JP6016788B2 - DOCK−Aサブファミリー分子によるRac活性化を制御する低分子化合物及びその用途 - Google Patents
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Description
(I-1).一般式(1)で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするRac活性化阻害剤:
(a)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(b)4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(c)4‐[(2‐クロロフェニル)メチリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(d)4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(e)4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(f)4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(g)4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(h)4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(i)4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(j)4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(k)4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(l)4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(m)4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(n)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(o)4-(3-フェニルアリリデン)-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(p)(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
(II-1)(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物。(II-2)上記Rac活性化が、DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化である、(II-1)に記載する医薬組成物。
(III-1)一般式(1):
で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を、Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態に罹患しているか、その罹患する可能性のある患者に投与する工程を有する、
Rac活性化に関連する疾患または病態を予防または治療する方法。
(a)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(b)4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(c)4‐[(2‐クロロフェニル)メチリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(d)4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(e)4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(f)4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(g)4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(h)4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(i)4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(j)4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(k)4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(l)4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(m)4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(n)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(o)4-(3-フェニルアリリデン)-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(p)(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
(IV-1)Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態に罹患しているか、その罹患する可能性のある患者について、当該疾患または病態を予防または治療するために使用される、一般式(1):
で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
(a)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(b)4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(c)4‐[(2‐クロロフェニル)メチリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(d)4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(e)4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(f)4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(g)4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(h)4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(i)4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(j)4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(k)4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(l)4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(m)4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(n)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(o)4-(3-フェニルアリリデン)-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(p)(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
(V-1)Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物の製造のための、一般式(1):
で表されるピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩の使用。
(a)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(b)4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(c)4‐[(2‐クロロフェニル)メチリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(d)4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(e)4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
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(h)4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(i)4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(j)4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(k)4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(l)4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(m)4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
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(o)4-(3-フェニルアリリデン)-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(p)(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。
本発明が対象とするRac活性化阻害剤、並びにRac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物(以下、これを単に「医薬組成物」ともいう)は、いずれもDOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化を阻害する作用を有する下記一般式(1)で表されるピラゾリジンジオン誘導体またその薬学的に許容される塩(以下、これらを総称して「本発明の化合物」という)を有効成分とする:
さらに本発明の化合物(1)には幾何異性体が含まれ、具体的にはシス異性体、トランス異性体、またはこれらの混合物の状態であってもよいが、好ましくはシス異性体である。幾何異性体と互変異性体を考慮すると本発明の化合物(1)は、下記の状態で存在していてもよい。
さらに本発明の化合物(1)には立体異性体も含まれ、具体的には光学的に純粋なエナンチオマー、エナンチオマー混合物、ラセミ体、エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、エピマーの状態であってもよい。
好適な反応条件は、特に制限されないが、ピラゾリジンジオン誘導体(I)と芳香族アルデヒド化合物(II)とをTHF中、触媒量のプロリンの存在下で、室温で24時間攪拌する方法を例示することができる。
ピラゾリジンジオン誘導体(I)を調製するための好適な方法としては、フェニルヒドラジン誘導体(III)とモノエチルマロニルクロリド(IV)との、THF等の適切な溶媒中Et3N存在下での縮合、又はフェニルヒドラジン誘導体(III)とジアルコキシマロネート(IV)とのエタノール又はメタノール等の適切な溶媒中、適切な塩基(例えばナトリウムエトキシドまたはナトリウムメトキシド)の存在下または非存在下での縮合を例示することができる。
より詳細には、後述する製造例において説明する方法に従って製造することができる。
上記本発明の化合物(1)は、後述する試験例で示すようにDOCK2とRacとの会合を阻害することにより、免疫反応に必要不可欠な免疫細胞におけるRacの活性化を阻害する作用(Rac活性化阻害作用)を有している。その結果、本発明の化合物(1)は、リンパ球などの免疫細胞の遊走を阻止し、不適切な免疫反応(例えば、自己免疫疾患やアレルギー疾患などの過剰な免疫反応、並びに同種移植片拒絶反応など)を抑制することが可能である。
製造例1
4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物5)の製造
Et3N(25.9ml、186mmol)を、THF(300ml)に溶解した−10℃のフェニルヒドラジン溶液(17.5ml、177mmol)に添加し、撹拌した。これに、−10℃の条件で塩化メチルマロニル(22.9ml、181mmol)を30分間以上かけて滴下し、次いで反応液を室温まで温めて撹拌した。1日後、反応液に水を入れて反応を停止し、得られた生成物をEtOAcで抽出した。次いで回収した有機相を、水及び塩水で繰り返し洗浄した。Na2SO4を用いて有機相を脱水し、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた粗生成物をCH2Cl2およびヘキサンで再結晶し、標記化合物VとV'の混合物を黄色の固形物として取得した(26.6g、収率68%、化合物V:V’=3:1混合物)。なお、化合物VとV’とは分離できなかった。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.72 (s), 7.29-7.23 (m), 6.99-6.79 (m), 6.20 (s, 1 H, major isomer), 5.99 (s, 1 H, minor isomer), 4.28 (q, J = 7 Hz, 2 H, major isomer), 4.16 (q, J = 7 Hz, 2 H, minor isomer), 3.53 (s, 2 H, minor isomer), 3.45 (s, 2 H, major isomer), 1.35 (t, J = 7 Hz, 3 H, major isomer), 1.27 (t, J = 7 Hz, 3 H, minor isomer)。
EtOH(10ml)に溶解した1Mの中のNaOH溶液を、(1)で調製した化合物VとV’の混合物(1.0g、4.5 mmol)の中に添加し、反応混合物を室温で30分間撹拌した。その後、AcOHを添加し、H2Oを添加した後、生成物をCH2Cl2で抽出した。回収した有機相を、水と塩水で繰り返し洗浄し、Na2SO4を用いて脱水した。次いで溶媒を減圧下で蒸発させて標題の化合物Iを黄色の固形物として取得した(462mg、収率58%)。
H ), 7.26 (m, 1H), 3.45 (s, 2 H)。
THF(140ml)に溶解した化合物Iの溶液(6.28g、35.6 mmol)に、3-(2-クロロフェニル)プロペナール(5.0g、30.0 mmol)(Dong, H.; Shen, M.; Redford, J. E.; Stokes, B. J.;Pumphrey, A. L.; Driver, T. G. Org. Lett., 2007, 9, 5191-5194)、およびプロリン(35mg、0.3 mmol)を添加した。その混合液を、室温で1日間撹拌した後、得られた反応混合物を減圧下で蒸発処理に供した。斯くして得られた粗生成物を、THFとヘキサンで再結晶し、赤い固形物として標題の化合物6(6.80g、収率70%、E:Z=1:1混合)を取得した。
Pd/C(10mol%、4.3mg)を、室温でEtOH(1.0ml)に溶解した化合物6(13mg、40.0μmol)の溶液に添加し、また、水素ガスを1気圧の条件で加えた。次いで溶液を45分間撹拌し、その後、反応液をセライトパットを用いてろ過し、溶媒を蒸発させた。斯くして得られた粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ(溶離剤: ヘキサン/EtOAc、1/1)に供し、淡黄色固形物として標題の化合物5(10.4mg、収率79%)を取得した。
IR (KBr) νmax 3196, 3071, 2931, 2868, 1680, 1597, 1507, 1356, 749 cm-1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ7.57 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.40(t, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.30 (d, J = 6.1 Hz, 1 H), 7.23-7.04 (m, 4 H), 3.28 (t, J = 6.1 Hz, 1 H), 2.79-2.64 (m, 2H) (2.78 (t, J = 7.8 Hz, 1.5 H), 2.66 (t, J = 7.5 Hz, 0.5 H, enol)), 2.11-2.03 (m, 2 H), 1.90-1.82 (m, 2 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3)・172.3, 166.6, 138.9, 135.3, 133.9, 130.3, 129.5, 129.4, 128.4, 127.5, 126.8, 126.0, 118.8, 46.8, 35.6, 33.1, 27.2, 25.9;
MS (ESI-MS) 329 [M+H+], 351 [M+Na+];
HRMS (ESI-MS) calcd. for C18H18ClN2O2 + [M+H+] 329.1057, found 329.1058。
(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物20)の製造
標題の化合物20は、製造例1(3)で合成した化合物6(E/Z混合、200mg、616μmol)をクロロホルムで5回洗浄することにより、赤い固形物として単離された (90mg、278μmol)。
m.p. 186-187 oC (decomposition);
IR (KBr) νmax 3160, 3064, 2845, 1677, 1616, 1499, 1378, 1300, 1165, 753 cm-1;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.31 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 7.88 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.86 (s, 1H), 7.83 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.44 (t, J = 8.0 Hz, 3 H), 7.34 (t, J = 5.4 Hz, 2 H), 7.23-7.21 (m, 1 H);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ165.2, 160.3, 156.0, 150.4, 147.2, 136.5, 135.7, 133.1, 132.0, 130.4, 129.3, 128.2, 127.3, 125.7, 124.9, 118.7;
MS (ESI-MS) 325 [M+H+], 347 [M+Na+];
HRMS (ESI-MS) calcd. for C18H13ClN2NaO2 + [M+Na+] 347.0563, found 347.0566。
4‐[(2‐クロロフェニル)メチリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン (化合物7)の製造
Aldrich社から入手した2‐クロロベンズアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って標題の化合物7を合成した。
orange solid (収率32%, E/Zmixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (d, J = 7 Hz, 1 H), 8.13 (s, 2 H), 7.75 (s, 4 H), 7.66 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.63 (t, J = 8 Hz, 2 H), 7.52-7.43 (m, 7 H), 7.22 (s, 3 H) ;
MS (ESI-MS) 321 [M+Na+]。
4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン (化合物8)の製造
既知法(Rekha, S.; Sunil K. G. Tetrahedron, 2010, 66, 2284-2292)に従って合成した(2E,4E)-5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4‐ジエナールを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物8を合成した。
orange solid (収率37%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.83 (m, 1 H), 7.72-7.64 (m, 3 H ), 7.46-7.40 (m, 3 H), 7.12-7.07 (m, 1 H);
MS (ESI-MS) 351 [M+H+], 373 [M+Na+]。
4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物9)の製造
Aldrich社から入手したシンアムアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物9を合成した。
orange solid (収率67%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.53 (d, J = 9 Hz,1 H), 8.48 (d, J = 7 Hz, 2 H), 8.31 (dd, J = 15.3, 10.4 Hz, 1 H), 8.07-8.05 (m, 2 H), 7.80 (d, J = 10 Hz, 1 H), 7.67 (dd, J = 15.0, 8 Hz, 5 H) 7.60-7.58 (m, 2 H), 7.52 (t, J = 8 Hz, 4 H), 7.46-7.43 (m, 9 H) ;
MS (ESI-MS) 291 [M+H+]。
4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物10)の製造
既知法(Lian, S. Z.; Shilei, Z.; Hexin, X.; Wei, W. Org. Lett., 2009, 11, 1627-1630)で合成した(E)-3-(2-ヒドロキシフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物10を合成した。
red solid (収率33%, E/Zmixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.5 (s, 1 H), 8.49-8.31 (m, 1 H), 7.84-7.77 (m, 5 H), 7.60-7.57 (m, 1 H), 7.49-7.46 (m, 2 H), 7.35-7.32 (m, 2H), 7.22 (s, 1 H), 6.97-6.94 (m, 2 H);MS (ESI-MS) 307 [M+H+]。
4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物11)の製造
既知法(Laihia, K.; Kolehmainen, E.; Manttari, P.; Kauppinen, R. Magn. Reson. Chem., 1993, 31, 512-515)で合成した(E)-3-(2-フルオロフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物11を合成した。
red solid (収率42%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.48 (dd, J = 16.6, 10.9 Hz, 1 H), 8.35 (dd, J = 16.6, 10.9 Hz, 2 H), 7.82-7.76 (m, 4 H), 7.66 (d, J = 7.5 Hz, 5 H), 7.60-7.55 (m, 4 H), 7.45-7.42 (m, 7 H), 7.22-7.11 (m, 8 H);
MS (ESI-MS) 331 [M+Na+]。
4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物12)の製造
既知法 (Shu-Yu, Z.; Yong-Qiang, T.; Chun-An, F.; Ming, Y.; Fu-Min, Z. Org. Lett., 2009, 50, 4178-4181)で合成した(E)-3-(2-ブロモフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物12を合成した。
red solid (収率27%, E/Zmixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.42 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 8.28 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 7.87-7.76 (m, 5 H), 7.68-7.62 (m, 5 H), 7.46-7.42 (m, 4 H), 7.38-7.34 (m, 2 H);
MS (ESI-MS) 391 [M+Na+]。
4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物13)の製造
既知法(Jie, L.; Jin, Z.; Hualiang, J.; Wei, W.; Jian, L. Asian. J. Chem., 2009, 4, 1712-1716) で合成した(E)-3-(2-メチルフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物13を合成した。
red solid (収率54%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.40 (dd, J = 15.3, 11.9 Hz, 1 H), 8.27 (dd, J = 15.3, 11.9 Hz, 2 H), 8.02-7.91 (m, 3 H), 7.86-7.80 (m, 5 H), 7.76-7.65 (m, 11 H), 7.61-7.59 (m, 2 H), 7.45-7.42 (m, 8 H), 7.34-7.28 (m, 4 H), 7.20-7.03 (m, 2 H), 2.48 (s, 6 H), 2.43 (s, 3 H);
MS (ESI-MS) 305 [M+H+], 327 [M+Na+]。
4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物14)の製造
既知法(Laihia, K.; Kolehmainen, E.; Manttari, P. Magn. Reson. Chem., 1991, 29, 1109-1113)で合成した(E)-3-(3-クロロフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物を合成した。
orange solid (収率26%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.32 (dd, J = 17.4, 12.8 Hz, 1 H), 7.83-7.81 (m, 3 H), 7.67-7.60 (m, 5 H), 7.54-7.50 (m, 6 H), 7.40-7.38 (m, 4 H), 7.16-7.08 (m, 2 H);
MS (ESI-MS) 325 [M+H+], 347 [M+Na+]。
4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物15)の製造
既知法(Omori, K.; Onzuka, K.; Fuse, K.; Miyata, H.(Ube Industry, Ltd., Japan) Jpn. Kokai Tokkyo Koho, 2000204057) で合成した(E)-3-(4-クロロフェニル)アクリルアルデヒドを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物15を合成した。orange solid (収率58%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.31 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H), 8.12 (s, 1 H), 7.78 (s, 4 H), 7.68 (t, J = 7 Hz, 4 H), 7.65-7.54 (m, 8 H), 7.45-7.35 (m, 4 H), 7.15 (d, J = 7.4 Hz, 2 H);
MS (ESI-MS) 325 [M+H+], 347 [M+Na+]。
4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物16)の製造
既知法(Kim, J.; Lee, S.; Kwon, M.; Park, Y.; Choi, S.; Kwon, B. Synth. Commun., 2004, 34, 1223-1228)で合成した3-(3-ヒドロキシルフェニル)プロペナールを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率 26%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.78 (s, 2 H), 8.30 (dd, J = 16.1, 9.2 Hz, 1 H), 8.81 (s, 1 H), 7.94-7.13 (m, 24 H);
MS (ESI-MS) 307 [M+H+]。
4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物17)の製造
既知法(Fujisawa, T.; Mori, T.; Tsuge, S.; Sato, T. Tetrahedron Lett., 1983, 24, 1543-1546)で合成した3-(4-ヒドロキシルフェニル)-プロペナールを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率 75%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.33 (s, 2 H), 8.13 (dd, J = 15.6, 11.9 Hz, 1 H),7.96 (s, 1 H), 7.72-7.54 (m, 14 H), 7.42 (t, J = 7 Hz, 4 H), 7.17-7.16 (m, 2 H), 6.87 (d, J = 8 Hz, 4 H);
MS (ESI-MS) 307 [M+H+]。
4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物18)の製造
既知法(Houille, O.; Fretz, H.; Hilpert, K.; Riederer, M.; Giller, T.; Valdenaire, O. WO 2005/002574 A1)で合成した1-ピリジン-2-イル-ピラゾリジン-3,5-ジオンを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率 46%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.44-8.33 (m, 3 H), 7.92-7.77 (m, 4 H), 7.46-7.44 (m, 1 H), 7.37-7.32 (m, 2 H), 7.12-7.09 (m, 1 H)。
4-(3-フェニルアリリデン)-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物19)の製造
既知法(Houille, O.; Fretz, H.; Hilpert, K.; Riederer, M.; Giller, T.; Valdenaire, O. WO 2005/002574 A1)で合成した1-ピリジン-2-イル-ピラゾリジン-3,5-ジオンを用いて、製造例1の(3)の方法に従って、標題の化合物を合成した。(収率 25%, E/Z mixture):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.40 (dd, J = 15.3, 11.6 Hz, 1 H), 8.35-8.33 (m, 1 H), 7.82-7.77 (m, 2 H), 7.68 (s, 2 H), 7.44 (s, 3 H), 7.37 (d, J = 15.6 Hz, 1 H), 7.10 (t, J = 6 Hz, 1 H), 3.75 (s, 1 H), 1.85 (s, 1 H)。
DOCK2は、図1に示すように、SH3ドメイン、DHR-1ドメイン及びDHR-2ドメインを有する、マウスでは1828、ヒトでは1831アミノ酸残基からなるタンパク質であり、DHR-2ドメインを介してRacを活性化するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)である。DOCK2は、免疫系組織に特異的に発現しており、リンパ球などの免疫細胞においてRacを活性化させるマスター分子であるといわれている。ケモカイン受容体からのシグナルがDOCK2を介して伝わり、Racを活性化することにより、細胞骨格のアクチン繊維が再構築されて免疫細胞の分化、遊走、活性化が起こることが知られている。
(a)DOCK2ノックアウトマウスの作製
非特許文献14(Nature, 412, 826-831, 2001)に記載する方法に従って、DOCK2ノックアウトマウス(DOCK2欠損マウス:DOCK2-/-マウス)を作製した。
非特許文献20(J Exp Med 202, 1121-1130, 2005)に記載する方法に従って、アロ心臓移植試験を行った。具体的には、まずドナーとレシピエントのマウスを、ケタミンとキシラジンで麻酔をかけた。ドナーマウスから心臓を取り出し、レシピエントマウスに移植するまでの間、氷冷した生理的食塩水の中に保管した。次いでその心臓を、ドナーの大動脈及び肺動脈をそれぞれレシピエントの腹大動脈及び下大静脈に端側吻合することによって、レシピエントマウスに異種移植した。少なくとも84%は技術的に成功した。移植片の生着は毎日触診することによって判断した。明白に心拍が停止した段階で拒絶が生じたと判断し、開腹して肉眼で確認した。
I型糖尿病のモデルマウスであるNODマウスとDOCK2-/-マウスを8世代戻し交配した後、DOCK2遺伝子座が+/-もしくは-/-となるNODマウスを作製した。これらのマウス(4〜5ヶ月齢)より尿を採取し、尿糖検査用試験紙を用いて尿糖を測定し、陽性と判定されたものを糖尿病発症動物として、DOCK2+/-およびDOCK2 -/-についてそれぞれの発症率を求めた。また、これらのマウス(3〜5ヶ月齢)より採取した膵臓のパラフィン包埋切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。マウス1匹あたり15〜25個の膵島を観察し、それらへのリンパ球浸潤率をもとに次の様にステージ分類し、その平均値を指標として用いた。
ステージ0:膵島へのリンパ球浸潤なし、
ステージ2:膵島の25%未満にリンパ球の浸潤が見られる、
ステージ3:膵島の25〜50%未満にリンパ球の浸潤が見られる、
ステージ4:膵島の50%以上にリンパ球の浸潤が見られる。
結果を図2に示す。
(a)アロ心臓移植試験
図2(A)に示すように、同種心臓を移植したWTマウスにおける移植心臓の生着日数(median survival time; MST)は、単独使用ではほとんど効果のない量のFK506 (3.2 mg/kg/day for 10 days after transplantation)の投与下で13日、非投与下で7日であったのに対して、同種心臓を移植したDOCK2欠損マウス(DOCK2-/-)のMSTは、投与下で100日以上、FK506非投与下でも60日と、DOCK2を欠損させることで、移植心臓の長期生着が可能になることが確認された。
図2(B)に示すようDOCK2+/- NODマウスは、自己免疫糖尿病及び膵島炎を発症したのに対して、DOCK2欠損マウス(DOCK2-/-)NODマウスでは殆ど発症しなかった。このことから、DOCK2を欠損させることにより、自己免疫疾患の発症を抑制することができることが確認された。
試験例1の結果から、DOCK2とRacとの相互作用を阻害する化合物は、免疫抑制剤の有効成分として、また自己免疫疾患の予防または治療剤の有効成分になり得ると考えられる。そこで、9,392個の化合物を対象として、(a)DOCK2-Racとの相互作用を阻害する化合物の探索、(b)DOCK2のRac活性化を阻害する化合物の探索、及び(c)生存性を損なわずにリンパ球の遊走を阻害する化合物の探索を、順次行った。
ELISAを用いて、ライブラリーからDOCK2-Rac間の相互作用を阻害する化合物を探索した。まず、96-ウエルのポリスチレン・プレートの各ウエルを、50 mM炭酸塩緩衝液(pH 9.6
)に溶解したstreptavidin(250 ng/well)を用いて4℃で一晩処理してコートした。各ウエルを、TBST(20 mMトリス塩酸、150 mM NaCl、0.1%のTween-20、pH7.5)に溶解した5%のスキムミルク150μlで、室温で1時間処理してブロッキングした。次いで、ウエルをTBST 150μlで4回洗浄した。TF-DOCK2-DHR2-SBP(50μl、TBST中の濃度60μg/ml)を、各ウエルに添加し、室温で1時間培養した。その後、ウエルを、1 mM EDTAを添加したTBST(TBST/1 mM EDTA)150μl で4回洗浄した。各ウエルに、ライブラリー由来の被験化合物またはDMSO(担体)(50μl、TBST/1 mM EDTA中に200μM)を添加して、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウエルにGST-Rac1あるいはGST-Cdc42(50μl、TBST/1 mM EDTA中に50μg/ml)を添加し、室温で1時間インキュベートした。その後、ウエルを、TBST/1 mM EDTA 150μlで4回洗浄した。次いで各ウエルにペルオキシダーゼを標識した抗GST抗体(50μl、TBST/1 mM EDTA)を添加して、室温で1時間インキュベートした。その後、ウエルを、TBST/1 mM EDTA 150μlで4回洗浄した。各ウエルに、ペルオキシダーゼの基質(50μl、0.1 Mのクエン酸塩緩衝液に溶解した0.4 mg/mlのo-フェニレンジアミンおよび0.01%のH2O2、pH 5.0)を添加し、室温で30〜60分間インキュベートした。次いで、Multiskan Bichromatic plate reader (Labsystems)を用いて、波長450nmの吸光度を測定した。GST-Cdc42を添加したウエルをブランクとして各ウエルの吸光度から差し引いた。また被験化合物の代わりにDMSOのみを加えたウエルをコントロールにした。被験化合物の阻害率(DOCK2-Rac間の相互作用を阻害する割合)は、下式により計算した。
[数1]
阻害率(%)
={[(DMSOを加えた際の吸光度)−(被験化合物を加えた際の吸光度)]/DMSOを加えた際の吸光度}x 100
以上のスクリーニング試験により、9,392個の化合物の中から、DOCK2-Racの相互作用を阻害する作用を有する化合物を131個取得した。
反応バッファーA(20 mM MES-NaOH、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、0.4 mg/mlのBSA、20μM GDP、pH 7.0)もしくは反応バッファーB(20 mM MES-NaOH, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.2 mg/ml BSA, 20 mM GDP, pH 7.0)の中で希釈したGEFを、室温で30分間、被験化合物またはDMSO(溶媒)の存在下で遮光しながらインキュベートした。DMSOの最終濃度は、反応バッファーAを用いた系では3%、反応バッファーBを用いた系では1%になるように調整した。次に、GDPとRac(15μM)を混合して氷上で30分間静置することにより作製したGDP-Rac(100μl)と、3.6μM mant-GTPを反応バッファーに加え、30℃で8分間平衡化させた。平衡化後、前処理したGEF (50μl)を添加し30℃で反応させた。反応中のmant-GTP蛍光強度の変化を、Molecular Devices XS-N蛍光光度分光計を用いてモニターした(励起波長:360 nm、発光波長:440 nm)。得られた測定値について、反応開始時(0秒)での蛍光強度が0となるよう補正した値を算出した。そして、GraphPad Prism5(GraphPad software)を用いて、算出した補正値をy軸に、時間(t)をx軸にとってプロットした際の近似曲線(双曲線)を求め、t=0〜10秒における傾きをグアニンヌクレオチド交換反応の初速度とした。IC50は、溶媒(DMSO)のみを加えた時の反応初速度を100%として計算した。
(3-1)生存性試験
マウス脾細胞(1 x 106個)を0.5% BSA/RPMI-1640培地(100μl)に懸濁し、100μMの被験化合物もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養したものに、等量の0.4% Trypan blue/PBSを加え、光学顕微鏡で観察した。トリパンブルー陰性細胞を生細胞として、細胞100個あたりの生細胞の割合を求めた。1時間培養後の生細胞の割合が80%以上であったものを、生存性に影響しない化合物とした。
Transwellを用いた走化性解析を行った。具体的には、まず細胞(1×107/ml)を、被験化合物またはDMSOを配合した0.5%BSA含有RPMI-1640(Transwell培地)中で37 ℃で1時間培養した。24-ウエルプレートに、ケモカインと被験化合物を所定量添加したTranswell培地を加えた後、ウエルにTranswells(コーニング、5μm孔径)をセットし、前培養した細胞(1×106/100μl)を))ロードした。37℃で2時間インキュベートした後、下層のチャンバーに移動した細胞を集め、PE標識-抗Thy1.2抗体(53-2-1、BD Pharmingen)、およびFITC標識-抗B220抗体(RA-6B2、eBiosciences)で染色した。移動した細胞の割合(%)は、下層チャンバー中のThy1.2+細胞(T細胞)とB220+細胞(B細胞)の数を、Transwellsに入れた細胞の数で割ることで算出した。
試験例2で取得した(E)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン(化合物6)について、下記の方法によりDOCK2−Rac1相互作用の選択的阻害活性を評価した。
大腸菌で発現させたTrigger factor(TF)融合DOCK2-DHR-2およびTiam1 DH-PHを、化合物存在下、氷上で1時間前処理したものに、GST融合Rac1を結合したビーズを加え、4℃で1時間反応させた。ビーズを3回洗浄した後、SDS-PAGEでタンパク質を分離し、CBBで染色した。染色したバンドの濃度をデンシトメトリーにより測定した。
HEK293T細胞を、12穴プレートで培養し、polyethylenimineを用いてDOCK2、Tiam1および Trio(DH-D1/PH-D1ドメイン)発現ベクターを導入した。24時間後に、100μMの化合物6もしくは等量のDMSOを含む培養液(500μl)に交換して1時間培養した後、Rac activation assay kit (Millipore 17-283)を用いて、細胞レベルでのRac活性化を検討した。
DOCK2、DOCK180、及びDOCK5のGEF活性阻害効果を、試験例2-(2)に記載した方法で検討した。DOCK2のGEF活性阻害効果を評価するためのサンプルとして、0, 1, 3, 10, 30, 50, 100, 150, 300μMの化合物6に対しSUMO-DOCK2DHR-2 DlobeA(SUMOタグを有する、lobe Aを欠損したDOCK2 DHR2ドメインの組み換えタンパク質)とGST-Rac1が、それぞれ0.1μM , 10μMとなるようにそれぞれ調整した。また、DOCK180のGEF活性阻害効果を評価するためのサンプルとして、0, 1, 3, 10, 30, 50, 100μMの化合物6に対しSUMO-DOCK180DHR-2 DlobeA(SUMOタグを有する、lobe Aを欠損したDOCK180 DHR2ドメインの組み換えタンパク質)とGST-Rac1が、それぞれ0.1μM , 10μMとなるようにそれぞれ調整した。さらに、DOCK5のGEF活性阻害効果を評価するためのサンプルとして、0, 1, 3, 10, 30, 50, 100μMの化合物6に対しSUMO-DOCK2DHR-2 DlobeA(SUMOタグを有する、lobe Aを欠損したDOCK5 DHR2ドメインの組み換えタンパク質)とGST-Rac1が、それぞれ0.1μM , 10μMとなるようにそれぞれ調整した。
マウス脾臓より、Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-095-130)もしくはB cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-090-862)を用いて、それぞれT細胞、B細胞を単離した。単離した細胞(1〜2 x 107個)を200μlのHBSS (Invitrogen)に懸濁し、100μMの化合物6もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養した。培養後、ケモカイン[T細胞の場合は1μg/ml SLC (CCL21)、B細胞の場合は1μg/ml BLC (CXCL13)]を加えて所定の時間培養し、Rac activation assay kit (Millipore 17-283)を用いて、Rac活性化を検討した。遊走試験は、試験例2-(3)に記載した方法で行い、T細胞の走化性因子としてSLCを、B細胞の走化性因子としてBLCをそれぞれ用いた。
マウス脾臓より、Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotech, 130-095-130)を用いてT細胞を単離した。単離した細胞(1〜2 x 107個)を200 μlのHBSSに懸濁し、抗CD3ε抗体(Becton Dickinson, 145-2C11)を10μg/mlとなるように加え、氷上で20分間静置した。細胞を氷冷したHBSSで3回洗浄した後、200μlのHBSSに再懸濁し、100μMの化合物6もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養した。培養後、抗ハムスター抗体(Becton Dickinson, G94-56)を10μg/mlとなるように加え、所定の時間37℃で保温し、Rac activation assay kit (Millipore 17-283)を用いて、Rac活性化を検討した。
マウス骨髄細胞をFlt3リガンド存在下で培養することにより、pDCに分化させた。得られた細胞(1〜2 x 107個)を200 μlのHBSSに懸濁し、100μMの化合物6もしくは等量のDMSO存在下、37℃で1時間培養した。培養後、3μMのCpG-A〔ODN D19、ggTGCATCGATGCAgggggG(配列番号1)、上流側の小文字はリン酸ジエステルで、下流側の小文字はホスホロチオエートで、それぞれ基本骨格が修飾されていることを示す〕を加えて、所定の時間37℃で保温し、Rac activation assay kit (ミリポア17-283)を用いてRac活性化を検討した。
自己免疫脳脊髄炎(EAE)を誘導するために、0日目にCFA(5 mg/ml 結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を添加)中で乳化したミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG)ペプチド35-55(Mimotopes)を、B6マウスの皮下に1匹あたり100μgを、0日目および2日目に腹腔内に1匹あたり500ngの百日咳毒素(Calbiochem)をそれぞれ投与した。
0:無症状、1:尾が弛緩、2:後肢不完全麻痺、3:後肢完全麻痺、4:前肢不完全麻痺、5:四肢麻痺、6:死。
グリア芽腫細胞株(LN-229)ならびに肺がん細胞株(3LL)の細胞外マトリクスへの浸潤に対する化合物6の効果を検討した。
足場非依存的ながん細胞の増殖に対する化合物6の抑制効果を、ソフトアガーアッセイを用いて行った。3LL株(1 x 105個)を0.3%アガロース、10% FCSを含むDMEMに懸濁し、0.7%寒天、10% FCSを含むDMEM により6ウエルプレート中に形成させたベースアガー上に重層した。37℃、5%CO2環境下で10日間培養した後、0.005%クリスタルバイオレットで室温1時間の反応により細胞を染色し、形成されたコロニーの数を計数した。
製造例1(化合物5)及び製造例3〜15(化合物7〜19)に記載する方法で製造した、化合物6のアナログ(14化合物)を対象として、試験例4と同様にして、DOCK2のGEF活性に対する阻害作用を評価し、IC50値を求めた。また、化合物6からシス体(化合物20)を単離し、その阻害活性も合わせて検討した。測定は、試験例2−(2)で記載したバッファーAおよびバッファーBの両方を用いて行い、それぞれについてIC50値を求めた。
Claims (12)
- 上記ピラゾリジンジオン誘導体が、式(2)中、nが1〜2の整数であって、R2が水素原子、ハロゲン原子、水酸基、またはメチル基である化合物である、請求項1に記載するRac活性化阻害剤。
- 上記ピラゾリジンジオン誘導体が、式(2)中、nが1である化合物である、請求項1または2に記載するRac活性化阻害剤。
- 上記ピラゾリジンジオン誘導体が、一般式(1)中、Zがメチンである化合物である、請求項1乃至3のいずれかに記載するRac活性化阻害剤。
- 一般式(1)で示されるピラゾリジンジオン誘導体が、下記(a)〜(p)からなる群から選択される少なくとも1つであるRac活性化阻害剤:
(a)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(b)4-[3-(2-クロロフェニル)プロピル]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(c)4‐[(2‐クロロフェニル)メチリデン]‐1‐フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(d)4‐[5-(2-クロロフェニル)ペンタ‐2,4-ジエニリデン]-1-フェニルピラゾリジン‐3,5‐ジオン
(e)4-(3-フェニルアリリデン)-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(f)4-[3-(2-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(g)4-[3-(2-フルオロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(h)4-[3-(2-ブロモフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(i)4-[3-(2-メチルフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(j)4-[3-(3-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(k)4-[3-(4-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(l)4-[3-(3-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(m)4-[3-(4-ヒドロキシフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン
(n)4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(o)4-(3-フェニルアリリデン)-1-(2-ピリジニル)ピラゾリジン-3,5-ジオン
(p)(Z)-4-[3-(2-クロロフェニル)アリリデン]-1-フェニルピラゾリジン-3,5-ジオン。 - 請求項1乃至5のいずれかに記載するピラゾリジンジオン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、Rac活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態を予防または治療するための医薬組成物。
- 上記Rac活性化が、DOCK2、DOCK180またはDOCK5を介したRacの活性化である、請求項6に記載する医薬組成物。
- 上記疾患または病態が、DOCK2を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である、請求項6または7に記載する医薬組成物。
- 上記疾患または病態が、免疫関連疾患、または生体移植に対する拒絶反応である、請求項8に記載する医薬組成物。
- 上記医薬組成物が免疫抑制剤である、請求項9に記載する医薬組成物。
- 上記疾患または病態が、DOCK180またはDOCK 5を介したRacの活性化に関連して発症または増悪する疾患または病態である、請求項6または7に記載する医薬組成物。
- 上記疾患または病態が悪性腫瘍である、請求項11に記載する医薬組成物。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040176372A1 (en) * | 2002-03-01 | 2004-09-09 | Pintex Pharmaceuticals, Inc. | Pin1-modulating compounds and methods of use thereof |
JP2004534072A (ja) * | 2001-06-18 | 2004-11-11 | アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ | アルキリデンピラゾリジンジオン誘導体並びに糖尿病及び肥満症治療のための使用 |
JP2007506661A (ja) * | 2003-06-24 | 2007-03-22 | アクテリオン ファマシューティカルズ リミテッド | ピラゾリジンジオン誘導体 |
JP2007186492A (ja) * | 2005-09-13 | 2007-07-26 | Japan Health Science Foundation | がんの診断、処置および/または予防、および/または浸潤・転移の抑制のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 |
JP2009508809A (ja) * | 2005-07-29 | 2009-03-05 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | RAC−1GTPaseのGTPase阻害因子とその使用方法およびその結晶構造 |
WO2010020647A2 (en) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | New method for identifying compounds useful for treating and/or preventing disease-associated bone loss |
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004534072A (ja) * | 2001-06-18 | 2004-11-11 | アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ | アルキリデンピラゾリジンジオン誘導体並びに糖尿病及び肥満症治療のための使用 |
US20040176372A1 (en) * | 2002-03-01 | 2004-09-09 | Pintex Pharmaceuticals, Inc. | Pin1-modulating compounds and methods of use thereof |
JP2007506661A (ja) * | 2003-06-24 | 2007-03-22 | アクテリオン ファマシューティカルズ リミテッド | ピラゾリジンジオン誘導体 |
JP2009508809A (ja) * | 2005-07-29 | 2009-03-05 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | RAC−1GTPaseのGTPase阻害因子とその使用方法およびその結晶構造 |
JP2007186492A (ja) * | 2005-09-13 | 2007-07-26 | Japan Health Science Foundation | がんの診断、処置および/または予防、および/または浸潤・転移の抑制のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 |
WO2010020647A2 (en) * | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | New method for identifying compounds useful for treating and/or preventing disease-associated bone loss |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
JPN6012035182; Atreya, Lmke et al.: 'Rational development of 6-Thio-GTP analogues: A novel class of immunosuppressive drugs for inflammat' Gastroenterology Vol. 132, No. 4, Suppl. 2, 200704, p. A554 * |
JPN6015052040; Wang, Shuang et al., Transplant Immunology, 2007, Vol. 18, No. 1, p. 53-61 * |
JPN6015052041; Chemistry of Heterocyclic Compounds, 2007, Vol43(9), p.1131-1137 * |
JPN6015052043; Journal of the Serbian Chemical Society, 1992, Vol.57(4), p.221-231 * |
JPN6015052046; Annales Pharmaceutiques Francaises, 1980, Vol.38(5), p.429-438 * |
JPN6015052049; Archiv der Pharmazie und Berichte der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, 1965, Vol.298(8), p.5 * |
JPN6015052051; Canadian Journal of Chemistry, 1954, Vol.32, p.823-838 * |
JPN6015052053; Journal of Chemical Physics,1950, Vol.18, p.1307-1308 * |
JPN6015052055; Chemistry & Biology, 2012, Vol.19, p.488-497 * |
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