JP6826047B2 - 生体分子測定装置 - Google Patents

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Description

本発明は、ナノポアを用いた生体分子測定装置に関する。
次世代ＤＮＡシーケンサとして、伸長反応及び蛍光ラベルを行わずにＤＮＡの塩基配列を電気的に直接計測する手法が注目を浴びている。これを実現するため、試薬を用いずＤＮＡ断片を直接計測して塩基配列を決定するナノポアＤＮＡシーケング方式の研究開発が活発に進められている。この方式は、ＤＮＡ鎖がナノポアを通過する際にＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種の違いを封鎖電流量で直接計測することで、塩基種を順次同定するという原理に基づく。鋳型ＤＮＡの酵素による増幅を行わない上に、蛍光体等の標識物を用いないため、本方式は、高スループット、低ランニングコスト、長塩基長解読につながると期待されている。
ナノポア方式の課題の１つとして、ナノポアを通過するＤＮＡの搬送制御が挙げられる。ＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種の違いを封鎖電流量で計測するには、計測時の電流ノイズ及びＤＮＡ分子の揺らぎの時定数から、ＤＮＡのナノポア通過速度を１塩基辺り１００μｓ以上にする必要があると考えられている。ナノポアを用いてＤＮＡをシーケンシングする際、ナノポアの上下に位置する電極を用いて電位勾配を形成し、負電荷を持つＤＮＡをナノポアへ通過させる。しかし、ＤＮＡのナノポア通過速度は通常１塩基当たり１μｓ以下と速く、各塩基由来の封鎖電流を十分に計測することが困難である。
搬送制御法の一つとして、固定プローブの先端に読取り対象のＤＮＡ末端を固定し、固定プローブの微小変位を外部駆動機構（モーターならびにピエゾ素子）で制御することで、ナノポアを通過するＤＮＡの運動を制御するものがある。
US 2006/0057585 A1
ナノポアデバイスを用いた生体分子測定装置で計測される信号は、生体分子を構成するモノマ分子種に応じて異なる準位を示す矩形階段信号となる。また、当該生体分子測定装置の信号応答速度は、ナノポアデバイス周辺に満たされている電解質溶液の溶液抵抗(ＲＬ)と、ナノポアデバイスの容量（Ｃs）と、ナノポアデバイスと固定プローブの接近に伴って生じる狭小領域のサイズで規定される通過抵抗（Ｒｇ）とによって定義される。
当該生体分子測定装置では、生体分子を解析する際にナノポアデバイスと固定プローブを接近させる。この接近に伴い、ナノポアデバイスと固定プローブとの間の距離は小さくなり、通過抵抗の上昇を招く。これは、信号時定数の低下を意味するため、取得される信号波形のなまり、及び、ＳＮ低下を招くことになる。
そこで、本発明は、溶液の通過抵抗を低減し、時定数の低下を抑制する技術を提供する。
上記課題の解決のため、本発明は、生体分子測定装置における固定部材（固定プローブ）及びナノポアデバイスの少なくとも一方に対して溝構造を形成し、通過抵抗の上昇を抑制する手法を提案する。
例えば、上記課題を解決するために、請求の範囲に記載の構成を採用する。本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例をあげるならば、電解質溶液が満たされる第１の液槽と、電解質溶液が満たされる第２の液槽と、ナノポアを有する薄膜を支持し、前記ナノポアを介して前記第１の液槽と前記第２の液槽を連通するように前記第１の液槽と前記第２の液槽の間に設けられたナノポアデバイスと、前記第１の液槽に配置され、前記薄膜より大きなサイズを有し、生体分子が固定される固定部材と、前記固定部材を前記薄膜に対して近づく方向あるいは遠ざかる方向に駆動する駆動機構と、前記第１の液槽に設けられた第１の電極と、前記第２の液槽に設けられた第２の電極と、前記固定部材と前記薄膜との接触を防止するストップ機構と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電源と、前記第１の電極と前記第２の電極の間に流れるイオン電流を計測する測定部とを備え、前記ナノポアデバイス及び前記固定部材の少なくとも一方は、前記ナノポアデバイス及び前記固定部材が対向する領域に溝構造を備えており、前記測定部は、前記固定部材に固定された前記生体分子が前記ナノポアを通過するとき計測されるイオン電流により当該生体分子の配列情報を取得する、生体分子測定装置が提供される。
また、他の例によれば、電解質溶液が満たされる第１の液槽と、電解質溶液が満たされる第２の液槽と、ナノポアを有する薄膜を支持し、前記ナノポアを介して前記第１の液槽と前記第２の液槽を連通するように前記第１の液槽と前記第２の液槽の間に設けられたナノポアデバイスと、前記第１の液槽に設けられた第１の電極と、前記第２の液槽に設けられた第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電源と、前記第１の電極と前記第２の電極の間に流れるイオン電流を計測する測定部とを備え、前記第１の液槽は、前記ナノポアの近傍の領域に微小流路を備え、前記ナノポアデバイスは、溝構造を備え、前記測定部は、生体分子が前記ナノポアを通過するとき計測されるイオン電流により当該生体分子の配列情報を取得する、生体分子測定装置が提供される。
また、他の例によれば、生体分子測定装置において生体分子を固定するための固定部材であって、当該固定部材の表面に溝構造が形成されている固定部材が提供される。
また、他の例によれば、生体分子測定装置用のナノポアデバイスであって、ナノポアを有する薄膜と、前記薄膜より外側に設けられ、前記ナノポアの周辺に空間を形成する空間形成部材とを備え、前記空間形成部材が溝構造を備える、ナノポアデバイスが提供される。
本発明によれば、溶液の通過抵抗を低減し、時定数の低下を抑制することができる。本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。
生体分子測定装置の構成例を説明する断面模式図である。 ナノポアデバイス及び周辺機構の等価回路の説明図である。 固定部材及びナノポアデバイスの間の距離と、溶液抵抗及び通過抵抗との関係を示すグラフである。 固定部材をナノポアデバイスへ接近させ、その後、固定部材をナノポアデバイスから離したときの信号模式図を示す。 溝を形成する範囲を説明する図である。 溝を形成する範囲を説明する図である。 駆動機構が固定部材をナノポアデバイスの僅か上方の位置で停止させる構成の例である。 図７の構成の場合の固定部材の平面図である。 駆動機構が固定部材をナノポアデバイスに接触させる構成の例である。 図９の構成の場合の固定部材の平面図である。 溝構造の一例である。 溝構造の一例である。 溝構造の一例である。 溝構造を形成していない従来の構成での通過抵抗Ｒを説明する図である。 溝構造を形成していない従来の構成での通過抵抗Ｒを説明する図である。 溝構造を備える構成での通過抵抗を説明する図である。 溝構造を備える構成での通過抵抗を説明する図である。 溝幅と溝ピッチの関係を変化させた際の溝深さと溶液抵抗の関係を示すグラフである。 ナノポア周辺に生成される電場とナノポアへの生体分子の導入例を示す模式図である。 ナノポア周辺に生成される電場とナノポアへの生体分子の導入例を示す模式図である。 溝とナノポアデバイスとの間の位置合わせ機構が無い場合の溝の構成を説明する図である。 溝とナノポアデバイスとの間の位置合わせ機構が無い場合の溝の構成を説明する図である。 溝とナノポアデバイスとの間の位置合わせ機構がある場合の溝の構成を説明する図である。 溝とナノポアデバイスとの間の位置合わせ機構がある場合の溝の構成を説明する図である。 溝構造を有する固定部材の一例である。 溝構造を有する固定部材の一例である。 溝構造を有する固定部材の一例である。 固定部材に溝構造を形成する方法の一例である。 固定部材に溝構造を形成する方法の一例である。 固定部材に溝構造を形成する方法の一例である。 固定部材に溝構造を形成する方法の一例である。 固定部材に溝構造を形成する方法の一例である。 ナノポアデバイスに溝構造を形成する方法の一例である。 ナノポアデバイスに溝構造を形成する方法の一例である。 ナノポアデバイスに溝構造を形成する方法の一例である。 ナノポアデバイスに溝構造を形成する方法の一例である。 ナノポアデバイスに溝構造を形成する方法の一例である。 溝構造の凹部及び凸部をそれぞれ異なる材料で作成する方法の一例である。 溝構造の凹部及び凸部をそれぞれ異なる材料で作成する方法の一例である。 溝構造の凹部及び凸部をそれぞれ異なる材料で作成する方法の一例である。 固定部材上に複数種の生体分子を固定する方法の一例である。 固定部材上に複数種の生体分子を固定する方法の一例である。 固定部材上に複数種の生体分子を固定する方法の一例である。 固定部材上に複数種の生体分子を固定する方法の一例である。 ナノポアデバイスと固定部材との間の位置関係を調節する機構の第１の例である。 ナノポアデバイスと固定部材との間の位置関係を調節する機構の第２の例である。 固定部材を用いない生体分子測定装置の構成例を説明する断面模式図である。 固定部材を用いない生体分子測定装置の上面図である。 固定部材への生体分子の結合手順及び固定部材の生体分子測定装置への設置手順の第１の例を説明する模式図である。 固定部材への生体分子の結合手順及び固定部材の生体分子測定装置への設置手順の第１の例を説明する模式図である。 固定部材への生体分子の結合手順及び固定部材の生体分子測定装置への設置手順の第１の例を説明する模式図である。 固定部材への生体分子の結合手順の第２の例を示す模式図である。 固定部材への生体分子の結合手順の第２の例を示す模式図である。 固定部材の駆動手順を示す模式図である。 固定部材の駆動手順を示す模式図である。 固定部材の駆動手順を示す模式図である。 固定部材の駆動手順を示す模式図である。 リンカーを介した結合の例を示す模式図である。 イオン電流信号の検出例を示す模式図である。 固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第１の例を示す模式図である。 固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第２の例を示す模式図である。 固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第２の例を示す模式図である。 固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第３の例を示す模式図である。 固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第３の例を示す模式図である。 ナノポアデバイス上への電極配置例を示す上面模式図である。 ナノポアデバイス上への電極配置例における対向電極の例である。 ナノポアデバイス上への電極配置例を示す上面模式図である。 生体分子固定部材−ナノポアデバイス間距離ｈと電流量の関係を示すグラフである。 生体分子事前引き伸ばし機構を有する生体分子測定装置の例を示す断面模式図である。 生体分子事前引き伸ばし機構を有する生体分子測定装置の例を示す断面模式図である。 生体分子事前引き伸ばし機構を有する生体分子測定装置を説明する図であり、ナノポア近傍の拡大図である。 生体分子事前引き伸ばし機構を有する生体分子測定装置を説明する図であり、ナノポア近傍の拡大図である。 生体分子事前引き伸ばし機構を有する生体分子測定装置の例を示す断面模式図である。 生体分子事前引き伸ばし機構を有する生体分子測定装置を説明する図であり、ナノポア近傍の拡大図である。 生体分子の先端から読み取られた信号の例を示す模式図である。 生体分子測定装置の一部の断面模式図及び駆動機構の上面模式図である。 複数の生体分子の解析を説明するための、ナノポア近傍の拡大図である。 複数の生体分子の解析を説明するための、ナノポア近傍の拡大図である。 ＤＮＡの塩基配列を読み取る方法の例を示す説明図である。 並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第１例を示す断面模式図である。 並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第１例を示す断面模式図である。 並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第２例を示す断面模式図である。 並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第２例を示す断面模式図である。 並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第３例を示す断面模式図である。 並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第３例を示す断面模式図である。 磁気ビーズを用いた測定手順を説明する断面模式図である。 磁気ビーズを用いた測定手順を説明する断面模式図である。 磁気ビーズを用いた測定手順を説明する断面模式図である。 生体分子固定部材の駆動に伴う封鎖電流解消の様子を示す図である。 生体分子固定部材の移動速度とＤＮＡ駆動時間の関係を示す図である。 二種ポリマ混合分子（（ｄＡ５０ｄＣ５０）ｍ）のイオン電流トレース例を示す図である。 ポーラス材料部を有する生体分子固定部材を示す図である。
以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている場合がある。
以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。各実施例で述べるナノポアとは、薄膜に設けられた表裏を貫通するナノサイズの孔である。薄膜は主に無機材料によって形成される。薄膜材料の例としてはＳｉＮ、ＳｉＯ２、Ｇｒａｐｈｅｎｅ、Ｇｒａｐｈｉｔｅ、Ｓｉなどがあるが、他に有機物質、高分子材料などを含むこともできる。ナノポアを有するナノポア薄膜は、ナノポアデバイス上の一部に形成されており、上下に支持膜を持たず縁部がナノポアデバイスに支持されて宙に浮いた構造を有する。本明細書で云う生体分子には、核酸、タンパク質、アミノ酸、長鎖高分子等が含まれる。
＜実施例１＞
本発明の搬送制御機構を有する生体分子測定装置、及びその装置を用いた生体分子の配列読取の例について説明する。図１は、生体分子測定装置の構成例を説明する断面模式図である。
本実施例の生体分子測定装置１００は、ナノポアデバイス（ナノポア基板とも言う）１０１により隔てられた上下２つの液槽１３１、１３２を有する。各液槽１３１、１３２には電解質溶液１０２が満たされている。電解質溶液としては、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、ＭｇＣｌ2などが用いられる。また、これらの溶液に対して、生体分子の自己相補鎖形成抑制のために４Ｍ以上のＵｒｅａや、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮａＯＨを混在させることも可能である。また、生体分子の安定化のため、緩衝剤を混在させることも可能である。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＰＢＳなどが用いられる。
ナノポアデバイス１０１には薄膜１１３が形成されており、薄膜１１３中のいずれかの位置にナノポア１１２が形成されている。上下２つの液槽１３１、１３２は、ナノポアデバイス１０１に支持された薄膜１１３のナノポア１１２を介して連通している。２つの液槽１３１、１３２には各々Ａｇ／ＡｇＣｌ電極１０３ａ、１０３ｂが電解質溶液１０２に接触するようにして配置されており、電極１０３ａ、１０３ｂ間には電源１０４及び電流計１０９が接続されている。電流計１０９は、ＡＤＣ（図示省略）及びＰＣ１１０に接続されており、ＰＣ１１０は、取得された電流値を記録できる。一方で、上部の液槽１３１には、駆動機構１０５が設置され、駆動機構制御ユニット１０６に接続されている。駆動機構１０５には接続部材１１１により生体分子固定部材（以下、単に固定部材という）１０７が連結している。固定部材１０７は、平面視において薄膜１１３より大きなサイズを有し、固定部材１０７の平坦な下面には生体分子１０８が固定される。
ナノポア１１２が形成された薄膜１１３に固定部材１０７が接触すると、薄膜１１３が破壊される恐れがある。そのため、駆動機構１０５によって駆動された固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に向かって降下するときに、固定部材１０７と薄膜１１３との接触を防止するためにストップ機構が設けられている。本実施例のストップ機構は、ナノポアデバイス１０１の薄膜１１３より外側の周囲を土手のように囲み、固定部材１０７と薄膜１１３の間に空間を形成する空間形成部材１１４である。空間形成部材１１４の中心に形成された円形空間の中にナノポア１１２を有する薄膜１１３が配置され、薄膜１１３の平面視における寸法は、固定部材１０７の寸法より小さい。従って、ナノポアデバイス１０１に向けて移動してきた固定部材１０７は、薄膜１１３に接触する前に空間形成部材１１４に突き当って停止し、薄膜１１３に接触して破壊することがない。
薄膜１１３の寸法は、薄膜強度及び電圧印加による穴形成の際に二個以上の穴が形成されにくい面積である必要があるため、一辺（薄膜１１３が矩形であれば辺の長さ、薄膜が円形であれば直径）の長さが１００〜５００ｎｍ程度であればよい。ＤＮＡ一塩基分解能を達成するために、一塩基相当の実効膜厚を有するナノポア１１２を形成可能な膜厚として、１ｎｍ程度が適当である。また、空間形成部材１１４の膜厚は、薄膜１１３の強度を保つことや、固定部材１０７の表面の生体分子の固定高さ揺らぎを考慮すると、２００〜５００ｎｍ程度が適当である。本実施例では、薄膜１１３の寸法は直径５００ｎｍ、空間形成部材１１４の膜厚は２５０ｎｍである。
封鎖電流計測方式では、ＤＮＡがナノポア１１２を通過する際の抵抗変化からＤＮＡを構成する塩基種を識別する。その際に取得される信号変化は、矩形であることが想定されている。
図２は、ナノポアデバイス及びその周辺環境の等価回路を示す。図２において、２０１は、ポア抵抗Ｒｐであり、２０２は、溶液抵抗及び通過抵抗の合成抵抗（ＲＬ＋Ｒｇ）であり、２０３は、ナノポアデバイス容量Ｃｓである。
図の系における、信号の時定数は、
τ＝（ＲＬ＋Ｒｇ）Ｃｓ
となる。
ここで、
Ｒｇ＝Ｌ／σＷｈ
で表現される。
固定部材１０７がナノポアデバイス１０１へ近接する際に、ｈの値が小さくなるため、溶液抵抗の上昇が起きる。図３は、簡単のためＬ＝Ｗ規定した場合のｈと抵抗（ＲＬ＋Ｒｇ）との関係を示す。固定部材１０７とナノポアデバイス１０１との間の距離が、３００ｎｍになったとき、総溶液抵抗は、２桁から３桁に上昇することが分かる。そのため、図４に示すように、固定部材１０７とナノポアデバイス１０１とが最接近したときに、信号のなまりが生じる。
ＤＮＡのナノポア通過速度と検出器の応答速度の関係から、信号の時定数は１０ｕｓ以下であることが求められる。つまり、基板容量Ｃｓが６００ｕＦであるとき、Ｒｇは１００ｋΩであることが必要である。
以下では、上記の抵抗上昇を抑制する構成について説明する。抵抗上昇を抑制するために、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲において、ナノポアデバイス１０１及び固定部材１０７の少なくとも一方が、溝構造を備える。
ここで、溝構造は、電解質溶液１０２に接している必要があり、電解質溶液中の、ナノポアデバイス１０１及び固定部材１０７が対向している領域に形成されている。溝は、凹凸構造で形成されてもよいし、固定部材１０７を貫通する孔構造で形成されてもよい。
図５及び図６は、溝を形成する範囲をより具体的に説明する図である。複数の溝１１５は、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲（図５及び図６の点線の範囲）で形成されればよい。図５は、複数の溝１１５が固定部材１０７のみに形成された例である。固定部材１０７のみに溝１１５を形成する場合、ナノポアデバイス１０１に形成するよりも、製造方法が簡単となり、コストを低減できる。図６は、複数の溝１１５がナノポアデバイス１０１のみに形成された例である。
ナノポアデバイス１０１と、固定部材１０７とが完全に接触した際に、ナノポア１１２の周辺空間（例えば、図１の空間１２１）と、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向していない領域における空間（例えば、図１の固定部材１０７側面側の空間１２２）は、電気的に接触している必要がある。上記要件が満たされている限りにおいて、溝構造は、連続して形成される必要はない。以下の例を挙げて説明する。
図７は、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に向かって降下するときに、固定部材１０７をナノポアデバイス１０１の僅か上方の位置で停止する構成の例である。図８は、図７の構成の場合の固定部材１０７の平面図である。図７に示すように、駆動機構１０５が、固定部材１０７をナノポアデバイス１０１の僅か上方の位置で停止するように制御する（固定部材１０７とナノポアデバイス１０１との間の相対距離が０とならない）。このような構成では、溝１１５が、固定部材１０７の縁部に到達するように延びている必要はない（図８）。すなわち、溝１１５は、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲の全域で連続して形成されている必要はない。この場合、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲内で、溝１１５が部分的に形成されていない領域があってもよい。
図９は、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に向かって降下するときに、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に接触する構成の例である。図１０は、図９の構成の場合の固定部材１０７の平面図である。図９に示すように、駆動機構１０５が、固定部材１０７をナノポアデバイス１０１に向かって降下させたとき、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に完全に接触する（固定部材１０７とナノポアデバイス１０１との間の相対距離が０となる）。このような構成では、上記要件を満たすために、溝１１５は、固定部材１０７の縁部（すなわち、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲の末端）に到達するように延びている必要がある（図１０）。すなわち、溝１１５は、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲の全域で連続して形成されている。
図１１、図１２、及び図１３は、溝構造の例を示す。溝構造は、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲で連続的に形成されていればよい。図１１の例では、複数の溝１１５が、ナノポアデバイス１０１の空間形成部材１１４のみに形成されている。
なお、溝構造は、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７の両方に形成されてもよい。図１２の例では、固定部材１０７の外周部分が複数の溝１１５を備え、かつ、ナノポアデバイス１０１の空間形成部材１１４におけるナノポア１１２の周辺部分が複数の溝１１５を備えている。このように、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲で、複数の溝１１５が、上側の固定部材１０７と、下側のナノポアデバイス１０１との間で連続して形成されてもよい。
図１３の例では、固定部材１０７が、ナノポア１１２の周辺の領域において複数の溝１１５を備えており、かつ、ナノポアデバイス１０１が、上記領域の外側において複数の溝１１５を備えている。
溝１１５の寸法について説明する。図１４及び図１５は、溝構造を形成していない従来の構成での通過抵抗Ｒを説明する図である。これに対して、図１６及び図１７は、本実施例の溝構造を備える構成での通過抵抗Ｒ１を説明する図である。
溝構造の各寸法を、図１６及び図１７によって定義すると、Ｒ１は、以下で表される。
Ｒ１ ＝ （Ｌ−ｎＬ１）／（Ｗｈ０＋ｗ１ｈ１ｎ）
図１８は、溝幅と溝ピッチの関係を変化させた際の溝深さと溶液抵抗の関係を示すグラフである。ここで、αは、ｗ１とｗ２の比であり、ｗ１＝α×ｗ２である。グラフに示すように、３つのα値（α＝１．５、 ２、 ３）についてｈ０＝０のときの溶液抵抗を測定した。また、グラフにおいて、「ｈ０＿１００ｎｍ」の表記は、ｈ０＝１００ｎｍであることを示す。ここでは、３つのα値についてｈ０＝１００ｎｍのときの溶液抵抗を測定した。また、「系列４」は、溶液抵抗の目標値である。
例えば、ｗ１＝１．５×ｗ２の構成において、溝１１５の掘り込み深さが５μｍ程度の場合、目標値を達成することができる。一例として、溝１１５の掘り込み深さは、５μｍ以上であることが好ましい。
固定部材１０７をナノポアデバイス１０１に最も近づけた際に、溝１１５を形成したことによって生じる、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７との間の間隙の総体積が溶液抵抗の低下に十分寄与できればよい。したがって、上記のように溶液抵抗の低下に十分に寄与するならば、溝１１５のピッチ（上記のw2に対応する）及び幅（上記のw１に対応する）は、溝１１５を形成した部位の全体において、一様である必要はない。
次に、生体分子１０８（例えば、ＤＮＡ）の固定方法について説明する。図２１は、固定部材が溝を備える場合のナノポア近傍の拡大図である。溝１１５が形成された部位には、凸部１１５ａと凹部１１５ｂが形成される。ここで、凸部１１５ａにはＤＮＡが固定されるため、凸部１１５ａの幅は、ＤＮＡ固定ピッチ以上のサイズを有している必要がある。ＤＮＡ固定ピッチは、その性質上１００ｎｍ間隔であることが考えられる。したがって、例えば、溝１１５が形成された部位の凸部の幅は、１００ｎｍ以上であることが望ましい。
ここでは、溝１１５とナノポアデバイス１０１との間の位置合わせ機構が無い場合を想定する。図２１に示すように、ナノポア１１２と溝１１５の凸部１１５ａの位置関係によらず、固定部材１０７上のＤＮＡがナノポア１１２近傍に形成される電位勾配８０１によって引き寄せられる必要がある。したがって、溝１１５のピッチ（上記のｗ２に対応する）は、３００ｎｍ以下であることが必要である。図２１及び図２２は、溝１１５のピッチが３００ｎｍ以下である例である。図２１では、溝１１５の凸部１１５ａがナノポア１１２の直上に配置されているため、ＤＮＡが電位勾配８０１によって引き寄せられる。また、図２２のように、溝１１５の凸部１１５ａがナノポア１１２の直上に配置されていない場合でも、溝１１５のピッチが３００ｎｍ以下であることから、ＤＮＡが電位勾配８０１によって引き寄せられることが可能である。
次に、溝１１５とナノポアデバイス１０１との間の位置合わせ機構が有る場合を想定する。この場合、溝１１５のピッチ（上記のｗ２に対応する）が３００ｎｍ以上の場合でも、ＤＮＡのナノポア１１２への導入を達成することができる。図２３及び図２４は、溝１１５のピッチが３００ｎｍより大きい例である。図２４に示すように、溝１１５の凸部１１５ａがナノポア１１２の直上に配置されていない場合、ＤＮＡを電位勾配８０１によって引き寄せることができない。位置合わせ機構がある場合、図２３に示すように、固定部材１０７を薄膜１１３の面に平行な方向に移動することにより、溝１１５の凸部１１５ａをナノポア１１２の直上に配置することができる。なお、溝１１５とナノポアデバイス１０１との間の位置合わせ機構については、後述の実施例で説明する。
空間形成部材１１４は、任意の形状で構成することが可能であるが、図１に示すような構成ではなく、ナノポアデバイス１０１上に形成される凸部である場合に以下の制限がある（例えば、図８０の空間形成部材の場合など）。空間形成部材の幅を超える寸法で、溝１１５の幅（上記のｗ１に対応する）を形成した場合、固定部材１０７をナノポアデバイス１０１に完全に接触させた際に、高抵抗領域が出来てしまう。したがって、固定部材１０７とナノポアデバイス１０１との完全接触を避けるか、又は、溝１１５の幅を空間形成部材の幅以下に制限する必要がある。
図２５〜図２７は、溝構造を有する固定部材の一例である。溝構造の断面は、図１に示す矩形のみならず、三角形、半月形、又は台形であってもよい。
次に、固定部材１０７に溝構造を形成する方法を図２８〜図３２を用いて説明する。まず、固定部材となるシリコン基板１０７を用意する（図２８）。次に、シリコン基板１０７上にレジスト１１０１を塗布する（図２９）。次に、レジスト１１０１を目的の寸法でパターニングする（図３０）。次に、シリコン基板１０７をドライエッチングにより削り、溝１１５を形成する（図３１）。シリコン基板１０７上のレジスト１１０１を除去する（図３２）。なお、レジストなどを使用せずに、ダイシングブレードによって、シリコン基板１０７を加工し、溝１１５を形成してもよい。この例では、溝構造の凹部及び凸部が同一材料で形成される。
次に、ナノポアデバイスに溝構造を形成する方法を図３３〜図３７を用いて説明する。溝１１５の形成処理は、ナノポアデバイス１０１の作製工程の中に入れ込むのが良い。ナノポアデバイス１０１の基板となるシリコン基板３３０１を用意する（図３３）。シリコン基板３３０１上に窒化膜、酸化膜、及び窒化膜を成膜し、シリコン基板３３０１の裏面に窒化膜を成膜し、成膜後のシリコン基板３３０１の最上面にレジスト１１０１を塗布する（図３４）。
次に、レジスト１１０１を目的の寸法でパターニングする（図３５）まず、薄膜開口用のパターニング、及び、シリコンエッチング用のパターニングを行う。ここでのパターンによって薄膜１１３及びナノポア１１２の位置が特定されるため、上記のパターンを目印にして、レジスト１１０１に対して、溝構造用のパターニングを行う。別の例として、溝構造を作成するために、ダイシングブレードによる削りを入れてもよい。作成されたパターンに従って表面及び裏面に対してエッチングを行う（図３６）。最終的にレジスト１１０１を削除し、ナノポアデバイス１０１上に溝１１５を形成することができる（図３７）。
次に、溝構造の凹部及び凸部をそれぞれ異なる材料で作成する方法を図３８〜図４０を用いて説明する。溝構造の凹部及び凸部をそれぞれ異なる材料で作成することにより、固定部材１０７上で生体分子１０８を固定する領域と固定しない領域とに分けることが可能となる。
本例は、基本的には、図２８〜図３２で説明した方法と同じであるが、溝用の加工を行う前に２つの膜を成膜する点で異なる。まず、固定部材となるシリコン基板１０７を用意する（図３８）。次に、シリコン基板１０７上に、生体分子１０８が結合しにくい第１の膜１３０２を成膜し、その後、生体分子１０８が結合し易い第２の膜１３０１を成膜する（図３９）。次に、第２の膜１３０１をエッチングする（図４０）。なお、エッチングの際には、第１の膜１３０２でエッチストップが起こるようにガス種を選択する。
上記の例において、第１の膜として、ｐｏｌｙＳｉ膜を用いてもよい。また、第２の膜として、金、ニッケル、チタンなどを用いてもよい。その場合、ＡＰＴＥＳはＳｉ膜に成膜され、金属部には結合しない構成をとることが可能となる。
上記で説明した固定部材１０７の全面に対して、生体分子１０８（例えば、ＤＮＡ）は結合しうるが、上記の通り、溝構造の材料は選択可能である。溝構造の材料を選択し、例えば、溝１１５の凸部（すなわち、上記の第２の膜１３０１）にのみＤＮＡが固定できることは、信号の信頼度を上昇させるのみならず、ＤＮＡをより長く読む点においても有効である。
図３８〜図４０で説明した通り、対象とする生体分子１０８が固定不可能な材料を第１の層としてシリコン基板上に成膜し、生体分子１０８が固定可能な材料を第２の層として第１の層上に成膜する。その後、第２の層に対して溝１１５を形成する。このとき、第２の層と第１の層とでエッチレートが異なるガスを用いてエッチングを行う。別の例として、第１の層と第２の層との間に第３の膜を成膜しておき、第３の膜をエッチングストップの役割として用いてもよい。最後にエッチャントで除去することで、同様の構造を作製することも可能である。
Ｓｉ層のパターニングには、ドライエッチングではなく、Ｓｉ層上に更に窒化シリコン層を形成し、その後、窒化シリコン層をパターニングしてＳｉ層のエッチングマスクとしてもよい。また、ＫＯＨによるウエットエッチングを行ってもよい。この場合、溝の断面は、台形状又は三角形となる。
固定部材１０７上の生体分子１０８は、固定部材１０７上に予め固定された異なる生体分子（例えば、ＡＰＴＥＳや、チオール、任意の配列を有したＰＮＡなど）を介して結合してよい。ここで、固定部材１０７上の複数種の生体分子を用意する際には、溝構造を、固定位置アドレスを決める手段として用いることが可能である。
図４１〜図４４は、固定部材上に複数種の生体分子を固定する方法の一例である。まず、セレクションマーカを固定部材１０７に固定する。このとき、マーカ原液１４０３を、マスク１４０２を用いて、インクジェット方式によって、溝１１５を備える固定部材１０７に塗布する（図４１）。これにより、セレクションマーカ１４０１を固定部材１０７に固定する。マーカ原液１４０３に関して、固定対象の生体分子に合わせて、アドレス（固定部材１０７の領域）毎に異なる種類の原液を選択する。
次に、複数種の生体分子を含む生体分子混合液１４０４を固定部材１０７に流す（図４２）。このとき、静電相互作用によりセレクションマーカ１４０１に生体分子が結合する。セレクションマーカ１４０１と生体分子（ＤＮＡ）は、任意の配列が一致した場合のみにおいて強固に結合するため、各セレクションマーカ１４０１に対応づけられたＤＮＡを結合させることができる（図４３）。図４４は、上記のプロセスを実行した後の固定部材の平面図である。図４４に示すように、固定部材１０７のアドレスごとに、複数の異なる生体分子１４０４ａ、１４０４ｂ、１４０４ｃを結合することができる。
ナノポアデバイスの作成法及びナノポアの形成法は既知であり、例えばItaru Yanagi et al.、 Sci. Rep. 4、 5000 (2014) に記載されている。本実施例では、ナノポアを形成する薄膜を以下の手順で作製した。まず、７２５μｍ厚の８インチＳｉウエハの表面に、Ｓｉ3Ｎ4／ＳｉＯ2／Ｓｉ3Ｎ4を１２ｎｍ／２５０ｎｍ／１００ｎｍ、裏面にＳｉ3Ｎ4を１１２ｎｍ成膜した。次に、表面最上部のＳｉ3Ｎ4を５００ｎｍ四方、及び裏面のＳｉ3Ｎ4を１０３８μｍ四方、それぞれ反応性イオンエッチングした。さらに裏面のエッチングにより露出したＳｉ基板をＴＭＡＨ（Tetramethylammonium hydroxide）にてエッチングした。Ｓｉエッチングの間は、表面側ＳｉＯエッチングを防ぐために、ウエハ表面を保護膜で覆った。保護膜を取り除いた後、５００ｎｍ四方で露出しているＳｉＯ層をＢＨＦ溶液（ＨＦ／ＮＨ4Ｆ＝１／６０、８ｍｉｎ）にて取り除いた。これにより、膜厚１２ｎｍの薄膜Ｓｉ3Ｎ4が露出したナノポアデバイスが得られる。この段階では、薄膜にナノポアは設けられていない。
ナノポアデバイスに露出した薄膜へのナノポア形成は、パルス電圧により以下の手順で行った。上記のようにして作成したナノポアデバイスを生体分子測定装置にセットする前に、Ａｒ／Ｏ2 plasmaによって１０Ｗ、２０ｓｃｃｍ、２０Ｐａ、４５ｓｅｃの条件でＳｉ3Ｎ4薄膜を親水化した。次に、ナノポアデバイスを介して上下２槽に分離する構成の生体分子測定装置にナノポアデバイスをセットした後、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５溶液を満たし、各槽にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を導入した。
ナノポアを形成するための電圧印加及びナノポアが形成された後にナノポアを介して流れるイオン電流計測は、このＡｇ／ＡｇＣｌ電極間で行われる。下槽をcis槽、上槽をtrans槽と呼び、cis槽電極側の電圧Ｖcisを０Ｖに設定し、trans槽電極側の電圧Ｖtransを選択した。選択された電圧は、パルス発生器で印加した。各パルス印加後の電流値は電流アンプで読み取った。ナノポア形成のための電圧印加及びイオン電流読取のプロセスは、プログラムによって制御した。パルス電圧印加条件は、パルス電圧印加前に薄膜に形成されているポア径に応じて取得される電流値条件（閾値電流）を選択することで、順次ポア径を大きくし、目的のポア径を得た。ポア径はイオン電流値から見積もった。条件選択の基準は表１の通りである。ここでｎ番目のパルス電圧印加時間は
ｔn＝１０-3+(1/6)(n-1)−１０-3+(1/6)(n-2) for ｎ＞２
で決定される。
Figure 0006826047
ナノポアの形成は、パルス電圧印加による以外に、ＴＥＭによる電子線照射によっても可能である（A. J. Storm et al.、 Nat. Mat. 2 (2003)）。
図１に戻り、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極１０３ａ、１０３ｂを介して電源１０４から上下２槽の液槽１３１、１３２に電圧が印加されると、ナノポア１１２の近傍に電場が生じ、液中で負に帯電した生体分子１０８が、ナノポア１１２内を通過する。一方で、生体分子１０８の末端は固定部材１０７に固定されているため、電場により生体分子１０８を介して固定部材１０７及び駆動機構１０５が下槽の方向に引っ張られる。
ここで、例えばＤＮＡの塩基配列を精度よく読み取るためには、駆動機構５の出力揺らぎ、及び外乱由来の振動が起きた際に、生体分子１０８の変位が１塩基分の長さ、すなわち０．３４ｎｍ以上変化しない構成である必要がある。
次に、この要件を満たすための条件について検討する。ヤング率Ｅとすると、Ｅは次のように表される。
Figure 0006826047
ここで、Ｆは系に印加される力、Ｓは材料の面積、Ｌは材料の長さ、ΔＬは印加された力を受けた際の変位量である。ナノポアを介して、上下に１ｍＶ印加した際に、ＤＮＡにかかる力は０．２４ｐＮであることが分かっている（Ulrich F. Keyser et al.、 Nat. Phys. 2、 473-477 (2006)）。解析中の印加電圧の揺らぎが０．１ｍＶ程度起こりうることから、その際０．３４ｎｍ以上変位しないことが必要である。従って、固定部材１０７と駆動機構１０５及びその接続部材１１１のヤング率は、０．０７（Ｌ／Ｓ）［μＮ／ｍｍ２］以上を有する必要がある。
また、計測システムが熱的に安定であることも重要である。熱源がない場合でも、空間は０．１度の揺らぎを持つことが知られている。したがって、系に用いた材料全体から算出される、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７との間の距離の温度変化が０．１℃あたり０．３４ｎｍ以下である必要がある。
そのため、接続部材１１１として、ステンレス製又はインバーなどを用いて作製されたネジ等が用いられてもよい。別の例として、固定部材１０７が、駆動機構１０５に真空吸着あるいは圧着して固定されてもよい。駆動機構１０５は、ピエゾ素子に代表される圧電材料で形成されており、０．１ｎｍ／ｓ以上の駆動が可能である。圧電材料としては、チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ3）、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）、及び酸化亜鉛（ＺｎＯ）などが用いられる。
生体分子１０８の末端と固定部材１０７の表面は、互いに共有結合、イオン結合、静電相互作用、磁気力などで結合することができる。例えば、共有結合でＤＮＡを固定する際には、ＡＰＴＥＳ、グルタルアルデヒドを介してＤＮＡ末端修飾されたＤＮＡを固定することができる。固定部材１０７が上記結合を利用するために、ＡＰＴＥＳの足場となるＳｉ、ＳｉＯが利用される。他の共有結合法としては、金チオール結合が利用できる。ＤＮＡの５’末端をチオール修飾し、固定部材１０７の表面は金蒸着する。固定部材１０７に蒸着する金属種として、他にも、チオールが結合可能なＡｇ、Ｐｔ、Ｔｉを利用できる。
イオン結合を利用する方法は、固定部材１０７を表面修飾により溶液中で正に帯電する処理を施すことにより、正に帯電した固定部材１０７の表面に負に帯電した生体分子を固定する方法である。カチオン性のポリマとしては、ポリアニリンやポリリシンが用いられる。静電相互作用を利用する場合には、ＡＰＴＥＳ修飾した固定部材１０７の表面に直接アミノ末端修飾されたＤＮＡを固定することができる。また、固定部材１０７の基板表面として、ニトロセルロース膜、ポリフッ化ビニリデン膜、ナイロン膜、ポリスチレン基板が広く利用される。特にニトロセルロース膜は、マイクロアレイ技術に利用されている。磁気力を利用する際には、例えば磁気ビーズ表面に上記のような結合を利用して、ＤＮＡを予め固定化しておく。さらに、固定部材１０７として磁石材料を用いることで、ＤＮＡを固定化した磁気ビーズと固定部材１０７を相互作用させ、磁力によるＤＮＡ固定化磁気ビーズの吸引を実現する。磁性材料としては、鉄、ケイ素鋼、アモルファス磁性合金、ナノクリスタル磁性合金などが用いられる。
生体分子としてタンパク質やアミノ酸を測定する場合においても同様に、特異結合部位への修飾を施し、同様の手法にて固定部材１０７に結合させることが出来る。これによってタンパク質中の結合部位の特定、及びアミノ酸の配列情報を得ることが出来る。
固定部材１０７上の生体分子１０８の固定密度は、ナノポア１１２周辺に形成される電場の広がり量で決める。図１９は、ナノポア周辺に生成される電場とナノポアへの生体分子の導入例を示す模式図である。図１９に示すように、ナノポア１１２の周辺に広がる電位勾配８０１は、ナノポア１１２からの距離Ｌ、ナノポア径ｄ、薄膜の厚みｔ、印加した電圧ΔＶの間に、以下の関係がある。
Figure 0006826047
例えば、膜厚２．５ｎｍの薄膜に形成された直径１．４ｎｍのナノポアを挟んで１００ｍＶの電圧を印加した場合、ナノポア１１２から１００ｎｍの領域で、０．１［Ｖ／μｍ］の電場が伝播している。
ここで、生体分子の電気的移動度μ及び拡散係数Ｄから、生体分子がこの電場に閉じ込められてナノポアに導入される範囲を求めることができる。その範囲をＬdiffとすると、次式で表される。
Figure 0006826047
固定部材１０７が薄膜１１３に最も近づいた際の距離をｌとする。また、生体分子の溶液中での実効長さをｂとすると、以上から、生体分子固定ピッチａは次のようになる。
Figure 0006826047
上記を実現するため、例えば固定部材１０７上にＤＮＡを修飾する際、目的のＤＮＡ以外に、末端修飾された短鎖長ポリマ２０６を混在させたＤＮＡ溶液を用いる。図２０は、ナノポア周辺に生成される電場とナノポアへの生体分子の導入例を示す模式図である。図２０に示すように、生体分子（ＤＮＡ）１０８が末端修飾された短鎖長ポリマ２０６と混在して固定され、目的のＤＮＡ固定密度が実効的に低いＤＮＡ固定部材を作製できる。例えば、２０ｍｅｒ ｐｏｌｙ（ｄＡ）を７５％含むＤＮＡ溶液を用いて固定部材を用意すると、２．５〜３ｎｍのポア径を有するナノポアを用いて、一つのポアに複数本のＤＮＡが入る現象を排除できることを確認している。つまり約１００ｎｍピッチで固定できていると考えられる。混合する短鎖ポリマの長さは、２ｎｍ程度とは限らない。
上記実施例によれば、生体分子の固定領域（固定部材１０７の平面サイズ）がナノポア１１２を有する薄膜１１３の平面サイズ以上である生体分子測定装置１００において、固定部材１０７及びナノポアデバイス１０１の少なくとも一方に溝構造が形成される。これにより、通過抵抗の上昇を抑制することができる。ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが完全接触した際でも溶液通路抵抗が抑制されるために、溝１１５は、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７とが対向している範囲にわたって連続して形成されてもよい。
生体分子測定装置１００の一例は、電解質溶液１０２が満たされる第１の液槽１３１と、電解質溶液１０２が満たされる第２の液槽１３２と、ナノポア１１２を有する薄膜１１３を支持し、ナノポア１１２を介して第１の液槽１３１と第２の液槽１３２を連通するように第１の液槽１３１と第２の液槽１３２の間に設けられたナノポアデバイス１０１とを備える。第１の液槽１３１には、生体分子１０８が固定される固定部材１０７が配置されている。固定部材１０７の生体分子固定領域（ナノポアデバイス１０１に対向する平面のサイズ）は、薄膜１１３の平面サイズより大きい。生体分子測定装置１００は、固定部材１０７を薄膜１１３に対して近づく方向又は遠ざかる方向に駆動する駆動機構１０５と、駆動機構１０５を制御する駆動機構制御ユニット１０６とを備える。
第１の液槽１３１には第１の電極１０３ａが配置され、第２の液槽１３２には第２の電極１０３ｂが配置されている。固定部材１０７と薄膜１１３との接触を防止するためにストップ機構として、ナノポアデバイス１０１には、薄膜１１３より外側の周囲を土手のように囲み、固定部材１０７と薄膜１１３の間に空間を形成する空間形成部材１１４が設けられている。第１の電極１０３ａと第２の電極１０３ｂとの間には、電圧を印加する電源１０４が設けられている。また、第１の電極１０３ａと第２の電極１０３ｂとの間には、第１の電極１０３ａと第２の電極１０３ｂとの間に流れるイオン電流を計測する測定部（電流計１０９及びＰＣ１１０）が設けられている。測定部は、その一端が固定部材１０７に固定された生体分子１０８がナノポア１１２を通過するとき計測されるイオン電流から、当該生体分子１０８の配列情報を取得する。このとき、上記の溝１１５の構造によって、通過抵抗の上昇を抑制し、時定数の低下を抑制することができる。その結果、取得される信号波形のなまりが無くなり、ＳＮが向上する。
上記構成により、生体分子の構造を反映した信号変化に対し、高速応答することを可能とし、高精度な読取りを実現する。また、上記実施例では、ナノポア１１２の薄膜１１３内の位置確認をせずに生体分子１０８のナノポア１１２への導入を実現でき、安定した封鎖信号の取得を実現できる。
＜実施例２＞
次に、溝構造を利用した位置合わせ機構について説明する。図４５は、ナノポアデバイスと固定部材との間の位置関係を調節する機構の第１の例である。図４５において、上述した構成要素と同じ構成要素については、同じ符号を付して、それらの説明を省略する。
上記のように、溝１１５のピッチが広い場合、固定部材１０７上に複数種の生体分子１０８が固定されている場合、固定部材１０７及びナノポアデバイス１０１の両方に溝１１５が形成されている場合については、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７との間の位置関係の調節が必要となる。
生体分子測定装置１５００は、図１に示す構成要素に加え、レーザ照射ユニット１５０１と、ミラー１５０３と、レーザ１５０２の照射によって取得されたデータをフィードバックする機構（相対位置モニタ）１５０４と、固定部材１０７の回転機構１５０６と、固定部材１０７のｘｙ方向の調整機構１５０７と、回転機構１５０６及び調整機構１５０７を制御する制御ユニット１５０５とを備える。
制御ユニット１５０５は、相対位置モニタ１５０４からのデータを用いて回転機構１５０６及び調整機構１５０７を制御し、固定部材１０７の回転及びｘｙ方向の移動を制御することができる。一例として、制御ユニット１５０５は、レーザ照射により画像化された溝構造を、ナノポアデバイス１０１上に形成されたパターンと合わせるように、固定部材１０７の回転及びｘｙ方向を調整してよい。
溝１１５を備える固定部材１０７又はナノポアデバイス１０１は、位置合わせ機構としての機能も果たし得る。位置合わせ機構を実現する構成の一例として、レーザ照射により溝構造を画像化する測定部（制御ユニット１５０５）を設けてもよい。この測定部による結果に応じて、回転機構１５０６及び調整機構１５０７によって、固定部材１０７の回転及びｘｙ方向を調整してよい。これにより、溝構造とナノポアデバイスとの間の相対位置を調整することができる。
図４６は、ナノポアデバイスと固定部材との間の位置関係を調節する機構の第２の例である。位置合わせ機構として、ナノポアデバイスの周辺の溶液抵抗そのものを用いてもよい。生体分子測定装置１５１０は、図１に示す構成要素に加え、固定部材１０７の回転機構１５１１を備える。この例では、駆動機構制御ユニット１０６が、測定された溶液抵抗を入力として受け取る。駆動機構制御ユニット１０６が、溶液抵抗をモニタしつつ、回転機構１５１１を制御して固定部材１０７を回転させる。
ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７との間の位置がずれている場合、溶液抵抗が高い状態になる。駆動機構制御ユニット１０６が、溶液抵抗をモニタしつつ、固定部材１０７の軸を回転させることにより、固定部材１０７の溝１１５の位置を所望の位置に移動させる。これにより、溶液抵抗が低下する。図４６の構成は、レーザ源等が必要ないため、装置構成を簡略化することができる。
＜実施例３＞
溶液抵抗の上昇は、固定部材１０７を用いた搬送制御システムの課題には限らない。ナノポア１１２周辺の構造がマイクロオーダーの領域に狭められているナノ流路の構成においても、起こりうる課題である。以下では、固定部材を用いない生体分子測定装置の構成例を説明する。
図４７は、固定部材を用いない生体分子測定装置の構成例を説明する断面模式図である。図４８は、図４７の生体分子測定装置の上面図である。
生体分子測定装置１６００は、電解質溶液１０２が満たされる第１の液槽１６２１と、電解質溶液１０２が満たされる第２の液槽１６２２とを備える。第１の液槽１６２１は、ナノサイズ又はマイクロサイズの流路（微小流路）１６０１を備える。本例では、流路１６０１は、マイクロ流路である。
生体分子測定装置１６００は、上記の実施例と同様に、ナノポアデバイス１０１を備える。ナノポアデバイス１０１は、ナノポア１１２を有する薄膜１１３と、溝１１５を有する空間形成部材１１４とを備える。ナノポアデバイス１０１は、ナノポア１１２を介して第１の液槽１６２１と第２の液槽１６２２を連通するように第１の液槽１６２１と第２の液槽１６２２の間に配置されている。
第１の液槽１６２１には第１の電極１０３ａが配置され、第２の液槽１６２２には第２の電極１０３ｂが配置されている。第１及び第２の電極１０３ａ、１０３ｂ間には電源１０４及び電流計１０９が接続されている。電流計１０９は、ＡＤＣ（図示せず）及びＰＣ１１０に接続され、ＰＣ１１０は、取得された電流値を記録できる。したがって、電流計１０９を用いて、生体分子がナノポア１１２を通過するとき計測されるイオン電流から当該生体分子の配列情報を取得することができる。
本例では、第１の液槽１６２１が、インレット１６０２と、アウトレット１６０３とを有する。図４８に示すように、インレット１６０２とアウトレット１６０３との間であって、ナノポア１１２の近傍の領域がマイクロ流路１６０１となっている。
このような構成において、マイクロ流路１６０１が狭いほど、ナノポア１１２への生体分子導入効率、流路の閉塞、生体分子の導入順序などを制御することが可能となる。一方で、イオン電流を用いて解析を行う際、マイクロ流路１６０１の長さ及び断面積に応じて、回路の時定数低下を招く。
第１の液槽１６２１と第２の液槽１６２２の間に設けられたナノポアデバイス１０１において、第１の液槽１６２１に接触している空間形成部材１１４が、溝１１５を備える。本例において、溝１１５は、第１の液槽１６２１におけるナノポア１１２の近傍の領域であって、流路が狭くなっている領域（すなわち、流路１６０１）の範囲内で、空間形成部材１１４上に形成されている（図４７）。溝構造を形成することにより、信号時定数の低下を防ぐことが可能となる。
上記のように、固定基板を用いない、狭小流路内に存在するナノポア１１２を用いた生体分子測定装置１６００においても溶液抵抗の上昇が生じ得る。したがって、固定基板を用いない生体分子測定装置１６００においてもナノポアデバイス１０１上に溝構造（又は凹部）を形成することが有効である。
＜実施例４＞
図４９〜図５１は、固定部材への生体分子の結合手順及び固定部材の生体分子測定装置への設置手順の第１の例を説明する模式図である。説明を簡単にするために、電極及び溝１１５の図示を省略している。測定前の準備工程は３つの工程を含む。図４９に示す第１の工程では、固定部材１０７上に生体分子１０８を固定する。図５０に示す第２の工程では、固定部材１０７と駆動機構１０５を接続し、生体分子測定装置の上槽に挿入する。図５１に示す第３の工程では、ナノポアデバイス１０１の上下の空間に電解質溶液１０２を導入する。
図５２〜図５３は、固定部材への生体分子の結合手順の第２の例を示す模式図である。説明を簡単にするために、電極及び溝１１５の図示を省略している。測定前の準備工程は２つの工程を含む。図５２に示す第１の工程では、固定部材１０７を駆動機構１０５に接続し、生体分子測定装置の上槽に挿入する。図５３に示す第２の工程では、固定部材１０７に結合しうる状態の生体分子１０８が溶解している生体分子混合電解質溶液４０３を生体分子測定装置の上槽と下槽に流し込む。
ここで、生体分子を固定部材の表面に結合するための結合材料は、非特異的な吸着を極力少なくし、固定部材の表面上で目的の結合が行われる密度を高めるために、予め固定部材１０７の表面に修飾しておくことが必要である。結合材料とは、例えば、ＡＰＴＥＳグルタルアルデヒドを介した共有結合を利用して生体分子を固定する場合、ＡＰＴＥＳ及びグルタルアルデヒドのことを指す。イオン結合を利用して生体分子を固定する場合、基板表面の有機材料のことを指す。
生体分子が長鎖ＤＮＡである場合、特に複数のグアニンが続けて並んでいるような配列においては、ＤＮＡの強固なフォールディングが問題になる。ＤＮＡがフォールディングを起こしていると、ナノポア近傍で詰まり、ナノポアを通過しないなどの現象が起きうる。そのため、高温、特に６０℃から９８℃で１０分から１２０分、ＤＮＡを固定した固定部材を水中で加熱し、４℃まで急冷する処理を施すのが良い。その後、４℃又は室温のＫＣｌ溶液中で測定する。
図５４〜図５７は、固定部材の駆動手順を示す模式図である。説明を簡単にするために、電極及び溝１１５の図示を省略している。固定部材１０７の駆動法は、三つの工程を含む。図５４は、上記の第１の例又は第２の例に示した手順により、測定すべき生体分子１０８が下面に固定された固定部材１０７が生体分子測定装置の上部の液槽に挿入され、上下の液槽に電解質溶液が導入されて測定準備ができた状態を示している。
図５５に示す固定部材駆動の第１の工程では、駆動機構制御ユニット１０６が、駆動機構１０５を駆動制御し、固定部材１０７をｚ軸下方に駆動し、固定部材１０７に固定された生体分子１０８を、薄膜１１３のナノポア１１２の近傍に生成した電位勾配８０１内に入れる。このとき、生体分子１０８が負に帯電していれば、もしくは負に帯電する修飾をした場合、電場からの力を受け、生体分子１０８は固定されていない自由末端からナノポア１１２を通り下部の液槽に移動しようとする。生体分子１０８は、ナノポア１１２を通過して電位勾配８０１内に位置する部分と固定部材１０７上に固定されている末端の間で引き伸ばされた状態となる。ナノポア１１２内に生体分子が導入されたことはイオン電流からモニタできる。
図５６に示す第２の工程では、駆動機構１０５が更に、固定部材１０７をｚ軸方向下方に駆動し、ナノポアデバイス１０１上に形成された空間形成部材１１４に接触させ、ここで駆動機構１０５による固定部材１０７の移動を止める。薄膜１１３の上方に空間形成部材１１４が存在することにより、固定部材１０７と薄膜１１３の接触が避けられ、薄膜１１３が破壊されるのを防ぐことができる。第２の工程を完了した時点で、薄膜１１３のナノポア１１２内に生体分子１０８が入っていない場合には、一定時間、駆動機構１０５の駆動を停止することで導入確率を上げることができる。
図５７に示す第３の工程では、駆動機構制御ユニット１０６が、駆動機構１０５をナノポアデバイス１０１から離れる方向に駆動する。このとき、生体分子１０８は電場で引き伸ばされながら、固定部材１０７に引っ張られてナノポア１１２内を上方向に移動することになり、この間に生体分子の配列が、イオン電流の変化量から読み取られる。電流計１０９で読み取られた信号値は必要に応じて増幅され、ＰＣ１１０に記録される。
第２の工程で固定部材１０７が空間形成部材１１４に接触した時点が、第３の工程で行う生体分子特性解析の解析開始点となる。従って、生体分子の全長のうち、固定点から空間形成部材１１４の高さ分の領域は、ナノポア１１２内を通過せず解析できないことになる。ここで、図５８に示すように、固定部材１０７に生体分子１０８を固定する際に、空間形成部材１１４の高さ分のリンカー２００１を介して固定部材１０７と結合させることで、生体分子１０８中の全ての配列を読み取ることが可能となる。
図５９は、イオン電流信号の検出例を示す模式図である。ナノポアデバイスに対する固定部材の位置関係の模式図を上段に、イオン電流信号変化のグラフを中段に、駆動機構変位のグラフを下段に示した。下段の駆動機構変位ｚは、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７の間の距離に対応する。また、図５９では、イオン電流信号中の特徴点に対応する固定部材１０７とナノポアデバイス１０１の位置関係が矢印を用いて示される。
図５９を参照すると、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に近接する前は、ナノポア径に応じたイオン電流信号Ｉ０が得られている。生体分子１０８がナノポア１１２に入った際に、生体分子の平均直径に応じたイオン電流量の減少が起きる。このとき生体分子がナノポア１１２を通過する速度は、固定部材１０７の駆動速度ではなく、生体分子の自由電気泳動のスピードである。これは、生体分子が電場外から電場内に入る際、生体分子はフォールディングし撓んでいるため、端部が固定部材１０７に固定されていることによる影響を受けないからである。この際、測定分解能を得られず、取得されるイオン電流値は、生体分子平均直径に依存した平均的な電流値Ｉｂを示すことになる。
固定部材１０７がナノポアデバイス１０１の空間形成部材１１４と接触した後に、駆動機構１０５によって生体分子を引き上げる際の生体分子の運搬速度は、固定部材１０７の移動速度に等しくなるため、特性分解能に必要な速度で運搬できる。例えばＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種の違いを封鎖電流量で計測するには、計測時の電流ノイズ及びＤＮＡ分子の揺らぎの時定数から、ＤＮＡのナノポア通過速度を１塩基あたり１００μｓ以上にする必要があると考えられる。従って駆動機構１０５を制御して固定部材１０７を１塩基あたり１００μｓ以上より遅い速度で上方に移動させることにより、生体分子の塩基配列を反映した信号が得られる。一方で、解析スループットは高く維持されている必要がる為、一塩基あたり10ms以上かからないことが望まれる。すなわち、駆動機構は生体分子固定部材を３４ｎｍ／ｓｅｃ〜３４μｍ／ｓｅｃの間の速度で駆動するのが好ましい。
図６０は、固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第１の例を示す模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。図６０は、駆動機構１０５を含む固定部材１０７の側面模式図、及びスリット６０３を有する下面図も示す。この例では、ナノポアデバイス１０１の上にではなく、固定部材１０７の下面から下方に突出するように空間形成部材２２０１が設けられる。空間形成部材２２０１は、薄膜１１３より外側の位置でナノポアデバイス１０１と接触するように、固定部材１０７の下面外周、あるいは下面四隅又は対向する二辺に形成されている。すなわち、空間形成部材２２０１は、固定部材１０７の下面の薄膜１１３に対向する領域より外側の少なくとも一部に設けられている。固定部材１０７がナノポアデバイス１０１の方向に移動するとき、空間形成部材６０１により固定部材１０７と薄膜１１３の間に空間が形成され、薄膜１１３が固定部材１０７との接触により破壊されるのを防止する。
図６１〜図６２は、固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第２の例を示す模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。図６１は、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に接触する前の状態を示し、図６２は、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に接触した後の状態を示している。ストップ機構は、固定部材１０７と薄膜１１３の間に両者の接触を避けるための空間を作ることができればよい。本例のストップ機構は、ナノポアデバイス１０１の上面と、固定部材１０７の下面の薄膜に対応する領域の外側の少なくとも一部にそれぞれ電極２３０２ａと電極２３０２ｂを配置し、電極２３０２ａ、２３０２ｂ間の静電容量変化から固定部材１０７とナノポアデバイス１０１との間の相対距離を検出し、両者が接触したことをモニタする。電極２３０２ａ、２３０２ｂ間に印加する電圧は、想定電流量及び計測電流に応じて選択する。また、電極の腐食及び酸化を防ぐため、パルス電圧印加により計測することも可能である。駆動機構制御ユニット１０６（図示せず）は、駆動機構１０５によって固定部材１０７をナノポアデバイス１０１の方向に駆動させ、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７が近接した際に電極２３０２ａ、２３０２ｂから取得される信号変化を元に両者間の距離を検出し、駆動機構１０５の駆動を停止する。駆動機構制御ユニット１０６は、静電容量変化の信号を取得する代わりに、短絡から接触をモニタすることも可能である。ストップ機構を構成する電極２３０２ａ、２３０２ｂ間に電圧を印加している間は、計測用の第１及び第２の電極１０３ａ、１０３ｂには電圧を印加しない。
図６３〜図６４は、固定部材と薄膜との接触を防止するストップ機構の第３の例を示す模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。図６３に示した例では、電極２４０１、２４０２をナノポアデバイス１０１上にのみ配置して電極間を配線し、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に近接した際の電流量変化から固定部材１０７とナノポアデバイス１０１間の相対距離を検出する。電極２４０１、２４０２は、ナノポアデバイス１０１の上面の薄膜１１３の外側の領域の外周、四隅又は対向する二辺に配置する。図６４に示した例では、固定部材１０７の下面に電極２４０３、２４０４を配置して電極間を配線し、同様のメカニズムで固定部材１０７とナノポアデバイス１０１間の相対距離を検出する。電極２４０３、２４０４は、固定部材１０７の下面のうち薄膜１１３に対応する領域の外側の四隅又は対向する二辺に配置すればよい。溝１１５は、電極２４０１、２４０２が配置されている側（固定部材１０７又はナノポアデバイス１０１）に形成されてもよいし、電極２４０１、２４０２が配置されていない側（固定部材１０７又はナノポアデバイス１０１）に形成されてもよい。
電極を四隅に４個配置した場合、固定部材１０７の平衡出しに利用することも可能である。その場合、駆動機構１０５に傾き調整機能を持たせ、駆動機構制御ユニット１０６は、４箇所から取得される電流値がほぼ一致するように、駆動機構１０５の傾きを調整してもよい。例えば、４隅に独立のゴニオメータが設けられ、それを４箇所から取得した電流値に基づいて手動又は自動で調整してもよい。
図６５〜図６７は、図６３に示したナノポアデバイス１０１上への電極配置例を示す上面模式図である。図６５は、ナノポアデバイス１０１上の薄膜１１３、センサ配線２４０６、及び電極取り出し配線２４０７の配置図である。図６６及び図６７は、センサ配線拡大図である。図６６は、対向電極一種の例を示し、図６７は、薄膜１１３の周辺部の４箇所にリング状に対向電極２４０８を配置した例を示す。ここで、図６６に示す電極長さＬが１０μｍ、電極間隔ｓが０．４μｍ〜２μｍとして設計された電極間に、１Ｖの電圧を印加した上で、ナノポアデバイス１０１に固定部材１０７を近接させた際の電極間電流変化をモニタした。
図６８は、固定部材−ナノポアデバイス間距離ｈが１０μｍの時に流れる電流量で規格化して示した距離ｈと電流量の関係を示すグラフである。図６８に示すように、固定部材１０７とナノポアデバイス１０１との間の距離が７μｍ以上離れると、電流量の距離ｈ依存性は殆どないが、それ以下では距離と電流減少量に相関があることが分かった。従って、このような距離ｈと電流量の相関関係を取得することによって、固定部材１０７の高さ調整が可能となる。
固定部材１０７の駆動法の他の例として、固定部材１０７上の生体分子１０８を事前に引き伸ばしつつ、ナノポア近傍にアプローチする方法もある。図６９〜図７２、図７３〜図７４は、生体分子の事前引き伸ばし機構を有する生体分子測定装置による固定部材の駆動法の例を示す断面模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。
図６９に示すように、本例の生体分子測定装置は、固定部材１０７と、ナノポアデバイス１０１にそれぞれ電極１２０２ａ、１２０２ｂを備える。最初に、回路変換コントローラ２７０６により、電極１２０２ａ、１２０２ｂに接続された回路１２０７に電源を接続し、固定部材１０７とナノポアデバイス１０１の間に電位勾配１２０３を作る。すると、電位勾配１２０３によって、負に帯電した生体分子１０８は、固定部材１０７とナノポアデバイス１０１の間で引き伸ばされる。
次に、図７０に示すように、駆動機構１０５を駆動して固定部材１０７がナノポアデバイス１０１の空間形成部材１１４に接触するまで下方に駆動する。このとき、図７１の拡大図に示すように、第１及び第２の電極１０３ａ、１０３ｂに接続された回路１２０８に電源を接続した際にナノポア周辺に生成するはずの想定電場１２０９の範囲内に生体分子１０８を入れる。
次に、図７３に示すように、固定部材１０７がナノポアデバイス１０１の空間形成部材１１４に接触した際に、電極１２０２ａ、１２０２ｂに接続された回路１２０７から、ナノポア周辺に電場を形成する回路１２０８へと電源の接続を切り替える。図７４に示すように、ナノポア周辺に電位勾配８０１を形成することにより、生体分子１０８の先端はナノポアに挿入される。
図７０に示した工程を経た後、生体分子１０８の先端がナノポア１１２内に入らない場合と、確率は小さいながら図７２の拡大図に示すように、生体分子１０８の先端がナノポア１１２内に入る場合が存在する。生体分子１０８の先端がナノポア１１２内に入らず電場領域内に入った場合のみ、生体分子１０８の先端から塩基の読取が可能となる。
図７５は、生体分子の先端から読み取られた信号の例を示す模式図である。イオン電流信号変化のグラフを中段に、駆動機構変位のグラフを下段に示した。下段の駆動機構変位ｚは、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７との間の距離に対応する。また、イオン電流信号中の特徴点に関して、上段に示した固定部材１０７とナノポアデバイス１０１との対応を矢印で示した。
固定部材１０７がナノポアデバイス１０１に近接する前は、ナノポア径に応じたイオン電流信号Ｉ0が得られている。電源を第１及び第２の電極１０３ａ、１０３ｂに接続してナノポアの周囲に電位勾配８０１を形成したとき、生体分子１０８の先端が電位勾配８０１内に入っているため（図７４参照）、駆動機構１０５をｚ軸下方に駆動させると、生体分子１０８は自由末端から順次ナノポア１１２内に導入される。このとき、生体分子１０８には撓みが存在しないため、駆動機構制御ユニット１０６にて設定した速度で生体分子１０８が駆動され、生体分子１０８の各配列に応じた特性解析が可能となる。従って、生体分子１０８がナノポア１１２に導入されてから固定部材１０７とナノポアデバイス１０１が接触するまでの時間に読み取られた信号と、駆動機構１０５をｚ軸上方向に駆動し始めてから生体分子末端がナノポア１１２から抜け出るまでの時間に読み取られた信号は、図７５のように、接触した時間を中心に対称な信号となる。
固定部材１０７に固定された複数の生体分子１０８のうち、最初に測定した生体分子１０８とは異なる生体分子１０８の読み取りは、ｘｙ方向に駆動機構１０５を駆動させることによって実現できる。図７６は、生体分子測定装置の一部の断面模式図及び駆動機構１０５の上面模式図である。上面模式図に示すように、駆動機構１０５をｘｙ方向、すなわち薄膜１１３の面に平行な方向へ駆動することにより、ナノポア１１２に別の生体分子１０８を通過させることができ、固定部材１０７上の複数の生体分子の解析が実現される。
複数の生体分子の解析を実現するための条件を、図７７及び図７８に示すナノポア近傍の拡大図を用いて説明する。図７７は、第１の生体分子１４０５の特性解析を行った際のナノポア１１２を有する薄膜１１３と、固定部材１０７の位置関係を示す断面模式図である。ここで第２の生体分子１４０６を解析する場合、駆動機構１０５により固定部材１０７を電位勾配８０１の直径と同じ距離だけ薄膜１１３の面に平行に移動させる。図７８は、移動後のナノポア１１２を有する薄膜１１３と固定部材１０７の位置関係を示す断面模式図である。この移動により、電位勾配８０１の範囲内には、第１の生体分子１４０５は必ず入らない状態を作り出すことができる。その後、駆動機構１０５により固定部材１０７を薄膜１１３に向けて駆動することによって、第２の生体分子１４０６をナノポア１１２に導入して解析することが可能になる。
＜実施例５＞
生体分子測定装置を用いて生体分子を測定する手順の実施例を以下に述べる。以下の全ての工程において、ナノポアを介して流れるイオン電流Ｉは増幅器を通して計測されている。また、上下２槽の液槽に各々挿入された一対のＡｇ／ＡｇＣｌ電極間には一定の電圧が印加されており、ナノポアのサイズに応じたイオン電流量Ｉ0が取得されている。
図７９は、生体分子としてのＤＮＡの塩基配列を読み取る方法の例を示す説明図である。図７９の上段には、ＤＮＡ塩基配列解析中の固定部材１０７及びナノポアデバイス１０１の代表的な２つの位置関係を示す。図７９の中段にはイオン電流変化を、下段には固定部材１０７の変位を示す。下段の変位ｚは、固定部材１０７とナノポアデバイス１０１の間の距離に対応する。また、駆動機構１０５による固定部材１０７の駆動方向を変えた時点、及びその際の固定部材１０７とナノポアデバイス１０１の位置関係を図中に示す。中段の黒矢印は上段左側に図示した第１の位置関係を取ることを示し、白矢印は上段右側に図示した第２の位置関係を取ることを示している。
駆動機構１０５によりｚ軸下方に固定部材１０７を駆動すると、生体分子１０８の自由な末端がナノポア１１２の中に入り、生体分子１０８は固定部材１０７に固定された末端とナノポア１１２の間で引き伸ばされる。このとき、イオン電流は、生体分子１０８の平均直径サイズに応じて減少し、Ｉbとなる。生体分子１０８が外から電位勾配８０１内に入る際、生体分子１０８はフォールディングしているため、固定部材１０７の移動速度ではなく、生体分子１０８の自由電気泳動のスピードでナノポア１１２内を通過することになる。その際のイオン電流値は、各塩基由来の電流値ではなく、生体分子１０８の平均直径に依存した平均的な電流値Ｉbを示すことになる。
その後、固定部材１０７は駆動機構１０５により更にｚ軸下方に駆動されるが、空間形成部材１１４によってｚ軸下方への移動が妨げられて移動が停止する。このときの固定部材１０７、生体分子１０８、及びナノポアデバイス１０１の位置関係を第１の位置関係として図７９の上段左に示す。
その後に生体分子１０８を引き上げる際の生体分子１０８の運搬速度は、固定部材１０７の駆動速度に等しくなるため、一塩基分解に必要な速度（＜３．４ｎｍ／ｍｓ）で生体分子１０８を運搬できる。従って、生体分子１０８の塩基配列を反映した信号が得られることになる。こうして駆動機構１０５により固定部材１０７をｚ軸上方に駆動する過程では、ナノポア１１２中を移動する生体分子１０８の配列情報を読み取ることができる。生体分子１０８のうち固定されていない自由末端がナノポア１１２から抜け、かつナノポア周辺の電位勾配８０１内に入っている間は、生体分子１０８は、固定部材１０７とナノポア周辺の電位勾配８０１の双方から逆方向の力を受け、引き伸ばされている。このときの固定部材１０７、生体分子１０８、及びナノポアデバイス１０１の関係を第２の位置関係として図７９上段右に示す。また、生体分子１０８はナノポア１１２から抜けるため、イオン電流量はＩ0に戻る。この電流値の変化を検知し、駆動機構１０５による固定部材１０７の駆動を止める。
再び駆動機構１０５により固定部材１０７をｚ軸下方に駆動して生体分子１０８を自由端からナノポア１１２に通し、その間に生体分子１０８の塩基配列を読む。このとき、生体分子１０８の末端が固定部材１０７に固定された状態で、生体分子１０８の他方の自由末端が電位勾配８０１内に入っているため、生体分子１０８は全体として引き伸ばされている。従って、生体分子１０８は、その自由末端からナノポア１１２中を駆動機構１０５による駆動速度で通過するため、高精度な信号の読み取りが可能となる。また、ｚ軸上方に駆動していた間に読み取られた配列を逆方向から読み取ることになり、それを反映して対称に変化するイオン電流が計測される。再び固定部材１０７が空間形成部材１１４に接触した際に、固定部材１０７の駆動が止まる。
以降は、上昇及び下降の繰り返しにより、必要な配列読取精度が出るまで反復して信号を読み続ける。固定部材１０７とナノポアデバイス１０１が接触した位置からイオン電流値がＩ0になる位置までの変位１５３０は、生体分子１０８の長さを反映している。
＜実施例６＞
次に、生体分子測定装置を並列化した実施例について説明する。上記で説明した生体分子測定装置は、並列化したナノポアデバイスとの親和性が良い。並列化により同種の生体分子を同時に測定可能となるため、スループットの向上を測ることが可能となる。ここでは、並列化に対する３種類の例を示す。
図８０及び図８１は、並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第１例を示す断面模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。図８０に示すように、この例では、複数のナノポアデバイス１６０４が横方向に隣接して配置され、複数のナノポアデバイス１６０４の上部に、共通の１つの駆動機構１０５と固定部材１０７が配置されている。固定部材１０７は、複数のナノポアデバイス１６０４の全体を覆うだけの面積を有する。並列化された複数のナノポアデバイス１６０４はそれぞれ独立した液槽を備え、各ナノポアデバイス１６０４の液槽にはアレイ電極１６０８の一つが配置され、アレイ電極１６０８はそれぞれ増幅器に接続されている。並列化された複数のナノポアデバイス１６０４の上部には１つの液槽が共通に設けられ、その液槽にはアレイ電極１６０８に対して共通の電極１６０９が配置されている。並列化されたナノポアデバイス１６０４の側方には、複数のナノポアデバイス１６０４に共通の空間形成部材１６１０が設けられている。個々のナノポアデバイス１６０４が備える液槽は、そのナノポアデバイス１６０４に設けられたそれぞれのナノポア１１２を介して上部の液槽に連通している。
固定部材１０７の下面には複数の生体分子１０８が結合している。図８１に示すように、駆動機構１０５をｚ軸下方に降下させると、固定部材１０７上の生体分子１０８が、各ナノポアデバイス１６０４に設けられたナノポア１１２中を通過する。本形態により複数のナノポア１１２を用いて複数の生体分子の計測が同時並行にて可能となるため、計測スループットが上がる。
図８２及び図８３は、並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第２例を示す断面模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。図８２に示すように、この例では、複数の並べられたナノポアデバイス１６０４の上部に、一つの駆動機構１０５が配置されている。ナノポアデバイス１６０４にはアレイ電極１６０８が接続している。複数のナノポアデバイス１６０４の上部には１つの液槽が共通に設けられ、各アレイ電極１６０８に対して共通電極１６０９が配置されている。並列化されたナノポアデバイス１６０４の側方には、複数のナノポアデバイス１６０４に共通の空間形成部材１６１０が設けられている。駆動機構１０５には、複数の固定部材が接続されており、各々別種の生体分子が固定されている。これにより、同時に異なる生体分子の特性解析が実現可能となる。
図示した例では、駆動機構１０５には、第１の固定部材１０７と第２の固定部材１６０５の２つの生体分子固定部材が接続されている。第１の固定部材１０７には第１の生体分子１０８が結合され、第２の固定部材１６０５には第２の生体分子１６０６が結合されている。本形態により、一種類のサンプルにつき複数のナノポア１１２を用いることが可能のみならず、複数種類のサンプル（生体分子）を同時に計測することが可能となり、計測スループットが上がる。
図８４及び図８５は、並列化したナノポアデバイスを有する生体分子測定装置の第３例を示す断面模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。この例では、複数の並べられたナノポアデバイス１６０４の上部に、複数の駆動機構が配置されている。各々の駆動機構にはそれぞれ固定部材が接続されており、それぞれの固定部材には別種の生体分子が固定されている。空間形成部材も固定部材ごとに設けることが可能である。
図示した例では、複数のナノポアデバイス１６０４の上方に、第１の駆動機構１０５及び第２の駆動機構１６０７が配置されている。第１の駆動機構１０５には第１の固定部材１０７が接続されており、第２の駆動機構１６０７には第２の固定部材１６０５が接続されている。また、第１の固定部材１０７に第１の生体分子１０８が結合され、第２の固定部材１６０５に第２の生体分子１６０６が結合されている。第１の固定部材１０７に対して第１の空間形成部材１６１１が設けられ、第２の固定部材１６０５に対して第２の空間形成部材１６１２が設けられている。第１の空間形成部材１６１１と第２の空間形成部材１６１２とは膜厚が異なる。これにより長さの異なる生体分子であっても、独立の高さ調整が可能となる。第１及び第２の空間形成部材１６１１、１６１２にはスリット等が形成されている。第１及び第２の固定部材１０７、１６０５が下降し、第１及び第２の空間形成部材１６１１、１６１２に接触した際に、ナノポア１１２の上部を満たしている溶液がサンプル毎に独立にならないような構成となっている。これにより、複数のナノポア１１２の上部に配置する電極は、共通電極１６０９のみでよい。
いずれの例においても、ナノポアの個数ａと固定部材上の生体分子の数ｂの大小関係はａ＜ｂとなっており、生体分子を密に固定部材上に結合することによって、固定部材をナノポアデバイスに向かって垂直に降下させた際に、必ずナノポア内に生体分子が導入される。
＜実施例７＞
生体分子を固定部材に固定するための他の手段として磁気ビーズを用いた実施例を示す。ここでは、生体分子測定装置として図８６〜図８８に示した装置を用いる例によって説明する。ただし、固定部材は磁石材料によって構成する。
図８６〜図８８は、磁気ビーズを用いて生体分子を固定部材に固定し、測定する手順を説明する断面模式図である。説明を簡単にするために、溝１１５の図示を省略している。生体分子は予め磁気ビーズに固定化したものを用意する。
第１の工程では、図８６に示すように、並列化したナノポアデバイス１６０４に配置されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極１６０８と共通電極１６０９との間に電圧を印加して、各ナノポアの周囲の電解質溶液中に電場を生成し、磁気ビーズ３４０３に固定された生体分子３４０４を電気泳動により泳動させ、並列化されたナノポアデバイス１６０４のナノポアに生体分子を導入する。ここで、各ナノポア由来のイオン電流をモニタし、イオン電流の変化率から、ナノポアに生体分子が入り込んでいる有効なナノポアデバイスを確認できる。
第２の工程では、図８７に示すように、第１の工程におけるナノポアを介した電圧印加を継続しつつ、駆動機構１０５によって固定部材１０７を矢印で示すようにナノポアデバイス１６０４に向けて駆動し、磁力によって磁気ビーズ３４０３を固定部材１０７に引き付けて固定させる。
第３の工程では、図８８の矢印に示すように、駆動機構１０５によって固定部材１０７を、ナノポアデバイス１６０４から離れる方向に、制御された速度で駆動し、ナノポアの中を移動する生体分子に起因して変化するイオン電流を電流計１０９で検出し、ＰＣ１１０に記録する。圧電素子からなる駆動機構１０５は、任意の速度で固定部材１０７を駆動することができ、特にＤＮＡの配列を読む場合には、磁気ビーズに固定化されたＤＮＡを３．４ｎｍ／ｍｓ以下の速度でナノポア内を移動させることにより高精度な読み取りが可能となる。
本実施例によると、ナノポアと生体分子の初期の位置合わせが不要である。また、ナノポア近傍に生成した電場内に拡散させてナノポア内に生体分子を導入することが可能であるため、並列化したナノポア内のうち生体分子が通過しないナノポアが存在する確率を低減することができる。
＜実施例８＞
図８９は、駆動機構による固定部材の駆動に伴う封鎖電流解消の様子を示す図である。図１に示した生体分子測定装置を用い、ＡＰＴＥＳ／グルタルアルデヒド修飾した表面に鎖長５ｋのｓｓ−ｐｏｌｙ（ｄＡ）を固定した固定部材１０７をナノポアデバイス１０１のナノポア１１２近傍まで近づけた。その結果、図８９（ａ）に示すように、封鎖信号が確認され、固定部材１０７をナノポアデバイス１０１から離すと、封鎖信号が解消した。図８９（ｂ）に、図８９（ａ）と同一時間での固定部材１０７の軌跡を示す。カウンタ変位が増えるにつれ、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７は近接する。イオン電流の減少を確認してから約１秒後に、駆動機構１０５による固定部材１０７の駆動を停止した。約１０秒後に、ナノポアデバイス１０１と固定部材１０７との間の距離を離し始め、再び、イオン電流が増大した時点で（３０秒経過後に）再び駆動機構１０５による駆動を停止させた。ＤＮＡを固定した固定部材１０７をナノポア１１２に近づけるとイオン電流が減少し、ナノポア１１２から遠ざけることで元の電流値に戻った。これは、駆動機構１０５による固定部材１０７の駆動により、ＤＮＡのナノポア１１２への導入、引き抜きが生じたことを示している。
固定部材１０７をナノポアデバイス１０１から離すために駆動機構１０５を駆動し始めた時間から、封鎖信号が解消された時間まで（ＤＮＡ駆動時間）を、図８９（ｂ）に示すようにｔoutと定義する。一方、駆動機構１０５の設定速度に応じたカウンタ速度との関係から固定部材１０７の移動速度を求めた。各固定部材１０７の移動速度に対して取得されたＤＮＡ駆動時間（ｔout）の関係を図９０に示す。図９０中のプロットは実験値である。ここで、各計測における、ＤＮＡ駆動距離すなわちＤＮＡのナノポア１１２内に導入される最大長は、ＤＮＡによりナノポア１１２が封鎖されてから固定部材１０７の駆動が止まった位置で決まる。駆動機構１０５による固定部材１０７の駆動は、ナノポア１１２にＤＮＡに入った事を示す封鎖信号を目視で確認し、手動で止めているため、実際にＤＮＡがナノポア１１２に入ってから固定部材１０７の駆動が止まるまで、最短約一秒程度かかっていると考えられる。従って、最短でも６０−１００ｎｍ程度のＤＮＡが必ずナノポア１１２に入ることになる。
図９０において、実線は固定したＤＮＡの長さから求められる最大ＤＮＡ駆動時間の計算値である。また、破線は６０ｎｍのＤＮＡが入った際にかかる最小ＤＮＡ駆動時間の計算値である。実験的に計測されたＤＮＡ駆動時間は、実線から破線までの範囲内に入っていることから、取得された封鎖信号は固定部材上のＤＮＡ由来のものであることを示し、実測値は妥当であると考えられる。また、実測されたＤＮＡ駆動時間は、固定部材１０７の移動速度が遅くなるほど、ＤＮＡ駆動時間が長くなる方向に分布している。これは、固定部材１０７上のＤＮＡが駆動機構１０５の駆動速度に依存してナノポア１１２内を搬送されていることを示していると考えられる。
図９１は、ｄＡ５０ｄＣ５０のポリマが繰り返し伸張した分子（（ｄＡ５０ｄＣ５０）ｍ）を同様に固定部材に結合し計測した結果を示す図である。固定部材をナノポアデバイスに近接させると、図８９で取得したような封鎖信号を確認した。封鎖後の電流を解析すると、二準位の信号を得た。このように、生体分子を固定部材に結合させ、分子通過速度を下げることによって、分子種に応じた封鎖信号強度が異なる様子を計測することが可能となった。
＜実施例９＞
溶液抵抗の低減を実現するその他の手法として、溝構造を形成する他に、固定部材の材料として、ポーラスシリカを用いてもよい。生体分子の固定部材が、ポーラスシリカで形成されるか、又は、固定部材における少なくとも一部がポーラスシリカで構成されてもよい。例えば、固定部材におけるナノポアデバイス（生体分子計測デバイス）に接近する表面がポーラスシリカで構成されてもよい。この構成において、ポーラスシリカの少なくとも最表面（ナノポアデバイスに対向する面）に計測対象である生体分子が固定される。
ポーラスシリカは、表面及び内部に細孔を有する。例えば、固定部材表面にポーラスシリカを設けることにより、固定部材がナノポアデバイスに接近した際、細孔内を溶液が通過することが可能となる。これにより、固定部材がナノポアデバイスに接近時に発生する通過抵抗の上昇を抑制することが可能となる。
図９２は、一部がポーラスシリカとなった生体分子固定部材を形成するための手段を示す。固定部材のシリコン基板１０７の表面に、シリカ前駆体と界面活性剤を混合した塗布液３５０１を塗布する。このとき、塗布液内にはミセル集合体が形成される。その後、焼成を行うことで、塗布液中のミセル集合体３５０２が取り除かれ、多孔質シリカ膜３５０３が形成される。３５０４は、ミセル集合体３５０２が取り除かれ後に形成された細孔を示す。
ここで、ミセル寸法及び密度によって通過抵抗の抑制の度合が決まる。界面活性剤はカチオン性界面活性剤であり、炭素数１６以上の疎水基、あるいはベンジル基、フェニル基のような疎水基を有することがより好ましい。疎水基の鎖長に応じて、ミセル寸法が決まり、焼結後に生成する平均細孔径が、３ｎｍ以上５ｎｍ未満の範囲で変化する。例えば、炭素鎖Ｃ１８の界面活性剤を用いると、平均細孔径は３．５ｎｍを形成することが可能となる。細孔の密度は、すなわちミセルの密度と相関するため界面活性剤の量比で調整することが出来る。細孔容積は０．１〜２．０ｃｍ３／ｇの範囲で変化し、最小でシリカ体積の２０％以上で制御可能である。接近による抵抗値の上昇を防ぐため、１００倍程度の構造の密度低下が必要になる。そのため、体積比率で９９％以上の密度低下を実現する必要があり、本構造の制御可能範囲内である。
抵抗値の上昇を防ぐためには、この細孔の内にも、水溶液が浸透する必要がある。この事項については、ポーラスシリカ表面を親水化することにより解消することが可能である。プラズマ処理による親水化の他、アミノ基修飾されたシロキサン結合を有する有機ケイ素化合物によって親水状態を保持することが可能である。シロキサン結合を有する有機ケイ素化合物はポーラス構造の骨格の補強のためにも有用である。
上記ポーラスシリカは、固体シリコン材料であるため、プラズマ照射によるシリコン末端に水酸基を立て、ＡＰＴＥＳを用いて末端にアミノ基修飾することが可能であり、グルタルアルデヒドを始めとしたカルボキシル末端を有する架橋剤及びアミノ基末端処理した生体分子の固定が可能である。
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。上記実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることもできる。また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また、各実施例の構成の一部について、他の構成を追加・削除・置換することもできる。
上記の測定部及び制御ユニットの各構成、機能等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリ、ハードディスク、ＳＳＤ（Solid State Drive）等の記録装置、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に格納することができる。また、上記の測定部及び制御ユニットの各構成、機能等は、それらの一部や全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。
１００ 生体分子特性解析装置
１０１ ナノポアデバイス
１０２ 電解質溶液
１０３ａ、１０３ｂ Ａｇ／ＡｇＣｌ電極
１０４ 電源
１０５ 駆動機構
１０６ 駆動機構制御ユニット
１０７ 生体分子固定部材
１０８ 生体分子
１０９ 電流計
１１０ ＰＣ
１１１ 接続部材
１１２ ナノポア
１１３ 薄膜
１１４ 空間形成部材
１１５ 溝
１１５ａ 溝の凸部
１１５ｂ 溝の凹部
１５０１ レーザ照射ユニット
１５０３ ミラー
１５０４ 相対位置モニタ
１５０５ 制御ユニット
１５０６、１５１１ 回転機構
１５０７ 調整機構
３５０１ シリカ前駆体と界面活性剤を混合した塗布液
３５０２ ミセル集合体
３５０３ 多孔質シリカ膜
３５０４ 細孔

Claims (14)

  1. 電解質溶液が満たされる第１の液槽と、
    電解質溶液が満たされる第２の液槽と、
    ナノポアを有する薄膜を支持し、前記ナノポアを介して前記第１の液槽と前記第２の液槽を連通するように前記第１の液槽と前記第２の液槽の間に設けられたナノポアデバイスと、
    前記第１の液槽に配置され、前記薄膜より大きなサイズを有し、生体分子が固定される固定部材と、
    前記固定部材を前記薄膜に対して近づく方向あるいは遠ざかる方向に駆動する駆動機構と、
    前記第１の液槽に設けられた第１の電極と、
    前記第２の液槽に設けられた第２の電極と、
    前記固定部材と前記薄膜との接触を防止するストップ機構と、
    前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電源と、
    前記第１の電極と前記第２の電極の間に流れるイオン電流を計測する測定部とを備え、
    前記ナノポアデバイス及び前記固定部材の少なくとも一方は、前記ナノポアデバイス及び前記固定部材が対向する領域に溝構造を備えており、
    前記溝構造は、格子状の凹部又は凹部及び貫通孔と、凸部と、を有し、
    前記測定部は、前記固定部材に固定された前記生体分子が前記ナノポアを通過するとき計測されるイオン電流により当該生体分子の配列情報を取得することを特徴とする生体分子測定装置。
  2. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記溝構造が、前記ナノポアデバイスと前記固定部材とが対向している範囲で連続的に形成されていることを特徴とする生体分子測定装置。
  3. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記ストップ機構は、前記ナノポアデバイス上に配置され、前記固定部材と前記薄膜との間に空間を形成する空間形成部材であり、
    前記溝構造が、前記空間形成部材に形成されていることを特徴とする生体分子測定装置。
  4. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記溝構造の断面は、矩形、三角形、半月形、又は台形であることを特徴とする生体分子測定装置。
  5. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記生体分子は、前記溝構造の前記凸部に固定されていることを特徴とする生体分子測定装置。
  6. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記溝構造の前記凸部及び前記凹部は、同一材料で形成されていることを特徴とする生体分子測定装置。
  7. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記溝構造の前記凸部及び前記凹部は、異なる材料で形成されていることを特徴とする生体分子測定装置。
  8. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記固定部材には、複数の異なるマーカを介して複数種の生体分子が固定されていることを特徴とする生体分子測定装置。
  9. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記溝構造の掘り込み深さは、５μｍ以上であることを特徴とする生体分子測定装置。
  10. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記溝構造の前記凸部の幅は、前記固定部材に固定される前記生体分子のピッチ以上であることを特徴とする生体分子測定装置。
  11. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記駆動機構が、前記固定部材を前記ナノポアデバイスに接触させる機能を備えており、前記溝構造は、前記ナノポアデバイスと前記固定部材とが対向している範囲の全域で連続して形成されていることを特徴とする生体分子測定装置。
  12. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記固定部材の移動又は回転を調節する調節機構と、
    前記溝構造にレーザを照射するレーザ照射機構と、
    前記調節機構を制御する制御ユニットとを備え、
    前記制御ユニットは、前記レーザの照射によって得られた画像を用いて前記調節機構を制御することを特徴とする生体分子測定装置。
  13. 請求項１に記載の生体分子測定装置において、
    前記固定部材の移動又は回転を調節する調節機構と、
    前記調節機構を制御する制御ユニットとを備え、
    前記制御ユニットは、前記ナノポアデバイスの周辺の溶液抵抗をモニタすることにより、前記調節機構を制御することを特徴とする生体分子測定装置。
  14. 電解質溶液が満たされる第１の液槽と、
    電解質溶液が満たされる第２の液槽と、
    ナノポアを有する薄膜を支持し、前記ナノポアを介して前記第１の液槽と前記第２の液槽を連通するように前記第１の液槽と前記第２の液槽の間に設けられたナノポアデバイスと、
    前記第１の液槽に設けられた第１の電極と、
    前記第２の液槽に設けられた第２の電極と、
    前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電源と、
    前記第１の電極と前記第２の電極の間に流れるイオン電流を計測する測定部とを備え、
    前記第１の液槽は、前記ナノポアの近傍の領域に、平面視におけるサイズが前記薄膜の平面視におけるサイズより大きい、ナノサイズ又はマイクロサイズの流路を備え、
    前記ナノポアデバイスは、前記第１の液槽において前記薄膜より外側の周囲を土手のように囲んで空間を形成するための空間形成部材を有し、前記空間形成部材は、前記ナノサイズ又はマイクロサイズの流路の範囲内で、かつ前記土手の上端に相当する領域に溝構造を備え、
    前記溝構造は、格子状の凹部又は凹部及び貫通孔と、凸部と、を有し、
    前記測定部は、生体分子が前記ナノポアを通過するとき計測されるイオン電流により当該生体分子の配列情報を取得することを特徴とする生体分子測定装置。
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