JP6727052B2

JP6727052B2 - 生体分子分析用デバイス及び生体分子分析装置

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Publication number: JP6727052B2
Application number: JP2016141675A
Authority: JP
Inventors: 玲奈赤堀; 佑介後藤; 一真松井; 崇秀横井
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: JP2018011532A; WO2018016117A1; US20190086362A1

Description

本発明は，生体分子（生体ポリマ）の分析に使用する電解質溶液，デバイス及び装置に関する。

次世代DNAシーケンサの分野では，伸長反応や蛍光ラベルを行うことなく，生体分子（以下「DNA」という。）の塩基配列を電気的に直接計測する手法が注目されている。具体的には，ナノポアDNAシーケング方式の研究開発が活発に進められている。この方式は，試薬を用いることなく断片化されたDNA鎖を直接計測し，塩基配列を決定する方式である。この方式は，薄膜に形成された細孔（以下「ナノポア」という。）を通過する際のDNA鎖に含まれる個々の塩基種の違いを封鎖電流量で直接計測し，塩基種を順次同定する。この方式では，鋳型DNAの酵素による増幅を行わない上に，蛍光体等の標識物を用いない。このため，高スループット，低ランニングコスト，長塩基のDNA解読が可能な方式として期待されている。

ナノポアDNAシーケング方式では，微少なナノポアを通過する電解質がキャリアとなることにより生じる電気抵抗の変化を電極により取得し，その増幅信号を計測する。以下では，測定対象とするDNA鎖の有無によらずに流れる電流を「ベース電流」と呼ぶ。ベース電流は，基本的に，ナノポアの寸法に依存する。電気泳動によりナノポアにDNA鎖が導入されると，通過中の塩基種に応じた電流量の減少が確認される。このとき取得される信号には，前述のベース電流に由来した信号成分と，DNAの寸法やDNAの内部構造に由来した信号成分が含まれる。ナノポアDNAシーケング方式では，このように取得された信号の変化を解析し，DNA鎖を構成する塩基種の配列を同定する。

米国特許出願公開第２００９／０２８６２４５号明細書

ところで，ナノポアDNAシーケング方式では，信号解析の際の信号変化の中に，ベース電流の揺らぎを反映した信号変化が含まれている場合，信号解析エラーが生じる問題がある。

上記課題を解決するために，本発明は，例えば特許請求の範囲に記載の構成を採用する。本明細書は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが，その一例を挙げるならば，「溶媒としてD_２Oを含む，並びに／又は，電解質溶液中のカチオン種が，Cs及びNa，若しくは，Na単独，若しくは，Na及びLi，若しくは，Li単独である電解質，若しくは，トリスヒドロキシアミノメタン，若しくは，それらの組み合わせを含む，生体分子分析用電解質溶液」である。

本発明によれば，薄膜中に形成されたナノポアの寸法に応じて測定されるベース電流が安定し，安定的に封鎖信号を取得することができる。前述した以外の課題，構成及び効果は，以下の実施の形態の説明により明らかにされる。

塩基識別のイメージを示す図。ベース電流が安定している場合の封鎖信号の変化と解析結果を説明する図。ベース電流が不安定である場合の封鎖信号の変化と解析結果を説明する図（比較例）。 H₂Oを溶媒として用いる場合のベース電流の計測例を示す図（比較例）。 D₂Oを溶媒として用いる場合のベース電流の計測例を示す図。比較例に係る溶液を用いる場合のベース電流の計測例を示す図。実施例に係る強アルカリ性電解質溶液を用いる場合のベース電流の計測例を示す図。強アルカリ性電解質溶液を用いる場合のベース電流の組成依存性を説明する図（比較例）。強アルカリ性電解質溶液を用いる場合のベース電流の組成依存性を説明する図。強アルカリ性電解質溶液を用いる場合のベース電流の組成依存性を説明する図。比較例に係る溶液を用いる場合のベース電流の計測例を示す図。トリスヒドロキシアミノメタン溶液を用いる場合のベース電流の濃度依存性を説明する図。トリスヒドロキシアミノメタン溶液を用いる場合のベース電流の濃度依存性を説明する図。パッシブ単体型の生体分子分析装置の構成例を説明する図。アクティブ単体型の生体分子分析装置の構成例を説明する図。アレイパッシブ型の生体分子測定装置の構成例を説明する図。アレイアクティブ型の生体分子測定装置の構成例を説明する図。電解質溶液の使用例を説明する図。電解質溶液の使用例を説明する図。

以下，図面に基づいて，本発明の実施の形態を説明する。なお，添付の図面は，本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが，それらは本発明の理解のためのものであり，決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。

（１）概要
発明者による鋭意検討の結果，計測に使用する生体分子分析用電解質溶液（以下「電解質溶液」という。）においては，以下に示す条件を満たす電解質溶液を用いることで，薄膜中に形成されたナノポアの寸法に応じて測定されるベース電流を，50Hz以上5kHz以下のとき20pA以下まで低下できること，すなわち，ベース電流の安定性が向上することが見出された。
・溶媒としてD_２Oを含む，
並びに／又は，
・電解質溶液中のカチオン種が，Cs及びNa，若しくは，Na単独，若しくは，Na及びLi，若しくは，Li単独である電解質，若しくは，トリスヒドロキシアミノメタン，若しくは，それらの組み合わせを含む。

前述の条件を満たす電解質溶液は，(i) 薄膜に開孔されたナノポアを介してイオン電流を取得する際に使用する試薬としても，(ii)薄膜に電圧を印加してナノポアを開孔する際に用いる試薬としても，(iii) 核酸から構成される生体ポリマをナノポアに通過させ，電気的信号の変化から生体ポリマを分析するための測定試薬としても使用することができる。

電解質溶液は，以下の（ａ）〜（ｃ）であることがより望ましい。
(ａ)溶媒としてD_２Oを含む，又は，
(ｂ)電解質溶液中のカチオン種が，Cs及びNa，若しくは，Na単独，若しくは，Na及びLi，若しくは，Li単独である電解質，若しくは，トリスヒドロキシアミノメタン，若しくは，それらの組み合わせを含む，又は
(ｃ)前記(ａ)と前記(ｂ)の組み合わせ

核酸から構成される生体分子を分析する際に使用する生体分子分析用デバイスは，それぞれに前述の条件を満たす電解質溶液が満たされている第１及び第２の液槽と，前記第１及び第２の液槽を仕切る薄膜と，前記第１及び第２の液槽に設けられる第１及び第２の電極とで構成される。生体分子分析用デバイスはアレイデバイスとして構成することもできる。アレイデバイスは，薄膜によって仕切られる液室の組を複数個備えるデバイスをいう。例えば第１の液槽を共通槽とし，第２の液槽を複数個の個別槽とする。この場合，共通槽と個別槽のそれぞれに電極を配置する。なお，生体分子分析装置は，生体分子分析用デバイスに設けられた電極の間に流れるイオン電流（封鎖信号）を測定する測定部を有し，測定されたイオン電流（封鎖信号）の値に基づいて生体分子の配列情報を取得する。

前述の溶液を用いることで，ベース電流の安定性が確保され，安定したイオン電流（封鎖信号）の取得を実現できる。その結果，核酸から構成される生体分子の分析，並びに，その分析情報を利用する試験，診断，治療，創薬，基礎研究などの分野に有用である。実際に，生体分子を導入する前段階における，ベース電流に50 pA/0.1 V以下の信号変化が含まれる様子が観察された。

（２）電解質溶液
前述したように，いわゆる封鎖電流方式で生体分子を分析する方式では，ナノポアを有する薄膜に対して接液する電解質溶液として，「溶媒としてD_２Oを含む」，並びに／又は，「電解質溶液中のカチオン種がCs及びNa，若しくは，Na単独，若しくは，Na及びLi，若しくは，Li単独である電解質，若しくは，トリスヒドロキシアミノメタン，若しくは，それらの組み合わせを含む」溶液を使用する。

本溶液を使用することにより，ナノポアを介して流れるベース電流の安定性が高まり，ナノポアを通過する際に取得される生体分子の特性を精度よく解析することができる。安定度の指標として，例えば50Hz〜5kＨｚにおいて，20pA以下の低減を実現できる。以下では，これらの条件がベース電流の安定化に寄与することを具体的に説明する。

図１−１に，塩基識別のイメージを示す。封鎖電流方式でイオン電流を測定する際に使用する生体分子分析用デバイスは，ナノポアが形成された薄膜を挟んで対向する一対の液槽と各槽に対応する一対の電極とで構成されている。測定時には，一対の電極の間に電圧が印加され，各液槽の電極間に電流が流れる。電圧の印加当初は，ナノポアに生体分子が導入されていないため，ナノポアの寸法（ポア径）に応じた電流が計測される。この電流がベース電流I_０である。やがて，電解質溶液中に含まれる生体分子はナノポアの両端間に生じた電位差により，ナノポア中に導入される。

ナノポアに導入された生体分子（特にポリマ状生体分子）の通過中，生体分子が抵抗となり，ナノポアを通じて流れていた電流量が減少する。このとき流れる電流が封鎖電流I_ｂである。図１−１に示すように，封鎖電流I_ｂはベース電流I_０より小さい値となる。封鎖電流I_ｂの電流値は，図１−１に示すように，ポリマ生体分子を構成しているモノマ種に応じて変化する。図１−２は，ベース電流I_０の変化が小さい場合の封鎖電流I_ｂの変化を表している。図１−３は，ベース電流I_０の変化が大きい場合の封鎖電流I_ｂの変化を表している。図１−３に示すように，ベース電流I_０にノイズが載ると，封鎖電流I_ｂにも同量のノイズが載る。生体分子測定装置は，この封鎖電流I_ｂの変化を識別してモノマ種を解析するため，ベース電流I_０の変化は解析エラーの原因となる。なお，解析エラーを無くすには，１KHz以上で変動振幅ΔIが50pA以下である必要がある。

ベース電流I_０にノイズが入る原因として，RTN（random telegraph noise）が考えられる。RTNは，半導体デバイスにおいて一般に観察されており，その理由として，層間絶縁膜に形成された膜欠陥に電子の結合又は乖離が生じることが言われている。一方，電圧の印加によって形成されるナノポアについても，ナノポア形成後の膜に形成された欠陥に対し，電解質溶液中のプロトン，カチオン，アニオンが結合又は乖離することで同様の現象が確認されると考えられる。従って，この膜欠陥に対してアクセスするイオン種を制御すれば，ベース電流I_０の安定化が図られることが推定できた。

そこで，本実施例では，「溶媒としてD_２Oを含む」，並びに／又は，「電解質溶液中のカチオン種が，Cs及びNa，若しくは，Na単独，若しくは，Na及びLi，若しくは，Li単独である電解質，若しくは，トリスヒドロキシアミノメタン，若しくは，それらの組み合わせを含む」電解質溶液を，ナノポアの形成用の溶液又は測定時の測定溶液に使用する。

まず，溶媒としてD₂Oを用いることでベース電流I_０の安定化効果が得られることを確認する。図２−１は，溶媒としてH₂Oを用いる場合のベース電流I_０の取得例である。この場合，生体分子の導入前からベース電流I_０に，封鎖様の信号や揺らぎが観察された。図２−２は，溶媒としてD₂Oを用いる場合のベース電流I_０の取得例である。この場合，H₂Oの場合のような現象は確認されなかった。なお，ベース電流I_０の変動幅は１KHz以上で50pA以下を満たしている。

電解質溶液の溶媒としてD₂Oを用いることによるベース電流I_０の安定化は，重水素による極薄ゲートの信頼性向上効果への寄与からも推察される。例えばゲート酸化膜の形成時に，D₂燃焼酸化，ゲート電極多結晶シリコンに重水素シランガスによる成膜を行うことで，ゲート酸化膜，Si界面における欠陥の低減が確認されたという報告がある（東芝レビュー vol. 57, no.11, (2002)）。これは，酸化膜の成長過程により，安定な重水素結合がシリコン極薄ゲート酸化膜の全体にわたって形成されたため，電気的なストレスを印加したときに生成される半導体中に出来た膜欠陥によく吸着するためであると推測されている。

同様の現象が，ナノポア形成時の電圧印加後の膜中に形成された欠陥に対しても起きている可能性がある。D₂Oを溶媒とする電解質は，メンブレン膜中に形成された欠陥によく吸着するため，溶液中のプロトンの吸着及び脱離現象の減少につながり，ベース電流I_０の安定化が図られたと推察される。

なお，電解質溶液の溶媒はD₂Oのみである必要は無く，溶媒の一部がD₂Oであっても良い。D₂Oに混在させる溶媒としては，生体ポリマを安定に分散可能であり，かつ，電極が溶媒に溶解せず，電極との電子授受を阻害しない溶媒を用いることができる。例えばH₂O，アルコール類（メタノール，エタノール，イソプロパノールなど），酢酸，アセトン，アセトニトリル，ジメチルホルムアミド(DMF)，ジメチルスルホキシド(DMSO)などが挙げられる。生体ポリマとして核酸を測定対象とする場合，最も好ましいのは水である。

次に，電解質溶液に溶解される電解質が，前述した物質である場合にベース電流I_０の安定化効果が得られることを説明する。本実施例の場合，電解質として，一価のカチオンである，セシウム，カリウム，ルビジウム，ナトリウム，リチウムカチオンを利用する。このとき，カチオンから二種類を組み合わせた電解質についても，ベース電流I_０が安定する効果が確認された。

図３−１は，1M CsCl 0.1Mtris溶液（pH=10.6）を使用した際のベース電流I_０の取得例である。図３−２は，1M LiCl 0.1Mtrisに，1M NaOHを加えた電解質溶液（pH=11.8）を用いた際のベース電流I_０の取得例である。図３−２は，実施例に対応する強アルカリ性の電解質溶液の例である。両データとも，2kHzのソフトウエアフィルターをかけている。

従来溶液（図３−１）を用いる場合のベース電流I_０の特性は，Ipp = 0.1 nA，S.D.= 0.026となった。一方，強アルカリ電解質水溶液（図３−２）を用いる場合のベース電流I_０の特性は，20〜50 pAのベースラインの変動がなくなり，Ipp=0.03 nA，S.D. = 0.0074となった。

今回の変動は，pHのみならず，カチオン種の組み合わせにより効果が変化することも分かっている。図４−１〜図４−３に，カチオン種の変更に伴うベース電流I_０の変化を示す。図４−１は，塩化セシウムと水酸化セシウムを組み合わせた場合のベース電流I_０の変化を示し，図４−２は，塩化セシウムと水酸化ナトリウムを組み合わせた場合のベース電流I_０の変化を示し，図４−３は，塩化リチウムと水酸化ナトリウムを組み合わせた場合のベース電流I_０の変化を示す。

各図を比較して分かるように，塩化セシウムと水酸化セシウムを組み合わせた場合（図４−１）に比べ，塩化セシウムに水酸化ナトリウムを加えた組合せ（図４−２），又は，塩化リチウムに水酸化ナトリウムを加えた組み合わせ（図４−３）は，ベース電流I_０の安定度が高いことが分かる。もっとも，上記の組み合わせによりベース電流I_０が安定化する主な要因は不明である。なお，使用するカチオン種の量比により，効果を発揮する主体が変化する。

なお，セシウム，カリウム，ルビジウム，ナトリウム，リチウムの順にカチオンのイオン半径が小さくなっていく。このイオン半径の傾向と，電流安定化の傾向が概ね一致している傾向が確認されている。RTNを抑制する効果が，SiN膜に形成された欠陥へのイオンや電子の脱離又は吸着の影響であるとすると，カチオンのイオン半径が小さくなるほど，欠陥への吸着度が高くもしくは著しく低くなるためであることが推測される。従って，電解質溶液中に含まれるカチオン種はイオン半径の小さいものの割合を多く含めるのがよい。

また，生体分子によっては，アルカリ性への耐性が低いものもあるため，例えば，1M LiClなど，中性条件下でも，ベース電流I_０の安定化への寄与は十分に維持される。

ベース電流I_０を安定化させる電解質のその他の組み合わせとして，トリスヒドロキシアミノメタン（tris(hydroxymethyl)aminomethane）を加えたものがある。図５−１は，比較例に係る溶液を用いる場合のベース電流I_０の計測例である。ここでの溶液は，1M CsCl 0.1Mtrisであり，図３−１の測定に用いた溶液と同じである。図５−２と図５−３は，トリスヒドロキシアミノメタン溶液を用いる場合のベース電流I_０の計測例である。図５−２は，1M CsCl 2Mtrisで測定したベース電流I_０であり，図５−３は，1M CsCl 1M NaOHで測定した際のベース電流I_０である。各図のS.D.は，0.04, 0.017, 0.018であり，強アルカリ性の電解質溶液で測定した際と同等の効果を得ることができた。

前述したように，本実施例で提案する電解質溶液は，ナノポアの形成に用いることができる。当該電解質溶液を用いてナノポアが形成された薄膜を用いる生体分子分析用デバイスでは，前述の通り，プロトンの吸着及び脱離現象を伴う欠陥が少ない状態になっている。このため，測定時の電解質溶液として既存の電解質溶液を使用しても，ベース電流I_０が安定した状態で測定を行うことができる。また，ナノポアの形成には既存の手法を使用し，測定時の電解質溶液として実施例に係る電解質溶液を使用することもできる。勿論，ナノポアの生成にも測定にも実施例に係る電解質溶液を使用できる。

以下では，ナノポアの形成後に電解質を変更する場合について説明する。その際に利用する金属イオン類の代替カチオンには，有機物から構成される有機カチオン類を用いることができ，例えばアンモニウムイオンなどに代表される電離するカチオンを用いることができる。

アニオンとしては，電離するアニオン類を用いることができ，電極材質との相性によって選定することが好ましい。例えば電極材質としてハロゲン化銀を用いた場合，ハロゲン化物イオン（塩化物イオン，臭化物イオン，ヨウ化物イオン）をアニオンとして用いることが好ましい。また，アニオンは，グルタミン酸イオン等に代表される有機アニオン類であってもよい。

続いて，電解質溶液のpH値決定法について説明する。本実施例の場合，測定溶液のpHは，グアニン塩基のpKa以上pH 14以下となるようにする。ここで，グアニン塩基（N-1位）のpKaは，溶媒の共存する溶質種によっても変化するため，測定溶液の種類に応じて調整することが好ましい。典型的には，水溶液中におけるグアニン塩基N1位のpKaは9.2である（例えば，Fedor, et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6(5):399-412, 2005）。

pH値の上限は以下のように決定する。測定溶液のpH値の上限は，デバイスの耐性限界及び，測定対象とするポリマ生体分子の耐性限界によって決定される。半導体ナノポアにおいて典型的に用いられるシリコンウェハーを基板として用い，シリコンのエッチングが開始されるpH 14付近がデバイスの耐性限界である。このようなエッチングレートは既知である（Lloyd D. Clark, et al. Cesium Hydroxide (CsOH): A Useful Etchant for Micromachining Silicon, Technical Digest, Solid-State Sensor and Actuator Workshop, IEEE, 1988.）。

なお，しばしば薄膜材質として採用される窒化ケイ素は，高アルカリ領域のpHにおいてもエッチングされることはないが，土台としてのシリコン又は酸化ケイ素がエッチングされていくため，pHの上限値としては14を設定することが好ましい。他の半導体材質では，その材質のデバイス耐性限界によって同様に決定される。

一方，ポリマ生体分子（特にDNAなど）は，溶液中の水酸化ナトリウム（NaOH）が0.3 M以上の場合に，長鎖の切断が確認されることが分かっている。濃度依存性があることが分かっている，カチオン種の異なる水酸化物溶液でも同様の結果となる。ポリマ生体分子がDNAの場合，pH12以下にすることが望まれる。

ところで，測定溶液は，大気に触れていると大気中の二酸化炭素と反応して徐々にpHが酸性側へと移行してしまう現象が発生する。この二酸化炭素の影響を少なくするためには，pHを，初期状態からより高いアルカリ側へ設定しておくか，又は，pH調整剤の濃度を高濃度にすればよい。具体的には，10 mMと100 mMのpH調整剤では，100 mMの方が同一pHからグアニン塩基のpKa以下のpHに到達するまでの時間が延びるため，pH調整剤の濃度は高いほど好ましく，好ましくは50 mM以上，より好ましくは100 mM以上である。

pHをアルカリ側に調整する方法について説明する。実施例に係る測定溶液は，公知の方法にしたがって調製することができる。例えば，溶媒に電解質を溶解した後，適当な手段を用いてpHを調整することによって調製することができる。

加えて，信号対ノイズ比の観点から，電解質濃度の下限を設けることが好ましい。本実施例の場合，電解質濃度の下限は10 mMである必要がある。一方，電解質濃度の上限を妨げる要件はなく，飽和濃度まで許容することができる。すなわち，測定溶液のセシウムイオン濃度は，10 mM以上，飽和濃度以下となる。好ましくは0.1M以上飽和濃度以下となる。

本実施例に係る電解質溶液は，ナノポアの形成時に使用すれば，当該溶液とは異なる溶液を用いて生体分子を解析してもベース電流の安定化効果を発揮することが分かっている。そのため，ナノポアの形成に使用する溶液と，測定に使用する溶液の組成が代わっていてもかまわない。生体分子の解析時に使用する溶液としては，測定対象分子の立体構造の形成に寄与しないカチオン種やpH濃度で構成されているものを用いるのがよい。

本実施例に係る生体ポリマを分析するための測定溶液は，上述した測定溶液を構成要素として含む。測定溶液は，使用手順や使用量などを記載した説明書と共に提供され得る。測定溶液は，即時使用可能な状態（液体）で提供されてもよいし，使用時に適当な溶媒で希釈するための濃縮液として提供されてもよいし，あるいは，使用時に適当な溶媒で再構成するための固形状態（例えば粉末など）であってもよい。そのような測定溶液の形態及び調製は，当業者であれば理解することができる。

（３）生体分子分析用デバイス及び生体分子分析装置
以下では，前述の電解質溶液を使用してナノポアが形成された薄膜を有する生体分子分析用デバイス，又は，測定溶液として前述の電解質溶液が用いられる生体分子分析用デバイスと，当該デバイスを使用して生体分子を分析する装置について説明する。

（３−１）パッシブ単体型
図６に，使い捨てタイプの生体分子分析用デバイス１１０と，電源１２０と，電流計１２１と，コンピュータ１３０とで構成される生体分子分析装置１００の構成例を示す。生体分子分析用デバイス１１０は，仕切り体１１１により分離された２つの液槽１１２Ａと１１２Ｂを備えている。仕切り体１１１は，ナノポア１１３が形成された薄膜１１１Ａと，その薄膜固定部材１１１Ｂ及び１１１Ｃとで構成される。ナノポア１１３は，薄膜１１１Ａのいずれかの位置に形成されていれば良い。本実施例の場合，ナノポア１１３は１つだけ設けられる。

薄膜固定部材１１１Ｂと薄膜１１１Ａは，液槽１１２Ａの構造の一部を構成する。また，薄膜１１１Ａと薄膜固定部材１１１Ｃは，液槽１１２Ｂの構造の一部を構成する。薄膜固定部材１１１Ｂ，１１１Ｃの中央部分には貫通孔が形成されており，当該貫通孔の部分で，ナノポア１１３が形成された薄膜１１１Ａが電解質溶液１１４と接触する。

薄膜固定部材１１１Ｂ及び１１１Ｃに設けられた貫通孔の部分で露出する薄膜１１１Ａの寸法は，電圧の印加によるナノポア１１３の形成の際に２個以上のナノポア１１３が形成され難い面積であり，かつ，強度上許容される面積である必要がある。当該面積は，例えば100〜500 nm程度，DNA一塩基分解能を達成するためには，一塩基相当の実効膜厚を有するナノポア１１３を形成可能な膜厚〜7 nm程度が適当である。

本明細書では，図６に示すように，１つの液槽１１２Ａと１つの液槽１１２Ｂとが薄膜１１１Ａを挟んで配置されている装置構成を「単体型」という。また，本明細書では，装置内に可動部を有しない装置構成を「パッシブ型」といい，装置内に可動部を有する装置構成を「アクティブ型」という。従って，図６に示す生体分子分析装置１００は，パッシブ単体型に分類される。

液槽１１２Ａと液槽１１２Ｂは，いずれも電解質溶液１１４で満たされている。本実施例の場合，電解質溶液１１４の容量は，マイクロリットルオーダー又はミリリットルオーダーである。液槽１１２Ａには，不図示の注入口が設けられており，当該注入口を通じてDNA鎖１１６を含むDNA溶液である電解質溶液１１４を注入できるようになっている。すなわち，分析対象であるDNA溶液は，図中の上側に位置する液槽１１２Ａに注入される。後述する他のタイプについても同様である。

電解質溶液１１４には，例えばKCl，NaCl，LiCl，CsCl，MgCl₂が用いられる。これらの溶液に対して，生体分子の自己相補鎖形成抑制のために4M以上のUreaや，DMSO，DMF，NaOHを混在することも可能である。また，生体分子の安定化のため，緩衝剤を混在させることも可能である。緩衝剤としては，TrisやEDTAやPBSなどが用いられる。

液槽１１２Ａには電極１１５Ａが設けられ，液槽１１２Ｂには電極１１５Ｂが設けられている。電極１１５Ａ及び１１５Ｂは，例えばAg，AgCl，プラチナであり，電解質溶液１１４と接触している。図６では図示していないが，生体分子分析用デバイス１１０の外周面には電極１１５Ａ及び１１５Ｂと電気的に接続された接続端子が設けられており，前述の電源１２０及び電流計１２１と接続される。

電極１１５Ａと電極１１５Ｂの間に電圧を印加すると，ナノポア１１３が形成された薄膜１１１Ａの両面の間に電位差が生じ，上側の液槽１１２Ａに溶解しているDNA鎖１１６が，下側に位置する液槽１１２Ｂの方向に泳動される。因みに，前述の電流計１２１は，電圧の印加によって電極間に流れる電流を増幅するアンプとADC（Analog to Digital Converter）を有している。ADCの出力である検出値がコンピュータ１３０に出力される。コンピュータ１３０は，検出された電流値を収集し記録する。なお，図６に示すように，電源１２０，電流計１２１及びコンピュータ１３０を生体分子分析用デバイス１１０に対して別部材とするのではなく，電源１２０，電流計１２１及びコンピュータ１３０を生体分子分析用デバイス１１０と一体構成としても良い。

ここで，生体分子分析用デバイス１１０は，例えば以下に示す形態で流通される。後述する他のタイプの生体分子分析用デバイス１１０についても基本的に同様である。
(a)「（２）電解質溶液」で説明した実施例に係る組成の電解質溶液１１４を用いて加工されたナノポア１１３を有する薄膜１１１Ａを有する生体分子分析用デバイス１１０。この場合，液槽１１２Ａ及び１１２Ｂは，電解質溶液で充填されていても，充填されていなくても良い。
(b)「（２）電解質溶液」で説明した実施例に係る組成の電解質溶液１１４で液槽１１２Ａ及び１１２Ｂが充填されている生体分子分析用デバイス１１０。この場合，ナノポア１１３の形成方法は問わない。

（３−２）アクティブ単体型
図７に，アクティブ単体型の生体分子分析装置２００の構成例を示す。図７には図６との対応部分に同一符号を付して示す。本実施例における生体分子分析用デバイス１１０Ａの基本構成は，前述したパッシブ単体型と同様である。ただし，生体分子分析用デバイス１１０Ａを構成する液槽１１２Ａには，外壁の一部には開口が形成されており，当該開口に駆動機構２０１が取り付けられている。

駆動機構２０１の下面側には，生体分子固定部材２０２が取り付けられている。生体分子固定部材２０２のうち薄膜１１１Ａと対向する表面にはDNA鎖１１６が固定されている。DNA鎖１１６が固定された面の寸法は，薄膜１１１Ａのうち電解質溶液１１４と接触する部分の寸法より大きい。生体分子固定部材２０２は，駆動機構２０１の駆動動作により，図中上下に移動される。すなわち，DNA鎖１１６が固定された生体分子固定部材２０２の表面が薄膜１１１Ａに近づく方向又は遠ざかる方向に移動する。アクティブ型では，生体分子固定部材２０２の表面が薄膜１１１Ａに近づくことでDNA鎖１１６がナノポア１１３に導入される。

駆動機構２０１の動作は，制御ユニット２０３により制御される。生体分子固定部材２０２と薄膜１１１Ａの接触は，薄膜固定部材１１１Ｂにより防止される。ナノポア１１３が形成された薄膜１１１Ａに生体分子固定部材２０２が接触すると，薄膜１１１Ａが破壊されるおそれがあるためである。すなわち，薄膜固定部材１１１Ｂは，生体分子固定部材２０２の降下をストップする手段としても機能する。このため，薄膜固定部材１１１Ｂは，薄膜１１１Ａの外周を土手のように囲み，生体分子固定部材２０２と薄膜１１１Ａの間に空間を形成する。薄膜固定部材１１１Ｂの中心部分には，円形の貫通孔が形成されており，その内側にナノポア１１３が配置される。

前述したように，薄膜固定部材１１１Ｂの中央に設けられた貫通孔の内側に位置する薄膜１１１Ａの寸法は，生体分子固定部材２０２の下面側の寸法より小さい。このため，生体分子固定部材２０２が降下する場合，その下面は，薄膜１１１Ａに接触する前に薄膜固定部材１１１Ｂに突き当る。これにより，生体分子固定部材２０２の降下が停止し，生体分子固定部材２０２と薄膜１１１Ａとの接触が妨げられる。すなわち，薄膜１１１Ａの破壊が回避される。なお，薄膜固定部材１１１Ｂ，１１１Ｃの膜厚は，薄膜１１１Ａの強度の確保と，生体分子固定部材２０２の表面に固定された生体分子の固定高さ揺らぎを考慮すると，200〜500 nm程度が適当である。本実施例の場合，薄膜１１１Ａの寸法は直径500 nm，薄膜固定部材１１１Ｂ，１１１Ｃの膜厚は250 nmである。

生体分子固定部材２０２は，駆動機構２０１に真空吸着あるいは圧着して固定することも可能である。駆動機構２０１はピエゾ素子に代表される圧電材料で形成されており，0.1 nm/s以上の駆動が可能である。圧電材料としては，チタン酸バリウム（BaTiO₃）や，チタン酸ジルコン酸鉛（PZT），酸化亜鉛（ZnO）などが用いられる。

DNA鎖１１６の末端と生体分子固定部材２０２の表面とは，互いに，共有結合，イオン結合，静電相互作用，磁気力などで結合される。例えば，共有結合でDNA鎖１１６を固定する場合，APTES，グルタルアルデヒドを介してDNA末端修飾されたDNA鎖１１６を使用する。一方，生体分子固定部材２０２の表面には，上記結合を利用するために，APTESの足場となるSi，SiOが利用される。

他の共有結合法として，金チオール結合が利用できる。DNA鎖１１６の５’末端をチオール修飾し，生体分子固定部材２０２の表面は金蒸着する。生体分子固定部材２０２に蒸着する金属種は他にも，チオールが結合可能なAg，Pt,Tiを利用できる。

イオン結合を利用する方法は，生体分子固定部材２０２を表面修飾により溶液中で正に帯電する処理を施すことにより，正に帯電した生体分子固定部材２０２の表面に負に帯電した生体分子を固定する方法である。カチオン性のポリマとしては，ポリアニリンやポリリシンが用いられる。

静電相互作用を利用する方法は，APTES修飾した生体分子固定部材２０２の表面に直接アミノ末端修飾されたDNA鎖１１６を固定することができる。また，基板表面として，ニトロセルロース膜，ポリフッ化ビニリデン膜，ナイロン膜，ポリスチレン基板が広く利用される。特にニトロセルロース膜は，マイクロアレイ技術に利用されている。磁気力を利用する際には，例えば磁気ビーズ表面に上記のような結合を利用して，DNA鎖１１６を予め固定化しておく。さらに生体分子固定部材２０２として磁石材料を用いることで，DNA鎖１１６を固定化した磁気ビーズと生体分子固定部材２０２を相互作用させ，磁力によるDNA固定化磁気ビーズの吸引を実現する。磁性材料としては，鉄，ケイ素鋼，アモルファス磁性合金，ナノクリスタル磁性合金などが用いられる。

DNA鎖１１６としてタンパク質やアミノ酸を測定する場合においても同様に，特異結合部位への修飾を施し，同様の手法にて固定基板に結合させることができる。これによってタンパク質中の結合部位の特定，及び，アミノ酸の配列情報を得ることができる。生体分子固定部材２０２上のDNA鎖１１６の固定密度は，ナノポア１１３周辺に形成される電場の広がり量で決める。DNA鎖１１６を含むDNA溶液は，生体分子固定部材２０２と駆動機構２０１を取り付けるために設けられている開口を通じて液槽１１２Ａに注入される。

なお，前述の説明では，生体分子固定部材２０２と駆動機構２０１が生体分子分析用デバイス１１０Ａに取り付けられた構造を前提としているが，流通段階では，これらの部材が装着されていなくても良い。

（３−３）アレイパッシブ型
図８に，アレイパッシブ型の生体分子分析装置３００の構成例を示す。図８には，図６との対応部分に同一符号を付して示す。アレイ型とは，１つの液槽１１２Ａに対して，複数の液槽１１２Ｂが配列される装置構成をいう。アレイ型は，より多くのDNA鎖１１６の情報を同時に取得するのに効果的である。

本実施例の場合，薄膜固定部材１１１Ｃは，３つの隔壁により分離された４つの空間を有し，これらの空間がそれぞれ液槽１１２Ｂとして用いられる。なお，液槽１１２Ａは，下側に位置する４つの液槽１１２Ｂに対する共通液槽として用いられる。

本実施例の場合，各液槽１１２Ｂのそれぞれには，単一のナノポア１１３と電極１１５Ｂが設けられており，隔壁により互いに絶縁されている。このため，各ナノポア１１３を流れる電流を独立に計測することができる。本実施例の場合，電極１１５Ａの装着口がDNA鎖１１６を含むDNA溶液の注入口３０１としても使用される。すなわち，注入口３０１を通じてDNA溶液が注入される。

（３−４）アレイアクティブ型
図９に，アレイアクティブ型の生体分子分析装置４００の構成例を示す。図９には，図７との対応部分に同一符号を付して示す。図９の矢印は，生体分子固定部材２０２を下方に移動させる状態変化を表している。図９の場合，生体分子固定部材２０２は１つであるが，液槽１１２Ｂに対応して複数個の生体分子固定部材２０２を用意しても良い。勿論，個々の生体分子固定部材２０２の表面には，DNA鎖１１６が前述した手法で固定される。また，複数個の生体分子固定部材２０２は，１つの駆動機構２０１で駆動しても良いし，それぞれに対応する駆動機構２０１で駆動しても良い。

（４）デバイスの作製法
以下では，前述した生体分子分析用デバイス１１０〜１１０Ｃの作製方法について説明する。いわゆる封鎖電流方式で生体ポリマの分析に用いられる生体分子分析用デバイス１１０〜１１０Ｃの基本的な構成自体は当技術分野で既知であり，その構成要素も当業者であれば容易に理解することができる。例えば，米国特許第5795782号，“Scientific Reports 4, 5000, 2014，Akahori, et al.”, “Nanotechnology 25(27):275501, 2014，Yanagi, et al.”, “Scientific Reports, 5, 14656, 2015，Goto, et al.”, “Scientific Reports 5, 16640, 2015”に具体的なデバイスが開示されている。

・薄膜
ナノポア１１３が形成される薄膜１１１Ａは，中心に細孔を有するタンパク質が埋め込まれた両親媒性分子層からなる脂質二重層（バイオポア）であってもよいし，半導体微細加工技術で形成できる材質からなる薄膜（ソリッドポア）であってもよい。半導体微細加工技術で形成できる材質としては，例えば窒化ケイ素（SiN），酸化ケイ素（SiO₂），酸窒化ケイ素（SiON），酸化ハフニウム（HfO₂），二硫化モリブデン（MoS₂），グラフェンなどがある。薄膜の厚さは，1Å〜200 nm，好ましくは1Å〜100 nm，より好ましくは1Å〜50 nm，例として約5 nmである。

例えば薄膜１１１Ａを以下の手順で作製する。まず，７２５μｍ厚の８インチＳｉウエハの表面に，Si₃N₄／SiO₂／Si₃N₄を12 nm／250 nm／100 nmで成膜し，裏面にSi₃N₄を112 nm成膜した。次に，表面最上部のSi₃N₄を500 nm四方反応性エッチングし，裏面のSi₃N₄を1038 mm四方反応性イオンエッチングした。さらに裏面については，エッチングにより露出したSi基板をTMAH（Tetramethylammonium hydroxide）により更にエッチングした。Siエッチングの間は，表面側SiOのエッチングを防ぐためウエハ表面を保護膜（ProTEKTMB3primer and ProTEKTMB3, Brewer Science, Inc.）で覆った。

次に，保護膜を取り除いた後，500 nm四方で露出しているSiO層をBHF溶液（HF／NH₄F＝1／60，8 min）で取り除いた。これにより，膜厚12 nmの薄膜Si₃N₄が露出した仕切り体１１１が得られる。この段階では，薄膜１１１Ａにナノポアは設けられていない。

・ナノポアの寸法
ナノポア１１３の寸法は，分析対象である生体ポリマの種類に応じて適切な寸法を選択することができ，例えば0.9 nm〜100 nm，好ましくは0.9 nm〜50 nmであり，具体的にはおよそ0.9 nm以上10 nm以下などである。例えば直径が約1.4 nmであるssDNA（１本鎖DNA）の分析に用いるナノポア１１３の径は，好ましくは，1.4nm〜10nm程度，より好ましくは1.4nm〜2.5nm程度，具体的にはおおよそ約1.6 nmである。また，例えば直径が約2.6 nmであるdsDNA（２本鎖DNA）の分析に用いるナノポア１１３の径は，好ましくは3 nm〜10 nm程度，より好ましくは3 nm〜5 nm程度である。

ナノポア１１３の深さは，薄膜１１１Ａの厚さを調整することにより調整することができる。ナノポア１１３の深さは，生体ポリマを構成するモノマ単位の２倍以上，好ましくは３倍以上，より好ましくは５倍以上の大きさとする。例えば生体ポリマが核酸から構成されている場合には，ナノポア１１３の深さは，塩基３個以上の大きさ，例えば約1 nm以上とすることが好ましい。これにより，生体ポリマをその形状と移動速度を制御しながらナノポア１１３に進入させることができ，高感度及び高精度な解析が可能となる。また，ナノポア１１３の形状は，基本的には円形であるが，楕円形や多角形とすることも可能である。

ナノポア１１３を有する薄膜１１１Ａを複数備えるアレイ型の装置構成の場合には，ナノポア１１３を有する薄膜１１１Ａを規則的に配列することが好ましい。複数の薄膜１１１Ａを配置する間隔は，使用する電極，電気測定系の能力に応じて，0.1 mm〜10 mm，好ましくは0.5 mm〜4 mmとすることができる。

・ナノポアの形成
薄膜１１１Ａ中にナノポア１１３を形成する方法は，特に限定されるものではなく，例えば透過型電子顕微鏡などによる電子ビーム照射や電圧印加による絶縁破壊などを用いることができる。例えば“Itaru Yanagi et al., Sci. Rep. 4, 5000 (2014)”に記載されている方法を使用することができる。

ナノポア１１３の形成は，例えば以下の手順で行うことができる。仕切り体１１１を生体分子分析用デバイス１１０等にセットする前に，Ar／O₂ plasma（SAMCO Inc., Japan）により，10 WＷ，20 sccm，20 Pa，45 secの条件で，Si₃N₄薄膜を親水化する。次に，生体分子分析用デバイス１１０に仕切り体１１１をセットする。その後，液槽１１２Ａ，１１２Ｂを，1M KCl，1mMTris - 10 mM EDTA，pH7.5溶液で満たし，各液槽１１２Ａ，１１２Ｂのそれぞれに電極１１５Ａ，１１５Ｂを導入した。

電圧の印加は，ナノポア１１３の形成時だけでなく，ナノポア１１３が形成された後にナノポア１１３を介して流れるイオン電流の計測時にも行われる。ここでは，下側に位置する液槽１１２Ｂをcis槽と呼び，上側に位置する液槽１１２Ａをtrans槽と呼ぶ。また，cis槽側の電極に印加する電圧Ｖcisを0 Vに設定し，trans槽側の電極に電圧Ｖtransを印加する。電圧Ｖtransは，パルス発生器（41501B SMU AND Pulse Generator Expander, Agilent Technologies, Inc.）により発生する。

パルス印加後の電流値は，電流計１２１（4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER, Agilent Technologies, Inc.）で読み取った。ナノポア１１３の形成のために電圧を印加するプロセス及びイオン電流値を読み取るプロセスは，自作プログラム（Excel VBA, Visual Basic for Applications）で制御した。パルス電圧の印加前に形成されたナノポア１１３の直径に応じて電流値条件（閾値電流）を選択し，順次，ナノポア１１３の直径を大きくしつつ，目的とする直径を得る。

ナノポア１１３の直径は，イオン電流値から見積もった。条件選択の基準は表１の通りである。

ここで，ｎ番目のパルス電圧印加時間ｔ_n（ただし，ｎ＞２の整数。）は，次式で決定される。

ナノポア１１３の形成は，パルス電圧を印加する方法以外に，ＴＥＭによる電子線照射によっても可能である（A. J. Storm et al., Nat. Mat. 2 (2003)）。

上下２つの液槽１１２Ａ，１１２Ｂに設けられた電極１１５Ａ，１１５Ｂに電源１２０から電圧が印加されると，ナノポア１１３の近傍に電場が生じ，液中で負に帯電したDNA鎖１１６は，ナノポア１１３内を通過する。その際，前述した封鎖電流I_ｂ（図１−１）が流れる。

・液槽
薄膜１１１Ａに接触する測定溶液を収納できる液槽１１２Ａ，１１２Ｂは，封鎖電流の測定に影響を及ぼさない材質，形状及び大きさで，適宜設けることができる。これらの液槽１１２Ａ，１１２Ｂを仕切る薄膜１１１Ａに接液するように測定溶液が注入される。

・電極
電極１１５Ａ，１１５Ｂは，測定溶液中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質で作製されることが好ましく，典型的には，ハロゲン化銀又はハロゲン化アルカリ銀で作製される。電位安定性及び信頼性の観点からは，銀又は銀塩化銀を使用することが好ましい。

電極１１５Ａ，１１５Ｂは，分極電極となる材質で作製されてもよく，例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合，安定的なイオン電流を確保するために測定溶液に電子授受反応を補助することができる物質，例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することが好ましい。あるいは，電子授受反応を行うことが可能な物質，例えばフェロセン類をその分極電極表面に固定化することが好ましい。

電極１１５Ａ，１１５Ｂの構造は，全てが前記材質で構成されていてもよく，あるいは前記材質が下地材（銅，アルミニウムなど）の表面に被覆されていてもよい。電極の形状は特に限定されるものではないが，測定溶液と接液する表面積が大きくなる形状が好ましい。電極は配線と接合されて，測定回路へと電気的信号が送られる。

（５）電解質溶液の使用例
最後に，「（２）電解質溶液」で説明した実施例に係る組成の電解質溶液１１４の使用例を確認する。図１０は，ナノポア１１３の形成後の溶液の置換を行わない場合の手順である。この場合，最初に，液槽１１２Ａ及び１１２Ｂを「（２）電解質溶液」で説明した実施例に係る組成の電解質溶液１１４を封入し（１００１）。次に，電極１１５Ａ及び１１５Ｂに電圧を印加してナノポア１１３を形成する（１００２）。適切な直径のナノポア１１３が得られた段階で生体分子の特性解析処理を実行する（１００３）。

図１１に，ナノポア１１３の形成後に溶液を置換する場合の手順を示す。図１１には，図１０との対応部分に同一符号を付して示している。この場合，処理１００２でナノポア１１３が形成されると，液槽１１２Ａ及び１１２Ｂ内の電解質溶液１１４を交換する（１１０１）。新たに導入される電解質溶液１１４は，前述したように「（２）電解質溶液」で説明した実施例に係る組成の電解質溶液１１４でも良いし，既存の電解質溶液でも良い。

（６）他の実施例
本発明は，上述した実施例に限定されるものでなく，様々な変形例を含んでいる。例えば，上述した実施例は，本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり，必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また，ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることができる。また，ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また，各実施例の構成の一部について，他の実施例の構成の一部を追加，削除又は置換することもできる。

１００，２００，３００，４００…生体分子分析装置，
１１１…仕切り体，
１１１Ａ…薄膜，
１１１Ｂ，１１１Ｃ…薄膜固定部材，
１１２Ａ，１１２Ｂ…液槽，
１１３…ナノポア，
１１４…電解質溶液，
１１５Ａ，１１５Ｂ…電極，
１１６…DNA鎖，
１２０…電源，
１２１…電流計，
１３０…コンピュータ，
２０１…駆動機構，
２０２…生体分子固定部材，
２０３…制御ユニット，
３０１…注入口。

Claims

電解質溶液が満たされる第１の液槽と，
電解質溶液が満たされる１つ又は複数の第２の液槽と，
前記第１の液槽を満たす電解質溶液と１つ又は複数の前記第２の液槽を満たす電解質溶液とを仕切る薄膜と，
前記第１の液槽に設けられる第１の電極と，
前記第２の液槽に設けられる第２の電極と，
を有し，
前記電解質溶液は，
（ａ１）溶媒としてD_２Oを含む，
並びに，
（ａ２）前記電解質溶液中のカチオン種がCs及びNa，若しくは，Na及びLiである複数種の電解質を含む，若しくは，前記複数種の電解質及びトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む，若しくは，前記電解質溶液中のカチオン種がCsである電解質及び前記トリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む
生体分子分析用デバイス。
請求項１に記載の生体分子分析用デバイスにおいて，
前記薄膜には，ナノポアが形成されている
ことを特徴とする生体分子分析用デバイス。
請求項１に記載の生体分子分析用デバイスにおいて，
前記第１の液槽は，分析対象である生体分子を固定する生体分子固定部材を槽内に導入するための開口部を有する
ことを特徴とする生体分子分析用デバイス。
電解質溶液が満たされる第１の液槽と，電解質溶液が満たされる１つ又は複数の第２の液槽と，前記第１の液槽を満たす電解質溶液と１つ又は複数の前記第２の液槽を満たす電解質溶液とを仕切る薄膜と，前記第１の液槽に設けられる第１の電極と，前記第２の液槽に設けられる第２の電極と，を有する生体分子分析用デバイスと，
前記第１の電極と前記第２の電極の間に流れるイオン電流を計測する測定部と
を有し，
前記電解質溶液は，
（ａ１）溶媒としてD_２Oを含む，
並びに，
（ａ２）前記電解質溶液中のカチオン種がCs及びNa，若しくは，Na及びLiである複数種の電解質を含む，若しくは，前記複数種の電解質及びトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む，若しくは，前記電解質溶液中のカチオン種がCsである電解質及び前記トリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む
生体分子分析装置。
請求項４に記載の生体分子分析装置において，
前記第１の液槽は，分析対象である生体分子を固定する生体分子固定部材を槽内に導入するための開口部を有し，
更に，
前記生体分子固定部材を前記薄膜に近づける方向又は遠ざける方向に駆動する駆動機構と，
前記駆動機構の動作を制御する制御ユニットと
を有することを特徴とする生体分子分析装置。
請求項５に記載の生体分子分析装置において，
前記生体分子固定部材のうち前記薄膜と対向する面の面積は，前記薄膜を固定する薄膜固定部材に形成された貫通孔よりも広い
ことを特徴とする生体分子分析装置。
請求項４に記載の生体分子分析装置において，
分析対象とする生体分子は，核酸又はタンパク質である
ことを特徴とする生体分子分析装置。
請求項４に記載の生体分子分析装置において，
前記測定部は，
イオン電流の計測を開始する前に，前記電解質溶液が前記薄膜に接した条件下でナノポアを形成する処理を制御する
ことを特徴とする生体分子分析装置。
請求項４に記載の生体分子分析装置において，
前記測定部は，
測定された前記イオン電流の変化から分析対象である生体分子を分析する
ことを特徴とする生体分子分析装置。