JP2017039691A

JP2017039691A - 炎症性疾患の治療剤及びその使用

Info

Publication number: JP2017039691A
Application number: JP2016014828A
Authority: JP
Inventors: 晶山▲崎▼; Sho Yamasaki
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2015-08-21
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2017-02-23

Abstract

【課題】コレステロール結晶を認識するパターン認識受容体を同定し、コレステロール結晶と当該受容体との結合の阻害に基づく炎症性疾患の治療剤を提供する。【解決手段】Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＣ−ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎ（Ｍｉｎｃｌｅ）の発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質又はコレステロール結晶に対する特異的結合物質を有効成分とし、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する、炎症性疾患の治療剤。【選択図】図２４

Description

本発明は、炎症性疾患の治療剤及びその使用に関する。より具体的には、炎症性疾患の治療剤、炎症性疾患の治療用組成物、炎症性疾患の治療剤のスクリーニング方法、及び炎症性疾患モデル非ヒト動物に関する。

コレステロールは、細胞の完全性、流動性及び様々な生物学的活性に必須の膜成分の１つである。しかしながら、コレステロールの過剰摂取は、高コレステロール血症を引き起こし、コレステロール結晶を形成させる。また、コレステロール結晶は、動脈硬化等の炎症性疾患において、炎症を惹起し、疾患の慢性化、憎悪に寄与していることが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。

ところで、Ｃ型レクチン受容体は、病原体や傷害を受けた組織を認識して自然免疫応答を誘導するパターン認識受容体の１つである。しかしながら、Ｃ型レクチン受容体の内在性のリガンドは完全には解明されていない。

Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＣ−ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎ（Ｍｉｎｃｌｅ）は、活性化したマクロファージ及び樹状細胞で発現するＣ型レクチン受容体の１つである。Ｍｉｎｃｌｅは、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｏｔｉｆ（ＩＴＡＭ）を有するアダプタータンパク質であるＦｃＲγ鎖と結合し、シグナル伝達を行うことが知られている。

Duewell P., et al., NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals., Nature, 464 (7293), 1357-1361, 2010.

コレステロール結晶を認識する直接的なパターン認識受容体は同定されていなかった。そこで、本発明は、コレステロール結晶を認識するパターン認識受容体を同定し、コレステロール結晶と当該受容体との結合の阻害に基づく炎症性疾患の治療剤を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
（１）Ｍｉｎｃｌｅの発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質又はコレステロール結晶に対する特異的結合物質を有効成分とし、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する、炎症性疾患の治療剤。
（２）Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質を有効成分とし、当該特異的結合物質が、ＭｉｎｃｌｅのＣＲＡＣモチーフに結合するものである、（１）に記載の炎症性疾患の治療剤。
（３）（１）又は（２）に記載の炎症性疾患の治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、炎症性疾患の治療用組成物。
（４）被検物質の存在下又は非存在下で、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量又はＭｉｎｃｌｅと固相上にコートされたコレステロールとの結合量を測定する工程と、被検物質の存在下における前記結合量が、被検物質の非存在下における前記結合量よりも低下していた場合に、前記被検物質は炎症性疾患の治療剤であると判定する工程と、を備える、炎症性疾患の治療剤のスクリーニング方法。
（５）コレステロール結晶への結合性を有するＭｉｎｃｌｅを発現する、炎症性疾患モデル非ヒト動物。

本発明により、コレステロール結晶を認識するパターン認識受容体が同定され、コレステロール結晶と当該受容体との結合の阻害に基づく炎症性疾患の治療剤を提供することができる。

（ａ）は、実験例１における脂質抽出物フラクションのＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１におけるＨＰＴＬＣ解析の結果を示す写真である。（ａ）は、実験例２におけるサブフラクションのＨＰＴＬＣ解析の結果を示す写真である。（ｂ）は、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。（ａ）は、実験例３におけるフラクションＮｏ．７−１５のＨＰＬＣクロマトグラムであり、（ｂ）は、コレステロールのＨＰＬＣクロマトグラムである。（ａ）は、実験例３におけるフラクションＮｏ．７−１５のポジティブモード、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）スペクトルの結果であり、（ｂ）は、コレステロールのＴＯＦ−ＭＳスペクトルの結果である。（ａ）は、実験例４における、フラクションＮｏ．７−１５のＴＭＳエステルのトータルイオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムである。（ｂ）は、標準コレステロールＴＭＳエステルのＴＩＣクロマトグラムである。（ｃ）は、フラクションＮｏ．７−１５のＴＭＳエステルの電子イオン化質量分析スペクトルである。（ｄ）は、標準コレステロールＴＭＳエステルの電子イオン化質量分析スペクトルである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例５における、プレートにコートされたコレステロール又はコレステロール結晶のＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。実験例６において、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ又はヒトＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇの、プレートにコートされたコレステロールへの結合能を測定した結果を示すグラフである。実験例７における、プレートにコートされた様々な脂肪酸のＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。コレステロール、ステロイドホルモン及びステロールの化学構造を示す図である。実験例８における、コレステロール、コルチゾン、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、アルドステロン及びＤＨＥＡのＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。実験例９における、様々なコレステロールエステルのＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。実験例１０における、コレステロール、シトステロール、デスモステロール、エルゴステロール及びコレスタン酸のＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。実験例１１において、マウスＭｉｎｃｌｅ、ヒトＭｉｎｃｌｅ、マウスＭＣＬ又はヒトＭＣＬを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞をコレステロール結晶で刺激した結果を示すグラフである。実験例１２において、ヒトＤｅｃｔｉｎ−１、マウスＤｅｃｔｉｎ−１、ヒトＤｅｃｔｉｎ−２又はマウスＤｅｃｔｉｎ−２を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞をコレステロール結晶で刺激した結果を示すグラフである。実験例１３において、ヒト、マウス又はラットＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞をコレステロール結晶で刺激した結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例１４においてＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞が産生したＴＮＦの濃度の測定結果を示すグラフである。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例１４においてＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞が産生したＭＩＰ−２の濃度の測定結果を示すグラフである。（ａ）〜（ｃ）は、実験例１５において抗ｈＭｉｎｃｌｅ抗体の存在下、ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞が産生したＴＮＦの濃度の測定結果を示すグラフである。（ｄ）〜（ｆ）は、実験例１５において抗ｈＭｉｎｃｌｅ抗体の存在下、ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞が産生したＭＩＰ−２の濃度の測定結果を示すグラフである。実験例１６におけるマイクロアレイ解析の結果を示す図である。実験例１７における定量的ＰＣＲの結果を示すグラフである。（ａ）は、実験例１８において、ＬＰＳ及びコレステロール結晶による刺激でヒト単球由来樹状細胞が産生したＩＬ−１βの濃度の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１８において、ＬＰＳ及び尿酸一ナトリウム結晶による刺激でヒト単球由来樹状細胞が産生したＩＬ−１βの濃度の測定結果を示すグラフである。実験例１９において、ヒトＭｉｎｃｌｅ及びマウスＭｉｎｃｌｅの炭水化物認識ドメインのアミノ酸配列をアラインメントした結果を示す図である。実験例２０において、ｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。実験例２１において、ｈＭｉｎｃｌｅ又はｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、コレステロール結晶又はトレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）で刺激した結果を示すグラフである。コレステロール結晶によるｈＭｉｎｃｌｅを介した刺激を説明する模式図である。

［炎症性疾患の治療剤］
１実施形態において、本発明は、Ｍｉｎｃｌｅの発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質又はコレステロール結晶に対する特異的結合物質を有効成分とし、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する、炎症性疾患の治療剤を提供する。

実施例において後述するように、発明者らは、コレステロール結晶を認識するパターン認識受容体がＭｉｎｃｌｅであることを明らかにした。また、Ｍｉｎｃｌｅ及びコレステロール結晶が結合することにより、炎症性サイトカインの発現が上昇することを明らかにした。更に、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害することにより、炎症性サイトカインの発現の上昇が抑制されることを明らかにした。したがって、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する物質は、炎症性疾患の治療剤であるということができる。

Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する物質としては、Ｍｉｎｃｌｅの発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質、コレステロール結晶に対する特異的結合物質等が挙げられる。

Ｍｉｎｃｌｅの発現阻害物質は、Ｍｉｎｃｌｅの発現を阻害することにより、結果的にＭｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する。また、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質は、Ｍｉｎｃｌｅに結合することにより、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する。また、コレステロール結晶に対する特異的結合物質は、コレステロール結晶に結合することにより、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する。

（Ｍｉｎｃｌｅ）
Ｍｉｎｃｌｅとしては、コレステロール認識／相互作用アミノ酸コンセンサス（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｎｓｅｎｓｕｓ、ＣＲＡＣ）モチーフ（以下、「ＣＲＡＣモチーフ」という場合がある。）を有するＭｉｎｃｌｅが挙げられる。ＣＲＡＣモチーフとは、（Ｌ／Ｖ）Ｘ_１−５ＹＸ_１−５（Ｒ／Ｋ）のアミノ酸配列からなるモチーフである。ここで、Ｌはロイシンを示し、Ｖはバリンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｙはチロシンを示し、Ｒはアルギニンを示し、Ｋはリジンを示す。

より具体的には、ヒトＭｉｎｃｌｅが挙げられる。ヒトＭｉｎｃｌｅのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。配列番号１に示すアミノ酸配列において、第１２７〜１３５番目の領域がＣＲＡＣモチーフである。

Ｍｉｎｃｌｅには、遺伝子多型やスプライシングバリアント等が存在する場合がある。このため、本実施形態におけるＭｉｎｃｌｅは、配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロール結晶に対する結合活性を有するタンパク質であってもよい。本明細書において、１若しくは数個とは、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個、例えば１〜５個、例えば１〜３個を意味する。

（発現阻害物質）
発現阻害物質としては、Ｍｉｎｃｌｅの発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸等が挙げられる。

ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０〜９５℃で約１分程度変性させた後、３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。

Ｍｉｎｃｌｅの発現を阻害するｓｉＲＮＡのセンス鎖の具体的な塩基配列としては、例えば、配列番号２５〜２８に記載の塩基配列等が挙げられる。

ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

Ｍｉｎｃｌｅの発現を阻害するｓｈＲＮＡとしては、例えば、細胞内で切断されて、上述したＭｉｎｃｌｅの発現を阻害するｓｉＲＮＡを生成するもの等が挙げられる。

リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。

アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。

ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。

（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に対象タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより作製してもよい。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することもできる。また、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。

アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。対象タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｉｇａｎｄｂｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、対象タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。

特異的結合物質は、上記の他にも、例えば、対象物質に対する結合性を指標として、化合物ライブラリー等からスクリーニングしたものであってもよい。

Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質としては、Ｍｉｎｃｌｅに結合してＭｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害するものであれば特に制限されない。例えば、ＭｉｎｃｌｅのＣＲＡＣモチーフ（配列番号１の第１２７〜１３５番目のアミノ酸配列）に結合する、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。より具体的には、実施例において後述する、抗ヒトＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体１３Ｄ１０−Ｈ１１であってもよい。あるいは、上記抗体に基づく抗体断片等であってもよい。

コレステロール結晶に対する特異的結合物質としては、コレステロール結晶に結合してＭｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害するものであれば特に制限されない。例えば、ＣＲＡＣモチーフ（（Ｌ／Ｖ）Ｘ_１−５ＹＸ_１−５（Ｒ／Ｋ））のアミノ酸配列からなるペプチド、ＣＲＡＣモチーフを有するタンパク質、抗コレステロール結晶抗体等が挙げられる。

（炎症性疾患）
本実施形態の治療剤が治療対象とする炎症性疾患としては、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合に起因する疾患が挙げられ、例えば動脈硬化、脂質代謝異常症、２型糖尿病、メタボリック症候群、高血圧症、狭心症、脳梗塞等が挙げられる。

［炎症性疾患の治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した炎症性疾患の治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、炎症性疾患の治療用組成物を提供する。本実施形態の治療用組成物を生体に投与することにより、炎症性疾患を治療、予防又は症状を緩和することができる。

炎症性疾患の治療用組成物は、常法（例えば、日本薬局方記載の方法）にしたがって、上述した炎症性疾患の治療剤、薬学的に許容される担体、及び場合によりその他の添加剤を混合して製剤化することにより製造することができる。

薬学的に許容される担体としては、特に制限されず、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、注射剤用溶剤等を使用することができる。また、その他の添加剤としては、特に制限されず、例えば、防腐剤、ｐＨ調整剤、安定剤紫外線吸収剤、酸化防止剤、着色剤、香料等が挙げられる。薬学的に許容される担体及びその他の添加剤としては、例えば、第十六改正日本薬局方等に記載されている一般的な原料を使用することができる。

治療用組成物の剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口的に投与する剤型、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の非経口的に投与する剤型等が挙げられる。

治療用組成物中の炎症性疾患の治療剤の含有量は、固形分換算で、例えば０．０１〜１０質量％であってもよく、例えば０．０１〜５質量％であってもよく、例えば０．１〜２質量％であってもよい。

炎症性疾患の治療剤又は炎症性疾患の治療用組成物の投与方法は特に制限されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。

炎症性疾患の治療剤又は炎症性疾患の治療用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（固形分換算した炎症性疾患の治療剤）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．０１〜５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり０．０１〜１００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば１日あたり０．０１〜５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。

［炎症性疾患の治療剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下又は非存在下で、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量又はＭｉｎｃｌｅと固相上にコートされたコレステロールとの結合量を測定する工程と、被検物質の存在下における前記結合量が、被検物質の非存在下における前記結合量よりも低下していた場合に、前記被検物質は炎症性疾患の治療剤であると判定する工程と、を備える、炎症性疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供する。

（Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量又はＭｉｎｃｌｅと固相上にコートされたコレステロールとの結合量を測定する工程）
実施例において後述するように、Ｍｉｎｃｌｅは、コレステロール結晶又は固相上にコートされたコレステロールと結合することによりシグナル伝達を行う。そこで、本工程では、被検物質の存在下又は非存在下で、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量又はＭｉｎｃｌｅと固相上にコートされたコレステロールとの結合量を測定する。被検物質としては、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。

固相としては、例えば、マイクロウェルプレート、プラスチックチューブ、ガラス板、ビーズ、膜等が挙げられる。固相上へのコレステロールのコートは、例えば、コレステロールを２−プロパノール等の有機溶媒に溶解した溶液を固相に接触させた後、溶媒を除去すること等により行うことができる。溶媒の除去は、例えば、溶媒を蒸発させること等により行うことができる。

Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量は、例えば、実施例において後述するＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイ等により測定することができる。あるいは、例えばＭｉｎｃｌｅタンパク質をビアコア等の生物物理学的相互作用解析装置のセンサーチップに固定化し、被検物質の存在下又は非存在下でコレステロール結晶を接触させて解析することにより、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量を測定してもよい。ここで、Ｍｉｎｃｌｅは、例えば実施例において後述する、Ｍｉｎｃｌｅとイムノグロブリン（Ｉｇ）との融合タンパク質（ｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇ）の形態であってもよい。あるいは、Ｍｉｎｃｌｅは、ＣＲＡＣ領域のアミノ酸配列のみからなるペプチドであってもよく、ＣＲＡＣ領域のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、ＣＲＡＣ領域のアミノ酸配列を含む部分タンパク質であってもよい。

また、Ｍｉｎｃｌｅと固相上にコートされたコレステロールとの結合量は、例えば、マイクロウェルプレート等の固相にコレステロールをコートした後、被検物質の存在下又は非存在下でＭｉｎｃｌｅを反応させ、Ｍｉｎｃｌｅの結合量を測定することにより測定することができる。Ｍｉｎｃｌｅの結合量は、例えば、抗Ｍｉｎｃｌｅ抗体等を用いて測定することができる。あるいは、例えば、上述した生物物理学的相互作用解析装置のセンサーチップにコレステロールを固定化し、被検物質の存在下又は非存在下でＭｉｎｃｌｅを接触させて解析することにより、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量を測定してもよい。上述したように、Ｍｉｎｃｌｅは、融合タンパク質の形態であってもよく、ペプチド又は部分タンパク質の形態であってもよい。

（判定する工程）
本工程において、被検物質が炎症性疾患の治療剤であるか否かを判定する。被検物質の存在下において測定された、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量又はＭｉｎｃｌｅと固相上にコートされたコレステロールとの結合量が、被検物質の非存在下における前記結合量よりも低下していた場合には、被検物質は炎症性疾患の治療剤であると判定することができる。

［炎症性疾患モデル非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、コレステロール結晶への結合性を有するＭｉｎｃｌｅを発現する、炎症性疾患モデル非ヒト動物を提供する。

実施例において後述するように、げっ歯類のＭｉｎｃｌｅは、コレステロール結晶への結合性を有していない。これは、げっ歯類のＭｉｎｃｌｅがＣＲＡＣモチーフを有していないためであると考えられる。マウスＭｉｎｃｌｅのアミノ酸配列を配列番号３に示し、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。

したがって、野生型のＭｉｎｃｌｅ遺伝子を有する、マウス、ラット等の非ヒト動物を用いて、コレステロール結晶とＭｉｎｃｌｅとの結合に基づく炎症応答を解析することは困難である。これに対し、本実施形態の炎症性疾患モデル非ヒト動物によれば、コレステロール結晶により誘導される生理的又は病理学的な応答をより詳細に解析することができる。

コレステロール結晶への結合性を有するＭｉｎｃｌｅは、ヒトＭｉｎｃｌｅであってもよい。あるいは、野生型のＭｉｎｃｌｅにＣＲＡＣモチーフを導入した組換えＭｉｎｃｌｅであってもよい。

本実施形態の非ヒト動物は、例えば、ヒトＭｉｎｃｌｅトランスジェニックマウスであってもよい。この場合、ヒトＭｉｎｃｌｅトランスジェニックマウスは、内在性のマウスＭｉｎｃｌｅ遺伝子が破壊されていることが好ましい。

あるいは、本実施形態の非ヒト動物は、相同組換え等により、内在性のマウスＭｉｎｃｌｅ遺伝子をヒトＭｉｎｃｌｅ遺伝子と置換した遺伝子改変マウス等であってもよい。あるいは、相同組換え等により、内在性のマウスＭｉｎｃｌｅ遺伝子にＣＲＡＣモチーフを導入した遺伝子改変マウス等であってもよい。非ヒト動物の遺伝子改変は、ＥＳ細胞を用いた方法、ゲノム編集技術を用いた方法等により行うことができる。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、Ｍｉｎｃｌｅの発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質又はコレステロール結晶に対する特異的結合物質の有効量を治療を必要とする患者に投与する工程を備える、炎症性疾患の治療方法を提供する。

１実施形態において、本発明は、炎症性疾患の治療のための、Ｍｉｎｃｌｅの発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質又はコレステロール結晶に対する特異的結合物質を提供する。

１実施形態において、本発明は、炎症性疾患の治療剤を製造するための、Ｍｉｎｃｌｅの発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質又はコレステロール結晶に対する特異的結合物質の使用を提供する。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［材料及び方法］
（試薬）
コレステロール（カタログ番号「Ｃ７５２０９」）、コルチゾン（カタログ番号「Ｃ２７５５」）、プロゲステロン（カタログ番号「Ｐ８７８３」）、エストラジオール（カタログ番号「Ｅ８８７５」）、テストステロン（カタログ番号「Ｔ１５００」）、アルドステロン（カタログ番号「Ａ９４７７」）、エルゴステロール（カタログ番号「Ｅ５６１０」）、トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ、カタログ番号「Ｔ３０３４」）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ、カタログ番号「Ｌ４５１６」）はシグマ−アルドリッチ社から購入した。

ウシ肝臓からの全脂質抽出物（カタログ番号「１８１１０４Ｃ」）、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（カタログ番号「７０００８７Ｐ」）、コレステロールエステル１４：０（カタログ番号「１１０８５９Ｐ」）、１６：０（カタログ番号「１１０８６２Ｐ」）、１８：０（カタログ番号「１１０８６６Ｐ」）、２０：０（カタログ番号「１１０８７０Ｐ」）、２２：０（カタログ番号「１１０８７５Ｐ」）、シトステロール（カタログ番号「７０００９５Ｐ」）、デスモステロール（カタログ番号「７０００６０Ｐ」）、コレスタン酸（カタログ番号「７０００７０Ｐ」）は、アバンティ社から購入した。

脂肪酸ライブラリー（商品名「ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（商標）ＦａｔｔｙＡｃｉｄｌｉｂｒａｒｙ」、型番「ＢＭＬ−２８０３−０１００」）は、エンゾライフサイエンス社から購入した。１−（トリメチルシリル）イミダゾールは、東京化成工業株式会社から購入した。尿酸一ナトリウム結晶はインビボジェン社から購入した。

コレステロール結晶は、コレステロールを９５％エタノールに溶解し、６０℃に加熱し、室温で放置することにより調製した。コレステロール結晶はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した。

（細胞）
２Ｂ４−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞（以下、「ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞」という場合がある。）は次のようにして作製した。まず、３つのタンデムに連結したＮＦＡＴ結合部位をＧＦＰのｃＤＮＡに結合させることによりＮＦＡＴ−ＧＦＰコンストラクトを作製した。続いて、Ｔ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４にＮＦＡＴ−ＧＦＰコンストラクトを遺伝子導入した。続いて、得られた細胞を抗ＴＣＲβ抗体で刺激し、ＧＦＰ陽性細胞をセルソーターで回収した。回収した細胞をクローニングし、代表的なクローン細胞を２Ｂ４−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞として実験に用いた。ＦｃＲγと結合した受容体を用いた場合には、ＦｃＲγのみを発現したレポーター細胞を対照として使用した。

ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞はインビボジェン社より購入し、レトロウイルスベクター（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ８）を用いた遺伝子導入によりヒトＭｉｎｃｌｅ（以下、「ｈＭｉｎｃｌｅ」という場合がある。）を遺伝子導入した。

ヒト単球由来樹状細胞の調製には、健康なドナーの末梢血からリンパ球分離液（ｄ＝１．０７７、ナカライテスク社）を使用した密度勾配遠心分離によりヒト末梢血単核球細胞を分離して使用した。ヒトＣＤ１４陽性単核球は、抗ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）を用いてヒト末梢血単核球細胞から精製した。樹状細胞は、ＣＤ１４陽性単核球を、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、１０ｎｇ／ｍＬヒトＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−４を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養することにより調製した。

細胞の刺激は、脂質リガンドをクロロホルム：メタノール（以下、「Ｃ：Ｍ」という場合がある。）に溶解し、２−プロパノールで希釈し、プレートにコートされた形で使用した。

（親油性画分の調製）
ウシ肝臓をＣ：Ｍ（体積比２：１）で処理し、可溶性抽出物を高性能薄層クロマトグラフイー（ＨＰＴＬＣ）で更に分画した。各フラクションを薄層クロマトグラフィープレートから回収してＣ：Ｍに溶解し、２−プロパノールで希釈して細胞の刺激に用いた。

（ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイ）
２−プロパノールで希釈した各脂質を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２０μＬずつ添加し、溶媒を蒸発させた。続いて、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、抗ヒトＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体１３Ｄ１０−Ｈ１１（ラット、ＩｇＧ１、κ）の存在下又は非存在下、コレステロール結晶又はプレートにコートされた形態の様々な脂質で１８〜２４時間刺激した。アイソタイプ適合コントロールモノクローナル抗体（クローンＲ３−３４）はＢＤバイオサイエンス社から購入した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰのレポーター活性は、フローサイトメトリーにより測定した。

（炎症性サイトカイン産生量の測定）
マウスＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）及びヒトＩＬ−１βの濃度はＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定した。

（コレステロールの同定）
フラクションＮｏ．７−サブフラクションＮｏ．１５（以下、「フラクションＮｏ．７−１５」という場合がある。）を順相ＨＰＬＣ（カラム：コスモシル５ＳＬＩＩ；移動相：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール（９９／１）；検出：λ_２１０）に供し、ピークを、後に続く質量分析（型式「ｍｉｃｒＯＴＯＦＩＩ」、ブルカー社）の結果に基づき、コレステロールを示すものであると同定した。

フラクションＮｏ．７−１５中のコレステロールは、保持時間（Ｒｔ）＝８．９５分、ｍ／ｚ＝４０９．３３１８［Ｍ＋Ｎａ］^＋、Ｃ_２７Ｈ_４６ＮａＯに対して計算、Δミリマスユニット（ｍｍｕ）＝１２．３であった。

標準的なコレステロールは、保持時間（Ｒｔ）＝８．９２分、ｍ／ｚ＝４０９．３３９４［Ｍ＋Ｎａ］^＋、Δミリマスユニット（ｍｍｕ）＝４．７であった。

トリメチルシリルステロールのガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）は、ＧＣ−ＭＳ装置（型式「ＱＰ−２０１０」、島津製作所）を用いて、電子イオン化モード、イオン化エネルギー７０ｅＶで行った。

ＧＣ−ＭＳ装置に、ＩＮＥＲＴＣＡＰ−５ＭＳ／ＳＩＬキャピラリーカラム（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、ジーエルサイエンス社）を装着し、キャリアガスとしてヘリウムを０．６６ｍＬ／分の流量で使用した。カラム温度は最初の２分間２５０℃に維持し、続いて５．０℃／分の割合で次第に２８０℃に上昇し、２８０℃で２０分間維持した。インジェクター及びインターフェイスは、それぞれ３００℃及び２５０℃にセットした。ガスクロマトグラフはスプリットレスモードで操作した。マススペクトルはｍ／ｚ＝４０〜６００の範囲で測定した。スキャン間隔は１．０秒であり、スレッシュホールドは１０００とした。ソルベントカットは２分に設定した。

ステロールサンプルは１−（トリメチルシリル）イミダゾール（ＴＭＳ）／ピリジン（１／１、０．１ｍＬ）と共に加熱して６０℃で１時間反応させ、ステロールのＴＭＳエステルを調製した。インジェクション溶液（１ｍＬ）は、ｎ−ヘキサン中のＴＭＳステロールであった。

（Ｉｇ融合タンパク質）
ヒトＭｉｎｃｌｅのＩｇ融合タンパク質（ｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇ）は、ヒトＭｉｎｃｌｅの細胞外ドメイン（アミノ酸４６−２１９）と、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ｈＩｇＧ１−Ｆｃ）との融合タンパク質を作製することにより調製した。

（インビトロＭｉｎｃｌｅ結合アッセイ）
２μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｇ）及びｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇを結合バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ_２、２ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．０）を０．１ｎｍｏｌ／０．３２ｃｍ^２の予めコートされたコレステロールとインキュベートした。結合したタンパク質を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ｈＩｇＧ抗体及び後に続く発色基質との反応により検出した。ペルオキシダーゼ活性は分光光度計により測定した。

（ＤＮＡマイクロアレイ）
ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社）を使用して細胞から全ＲＮＡを分離した。ＤＮＡマイクロアレイ解析は、ＨｕｍａｎＧｅｎｅ１．０ＳＴａｒｒａｙ（アフィメトリクス社）を用いて行った。

（定量的ＰＣＲ）
Ｓｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡＩＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク社）を用いて細胞から全ＲＮＡを分離した。ＲＮＡ試料１μｇを逆転写及びＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡社）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤＳＹＢＲｑＰＣＲｍｉｘ（東洋紡社）及びＡＢＩＰＲＩＳＭ７０００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。いくつかの標的遺伝子の遺伝子シンボルと、当該標的遺伝子増幅のためのプライマーの塩基配列の配列番号を表１に示す。

（分子シミュレーション）
コレステロール及びｈＭｉｎｃｌｅの結合の解析は、クエン酸と共結晶化したｈＭｉｎｃｌｅ（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）ＩＤ：３ＷＨ２）をテンプレートに用いて、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）ソフトウエア（菱化システム社）により行った。

（統計解析）
全ての統計解析は、独立両側スチューデントt検定により行った。

＜Ｉ．Ｍｉｎｃｌｅの内在性リガンドはコレステロールである＞
［実験例１］
発明者らは、まず、ｈＭｉｎｃｌｅが内在性の脂質を認識するか否かを検討した。具体的には、ウシ肝臓からの脂質抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより２０のフラクションに分画し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイを用いて各フラクションを評価した。

ウシ肝臓からの脂質抽出物を、２ｍＬのクロロホルム：メタノール（Ｃ：Ｍ＝２：１，ｖ／ｖ）で溶出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより各１００μＬずつ２０個のフラクションに分画した。各フラクションをプレートにコートし、ＦｃＲγのみ、又はＦｃＲγと共にｈＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導はフローサイトメトリーにより解析した。

図１（ａ）はＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。その結果、図１（ａ）に示すように、フラクションＮｏ．７に強い活性のピークが認められた。

また、上記の各フラクションをＨＰＴＬＣで解析し、クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４，ｖ／ｖ／ｖ）で展開した。ＨＰＴＬＣプレートは、酢酸銅−リン酸で染色した。

図１（ｂ）は、ＨＰＴＬＣ解析の結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。図１（ｂ）中、白矢頭及び黒矢頭は、それぞれ、原点及び溶媒の先端を示す。また、Ｔは全脂質抽出物を示す。

［実験例２］
続いて、発明者らは、実験例１のフラクションＮｏ．７を更に分画して解析した。具体的には、フラクションＮｏ．７をＨＰＴＬＣ（Ｃ：Ｍ＝８：２，ｖ／ｖ）で解析し、２０のサブフラクションに分画した。ＨＰＴＬＣプレートは、酢酸銅−リン酸で染色した。

図２（ａ）は、ＨＰＴＬＣ解析の結果を示す写真である。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。図２（ａ）中、白矢頭及び黒矢頭は、それぞれ、原点及び溶媒の先端を示す。

続いて、各サブフラクションをプレートにコートし、ＦｃＲγのみ、又はＦｃＲγと共にｈＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を１８時間刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導はフローサイトメトリーにより解析した。

図２（ｂ）は、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。その結果、ｈＭｉｎｃｌｅを発現したレポーター細胞は、フラクションＮｏ．７−サブフラクションＮｏ．１５（以下、「フラクションＮｏ．７−１５」という場合がある。）に特異的に反応した。

図２（ａ）に示すように、フラクションＮｏ．７−１５は、比較的高いＲ_ｆ値を示した。このことから、ｈＭｉｎｃｌｅは極性の低い脂質に結合すると考えられた。

［実験例３］
続いて、実験例２のフラクションＮｏ．７−１５をＨＰＬＣ及び質量分析によりさらに解析した。図３（ａ）は、フラクションＮｏ．７−１５のＨＰＬＣクロマトグラムであり、図３（ｂ）は、コレステロールのＨＰＬＣクロマトグラムである。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。図３中、「Ｒｔ」は保持時間を示す。

また、図４（ａ）は、フラクションＮｏ．７−１５のポジティブモード、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）スペクトルの結果であり、図４（ｂ）は、コレステロールのＴＯＦ−ＭＳスペクトルの結果である。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。図４中、「Ｉｎｔｅｎｓ」は強度を示す。

その結果、図３（ａ）、図３（ｂ）、図４（ａ）、図４（ｂ）に示すように、フラクションＮｏ．７−１５の主要な成分はコレステロールであることが明らかとなった。

［実験例４］
続いて、ＴＭＳを用いたエステル化後のＧＣ−ＭＳ解析によって、実験例２のフラクションＮｏ．７−１５を更に解析した。図５（ａ）〜（ｄ）は、フラクションＮｏ．７−１５及びコレステロールをＴＭＳでエステル化した後にＧＣ−ＭＳ解析した結果を示すグラフである。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。

図５（ａ）は、フラクションＮｏ．７−１５のＴＭＳエステルのトータルイオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムである。図５（ｂ）は、標準コレステロールＴＭＳエステルのＴＩＣクロマトグラムである。図５（ｃ）は、フラクションＮｏ．７−１５のＴＭＳエステルの電子イオン化質量分析スペクトルである。図５（ｄ）は、標準コレステロールＴＭＳエステルの電子イオン化質量分析スペクトルである。

標準コレステロールＴＭＳエステルの結果は、Ｒｔ＝１４．６、ｍ／ｚ＝４５８（Ｍ^＋），４４３（Ｍ−１５），３６８，３２９，１２９（ベースピーク）であった。また、肝臓由来のコレステロールのＴＭＳエステルの結果は、Ｒｔ＝１４．６、ｍ／ｚ＝４５８（Ｍ^＋），４４３（Ｍ−１５），３６８，３２９，１２９（ベースピーク）であった。

ＴＭＳを用いたエステル化後のＧＣ−ＭＳ解析の結果からも、フラクションＮｏ．７−１５の主要な成分がコレステロールであることが確認された。

［実験例５］
続いて、ｈＭｉｎｃｌｅ及びＦｃＲγを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、プレートにコートされたコレステロール又はコレステロール結晶で１８時間刺激し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーにより解析した。対照として、ＦｃＲγのみを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を用いた。

図６（ａ）及び（ｂ）は、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。

その結果、図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、プレートにコートされた精製コレステロール及び精製コレステロール結晶は、ｈＭｉｎｃｌｅを発現したレポーター細胞を活性化することが明らかとなった。

［実験例６］
続いて、発明者らは、可溶性のｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて、ｈＭｉｎｃｌｅが、コートされたコレステロールに結合するか否かを検討した。

具体的には、ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｇ）又はｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇをプレートにコートされたコレステロールと共にインキュベートした。続いて、プレートに結合したタンパク質を、抗ｈＩｇＧ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び後に続く発色基質の添加により検出した。ペルオキシダーゼ活性は分光光度計で測定した。

図７は、結果を示すグラフである。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。図７中、「なし」はタンパク質を添加していないことを示し、「Ｉｇ」はｈＩｇＧ１−Ｆｃを添加したことを示し、「ｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇ」はｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇを添加したことを示す。その結果、ｈＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇはプレートにコートされたコレステロールに結合することが明らかとなった。

以上の結果から、ｈＭｉｎｃｌｅは、コレステロール結晶と結合することが明らかとなった。

＜ＩＩ．ｈＭｉｎｃｌｅはコレステロールに特異的に結合する＞
［実験例７］
発明者らは、ｈＭｉｎｃｌｅが他の脂質を認識するか否かを検討した。具体的には、ＦｃＲγのみ、又はＦｃＲγと共にｈＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、プレートにコートされた形態の１０ｎｍｏｌ／ウェルの様々な脂肪酸（商品名「ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（商標）ＦａｔｔｙＡｃｉｄｌｉｂｒａｒｙ」、型番「ＢＭＬ−２８０３−０１００」、エンゾライフサイエンス社）及びプレートにコートされたコレステロールで１８時間刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導はフローサイトメトリーにより解析した。

図８は、結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。その結果、図８に示す６８種類の脂質のいずれもＮＦＡＴ活性化を誘導することができないことが明らかとなった。

［実験例８］
図９は、コレステロール、ステロイドホルモン及びステロールの化学構造を示す図である。図９に示すように、天然のステロイドホルモンはコレステロールから合成され、それらのコア構造はコレステロールのそれと類似している。そこで、発明者らは、ｈＭｉｎｃｌｅ及びマウスＭｉｎｃｌｅ（以下、「ｍＭｉｎｃｌｅ」という場合がある。）が、プレートにコートされたステロイドホルモンを認識するか否かを検討した。

具体的には、コレステロール、コルチゾン、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、アルドステロン及びＤＨＥＡを、プレートに１μｇ／ウェルコートし、ＦｃＲγのみ、又はＦｃＲγと共にｈＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を１８時間刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導はフローサイトメトリーにより解析した。

図１０は、結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、図１０に示すように、コレステロールのみがｈＭｉｎｃｌｅと反応し、コルチゾン、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、アルドステロン及びＤＨＥＡはｈＭｉｎｃｌｅ及びｍＭｉｎｃｌｅとの反応性を示さないことが明らかとなった。また、コレステロールは、ｍＭｉｎｃｌｅと反応性を示さないことが明らかとなった。

［実験例９］
摂取されたコレステロールの殆どはエステル化された形態で存在している。そこで、発明者らは、ｈＭｉｎｃｌｅとコレステロールエステルとの反応性を検討した。プレートにコートされた、様々なコレステロールエステル（５μｇ／ウェル）で、ＦｃＲγのみ、又はＦｃＲγと共にｈＭｉｎｃｌｅ若しくはｍＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を１８時間刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導はフローサイトメトリーにより解析した。各コレステロールエステルは、脂肪酸の長さが異なっていた（１４：０、１６：０、１８：０、２０：０及び２２：０）。

図１１は、結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、図１１に示すように、様々な長さの飽和脂肪酸とのコレステロールエステルは、ｈＭｉｎｃｌｅ及びｍＭｉｎｃｌｅとの反応性を示さないことが明らかとなった。

［実験例１０］
続いて、発明者らは、ｈＭｉｎｃｌｅとステロールとの反応性を検討した。具体的には、ＦｃＲγのみ、又はＦｃＲγと共にｈＭｉｎｃｌｅ若しくはｍＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、プレートにコートされた、コレステロール、シトステロール、デスモステロール、エルゴステロール及びコレスタン酸で１８時間刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導はフローサイトメトリーにより解析した。

図１２は、結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、図１２に示すように、真菌由来のステロールであるエルゴステロールは、ｈＭｉｎｃｌｅ及びｍＭｉｎｃｌｅとの反応性を示さなかったが、植物由来のステロールであるシトステロール及びコレステロール合成における中間体であるデスモステロールは、ｈＭｉｎｃｌｅとの反応性を示すことが明らかとなった。

以上の結果から、ｈＭｉｎｃｌｅは、様々なステロイドのうち、コレステロール及びコレステロールに密接に関連するステロールに特異的に結合することが明らかとなった。また、この結果から、ｈＭｉｎｃｌｅによる認識にＣ３位の水酸基及びＣ１７位のアルキル鎖が必要であることが示された。

＜ＩＩＩ．Ｃ型レクチン受容体のコレステロール結晶に対する特異性の検討＞
［実験例１１］
Ｍｉｎｃｌｅ及びｍａｃｒｏｐｈａｇｅＣ−ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎ（ＭＣＬ、「Ｃｌｅｃ４ｄ」又は「Ｃｌｅｃｓｆ８」とも呼ばれる。）は、トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）の脂質部分への結合に寄与する疎水性アミノ酸の領域を有しているが、他のＣ型レクチン受容体はそのような領域を有していない。

そこで、発明者らは、ＭＣＬがコレステロール結晶と結合するか否かを検討した。具体的には、ＦｃＲγと共にｍＭｉｎｃｌｅ、ｈＭｉｎｃｌｅ、マウスＭＣＬ（ｍＭＣＬ）又はヒトＭＣＬ（ｈＭＣＬ）を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞をコレステロール結晶で刺激し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーにより解析した。

図１３は、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、ＭＣＬはコレステロール結晶と結合しないことが明らかになった。

［実験例１２］
続いて、発明者らは、Ｍｉｎｃｌｅに密接に関連したＣ型レクチン受容体であるＤｅｃｔｉｎ−１及びＤｅｔｅｃｔｉｎ−２がコレステロール結晶と結合するか否かを検討した。具体的には、ＦｃＲγと共に、ヒトＤｅｃｔｉｎ−１（ｈＤｅｃｔｉｎ−１）、マウスＤｅｃｔｉｎ−１（ｍＤｅｃｔｉｎ−１）、ヒトＤｅｃｔｉｎ−２（ｈＤｅｃｔｉｎ−２）又はマウスＤｅｃｔｉｎ−２（ｍＤｅｃｔｉｎ−２）を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞をコレステロール結晶で１８時間刺激し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーにより解析した。

図１４は、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、Ｄｅｃｔｉｎ−１及びＤｅｔｅｃｔｉｎ−２はコレステロール結晶と結合しないことが明らかになった。

［実験例１３］
続いて、発明者らは、異なる種に由来するＭｉｎｃｌｅの、コレステロール結晶に対する結合能を検討した。具体的には、ＦｃＲγと共に、ヒト、マウス又はラットＭｉｎｃｌｅを発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、コレステロール結晶で１８時間刺激し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーにより解析した。

図１５は、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、ヒトＭｉｎｃｌｅはコレステロール結晶に結合したが、マウスＭｉｎｃｌｅ及びラットＭｉｎｃｌｅはコレステロール結晶に結合しないことが明らかとなった。

以上の結果から、哺乳動物が発現するＩＴＡＭ共役型のＣ型レクチン受容体のうち、ヒトＭｉｎｃｌｅのみがコレステロール結晶と結合できることが明らかになった。

＜ＩＶ．ｈＭｉｎｃｌｅはげっ歯類由来マクロファージにコレステロール結晶に対する感受性を付与した＞
［実験例１４］
続いて、発明者らは、骨髄細胞におけるｈＭｉｎｃｌｅとコレステロールとの相互作用により引き起こされる細胞応答を同定するために、げっ歯類由来のマクロファージであるＲＡＷ細胞を用いて炎症性のサイトカインの産生を検討した。というのは、炎症性のサイトカインの産生は、インフラマソームの活性化と独立しているためである。

具体的には、ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞又はｈＭｉｎｃｌｅを発現したＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞を、コレステロール結晶、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＴＤＭ（１００ｎｇ／ウェル）で刺激した。２４時間後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法により上清中のＴＮＦ及びＭＩＰ−２の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。

図１６（ａ）〜（ｄ）は、結果を示すグラフである。図１６（ａ）及び（ｂ）はＴＮＦの濃度を示し、図１６（ｃ）及び（ｄ）はＭＩＰ−２の濃度を示す。図１６中、「なし」はＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞の結果を示し、「Ｍｏｃｋ」は空のベクターを導入したＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞の結果を示し、「ｈＭｉｎｃｌｅ」はｈＭｉｎｃｌｅを発現したＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞の結果を示す。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。

その結果、ｍＭｉｎｃｌｅがコレステロールに結合しなかったという事実と一致して、ｍＭｉｎｃｌｅを発現し機能的なＦｃＲγシグナル経路を有するＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞は、コレステロール結晶によって活性化されなかった。一方、図１６（ａ）〜（ｄ）に示すように、ｈＭｉｎｃｌｅを遺伝子導入したＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞は、コレステロール結晶に応答し、ＴＮＦ及びＭＩＰ−２を産生することが明らかとなった。

［実験例１５］
続いて、ｈＭｉｎｃｌｅを発現したＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞を、０、１、３又は１０μｇ／ｍＬの抗ｈＭｉｎｃｌｅ抗体又はアイソタイプコントロール抗体（Ｒ３−３４）の存在下、コレステロール結晶（１００μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＴＤＭ（１００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。続いて、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法により上清中のＴＮＦ及びＭＩＰ−２の濃度を測定した。

図１７（ａ）〜（ｆ）は、結果を示すグラフである。図１７（ａ）〜（ｃ）はＴＮＦの濃度を示し、図１７（ｄ）〜（ｆ）はＭＩＰ−２の濃度を示す。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、図１７（ａ）〜（ｆ）に示すように、ＴＮＦ及びＭＩＰ−２の産生は、抗ｈＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体の存在によって減少することが明らかとなった。

以上の結果は、げっ歯類の骨髄細胞でｈＭｉｎｃｌｅを発現させることにより、コレステロール結晶に対する感受性が付与され、炎症性の応答につながることを示す。

＜Ｖ．コレステロール結晶は、ｈＭｉｎｃｌｅを通して炎症性遺伝子の転写を誘導した＞
［実験例１６］
発明者らは、ヒト樹状細胞のコレステロール応答における遺伝子発現を検討した。具体的には、内在性のｈＭｉｎｃｌｅを発現するヒト単球由来樹状細胞を、プレートにコートされたコレステロール又はコレステロール結晶で８時間刺激し、マイクロアレイ解析により遺伝子発現を解析した。

図１８はマイクロアレイ解析の結果を示す図である。図１８中、「結晶」はコレステロール結晶で刺激した結果であることを示し、「コート」はプレートにコートされたコレステロールで刺激した結果であることを示す。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。図１８に示す各遺伝子の名称を下記表２に示す。

その結果、コートされたコレステロール及びコレステロール結晶による刺激により、Ｃ型レクチン受容体、ケモカイン及びサイトカインを含む、類似の炎症性遺伝子のセットが顕著に発現上昇することが明らかになった。

コレステロール結晶は、細胞内小器官の傷害によりインフラマソームを活性化することが知られている。しかしながら、インフラマソームの活性化は、表１に示す遺伝子の発現上昇には全く寄与しない。

［実験例１７］
続いて、発明者らは、ヒト単球由来樹状細胞を、抗ヒトｈＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体の存在下又は非存在下、コレステロール結晶で８時間刺激し、定量的ＰＣＲにより遺伝子発現を解析した。

図１９（ａ）〜（ｊ）は定量的ＰＣＲの結果を示すグラフである。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、図１９に示すように、確かに、ＣＬＥＣ５Ａ、ＣＣＬ４、ＣＳＦ１、ＡＲＥＧ、ＤＣＳＴＡＭＰ等の遺伝子の発現誘導は、抗ヒトｈＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体の存在により減少することが明らかとなった。

以上の結果は、コレステロール結晶がヒト樹状細胞を活性化し、ｈＭｉｎｃｌｅを介して炎症性分子の発現を誘導することを示す。

［実験例１８］
コレステロール結晶は、インフラマソームの活性化を通じて成熟型ＩＬ−１βの産生を誘導することが報告されている。そこで、発明者らは、この過程におけるｈＭｉｎｃｌｅの役割を検討した。

具体的には、ヒト単球由来樹状細胞を、抗ヒトｈＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体の存在下又は非存在下、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）のみ、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びコレステロール結晶（３００μｇ／ｍＬ）、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）及び尿酸一ナトリウム結晶（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｕｒａｔｅｃｒｙｓｔａｌｓ：ＭＳＵ）（２５０μｇ／ｍＬ）で２日間刺激した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により培養上清中のＩＬ−１βの濃度を測定した。

図２０（ａ）及び（ｂ）に結果を示す。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、図２０（ａ）に示すように、ヒト単球由来樹状細胞は、ＬＰＳ及びコレステロール結晶による刺激でＩＬ−１βを産生した。しかしながら、上記のＩＬ−１βの産生は、抗ｈＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体により顕著に抑制された。対照的に、図２０（ｂ）に示すように、抗ｈＭｉｎｃｌｅモノクローナル抗体は別のインフラマソーム活性化因子である尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）により誘導されたＩＬ−１βの産生に影響を与えなかった。なお、尿酸一ナトリウム結晶はｈＭｉｎｃｌｅには結合しない（データ示さず。）。

以上の結果は、ｈＭｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合が、成熟型のＩＬ−１βの分泌に寄与していることを示す。

＜ＶＩ．ｈＭｉｎｃｌｅは、コレステロール認識／相互作用アミノ酸コンセンサスモチーフを介してコレステロール結晶と結合する＞
［実験例１９］
いくつかのタンパク質が、コレステロール認識／相互作用アミノ酸コンセンサス（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｎｓｅｎｓｕｓ、ＣＲＡＣ）モチーフ（（Ｌ／Ｖ）Ｘ_１−５ＹＸ_１−５（Ｒ／Ｋ）、ここで、Ｌはロイシンを示し、Ｖはバリンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｙはチロシンを示し、Ｒはアルギニンを示し、Ｋはリジンを示す。）を介してコレステロールと結合することが報告されている。

そこで、発明者らは、ｈＭｉｎｃｌｅ及びｍＭｉｎｃｌｅのアミノ酸配列におけるＣＲＡＣモチーフの存在を検討した。図２１に、ｈＭｉｎｃｌｅ及びｍＭｉｎｃｌｅの炭水化物認識ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。図２１中、ＣＲＡＣモチーフを四角で囲む。その結果、図２１に示すように、ｈＭｉｎｃｌｅにはＣＲＡＣモチーフ（ＬＸＹ^１２９ＸＸＸＸＸＲ）が存在するが、ｍＭｉｎｃｌｅにはＣＲＡＣモチーフが存在しないことが明らかとなった。

［実験例２０］
続いて、発明者らは、ＣＲＡＣモチーフに変異を導入し、コレステロール結合能における変異の効果を検討した。具体的には、ｈＭｉｎｃｌｅ及び１３５番目のアルギニンをロイシンに変異させたｈＭｉｎｃｌｅ（ｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}）の細胞表面での発現を検討した。

ｈＭｉｎｃｌｅ又はｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、染色せず（破線）又は抗ｈＭｉｎｃｌｅ抗体で染色し（実線）、フローサイトメトリーにより解析した。

図２２は結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。その結果、図２２に示すように、ｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}は、通常通りに細胞表面に発現することが明らかとなった。

［実験例２１］
続いて、ｈＭｉｎｃｌｅ又はｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、０、３０、１００、３００μｇ／ｍＬのコレステロール結晶、又は０、１、１０、１００ｎｇ／ウェルのＴＤＭで１８時間刺激し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーにより解析した。

図２３は、ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーターアッセイの結果を示すグラフである。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは平均値±標準偏差を示す。「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。

その結果、ｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞は、コレステロール結晶と結合することができないことが明らかとなった。重要なことに、ｈＭｉｎｃｌｅ^{Ｒ１３５Ｌ}は、ＴＤＭとの結合能を、野生型のｈＭｉｎｃｌｅと同程度に維持していた。

これらの結果は、ｈＭｉｎｃｌｅのＣＲＡＣモチーフがコレステロールとの結合能を決定していることを示す。

＜ＶＩＩ．コレステロール結晶によるｈＭｉｎｃｌｅを介した刺激＞
図２４は、上記各実験例の結果から明らかとなった、コレステロール結晶によるｈＭｉｎｃｌｅを介した刺激を説明する模式図である。図２４（ａ）に示すように、遊離コレステロール又は膜に埋まった形態のコレステロールは、Ｍｉｎｃｌｅにより認識されない。しかしながら、図２４（ｂ）に示すように、コレステロール結晶やコートされたコレステロール等の多量体化した形態のコレステロールは、ｈＭｉｎｃｌｅを介して骨髄性細胞を活性化することができる。

上述したように、げっ歯類のＭｉｎｃｌｅはコレステロールと結合しないことが明らかとなった。そこで、例えばｈＭｉｎｃｌｅをノックインしたマウス、ｍＭｉｎｃｌｅ遺伝子にＣＲＡＣモチーフを導入した変異マウス等の非ヒト動物モデルを樹立することにより、コレステロール結晶により誘導される生理的又は病理学的な応答をより詳細に解析することが可能になる。

Claims

Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＣ−ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎ（Ｍｉｎｃｌｅ）の発現阻害物質、Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質又はコレステロール結晶に対する特異的結合物質を有効成分とし、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合を阻害する、炎症性疾患の治療剤。
Ｍｉｎｃｌｅに対する特異的結合物質を有効成分とし、当該特異的結合物質が、ＭｉｎｃｌｅのＣＲＡＣモチーフに結合するものである、請求項１に記載の炎症性疾患の治療剤。
請求項１又は２に記載の炎症性疾患の治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、炎症性疾患の治療用組成物。
被検物質の存在下又は非存在下で、Ｍｉｎｃｌｅとコレステロール結晶との結合量又はＭｉｎｃｌｅと固相上にコートされたコレステロールとの結合量を測定する工程と、
被検物質の存在下における前記結合量が、被検物質の非存在下における前記結合量よりも低下していた場合に、前記被検物質は炎症性疾患の治療剤であると判定する工程と、
を備える、炎症性疾患の治療剤のスクリーニング方法。
コレステロール結晶への結合性を有するＭｉｎｃｌｅを発現する、炎症性疾患モデル非ヒト動物。