Veriahren zur Herstellung von Amiden und deren Salzen aus einem sauren Polysaccharid und komplexen, Aminogruppen enhaltenden organischen Verbindungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Amiden und deren Salzen aus einem sauren Polysaccharid, welches freie Carboxylgruppen oder Gruppen der Formel -0-SOz -O-H enthält oder aus funktionellen Säurederivaten dieses Polysaccharids und einer biochemisch aktiven, Aminogruppen enthaltenden Substanz. Die erfindungsgemäss erhältlichen Produkte stellen Molekül-Aggregate dar. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäss herstellbaren Amide in lösliche Natriumsalze oder unlösliche Calciumsalze übergeführt.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Überschuss des weiter oben erwähnten Polysaccharids mit der Aminogruppen enthaltenden Substanz in wässriger Lösung umsetzt.
Das neue Molekül-Aggregat besteht also aus einem komplexen, biochemisch aktiven organischen Molekül, hier später als aktive Komponente bezeichnet, welches auf solche Weise kovalent an ein Säuregruppen enthal- tendes Polysaccharid (hier als saures Polysaccharid bezeichnet) über einen Teil der Säuregruppen gebunden ist, dass das Molekül-Aggregat wie auch das Polysaccharid freie Säuregruppen enthält und fähig ist ein wasserlösliches Na-Salz und ein wasserunlösliches Ca Salz zu bilden. Die Bindung wird erfindungsgemäss durch basische Aminogruppen der aktiven Komponente mit den Säuregruppen des Polysaccharids bewirkt. Der Ausdruck basische Aminogruppe , wie er in dieser Beschreibung benutzt wird, bedeutet eine beliebige -NH-Gruppe, die imstande ist, mit einer Säure ein Additionssalz zu bilden.
IDie verwendeten sauren Polysaccharide insbesondere bilden wasserlösliche Na-Salze und wasserunlösliche Ca-Salze, und die erfindungsgemässe Herstellung der Molekül-Aggregate wird vorzugsweise auf solche Weise ausgeführt, dass diese Eigenschaften sowie auch die biochemische Aktivität der aktiven Komponente im Endprodukt erhalten bleibt.
Beispiele geeigneter saurer Polysaccharide sind Pektin, Pektinsäure, Alginsäure, Celluronsäure und Carrageen.
Pektin ist ein natürliches Produkt und kann unter anderem aus Äpfeln oder Citrusfrüchten gewonnen werden. Es besteht aus einem Polymeren von hauptsächlich Galakturonsäure, in welcher einige der Carboxylgruppen verestert sind. Pektinsäure ist die durch Verseifung von Pektin erhaltene freie Säure. Alginsäure ist ein aus Algen isoliertes, natürliches Produkt und besteht aus einem Polymeren von hauptsächlich Mannuronsäure und vermutlich etwas Glucuronsäure. Celluronsäure ist ein Polymer der Glucuronsäure und Glukose, welche durch geregelte, partielle Oxydation von Cellulose mit Stickstoffdioxyd hergestellt werden konnte.
Zur Herstellung des Ausgangsproduktes für das erfindungsgemässe Verfahren kann das Oxydationsprodukt in wässrigem Alkali gelöst, neutralisiert und als Ca-Salz ausgefällt werden. Anschliessend entfernt man in der Regel das Calcium durch Behandlung mit dem Dinatriumsalz der Aethylendiamintetraessigsäure und Dialyse gegen Wasser, um das lösliche Salz der Celluronsäure wieder herzustellen.
Diese sauren Polysaccharide können entweder als Na-Salze verwendet werden, die durch Gefriertrocknung ihrer Lösungen im Vakuum erhalten wurden, oder als freie Säuren, die man vorzugsweise durch wiederholte Umsetzung der getrockneten Na-Salze mit einem Über- schuss an äthanolischer Salzsäure, Waschen mit Alkohol und Trocknen im Vakuum herstellt.
Carrageen ist ein natürliches Produkt, welches man aus gewissen Algen erhalten kann. Es besteht aus einem sulfatischen Polymeren von Galaktose und wasserfreier Galaktose. Geeignete Ausgangsmaterialien für die Her stellung der Molekül-Aggregate können z. B. erhalten werden, indem man ein Ca-Salz zu eine Lösung von Carrageen gibt, den Niederschlag des gebildeten Ca Salzes abtrennt, dieses durch Zugabe des Dinatriumsalzes von Aethylendiamintetraessigsäure löst und die Lösung gegen Wasser dialysiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung gibt man gewöhnlich auf eine Kolonne, welche einen starken kationischen Harzaustauscher in der Wasserstoff-Form enthält, und man setzt die erhaltene Lösung der freien Carrageensäure mit genügend Natronlauge um, um die Säuregruppen zur Hälfte zu neutralisieren. Schliesslich kann diese Lösung im Vakuum gefriergetrocknet werden.
Die aktive Komponente des Molekül-Aggregats kann irgendeine komplexe organische Verbindung, welche basische Aminogruppen (wie hier definiert) enthält, sein. Im allgemeinen sind diese Stoffe proteinartige Substanzen wie Proteine, Polypeptide, Peptone oder Proteosen. Diese Stoffe unterliegen gewöhnlich in Gegenwart von Säuren oder Enzymen einer Hydrolyse zu Mischungen von a-Aminosäuren. Unter den in dieser Beschreibung erwähnten proteinartigen Substanzen versteht man also komplexe organische Materialien, die aus einzelnen Aminosäuren-Segmenten hergestellt werden konnten.
Ebenfalls kann man also biochemisch aktive Ausgangsprodukte, die Aminogruppen enthalten Extrakte aus allergenen und antigenen Substanzen, Extrakte von Mikroorganismen, Toxine, Toxoide Hormone und Enzyme verwenden. Spezielle Beispiele für allergene Substanzen können Pollenextrakte, z. B. von Bäumen, Am brosiapfl anzen, Extrakte aus Speiseproteinen, Pilzen oder Tierhaut oder Schuppen, Insekten oder Hausstaub sein. Die aktive Komponente kann auch ein kleines Molekül, welches selbst nicht antigen ist, sein, und erst in einem grossen, zusammengesetzten Molekül, wie z. B.
Hapten, antigen wird.
Die neuen erfindungsgemäss hergestellten Molekülaggregate werden nach den Methoden der kovalenten Bindung komplexer organischer Verbindungen, die basische Aminogruppen enthalten, mit Säuren oder funktionellen Säurederivaten hergestellt, und in dieser Hinsicht ist es insbesondere wichtig, eine Herstellungstechnik auszuwählen, durch welche man weder die biologische Aktivität der Bestandteile zerstört, noch unerwünschte Gruppen in das Molekül-Aggregat einführt. Diese Methoden sind im allgemeinen mit der Verwendung eines Kupplungsmittels verbunden.
Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf die Verwendung eines wasserlöslichen Diimids, wie Metho-p-toluolsulfonat von l-Cyclohexyl-3-morpholinyl-äthylcarboiimid, als Kupplungsmittel. Bei Ausführung dieser Methode werden gewöhnlich das saure Polysaccharid und das Antigen in wässriger Lösung mit der erwähnten Reagenz gemischt, wobei das Diimid in die entsprechende Harnstoffverbindung übergeht und die Säuregruppen des Polysaccharids mit den basischen Aminogruppen der aktiven Komponente reagieren, um Amidbindungen zu bilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens setzt man das saure Polysaccharid zuerst mit Aethylchlorformiat in Gegenwart von Triäthylamin zu einem gemischten Anhydrid um, welches man dann mit der aktiven Komponente reagieren lässt, um Amidbindungen zu bilden.
Man kann auch das saure Polysaccharid mit N-Hydroxypiperidin in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zum N-Hydroxypiperidinester des sauren Polysaccharids umsetzen. Diesen Ester setzt man dann gewöhnlich mit der aktiven Komponente um, welche an das saure Polysaccharid durch Amidbindungen, unter Freisetzung von N-Hydroxypiperidin, gebunden wird.
Ebenfalls ist es möglich, ein teilweise esterfiziertes saures Polysaccharid mit Hydrazinhydrat zu dem entsprechenden Hydrazid umzusetzen. Dieses Hydrazid wird dann im allgemeinen mit salpetriger Säure behandelt, um das entsprechende Azid herzustellen, welches man mit Ider aktiven Komponente umsetzt, die durch Amidbindungen mit dem sauren Polysaccharid verbunden wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des ertindungsgemässen Verfahrens wird zuerst ein Amin- oder Metallsalz des Polysaccharids mit einem Schwefel-Trioxyd-N, N'-dimethylformamid-Komplex zu einem gemischten Anhydrid umgesetzt, welches man dann anschliessend mit der aktiven Komponente unter Bildung von Amidbindungen umsetzt.
Alle diese erreichten Methoden weisen den Vorteil auf dass man sie in wässriger Lösung bei verhältnismässig niedrigen Temperaturen ausführen kann. Die Anwendung dieser Methoden zur erfindungsgemässen Herstellung der Molekül Aggregate wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass man auch andere Kupplungsmiftel verwenden kann.
Unabhängig von der verwendeten Methode wird das gewünschte Molekül-Aggregat im allgemeinen als wässrige Lösung erhalten. Aus dieser Lösung kann man es vorzugsweise durch Ausfällung als Ca-Salz isolieren, welches abfiltriert und gut mit Wasser gewaschen wird, um nicht umgesetztes Antigen zu entfernen. Anschliessend löst man in der Regel das gewaschene Ca-Salz in einer wässrigen Lösung von Natriumäthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat und dialysiert die erhaltene Lösung. Diese Lösung kann dann getrocknet werden und liefert das Molekül-Aggregat in Form des Na Salzes.
Um sicher zu sein, dass das erfindungsgemäss hergestellte Molekül-Aggregat freie Säuregruppen enthält, ist es im allgemeinen erwünscht, einen tlberschuss des sauren Polysaccharides zu verwenden, so dass das Molekül-Aggregat freie Säuregruppen aufweist und die Fähigkeit hat, ein wasserlösliches Na-Salz und unlösliches Ca-Salz zu bilden. Die Menge des in das Molekül Aggregat eingeführten Proteins kann durch Methoden der Proteinanalyse bestimmt werden, z. B. durch die Stickstoffbestunmung nach Kjeldahl.
Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäss herstellbaren Molekül-Aggregate in Reagenz-Systemen nützlich sind, in welchen eine lösliche Form der biochemisch aktiven Substanz, die, in situ, unlöslich ist oder unlöslich gemacht wurde, verwendet wird, und wobei das Molekül-Aggregat seine Aktivität während des Verfahrens beibehält. Man kann auch die unlösliche Form des Molekül-Aggregats herstellen und als solche verwenden.
Ein Beispiel für die Überführung in den unlöslichen Zustand in situ umfasst insbesondere die Verwendung eines löslichen konjugierten Enzyms oder einer anderen proteinhaltigen Substanz wie Eiweiss, um Fruchtsaft zu klären und anschliessend das Molekül-Aggregat durch Zugabe von Ca-Ionen zu entfernen. Eine andere bevorzugte Anwendung beruht auf der Verwendung eines unlöslichen Antigen < Molekül-Agglomerats um eine langsame Befreiung von Antigen in Geweben zu bewirken. Solch eine langsame Befreiung in Geweben wird oft mit Depot-Effekt bezeichnet. Die neuen Molekül Aggregate können ebenfalls zur Herstellung von Toxinen aus Antiseren in Tieren verwendet werden, z. B.
Schlangen Naja Naja (Kobra-Gift).
Die neuen Molekül-Aggregate können in trockenem Zustand gut aufgehoben werden.
In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.
Beispiel 1
Alginsäure (10 g, 0,046 Äquivalente) und 1-Cyclohexyl-3 -morphoiinyläthyl-carbodiimid-metho-p-toluol- sulfonat (10 g 0,024 Mol) wurden mit Triäthylamin (3,05 ml, 0,022 Mol) und dem Natriumsalz von Hühner eiweiss (1 g) in Wasser (200 ml) sieben Tage lang gerührt. Anschliessend fügte man Calciumacetatlösung (10 O/o, 100 ml) zu dieser Mischung und filtrierte den entstandenen Niederschlag ab. Es wurde mit destilliertem Wasser (1 Liter) eine Stunde lang gewaschen und dann zentrifugiert. Diese Art des Waschens wurde sieben Mal wiederholt, unter Verwendung von je 2 1
Wasser und Rühren über Nacht. Das gewaschene Gel wurde dann in einer wässrigen Lösung von Natrium äthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat gelöst.
Die entstandene Lösung dialysierte man gegen destillier tes Wasser. Die dialysierte Lösung wurde gefriergetrock net und man erhielt 9 g des Produktes. Durch Kjeldahl
Analyse konnte ein Proteingehalt von 5-6 O/o festge stellt werden. Das Produkt war nützlich zum langsamen
Auslösen antigener Substanzen zum Studium von Anti gen-Abwehrkörperreaktionen in Mäusen während ver längerter Zeit.
Beispiel 2
Pektinsäure (10 g, 0,046 Äquivalente) und 1-Cyclohexyl-3-morpholinyläthylcarbodiimid-metho-p-toluol sulfonat (10 g, 0,024 Mol) wurden mit Triäthylamin
3,05 ml, (0,022 Mol) und dem Natriumsalz von Hühner eiweiss (1 g) in Wasser (200ml) sieben Tage lang gerührt. Man arbeitete die erhaltene Lösung wie im
Beispiel 1 auf und erhielt 10 g des konjugierten Produk tes, mit einem Proteingehalt von 3 < 0/0. Dieses Pro dukt hatte die gleiche nützliche Anwendung wie das
Produkt von Beispiel 1.
Beispiel 3
Celluronsäure (3 g 0,005 Äquivalente), das Na triumsalz von Hühnereiweiss (0,3 g), Träthylamin (0,33 ml, 0,0024 Mol) und 1-Cyclohexyl-3-morpholinyl äthyl-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (3 g, 0,0072
Mol) wurden in Wasser (50 ml) sieben Tage lang gerührt. Dann fügte man eine Lösung von Calciumacetat (100/o, 50 ml) hinzu, und das erhaltene Gel wurde wie in
Beispiel 1 frei vom Antigen gewaschen. Man löste das
Produkt anschliessend in einer wässrigen Lösung von
Natriumäthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat, und dialysierte. Es wurde gleich wie in Beispiel 1 gefriergetrocknet, und man erhielt das gewünschte Mole kül-Aggregat (1,2g), welches einen Proteingehalt von
1,8 0/0 aufwies (durch Analyse bestimmt).
Die Mutterlauge, die nach der Ausfällung des
Molekül-Aggregates als Calciumsalz erhalten wurde, wurde mit einer Lösung von Calciumacetat (100/o,
20 ml) weiter behandelt. Es entstand ein Niederschlag den man abtrennte, einige Mal mit verdünnter Calciumacetatlösung wusch und dann löste. Man dialyserte auf die gleiche Weise wie für das Hauptprodukt. Es wurde ein zweiter Anschuss des gewünschten Molekül Aggregats erhalten 1.0 g), mit einem Proteingehalt von 2,8'0/0. Dieses Molekül-Aggregat hatte die gleiche Anwendung wie in Beispiel 1.
Beispiel 4
Fein verteilte Alginsäure (2 g) wurde mit Triäthylamin 1,32 mol, 0,0095 Mol) und Äthylchlorformiat (0,44 ml, 0,0046 Mol) in Dioxan bei 5 "C eine Stunde lang gerührt. Man filtrierte das Produkt und gab es zu einer Lösung des Natriumsalzes von Hühnereiweiss (100 mg in 25 ml Wasser). Man rührte einige Tage lang, und das Molekül-Aggregat wurde ausgefällt, indem man einen Überschuss einer Calciumacetatlösung (100/a, 20 ml) hinzufügte. Der Niederschlag wurde abgetrennt und gründlich mit Wasser gewaschen. Nach dem Auflösen in einer wässrigen Lösung von Natrium-äthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat und Dialyse gegen Wasser wie in Beispiel 1, gefolgt durch Gefriertrocknung, erhielt man 1,2 g des gewünschten Molekül Aggregates.
Die Verbindung hatte ein Proteingehalt von 2,5 0/0. Sie war auf die gleiche Weise nützlich wie die Verbindung von Beispiel 1.
Beispiel 5
Alginsäure (1,76 g 0,008 Äquivalente) wurden als Suspension in Tetrahydrofuran (50 ml) mit N,N'-Cyclohexylcarbodiimid (1,03 g, 0,005 Mol) und N-Hydroxypiperidin 1(1,5 g, 0,015 Mol) zwei Tage lang gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen, um den entstandenen N,N'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Man erhielt den N-Hydroxypiperidinester der Alginsäure mit einer Ausbeute von 1,9 g. Man löste Timotheus-Pollenextrakt (25 mg) in etwas Wasser und stellte die Lösung durch Zugabe von 0,01 N Natronlauge auf einen pH von 7-8 ein. Dann gab man zu dieser Lösung eine Suspension des N-Hydroxypiperidinesters der Alginsäure (500 mg) in Wasser (20 ml) und Triäthylamin (0,15) ml, 0,0011 Mol). Man rührte die Mischung drei Tage lang. Das Molekül-Aggregat wurde durch Ansäuern mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 ausgefällt.
Man löste die ausgefällte Verbindung in Natriumcarbonatlösung und dialysierte diese Lösung gegen Wasser. Gefriertrockung der dialysierten Lösung ergab die gewünschte Verbindung (200 mg). Durch Analyse konnte man feststellen, dass das Produkt 6-7 O/o Protein enthielt. Die Verbindung eignete sich als Depot-Antigen zur Erzielung einer verlängerten Hyposensibilisierung in iSäugetieren.
Beispiel 6
Man stellte Pektinhydrazid her, indem man ein Äquivalent des Natrimpektinats mit zwei Äquivalenten Hydrazinhydrat in Methanol zwei Stunden lang am Rückfluss erhitzte. Das Hydrazid wurde abfiltriert mit Methanol gewaschen und getrocknet. Man konnte das Hydrazid auch auf andere Weise herstellen, indem man ein Äquivalent Natriumpektinat mit fünf Äquivalenten Hydrazinhydrat in Methanol mischte, die Mischung zwei
Tage lang bei Zimmertemperatur stehen liess und dann abfiltrierte. Anschliessend wurde gewaschen und der Feststoff getrocknet. In beiden Fällen hatte das erhaltene Pektinhydrazid die gleiche physikalische Form wie das ursprüngliche Pektin.
Man löste das Natriumsalz von Pektinhydrazid (1 g) in Wasser (50 ml) bei 0 "C und gab zu dieser Lösung Natriumnitrit (0,117 g, 0,0017 Mol) und 1 normale Salzsäure (6mol, 0,006 Mol). Während dieser Zugabe wurde das Pektin teilweise ausgefällt. Man liess die Reaktion 30 Minuten lang wobei 0 "C fortschreiten. Dann fügte man genügend Natriumbicarbonatlösung hinzu, um das Produkt aufzulösen und den pH der Mischung auf 7-8 einzustellen. Zu dieser Lösung gab man ein gefriergetrocknetes Timotheus-Pollenextrakt (50 mg) in neutraler Lösung in Wasser (10 mi) und rührte drei Tage lang.
Durch Zugabe von Calciumacetatlösung (100/o, 10ml) konnte das Produkt ausgefällt werden, und das erhaltene Gel wurde gut mit destilliertem Wasser gewaschen und durch Zentrifugieren abgetrennt.
Das -Waschen und das Zentrifugieren wiederholte man 10 Mal. Man löste das gewaschene Gel in einer wässrigen Lösung von Natrium-äthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat und dialysierte die Lösung gegen destilliertes Wasser. Anschliessend wurde gefriergetrocknet und man erhielt das gewünschte Molekül-Aggregat (0,52 g) welches einen Proteingehalt von 6,3 e/o aufwies.
Dieses Molekül-Aggregat hatte die gleiche Verwendung wie die Verbindung in Beispiel 5.
Beispiel 7
Man suspendierte Carrageen (2 g, 0,01 Äquivalente) in Tetrahydrofuran (50 ml) bei O OC und gab Triäthylamin (1,17 ml, 0,0085 Mol) und Äthylchlorformiat (0,82ml, 0,086 Mol) zu dieser Mischung. Man rührte die Mischung 21/4 Stunden lang. Anschliessend trennte man das gebildete gemischte Anhydrid durch Filtration ab und gab es zu einer Lösung von Hühnereiweiss (200 mg) in Wasser (60 ml).
Man liess zwei Tage lang bei 0 "C stehen und durch Zugabe von Calciumacetat (20 ml einer 100/o-igen Lösung) schied sich ein Niederschlag ab. Dieser Niederschlag wurde gründlich mit verdünnter Calciumacetatlösung (0,01 Mol) gewaschen, um das freie Protein zu befreien. Man löste das Gel durch Zugabe von Natriumcarbonat, stellte auf ein pH von 9-10 ein und gab einen geringen Uberschuss an Dinatriumsalz von ithy- lendiamintetraessigsäure hinzu. Die Lösung wurde gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Man erhielt 300 mg des Produktes mit einem Proteingehalt von 3 4 /o. Das Produkt hatte die gleiche nützliche Anwen- dung wie das Produkt von Beispiel 1.
Beispiel 8
Das Triäthylaminsalz der Alginsäure (0,7 g, 0,0025 Äquivalente) wurde in trockenem Dimethylformamid (15 ml) suspendiert und auf -5 0C abgekühlt. Zu dieser Suspension gab man Athylchlorformat (1 ml, 0,0104 Mol) und rührte bei 0 "C bis -10 OC, bis sich die Suspension des Triäthylaminsalzes aufgelöst hatte.
Zu dieser Lösung gab man eine vorher hergestellte Lösung von 200 mg Hahnenfuss-Pollenextrakt in 35 ml eiskaltem Wasser. Man stellte den pH der kalten Lösung auf 8 ein. Der pH wurde am Anfang der Reaktion konstant gehalten. Man rührte die Mischung über Nacht in der Kälte, bevor das Molekül-Aggregat durch Zugabe einer Calciumlösung (100/o, 20 ml) ausgeschieden wurde. Man arbeitete das Produkt gleich wie in Beispiel 1 auf und erhielt 450 mg des Molekül-Aggregates. Man stellte einen Proteingehalt von 4 O/o fest. Das Molekül- Aggregat hatte die gleiche Anwendung wie das Produkt von Beispiel 5.
Beispiel 9
Man suspendierte trockenes Natriumpektat (0,5 g, 0,0025 Äquivalente) in 20 ml trockenem Dimethylformamid. Zu dieser Suspension gab man 0,4 ml Di methylformamid, welches 0,0014 Mol eines Schwefel Trioxydidimethylformamid- Komplexes enthilelt. Man liess die Lösung drei Wochen lang bei Zimmertemperatur stehen, trennte den Pektat-Komplex durch Filtration ab und gab ihn zu einer Lösung von 280 mg Ambrosia Pflanzen- Pollenextrakt in eiskaltem Wasser. Die Mischung wurde zwei Tage lang bei 2 "C gerührt. Das Molekül-Aggregat konnte als Calciumsalz ausgefällt werden und man arbeitete es wie in den vorhergehenden Beispielen auf. Man erhielt 0,5 g des Produktes, welches einen Proteingehalt von 3,5 O/o aufwies.
Das Molekül Aggregat war gleich nützlich wie das Produkt von Beispiel 5.
Beispiel 10
Man suspendierte Idas Triäthylaminsalz der Alginsäure (120 mg, 0,0004 Äquivalente) in 15 ml trockenem Dimethylformamid und kühlte auf -5 OC ab. Sithyl- chlorformat (0,25 ml, 0,0026 Mol) wurden unter Rühren während zwei Stunden bei -5 0C zu dieser Lösung gegeben. Die entstandene Lösung des gemischten Anhydrids gab man in Tetrahydrofuran (25 ml) und rührte einige Minuten lang. Man filtrierte das ausgefällte gemischte Anhydrid ab und gab es zu einer Lösung von Diphtherie-Toxin (1250Lf) in 20ml eiskaltem Wasser. Der pH der Lösung wurde auf 8 eingestellt und man rührte über Nacht.
Man fällte das Molekül-Aggregat als Calciumsalz aus und arbeitete es wie in den vorhergehenden Beispielen auf. Man erhielt 90 mg des Produktes. Dieses Produkt war nützlich zum immunisieren von Säugetieren.
Beispiele 11-61
In der folgenden Tabelle sind erfindungsgemäss hergestellte Molekül-Aggregate unter Angabe des Poly -saccharids, des Antigens oder des Proteinbestandteils sowie der Herstellungsmethode zusammengestellt.
-(M.A. = Gemischte Anhydridmethode unter Verwen dung von Äthylchlorformat; W.S.D. = wasserlösliche Diimid-Methode; S.Os = SO3-Komplex-Anhydrid methoden; N.H.P = N= Hydroxypiperidin-aktive-Estermethode; A. Chl = Säurechloridmethode; Azid = Azid Methode mit Pektinhydrazid). Die Molekül-Aggregat hatten die gleiche Nützlichkeit wie die Produkte der vorhergehenden Beispiele.
Beispiel Polysaccharid Aktive Komponente Methode 11 Alginsäure Thimotheus-Pollenextrakt N.H.P.
12 Alginsäure Thimotheus-Pollenextrakt M.A.
13 Alginsäure Thimotheus-Pollenextakt W.S.D.
14 Alginsäure Thimotheus-Pollenextrakt SO3 15 Pektinsäure Thimothleus-Pollenextrakt M.A.
16 Pektinsäure Thimotheus-Pollenextrakt W.S .D.
17 Pektin Thimotheus-Pollenextrakt Azid 18 Celluronsäure Thimotheus-Pollenextrakt M.A.
19 Celluronsäure Thimotheus-Pollenextrakt W.S.D.
20 Carrageen Thimotheus-Pollenextrakt W.S.D.
21 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt M.A.
22 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SO3 23 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt M.A.
24 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt 503 25 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt M.A.
26 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SOS 27 Pektinsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SOS 28 Pektinsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SO3 29 Pektinsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt 503 30 Pektinsäure Ambrosia-Pollenextrakt S03 31 Alginsäure Birken-Pollenextrakt M.A.
32 Alginsäure Pferdeschuppenextrakt M.A.
33 Alginsäure Katzen-Epithelzellenextrakt M.A.
34 Alginsäure Hühnereiweiss N.H.P.
35 Alginsäure Hühnereiweiss M.A.
36 Alginsäure Hühnereiweiss W.S.D.
37 Alginsäure Hühnereiweiss SO3 38 Alginsäure Hühnereiweiss A. Chi 39 Pektinsäure Hühnereiweiss M.A.
40 Pektinsäure Hühnereiweiss W.S.D.
41 Pektinsäure Hühnereiweiss SO3 42 Pektin Hühnereiweiss Azid 43 Celluronsäure Hühnereiweiss W.S.D.
44 Carrageen Hühnereiweiss M.A.
45 Carrageen Hühnereiweiss W.S.D.
46 Isländische Moossäure Hühnereiweiss W.S.D.
47 Alginsäure Lactalbumin M.A.
48 Alginsäure Lactalbumin SOS 49 Alginsäure Schellfischextrakt M.A.
50 Alginsäure geröstetes Flachsextrakt M.A.
51 Alginsäure geröstetes Baker's SOs Hefe -Extrakt 52 Alginsäure Naja-naja-Gift SO3 53 Alginsäure Bienen-Gift SOS 54 Alginsäure Insulin W.S.D.
55 Alginsäure Tetanustoxoid SO3 56 Alginsäure Diphtherie-Gift M.A.
57 Alginsäure Trypsin M.A.
58 Pektin Trypsin Azid 59 Alginsäure Chymotrypsin M.A.
60 Pektin Chymotrypsin Azid 61 Alginsäure Ficin M.A.