩＳＡ法により検討した。ステロイド化合物としては、コレステロール３－硫酸、コレステロール３－酢酸、コレステロール、プレグネノロン３－硫酸、エストロン３－硫酸、エストリオール３－硫酸、エストラジオール３－硫酸、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエピアンドロステロン３－硫酸を用いた。
まず、１００％メタノールを用いて１００μｇ／ｍｌに調製した各種ステロイド化合物を５０μＬずつＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（商品名「Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添加し、１時間クリーンベンチ内で風乾して固定した。続いて、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ－１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に希釈した５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１８０μＬずつ添加して、４℃で６時間インキュベーショトし、ウェルをブロッキングした。
続いて、各ウェルを１８０μＬのＰＢＳ－０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回リンスした後、濃度が２μｇ／ｍＬである、ヒスチジン－ＳＵＭＯタグを融合したＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質を１００μＬずつウェルに添加して室温で２．５時間静置した。
続いて、各ウェルを１８０μＬのＰＢＳ－０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回で洗浄した。続いて、５０００倍希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヒスチジンタグプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬずつ各ウェルに添加して室温で１．５時間静置した。
続いて、各ウェルを１８０μＬのＰＢＳ－０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回で洗浄し、ＨＲＰ発色基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬずつ各ウェルに添加して発色反応を行い、反応停止液（０．１６Ｍ硫酸、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬずつ各ウェルに添加して反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
図６は測定結果を示すグラフである。図６中、「＊＊」は、ｔ－検定で有意差ｐ＜０．０１を表す。その結果、ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質は、コレステロール３－硫酸に特異的に結合することが明らかとなった。
［実験例４］
（ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインとＲａｃとの結合に対するコレステロール３－硫酸の影響）
ＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインとＲａｃとの結合に対する、コレステロール３－硫酸の影響をＧＳＴ－Ｒａｃビーズを用いたＰｕｌｌ ｄｏｗｎアッセイにより検討した。
より具体的には、まず、上述したものと同様にしてＧＳＴ－Ｒａｃを発現誘導した大腸菌株を超音波破砕し、その上清をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ビーズと混ぜて、４℃で４時間インキュベーションした後、ＰＢＳ－１ｍＭ ＥＤＴＡ－０．０１％Ｔｗｅｅｅｎ－２０－５ｍＭ ２－メルカプトエタノールでよく洗浄し、ＧＳＴ－Ｒａｃを結合したビーズを調製した。
続いて、１μｇのＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質を、１５０μＭのコレステロール３－硫酸、コレステロール３－酢酸、コレステロール、デヒドロエピアンドロステロン３－硫酸及びＤＭＳＯのみ（対照、終濃度０．６％）の存在下で、２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ－Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ－１５０ｍＭ ＮａＣｌ－５ｍＭ ＥＤＴＡ－０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．５）中で室温、２０分間前処理した。
続いて、前処理物に２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて希釈し、別のチューブに２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いてあらかじめ分注した８μＬのＧＳＴ－Ｒａｃビーズに添加した（計６００μＬ）。これを４℃で１時間ローテーターを用いてゆっくりと混和した後、６００μＬのｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いてビーズを３回洗浄した。洗浄したビーズに３０μＬの１．５×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（８７．５ｍＭ－Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ６．８）－７．５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ－２．５％ＳＤＳ－０．００３％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）を添加し、９５℃で５分間煮沸した。
インプットとして０．１μｇのＤＯＣＫ２のＤＨＲ－２ドメインのＢローブ及びＣローブからなるタンパク質を１×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒに希釈して同様に煮沸した。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、３％スキムミルク－ＴＢＳＴでブロッキングした後、３％スキムミルク－ＴＢＳＴで１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヒスチジンタグプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたウエスタンブロット法により、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ融合ＤＯＣＫ２－ＤＨＲ－２タンパク質を検出した。
図７は、ＧＳＴ－Ｒａｃビーズに結合したＤＯＣＫ２－ＤＨＲ－２をウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。その結果、コレステロール３－硫酸は、ＲａｃとＤＨＲ－２との結合を特異的に阻害することが明らかとなった。
［実験例５］
（トランスウェルを用いたリンパ球の遊走アッセイ１）
Ｔ細胞の遊走に対する、コレステロール３－硫酸の影響を検討した。また、対照として、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウス由来のＴ細胞を用いた実験も行った。より具体的には、まず、マウス脾臓細胞（１×１０７個／ｍＬ）を、所定濃度のコレステロール３－硫酸又はＤＭＳＯのみ（対照）の存在下で、０．５％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０（トランスウェル培地）中で３７℃、１時間培養した。全てのサンプルにおいてＤＭＳＯの最終濃度が０．２％になるように調整した。
続いて、２４ウェルプレートに、ケモカインＣＣＬ２１（３００ｎｇ／ｍＬ）とコレステロール３－硫酸を所定濃度添加したトランスウェル培地を加えた後、ウェルにトランスウェル（５μｍ孔、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）をセットし、前培養した細胞（１×１０６個／１００μＬ）をロードした。続いて、３７℃で２時間インキュベートした後、下層のチャンバーに移動した細胞を集め、ＰＥ標識－抗Ｔｈｙ１．２抗体（型式「５３－２－１」、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）で染色した。移動したＴ細胞の割合（Ｔ細胞の遊走（％））は、下層チャンバー中のＴｈｙ１．２陽性細胞（Ｔ細胞）の数をトランスウェルに入れたＴｈｙ１．２陽性細胞（Ｔ細胞）の数で割ることにより算出した。
図８は、野生型及びＤＯＣＫ２欠損マウス由来のＴ細胞のＣＣＬ２１に対する遊走能を比較した結果を示すグラフである。図８中、「＊＊」は、ｔ－検定で有意差ｐ＜０．０１を表す。また、図９は、Ｔ細胞の遊走に対するコレステロール３－硫酸の阻害効果を検討した結果を示すグラフである。図９中、「＊＊」は、ｔ－検定で有意差ｐ＜０．０１を表す。その結果、コレステロール３－硫酸の存在により、Ｔ細胞の遊走が顕著に阻害された。また、コレステロール３－硫酸を６．２５μＭの濃度で添加した場合に、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウス由来のＴ細胞と同程度にまでＴ細胞の遊走が阻害されることが明らかとなった。
［実験例６］
（トランスウェルを用いたリンパ球の遊走アッセイ２）
Ｔ細胞の遊走に対する、各種ステロイド化合物の影響を検討した。ステロイド化合物としては、コレステロール３－硫酸、コレステロール、コレステロール３－酢酸、プレグネノロン３－硫酸、エストロン３－硫酸、エストリオール３－硫酸、エストラジオール３－硫酸、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエピアンドロステロン３－硫酸を用いた。
より具体的には、まず、マウス脾臓細胞（１×１０７個／ｍＬ）を、それぞれ１２．５μＭに調製した各種ステロイド化合物又はＤＭＳＯのみ（対照）の存在下で、０．５％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０（トランスウェル培地）中で３７℃、１時間培養した。全てのサンプルにおいてＤＭＳＯの最終濃度が０．２％になるように調整した。
続いて、上述したものと同様にしてトランスウェルアッセイを行い、ＣＣＬ２１（３００ｎｇ／ｍＬ）へのＴ細胞の遊走性に対する各種ステロイド化合物の効果を比較検討した。
図１０は、リンパ球の遊走に対する、各種ステロイド化合物の効果を検討した結果を示すグラフである。図１０中、「＊＊」は、ｔ－検定で有意差ｐ＜０．０１を表す。その結果、コレステロール３－硫酸のみが特異的にＴ細胞の遊走を阻害することが明らかとなった。
［実験例７］
（好中球の遊走アッセイ１）
好中球の遊走速度に対するコレステロール３－硫酸の影響を検討した。より具体的には、マウス骨髄から単離した好中球を、所定濃度のコレステロール３－硫酸、又はＤＭＳＯ単独（溶媒コントロール）の存在下で、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．３）－０．１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔａｘｉｓｃａｎ培地）中で室温、１時間インキュベーションした。全てのサンプルにおいてＤＭＳＯの最終濃度が０．２％になるように調整した。
続いて、ＥＺ－ＴＡＸＩＳｃａｎチャンバー（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）の一方のウェルに前処理した細胞をロードし、２６０μｍ離れたもう一方のウェルにＴａｘｉｓｃａｎ培地で１０μＭに調製したｆＭＬＰを１μＬ添加し、ｆＭＬＰ濃度勾配（０－１０μＭ）存在下において好中球を遊走させた。位相差顕微鏡画像を３０秒間隔で２０分間撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊプログラムのｍａｎｕａｌ ｔｒａｃｋｉｎｇ及びｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎツールを用いて、遊走の軌跡とスピードを解析した。
図１１（ａ）及び（ｂ）は、好中球のｆＭＬＰへの化学遊走性に対するコレステロール３－硫酸の効果を検討した実験結果を示すグラフである。図１１（ａ）は遊走スピードを表し、図１１（ｂ）は遊走の軌跡を表す。図１１（ａ）中、「＊＊」は、ｔ－検定で有意差ｐ＜０．０１を表す。その結果、コレステロール３－硫酸の存在により、好中球の遊走が顕著に阻害されることが明らかとなった。
［実験例８］
（好中球の遊走アッセイ２）
好中球の遊走速度に対するコレステロール３－硫酸の影響を、細胞の前処理でなく、化学遊走因子（ｆＭＬＰ）と同じウェルに添加した場合についても検討した。より具体的には、マウス骨髄由来好中球をＥＺ－ＴＡＸＩＳｃａｎチャンバー（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）の一方のウェルにロードし、２６０μｍ離れたもう一方のウェルにＴａｘｉｓｃａｎ培地で３μＭに調製したｆＭＬＰ溶液に、１５０μＭになるように調製したコレステロール３－硫酸、デヒドロエピアンドロステロン３－硫酸又はＤＭＳＯ（対照、最終濃度３％）を１μＬ添加し、好中球を遊走させた。位相差顕微鏡画像を３０秒間隔で４０分間撮影し、上記と同様の方法で解析した。
図１２（ａ）～（ｃ）は、実験結果を示すグラフ及び写真である。上段には、ＥＺ－ＴＡＸＩＳｃａｎチャンバーの起点（好中球をロードしたウェル）から終点（ｆＭＬＰ及び各種ステロイドを添加したウェル）までの間における好中球の位置と遊走スピードの関係を示すグラフを示す。また、中段には、各時点でのそれぞれの条件下で遊走している好中球の位相差顕微鏡写真を示す。また、下段には、好中球の軌跡を示すグラフを示す。図１２（ａ）はＤＭＳＯを添加した場合の結果であり、図１２（ｂ）はコレステロール３－硫酸を添加した場合の結果であり、図１２（ｃ）はデヒドロエピアンドロステロン３－硫酸を添加した場合の結果である。
その結果、コレステロール３－硫酸が所定の濃度に達したところで好中球の遊走が急激に停止することが明らかとなった。この効果は、コレステロール３－硫酸に特異的であった。
［実験例９］
（ストローマ細胞上でのリンパ球の遊走アッセイ）
コレステロール３－硫酸の産生酵素であるＳｕｌｔ２Ｂ１ｂを過剰発現したストローマ細胞上でのＴ細胞の遊走性を検討した。より具体的には、マウスの二次リンパ組織を摘出し、細切れにした後、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、０．８ｍｇ／ｍＬディスパーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉを添加したＤＭＥＭ培地に懸濁し、３７℃で４５分間処理してストローマ細胞を分離した。
分離したストローマ細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭで培養し、培養開始後５日目に抗ＣＤ４５抗体を架橋したマイクロビーズ（ミルテニー社）を用いて、残存するリンパ球を含む造血系細胞を除き、ガラスボトムディッシュにまき直した（４×１０４個／ｄｉｓｈ）。培養開始後６日目、７日目、８日目に連続してレトロウィルスを感染させ、遺伝子導入をおこなった。感染用のレトロウィルスは、パッケージ細胞株Ｐｌａｔ－ＥにｐＭＸ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（対照）又はｐＭＸ－Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを遺伝子導入し、その培養上清中に濃縮されたものをそのまま使用した。培養９日目に細胞をＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、１０日目にＣＣＬ２１（３００ｎｇ／ｍＬ）を添加してアッセイを行った。
アッセイには、ＰａｎＴ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ミルテニー社）にてマウス脾臓より単離したＴ細胞をストローマ細胞上にまきこみ、ディッシュを保温機能付きステージを持った蛍光顕微鏡にセットし、ＣＯ２存在下、３７℃でインキュベートしながら遊走させて、１分間隔で２０分間、微分干渉顕微鏡画像及び蛍光顕微鏡画像を撮影した。撮影した画像のスタックを再生し、Ｔ細胞が細胞上を通過したＧＦＰ陽性のストローマ細胞の数を求め、ＧＦＰ陽性ストローマ細胞の総数で割ることにより、Ｔ細胞の遊走性（％ストローマ細胞）を算出した。
図１３（ａ）は、対照のＧＦＰのみ又はＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子とＧＦＰを発現したストローマ細胞上でのＴ細胞の遊走性を示すタイムラプス画像である。図１３（ｂ）は、対照のＧＦＰのみ又はＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子とＧＦＰを発現したストローマ細胞上でのＴ細胞の遊走性を比較した結果を示すグラフである。図１３（ｂ）中、「＊＊」は、ｔ－検定で有意差ｐ＜０．０１を表す。
その結果、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ酵素を発現したストローマ細胞では、Ｔ細胞が細胞上を通過できずに、周辺部位にたまることが明らかとなった。この結果は、コレステロール３－硫酸を産生している細胞の周辺部位では、リンパ球の遊走が抑制され、免疫回避が起きていることを支持するものである。
［実験例１０］
（マウスの各組織におけるＳｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質の発現の検討）
Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質は、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ａタンパク質と同じ遺伝子から形成されるが、ＲＮＡスプライシングの結果、Ｎ末端領域のアミノ酸配列が異なっている。コレステロール３－硫酸の産生にはＳｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質の発現が必須である。そこで、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質に特異的な抗体を作製し、マウスの各組織におけるＳｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質の発現をウエスタンブロット法により検討した。
具体的には、マウスの各組織から抽出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、マウスＳｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質に特異的な抗体で染色した。図１４（ａ）はウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。各レーンにアプライした総タンパク質量はそれぞれ２０μｇであった。その結果、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質は、涙の脂質成分を形成するハーダー腺において最も多く発現していることが明らかとなった。また、小腸及び皮膚にも発現が認められた。
続いて、同様の検討を、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子を欠損したマウスの各組織を用いて行った。図１４（ｂ）は、野生型マウス（＋／＋）及びＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）の各組織におけるＳｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質の発現を検出した結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。各レーンにアプライした総タンパク質量はそれぞれ２０μｇであった。その結果、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウスにおいては、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質の発現が認められないことが確認された。
［実験例１１］
（マウスの各組織におけるコレステロール－３硫酸の存在量の検討）
野生型マウス（＋／＋）及びＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）の各組織及び涙におけるコレステロール－３硫酸（Ｃ３Ｓ）を、質量分析により定量した（ｎ≧７）。具体的には、重水素で標識したコレステロール－３硫酸を内部標準として各組織に添加し、ホモジナイズした。続いて、各組織の懸濁液を限外濾過チューブで限外濾過し、ろ液をＬＣ－ＭＳ／ＭＳに供して直接解析した。コレステロール－３硫酸の絶対量は、内部標準のピーク面積に対するコレステロール－３硫酸のピーク面積の比に基づいて算出した。図１５（ａ）及び（ｂ）は、コレステロール－３硫酸の定量結果を示すグラフである。
その結果、野生型マウスにおいては、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂタンパク質の発現量と一致して、コレステロール－３硫酸の存在量は、ハーダー腺と涙において多いことが明らかとなった。また、コレステロール－３硫酸の存在は、小腸及び皮膚にも認められた。一方、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）においては、コレステロール－３硫酸の存在が認められないことが確認された。
続いて、質量分析顕微鏡を用いて、野生型マウス（＋／＋）及びＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）の眼球におけるコレステロール－３硫酸の局在を可視化した。
具体的には、各マウス試料を凍結した後に新鮮な凍結薄切片を作製した。この切片上に、マトリックスとして９－ａｍｉｎｏ ａｃｒｉｄｉｎｅを噴霧し、質量分析顕微鏡による測定を行った。測定されたデータから質量電荷比（ｍ／ｚ）＝４６５に出現するピークをタンデム質量分析によりコレステロール３－硫酸として同定し、このピーク強度分布を画像化した。続いて、測定後の切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、光学顕微鏡で観察した。
図１６は、各マウスの眼球におけるコレステロール－３硫酸の局在を示す質量分析顕微鏡画像及び光学顕微鏡写真である。左上は野生型マウス（＋／＋）の眼球におけるコレステロール－３硫酸の局在を示す質量分析顕微鏡画像である。バーは５００μｍを表す。左下は左上の視野に対応する光学顕微鏡写真である。また、右上はＳｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）の眼球におけるコレステロール－３硫酸の局在を示す質量分析顕微鏡画像である。右下は右上の視野に対応する光学顕微鏡写真である。
その結果、野生型マウスの眼球の房水にもコレステロール－３硫酸が多く含まれることが明らかとなった。
［実験例１２］
（眼の炎症誘導におけるコレステロール－３硫酸の役割の検討１）
Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のヘテロマウス（＋／－）及びノックアウトマウス（－／－）を用いたＵＶ誘導性角膜炎モデルを検討した結果、いずれのマウスにおいても角膜上皮の萎縮が観察された。そこで、各マウスの眼球切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、光学顕微鏡で観察した。
図１７（ａ）は、各マウスの眼球切片の光学顕微鏡写真である。また、図１７（ｂ）はＵＶ照射前（－）及びＵＶ照射後（＋）に、各マウスの前眼房に浸潤した炎症細胞の総数を計測した結果を示すグラフである。また、図１７（ｃ）は、各マウスの眼球切片を、好中球のマーカーであるＧｒ１に対する抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。写真中の点線は角膜の境界を示す。
その結果、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）の眼球では、ヘテロマウス（＋／－）と比較して、ＵＶ照射後に、好中球を主体とした前眼房への炎症細胞の浸潤が亢進したことが明らかとなった。
続いて、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）にコレステロール－３硫酸を点眼し、ＵＶ照射を行って、前眼房に浸潤した炎症細胞の総数を計測した。対照として溶媒のみ（ベヒクル）を点眼したマウスを用いた。
図１７（ｄ）は、各マウスの前眼房に浸潤した炎症細胞の総数を計測した結果を示すグラフである。その結果、ＵＶ照射による前眼房への炎症細胞の浸潤は、コレステロール－３硫酸を点眼することにより抑制されることが明らかとなった。
［実験例１３］
（眼の炎症誘導におけるコレステロール－３硫酸の役割の検討２）
Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のヘテロマウス（＋／－）及びノックアウトマウス（－／－）をブタクサ花粉で感作し、その１０日及び１２日後に同抗原を眼内に投与することで誘導される結膜炎モデルを検討した。各マウスの眼球切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、光学顕微鏡で観察した。
図１８（ａ）は、各マウスの眼球切片の光学顕微鏡写真である。また、図１８（ｂ）はブタクサ花粉を眼内投与後に、各マウスの結膜に浸潤した炎症細胞の総数を計測した結果を示すグラフである。
その結果、ブタクサ花粉により誘導される結膜炎モデルにおいても、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）の眼球では、ヘテロマウス（＋／－）と比較して、結膜への炎症細胞の浸潤が亢進したことが明らかとなった。
続いて、Ｓｕｌｔ２Ｂ１ｂ遺伝子のノックアウトマウス（－／－）にコレステロール－３硫酸を点眼し、ブタクサ花粉への暴露を行って、結膜に浸潤した炎症細胞の総数を計測した。対照として溶媒のみ（ベヒクル）を点眼したマウスを用いた。
図１８（ｃ）は、各マウスの結膜に浸潤した炎症細胞の総数を計測した結果を示すグラフである。その結果、ブタクサ花粉への暴露による結膜への炎症細胞の浸潤は、コレステロール－３硫酸を点眼することにより抑制されることが明らかとなった。
［実験例１４］
（コレステロール３－硫酸の検出１）
質量分析顕微鏡を用いて妊娠期マウス胎児中のコレステロール３－硫酸の分布を検出した。より具体的には、野生型妊娠マウスの胎児（Ｅ８．５）を母体より摘出し、凍結した後に新鮮な凍結薄切片を作製した。この切片上に、マトリックスとして９－ａｍｉｎｏ ａｃｒｉｄｉｎｅを噴霧し、質量分析顕微鏡による測定を行った。測定されたデータから質量電荷比（ｍ／ｚ）＝４６５に出現するピークをタンデム質量分析によりコレステロール３－硫酸として同定し、このピーク強度分布を画像化した。続いて、測定後の切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した。
図１９（ａ）は野生型マウス胎児切片のＨＥ染色像であり、図１９（ｂ）は同じ切片におけるコレステロール３－硫酸（ｍ／ｚ＝４６５）の分布を示す写真であり、図１９（ｃ）は図１９（ａ）及び（ｂ）を重ね合わせた画像である。その結果、胎児の周辺にはコレステロール３－硫酸が局在していることが明らかとなった。この結果は、コレステロール３－硫酸が妊娠期における免疫特権部位を形成する分子実体であることを示すものである。
［実験例１５］
（コレステロール３－硫酸の検出２）
ヒト大腸癌のマウス肝転移モデルを用いて、癌組織中のコレステロール３－硫酸の分布を質量分析顕微鏡により検出した。より具体的には、ＧＦＰ変異体であるｖｅｎｕｓ遺伝子を導入して蛍光標識したヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＨＣＴ１１６／ｖｅｎｕｓ）を、ＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２ＲγＫＯマウス）の脾臓内に移入した。続いて、２週間後にＮＯＧマウスから肝臓を摘出し、液体窒素で凍結した後、凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡観察を行った。続いて、被検切片上に、マトリックスとして９－ａｍｉｎｏ ａｃｒｉｄｉｎｅを噴霧し、質量分析顕微鏡による測定を行った。測定されたデータからｍ／ｚ＝４６５に出現するピークをタンデム質量分析によりコレステロール３－硫酸として同定し、このピーク強度分布を画像化した。
図２０（ａ）は肝転移モデルマウスの肝臓組織中のＨＣＴ１１６／ｖｅｎｕｓ細胞の転移巣を示す蛍光顕微鏡写真であり、図２０（ｂ）はコレステロール３－硫酸の分布を示す質量顕微鏡写真であり、図２０（ｃ）は図２０（ａ）及び（ｂ）を重ね合わせた画像である。その結果、肝臓に転移した癌組織がコレステロール３－硫酸を高発現していることが明らかとなった。この結果は、コレステロール３－硫酸が、癌細胞が宿主の免疫系から逃れるための免疫特権部位を形成する分子実体であることを支持するものである。
［実験例１６］
（コレステロール３－硫酸の検出３）
ヒト非小細胞肺癌細胞の皮下移植モデルを用いて皮下腫瘍組織中のコレステロール３－硫酸及びアラキドン酸の分布を質量分析顕微鏡により検出した。より具体的には、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ－９をヌードマウスの皮下に移植し、４週間後に皮下腫瘍を摘出し、ＨＥ染色及び質量分析顕微鏡による解析を行った。詳細には、被検切片上に、マトリックスとして９－ａｍｉｎｏ ａｃｒｉｄｉｎｅを噴霧し、質量分析顕微鏡による測定を行い、測定されたデータからｍ／ｚ＝４６５に出現するピークをタンデム質量分析によりコレステロール３－硫酸として同定し、このピーク強度分布を画像化した。続いて、測定後の切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した。
図２１（ａ）は皮下腫瘍モデルマウスの皮下組織をＨＥ染色した顕微鏡写真であり、図２１（ｂ）は、該組織中のコレステロール３－硫酸及び免疫細胞が浸潤したことを示すマーカーであるアラキドン酸の分布を示す質量分析顕微鏡画像である。その結果、癌組織の周辺にはコレステロール３－硫酸が局在していることが明らかとなった。また、コレステロール３－硫酸とアラキドン酸とは排他的に局在していた。この結果は、コレステロール３－硫酸が存在する領域には免疫細胞が全く浸潤できないことを示す。この結果は、コレステロール３－硫酸が、癌細胞が宿主の免疫系から逃れるための免疫特権部位を形成する分子実体であることを更に支持するものである。
本発明によれば、新たな免疫制御剤を提供することができる。本発明の免疫制御剤を、その一態様として免疫抑制剤として使用することにより、過剰な免疫応答により生じる自己免疫疾患等の炎症性疾患を抑えることが可能である。また別の態様では、本発明の免疫制御剤を免疫特権除去剤として使用することにより、がんの免疫回避システムを解除し、がん免疫を賦活化することが可能である。さらに、本発明の免疫制御剤を利用して、免疫特権部位を人為的に作り出し、移植片に対する拒絶反応を抑制することで、再生医療や移植医療に貢献することが可能である。

Claims (2)

  1. コレステロール３－硫酸又はその塩を有効成分とする、Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ２（ＤＯＣＫ２）によるＲａｃ活性化の阻害剤。
  2. コレステロール３－硫酸を生成させるタンパク質、前記タンパク質をコードする発現ベクター、前記タンパク質の発現阻害物質又は前記タンパク質の阻害剤を有効成分とし、
    コレステロール３－硫酸を生成させる前記タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質であり、
    前記発現ベクターが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現ベクター、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールの３位の炭素に硫酸基を付加する活性を有するタンパク質の発現ベクターであり、
    前記発現阻害物質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸であり、
    前記阻害剤が、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤である、
    ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化の制御剤。
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