Veriahren zur Herstellung von Amiden und deren Salzen aus einem sauren Polysaccharid und komplexen, Aminogruppen enhaltenden organischen Verbindungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Amiden und deren Salzen aus einem sauren Polysaccharid, welches freie Carboxylgruppen oder Gruppen der Formel -0-SOz -O-H enthält oder aus funktionellen Säurederivaten dieses Polysaccharids und einer biochemisch aktiven, Aminogruppen enthaltenden Substanz. Die erfindungsgemäss erhältlichen Produkte stellen Molekül-Aggregate dar. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäss herstellbaren Amide in lösliche Natriumsalze oder unlösliche Calciumsalze übergeführt.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Überschuss des weiter oben erwähnten Polysaccharids mit der Aminogruppen enthaltenden Substanz in wässriger Lösung umsetzt.
Das neue Molekül-Aggregat besteht also aus einem komplexen, biochemisch aktiven organischen Molekül, hier später als aktive Komponente bezeichnet, welches auf solche Weise kovalent an ein Säuregruppen enthal- tendes Polysaccharid (hier als saures Polysaccharid bezeichnet) über einen Teil der Säuregruppen gebunden ist, dass das Molekül-Aggregat wie auch das Polysaccharid freie Säuregruppen enthält und fähig ist ein wasserlösliches Na-Salz und ein wasserunlösliches Ca Salz zu bilden. Die Bindung wird erfindungsgemäss durch basische Aminogruppen der aktiven Komponente mit den Säuregruppen des Polysaccharids bewirkt. Der Ausdruck basische Aminogruppe , wie er in dieser Beschreibung benutzt wird, bedeutet eine beliebige -NH-Gruppe, die imstande ist, mit einer Säure ein Additionssalz zu bilden.
IDie verwendeten sauren Polysaccharide insbesondere bilden wasserlösliche Na-Salze und wasserunlösliche Ca-Salze, und die erfindungsgemässe Herstellung der Molekül-Aggregate wird vorzugsweise auf solche Weise ausgeführt, dass diese Eigenschaften sowie auch die biochemische Aktivität der aktiven Komponente im Endprodukt erhalten bleibt.
Beispiele geeigneter saurer Polysaccharide sind Pektin, Pektinsäure, Alginsäure, Celluronsäure und Carrageen.
Pektin ist ein natürliches Produkt und kann unter anderem aus Äpfeln oder Citrusfrüchten gewonnen werden. Es besteht aus einem Polymeren von hauptsächlich Galakturonsäure, in welcher einige der Carboxylgruppen verestert sind. Pektinsäure ist die durch Verseifung von Pektin erhaltene freie Säure. Alginsäure ist ein aus Algen isoliertes, natürliches Produkt und besteht aus einem Polymeren von hauptsächlich Mannuronsäure und vermutlich etwas Glucuronsäure. Celluronsäure ist ein Polymer der Glucuronsäure und Glukose, welche durch geregelte, partielle Oxydation von Cellulose mit Stickstoffdioxyd hergestellt werden konnte.
Zur Herstellung des Ausgangsproduktes für das erfindungsgemässe Verfahren kann das Oxydationsprodukt in wässrigem Alkali gelöst, neutralisiert und als Ca-Salz ausgefällt werden. Anschliessend entfernt man in der Regel das Calcium durch Behandlung mit dem Dinatriumsalz der Aethylendiamintetraessigsäure und Dialyse gegen Wasser, um das lösliche Salz der Celluronsäure wieder herzustellen.
Diese sauren Polysaccharide können entweder als Na-Salze verwendet werden, die durch Gefriertrocknung ihrer Lösungen im Vakuum erhalten wurden, oder als freie Säuren, die man vorzugsweise durch wiederholte Umsetzung der getrockneten Na-Salze mit einem Über- schuss an äthanolischer Salzsäure, Waschen mit Alkohol und Trocknen im Vakuum herstellt.
Carrageen ist ein natürliches Produkt, welches man aus gewissen Algen erhalten kann. Es besteht aus einem sulfatischen Polymeren von Galaktose und wasserfreier Galaktose. Geeignete Ausgangsmaterialien für die Her stellung der Molekül-Aggregate können z. B. erhalten werden, indem man ein Ca-Salz zu eine Lösung von Carrageen gibt, den Niederschlag des gebildeten Ca Salzes abtrennt, dieses durch Zugabe des Dinatriumsalzes von Aethylendiamintetraessigsäure löst und die Lösung gegen Wasser dialysiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung gibt man gewöhnlich auf eine Kolonne, welche einen starken kationischen Harzaustauscher in der Wasserstoff-Form enthält, und man setzt die erhaltene Lösung der freien Carrageensäure mit genügend Natronlauge um, um die Säuregruppen zur Hälfte zu neutralisieren. Schliesslich kann diese Lösung im Vakuum gefriergetrocknet werden.
Die aktive Komponente des Molekül-Aggregats kann irgendeine komplexe organische Verbindung, welche basische Aminogruppen (wie hier definiert) enthält, sein. Im allgemeinen sind diese Stoffe proteinartige Substanzen wie Proteine, Polypeptide, Peptone oder Proteosen. Diese Stoffe unterliegen gewöhnlich in Gegenwart von Säuren oder Enzymen einer Hydrolyse zu Mischungen von a-Aminosäuren. Unter den in dieser Beschreibung erwähnten proteinartigen Substanzen versteht man also komplexe organische Materialien, die aus einzelnen Aminosäuren-Segmenten hergestellt werden konnten.
Ebenfalls kann man also biochemisch aktive Ausgangsprodukte, die Aminogruppen enthalten Extrakte aus allergenen und antigenen Substanzen, Extrakte von Mikroorganismen, Toxine, Toxoide Hormone und Enzyme verwenden. Spezielle Beispiele für allergene Substanzen können Pollenextrakte, z. B. von Bäumen, Am brosiapfl anzen, Extrakte aus Speiseproteinen, Pilzen oder Tierhaut oder Schuppen, Insekten oder Hausstaub sein. Die aktive Komponente kann auch ein kleines Molekül, welches selbst nicht antigen ist, sein, und erst in einem grossen, zusammengesetzten Molekül, wie z. B.
Hapten, antigen wird.
Die neuen erfindungsgemäss hergestellten Molekülaggregate werden nach den Methoden der kovalenten Bindung komplexer organischer Verbindungen, die basische Aminogruppen enthalten, mit Säuren oder funktionellen Säurederivaten hergestellt, und in dieser Hinsicht ist es insbesondere wichtig, eine Herstellungstechnik auszuwählen, durch welche man weder die biologische Aktivität der Bestandteile zerstört, noch unerwünschte Gruppen in das Molekül-Aggregat einführt. Diese Methoden sind im allgemeinen mit der Verwendung eines Kupplungsmittels verbunden.
Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf die Verwendung eines wasserlöslichen Diimids, wie Metho-p-toluolsulfonat von l-Cyclohexyl-3-morpholinyl-äthylcarboiimid, als Kupplungsmittel. Bei Ausführung dieser Methode werden gewöhnlich das saure Polysaccharid und das Antigen in wässriger Lösung mit der erwähnten Reagenz gemischt, wobei das Diimid in die entsprechende Harnstoffverbindung übergeht und die Säuregruppen des Polysaccharids mit den basischen Aminogruppen der aktiven Komponente reagieren, um Amidbindungen zu bilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens setzt man das saure Polysaccharid zuerst mit Aethylchlorformiat in Gegenwart von Triäthylamin zu einem gemischten Anhydrid um, welches man dann mit der aktiven Komponente reagieren lässt, um Amidbindungen zu bilden.
Man kann auch das saure Polysaccharid mit N-Hydroxypiperidin in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zum N-Hydroxypiperidinester des sauren Polysaccharids umsetzen. Diesen Ester setzt man dann gewöhnlich mit der aktiven Komponente um, welche an das saure Polysaccharid durch Amidbindungen, unter Freisetzung von N-Hydroxypiperidin, gebunden wird.
Ebenfalls ist es möglich, ein teilweise esterfiziertes saures Polysaccharid mit Hydrazinhydrat zu dem entsprechenden Hydrazid umzusetzen. Dieses Hydrazid wird dann im allgemeinen mit salpetriger Säure behandelt, um das entsprechende Azid herzustellen, welches man mit Ider aktiven Komponente umsetzt, die durch Amidbindungen mit dem sauren Polysaccharid verbunden wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des ertindungsgemässen Verfahrens wird zuerst ein Amin- oder Metallsalz des Polysaccharids mit einem Schwefel-Trioxyd-N, N'-dimethylformamid-Komplex zu einem gemischten Anhydrid umgesetzt, welches man dann anschliessend mit der aktiven Komponente unter Bildung von Amidbindungen umsetzt.
Alle diese erreichten Methoden weisen den Vorteil auf dass man sie in wässriger Lösung bei verhältnismässig niedrigen Temperaturen ausführen kann. Die Anwendung dieser Methoden zur erfindungsgemässen Herstellung der Molekül Aggregate wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass man auch andere Kupplungsmiftel verwenden kann.
Unabhängig von der verwendeten Methode wird das gewünschte Molekül-Aggregat im allgemeinen als wässrige Lösung erhalten. Aus dieser Lösung kann man es vorzugsweise durch Ausfällung als Ca-Salz isolieren, welches abfiltriert und gut mit Wasser gewaschen wird, um nicht umgesetztes Antigen zu entfernen. Anschliessend löst man in der Regel das gewaschene Ca-Salz in einer wässrigen Lösung von Natriumäthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat und dialysiert die erhaltene Lösung. Diese Lösung kann dann getrocknet werden und liefert das Molekül-Aggregat in Form des Na Salzes.
Um sicher zu sein, dass das erfindungsgemäss hergestellte Molekül-Aggregat freie Säuregruppen enthält, ist es im allgemeinen erwünscht, einen tlberschuss des sauren Polysaccharides zu verwenden, so dass das Molekül-Aggregat freie Säuregruppen aufweist und die Fähigkeit hat, ein wasserlösliches Na-Salz und unlösliches Ca-Salz zu bilden. Die Menge des in das Molekül Aggregat eingeführten Proteins kann durch Methoden der Proteinanalyse bestimmt werden, z. B. durch die Stickstoffbestunmung nach Kjeldahl.
Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäss herstellbaren Molekül-Aggregate in Reagenz-Systemen nützlich sind, in welchen eine lösliche Form der biochemisch aktiven Substanz, die, in situ, unlöslich ist oder unlöslich gemacht wurde, verwendet wird, und wobei das Molekül-Aggregat seine Aktivität während des Verfahrens beibehält. Man kann auch die unlösliche Form des Molekül-Aggregats herstellen und als solche verwenden.
Ein Beispiel für die Überführung in den unlöslichen Zustand in situ umfasst insbesondere die Verwendung eines löslichen konjugierten Enzyms oder einer anderen proteinhaltigen Substanz wie Eiweiss, um Fruchtsaft zu klären und anschliessend das Molekül-Aggregat durch Zugabe von Ca-Ionen zu entfernen. Eine andere bevorzugte Anwendung beruht auf der Verwendung eines unlöslichen Antigen < Molekül-Agglomerats um eine langsame Befreiung von Antigen in Geweben zu bewirken. Solch eine langsame Befreiung in Geweben wird oft mit Depot-Effekt bezeichnet. Die neuen Molekül Aggregate können ebenfalls zur Herstellung von Toxinen aus Antiseren in Tieren verwendet werden, z. B.
Schlangen Naja Naja (Kobra-Gift).
Die neuen Molekül-Aggregate können in trockenem Zustand gut aufgehoben werden.
In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.
Beispiel 1
Alginsäure (10 g, 0,046 Äquivalente) und 1-Cyclohexyl-3 -morphoiinyläthyl-carbodiimid-metho-p-toluol- sulfonat (10 g 0,024 Mol) wurden mit Triäthylamin (3,05 ml, 0,022 Mol) und dem Natriumsalz von Hühner eiweiss (1 g) in Wasser (200 ml) sieben Tage lang gerührt. Anschliessend fügte man Calciumacetatlösung (10 O/o, 100 ml) zu dieser Mischung und filtrierte den entstandenen Niederschlag ab. Es wurde mit destilliertem Wasser (1 Liter) eine Stunde lang gewaschen und dann zentrifugiert. Diese Art des Waschens wurde sieben Mal wiederholt, unter Verwendung von je 2 1
Wasser und Rühren über Nacht. Das gewaschene Gel wurde dann in einer wässrigen Lösung von Natrium äthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat gelöst.
Die entstandene Lösung dialysierte man gegen destillier tes Wasser. Die dialysierte Lösung wurde gefriergetrock net und man erhielt 9 g des Produktes. Durch Kjeldahl
Analyse konnte ein Proteingehalt von 5-6 O/o festge stellt werden. Das Produkt war nützlich zum langsamen
Auslösen antigener Substanzen zum Studium von Anti gen-Abwehrkörperreaktionen in Mäusen während ver längerter Zeit.
Beispiel 2
Pektinsäure (10 g, 0,046 Äquivalente) und 1-Cyclohexyl-3-morpholinyläthylcarbodiimid-metho-p-toluol sulfonat (10 g, 0,024 Mol) wurden mit Triäthylamin
3,05 ml, (0,022 Mol) und dem Natriumsalz von Hühner eiweiss (1 g) in Wasser (200ml) sieben Tage lang gerührt. Man arbeitete die erhaltene Lösung wie im
Beispiel 1 auf und erhielt 10 g des konjugierten Produk tes, mit einem Proteingehalt von 3 < 0/0. Dieses Pro dukt hatte die gleiche nützliche Anwendung wie das
Produkt von Beispiel 1.
Beispiel 3
Celluronsäure (3 g 0,005 Äquivalente), das Na triumsalz von Hühnereiweiss (0,3 g), Träthylamin (0,33 ml, 0,0024 Mol) und 1-Cyclohexyl-3-morpholinyl äthyl-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (3 g, 0,0072
Mol) wurden in Wasser (50 ml) sieben Tage lang gerührt. Dann fügte man eine Lösung von Calciumacetat (100/o, 50 ml) hinzu, und das erhaltene Gel wurde wie in
Beispiel 1 frei vom Antigen gewaschen. Man löste das
Produkt anschliessend in einer wässrigen Lösung von
Natriumäthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat, und dialysierte. Es wurde gleich wie in Beispiel 1 gefriergetrocknet, und man erhielt das gewünschte Mole kül-Aggregat (1,2g), welches einen Proteingehalt von
1,8 0/0 aufwies (durch Analyse bestimmt).
Die Mutterlauge, die nach der Ausfällung des
Molekül-Aggregates als Calciumsalz erhalten wurde, wurde mit einer Lösung von Calciumacetat (100/o,
20 ml) weiter behandelt. Es entstand ein Niederschlag den man abtrennte, einige Mal mit verdünnter Calciumacetatlösung wusch und dann löste. Man dialyserte auf die gleiche Weise wie für das Hauptprodukt. Es wurde ein zweiter Anschuss des gewünschten Molekül Aggregats erhalten 1.0 g), mit einem Proteingehalt von 2,8'0/0. Dieses Molekül-Aggregat hatte die gleiche Anwendung wie in Beispiel 1.
Beispiel 4
Fein verteilte Alginsäure (2 g) wurde mit Triäthylamin 1,32 mol, 0,0095 Mol) und Äthylchlorformiat (0,44 ml, 0,0046 Mol) in Dioxan bei 5 "C eine Stunde lang gerührt. Man filtrierte das Produkt und gab es zu einer Lösung des Natriumsalzes von Hühnereiweiss (100 mg in 25 ml Wasser). Man rührte einige Tage lang, und das Molekül-Aggregat wurde ausgefällt, indem man einen Überschuss einer Calciumacetatlösung (100/a, 20 ml) hinzufügte. Der Niederschlag wurde abgetrennt und gründlich mit Wasser gewaschen. Nach dem Auflösen in einer wässrigen Lösung von Natrium-äthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat und Dialyse gegen Wasser wie in Beispiel 1, gefolgt durch Gefriertrocknung, erhielt man 1,2 g des gewünschten Molekül Aggregates.
Die Verbindung hatte ein Proteingehalt von 2,5 0/0. Sie war auf die gleiche Weise nützlich wie die Verbindung von Beispiel 1.
Beispiel 5
Alginsäure (1,76 g 0,008 Äquivalente) wurden als Suspension in Tetrahydrofuran (50 ml) mit N,N'-Cyclohexylcarbodiimid (1,03 g, 0,005 Mol) und N-Hydroxypiperidin 1(1,5 g, 0,015 Mol) zwei Tage lang gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen, um den entstandenen N,N'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Man erhielt den N-Hydroxypiperidinester der Alginsäure mit einer Ausbeute von 1,9 g. Man löste Timotheus-Pollenextrakt (25 mg) in etwas Wasser und stellte die Lösung durch Zugabe von 0,01 N Natronlauge auf einen pH von 7-8 ein. Dann gab man zu dieser Lösung eine Suspension des N-Hydroxypiperidinesters der Alginsäure (500 mg) in Wasser (20 ml) und Triäthylamin (0,15) ml, 0,0011 Mol). Man rührte die Mischung drei Tage lang. Das Molekül-Aggregat wurde durch Ansäuern mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 ausgefällt.
Man löste die ausgefällte Verbindung in Natriumcarbonatlösung und dialysierte diese Lösung gegen Wasser. Gefriertrockung der dialysierten Lösung ergab die gewünschte Verbindung (200 mg). Durch Analyse konnte man feststellen, dass das Produkt 6-7 O/o Protein enthielt. Die Verbindung eignete sich als Depot-Antigen zur Erzielung einer verlängerten Hyposensibilisierung in iSäugetieren.
Beispiel 6
Man stellte Pektinhydrazid her, indem man ein Äquivalent des Natrimpektinats mit zwei Äquivalenten Hydrazinhydrat in Methanol zwei Stunden lang am Rückfluss erhitzte. Das Hydrazid wurde abfiltriert mit Methanol gewaschen und getrocknet. Man konnte das Hydrazid auch auf andere Weise herstellen, indem man ein Äquivalent Natriumpektinat mit fünf Äquivalenten Hydrazinhydrat in Methanol mischte, die Mischung zwei
Tage lang bei Zimmertemperatur stehen liess und dann abfiltrierte. Anschliessend wurde gewaschen und der Feststoff getrocknet. In beiden Fällen hatte das erhaltene Pektinhydrazid die gleiche physikalische Form wie das ursprüngliche Pektin.
Man löste das Natriumsalz von Pektinhydrazid (1 g) in Wasser (50 ml) bei 0 "C und gab zu dieser Lösung Natriumnitrit (0,117 g, 0,0017 Mol) und 1 normale Salzsäure (6mol, 0,006 Mol). Während dieser Zugabe wurde das Pektin teilweise ausgefällt. Man liess die Reaktion 30 Minuten lang wobei 0 "C fortschreiten. Dann fügte man genügend Natriumbicarbonatlösung hinzu, um das Produkt aufzulösen und den pH der Mischung auf 7-8 einzustellen. Zu dieser Lösung gab man ein gefriergetrocknetes Timotheus-Pollenextrakt (50 mg) in neutraler Lösung in Wasser (10 mi) und rührte drei Tage lang.
Durch Zugabe von Calciumacetatlösung (100/o, 10ml) konnte das Produkt ausgefällt werden, und das erhaltene Gel wurde gut mit destilliertem Wasser gewaschen und durch Zentrifugieren abgetrennt.
Das -Waschen und das Zentrifugieren wiederholte man 10 Mal. Man löste das gewaschene Gel in einer wässrigen Lösung von Natrium-äthylendiamintetraacetat und Natriumcarbonat und dialysierte die Lösung gegen destilliertes Wasser. Anschliessend wurde gefriergetrocknet und man erhielt das gewünschte Molekül-Aggregat (0,52 g) welches einen Proteingehalt von 6,3 e/o aufwies.
Dieses Molekül-Aggregat hatte die gleiche Verwendung wie die Verbindung in Beispiel 5.
Beispiel 7
Man suspendierte Carrageen (2 g, 0,01 Äquivalente) in Tetrahydrofuran (50 ml) bei O OC und gab Triäthylamin (1,17 ml, 0,0085 Mol) und Äthylchlorformiat (0,82ml, 0,086 Mol) zu dieser Mischung. Man rührte die Mischung 21/4 Stunden lang. Anschliessend trennte man das gebildete gemischte Anhydrid durch Filtration ab und gab es zu einer Lösung von Hühnereiweiss (200 mg) in Wasser (60 ml).
Man liess zwei Tage lang bei 0 "C stehen und durch Zugabe von Calciumacetat (20 ml einer 100/o-igen Lösung) schied sich ein Niederschlag ab. Dieser Niederschlag wurde gründlich mit verdünnter Calciumacetatlösung (0,01 Mol) gewaschen, um das freie Protein zu befreien. Man löste das Gel durch Zugabe von Natriumcarbonat, stellte auf ein pH von 9-10 ein und gab einen geringen Uberschuss an Dinatriumsalz von ithy- lendiamintetraessigsäure hinzu. Die Lösung wurde gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Man erhielt 300 mg des Produktes mit einem Proteingehalt von 3 4 /o. Das Produkt hatte die gleiche nützliche Anwen- dung wie das Produkt von Beispiel 1.
Beispiel 8
Das Triäthylaminsalz der Alginsäure (0,7 g, 0,0025 Äquivalente) wurde in trockenem Dimethylformamid (15 ml) suspendiert und auf -5 0C abgekühlt. Zu dieser Suspension gab man Athylchlorformat (1 ml, 0,0104 Mol) und rührte bei 0 "C bis -10 OC, bis sich die Suspension des Triäthylaminsalzes aufgelöst hatte.
Zu dieser Lösung gab man eine vorher hergestellte Lösung von 200 mg Hahnenfuss-Pollenextrakt in 35 ml eiskaltem Wasser. Man stellte den pH der kalten Lösung auf 8 ein. Der pH wurde am Anfang der Reaktion konstant gehalten. Man rührte die Mischung über Nacht in der Kälte, bevor das Molekül-Aggregat durch Zugabe einer Calciumlösung (100/o, 20 ml) ausgeschieden wurde. Man arbeitete das Produkt gleich wie in Beispiel 1 auf und erhielt 450 mg des Molekül-Aggregates. Man stellte einen Proteingehalt von 4 O/o fest. Das Molekül- Aggregat hatte die gleiche Anwendung wie das Produkt von Beispiel 5.
Beispiel 9
Man suspendierte trockenes Natriumpektat (0,5 g, 0,0025 Äquivalente) in 20 ml trockenem Dimethylformamid. Zu dieser Suspension gab man 0,4 ml Di methylformamid, welches 0,0014 Mol eines Schwefel Trioxydidimethylformamid- Komplexes enthilelt. Man liess die Lösung drei Wochen lang bei Zimmertemperatur stehen, trennte den Pektat-Komplex durch Filtration ab und gab ihn zu einer Lösung von 280 mg Ambrosia Pflanzen- Pollenextrakt in eiskaltem Wasser. Die Mischung wurde zwei Tage lang bei 2 "C gerührt. Das Molekül-Aggregat konnte als Calciumsalz ausgefällt werden und man arbeitete es wie in den vorhergehenden Beispielen auf. Man erhielt 0,5 g des Produktes, welches einen Proteingehalt von 3,5 O/o aufwies.
Das Molekül Aggregat war gleich nützlich wie das Produkt von Beispiel 5.
Beispiel 10
Man suspendierte Idas Triäthylaminsalz der Alginsäure (120 mg, 0,0004 Äquivalente) in 15 ml trockenem Dimethylformamid und kühlte auf -5 OC ab. Sithyl- chlorformat (0,25 ml, 0,0026 Mol) wurden unter Rühren während zwei Stunden bei -5 0C zu dieser Lösung gegeben. Die entstandene Lösung des gemischten Anhydrids gab man in Tetrahydrofuran (25 ml) und rührte einige Minuten lang. Man filtrierte das ausgefällte gemischte Anhydrid ab und gab es zu einer Lösung von Diphtherie-Toxin (1250Lf) in 20ml eiskaltem Wasser. Der pH der Lösung wurde auf 8 eingestellt und man rührte über Nacht.
Man fällte das Molekül-Aggregat als Calciumsalz aus und arbeitete es wie in den vorhergehenden Beispielen auf. Man erhielt 90 mg des Produktes. Dieses Produkt war nützlich zum immunisieren von Säugetieren.
Beispiele 11-61
In der folgenden Tabelle sind erfindungsgemäss hergestellte Molekül-Aggregate unter Angabe des Poly -saccharids, des Antigens oder des Proteinbestandteils sowie der Herstellungsmethode zusammengestellt.
-(M.A. = Gemischte Anhydridmethode unter Verwen dung von Äthylchlorformat; W.S.D. = wasserlösliche Diimid-Methode; S.Os = SO3-Komplex-Anhydrid methoden; N.H.P = N= Hydroxypiperidin-aktive-Estermethode; A. Chl = Säurechloridmethode; Azid = Azid Methode mit Pektinhydrazid). Die Molekül-Aggregat hatten die gleiche Nützlichkeit wie die Produkte der vorhergehenden Beispiele.
Beispiel Polysaccharid Aktive Komponente Methode 11 Alginsäure Thimotheus-Pollenextrakt N.H.P.
12 Alginsäure Thimotheus-Pollenextrakt M.A.
13 Alginsäure Thimotheus-Pollenextakt W.S.D.
14 Alginsäure Thimotheus-Pollenextrakt SO3 15 Pektinsäure Thimothleus-Pollenextrakt M.A.
16 Pektinsäure Thimotheus-Pollenextrakt W.S .D.
17 Pektin Thimotheus-Pollenextrakt Azid 18 Celluronsäure Thimotheus-Pollenextrakt M.A.
19 Celluronsäure Thimotheus-Pollenextrakt W.S.D.
20 Carrageen Thimotheus-Pollenextrakt W.S.D.
21 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt M.A.
22 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SO3 23 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt M.A.
24 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt 503 25 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt M.A.
26 Alginsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SOS 27 Pektinsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SOS 28 Pektinsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt SO3 29 Pektinsäure Hahnenfuss-Pollenextrakt 503 30 Pektinsäure Ambrosia-Pollenextrakt S03 31 Alginsäure Birken-Pollenextrakt M.A.
32 Alginsäure Pferdeschuppenextrakt M.A.
33 Alginsäure Katzen-Epithelzellenextrakt M.A.
34 Alginsäure Hühnereiweiss N.H.P.
35 Alginsäure Hühnereiweiss M.A.
36 Alginsäure Hühnereiweiss W.S.D.
37 Alginsäure Hühnereiweiss SO3 38 Alginsäure Hühnereiweiss A. Chi 39 Pektinsäure Hühnereiweiss M.A.
40 Pektinsäure Hühnereiweiss W.S.D.
41 Pektinsäure Hühnereiweiss SO3 42 Pektin Hühnereiweiss Azid 43 Celluronsäure Hühnereiweiss W.S.D.
44 Carrageen Hühnereiweiss M.A.
45 Carrageen Hühnereiweiss W.S.D.
46 Isländische Moossäure Hühnereiweiss W.S.D.
47 Alginsäure Lactalbumin M.A.
48 Alginsäure Lactalbumin SOS 49 Alginsäure Schellfischextrakt M.A.
50 Alginsäure geröstetes Flachsextrakt M.A.
51 Alginsäure geröstetes Baker's SOs Hefe -Extrakt 52 Alginsäure Naja-naja-Gift SO3 53 Alginsäure Bienen-Gift SOS 54 Alginsäure Insulin W.S.D.
55 Alginsäure Tetanustoxoid SO3 56 Alginsäure Diphtherie-Gift M.A.
57 Alginsäure Trypsin M.A.
58 Pektin Trypsin Azid 59 Alginsäure Chymotrypsin M.A.
60 Pektin Chymotrypsin Azid 61 Alginsäure Ficin M.A.
Process for the production of amides and their salts from an acidic polysaccharide and complex organic compounds containing amino groups
The present invention relates to a process for the preparation of amides and their salts from an acidic polysaccharide which contains free carboxyl groups or groups of the formula -O-SOz -O-H or from functional acid derivatives of this polysaccharide and a biochemically active substance containing amino groups. The products obtainable according to the invention are molecular aggregates. The amides which can be produced according to the invention are preferably converted into soluble sodium salts or insoluble calcium salts.
The process according to the invention is characterized in that an excess of the above-mentioned polysaccharide is reacted with the substance containing amino groups in aqueous solution.
The new molecular aggregate thus consists of a complex, biochemically active organic molecule, here later referred to as the active component, which is covalently bound in this way to a polysaccharide containing acid groups (here referred to as acid polysaccharide) via part of the acid groups, that the molecular aggregate as well as the polysaccharide contains free acid groups and is able to form a water-soluble Na salt and a water-insoluble Ca salt. According to the invention, the bond is brought about by basic amino groups of the active component with the acid groups of the polysaccharide. The term basic amino group as used in this specification means any -NH- group which is capable of forming an addition salt with an acid.
The acidic polysaccharides used in particular form water-soluble Na salts and water-insoluble Ca salts, and the production of the molecular aggregates according to the invention is preferably carried out in such a way that these properties as well as the biochemical activity of the active component are retained in the end product.
Examples of suitable acidic polysaccharides are pectin, pectic acid, alginic acid, celluronic acid and carrageenan.
Pectin is a natural product and can be obtained from apples or citrus fruits, among other things. It consists of a polymer of mainly galacturonic acid in which some of the carboxyl groups are esterified. Pectic acid is the free acid obtained by saponifying pectin. Alginic acid is a natural product isolated from algae and consists of a polymer of mainly mannuronic acid and probably some glucuronic acid. Celluronic acid is a polymer of glucuronic acid and glucose, which could be produced by controlled, partial oxidation of cellulose with nitrogen dioxide.
To produce the starting product for the process according to the invention, the oxidation product can be dissolved in aqueous alkali, neutralized and precipitated as a Ca salt. The calcium is then usually removed by treatment with the disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid and dialysis against water in order to restore the soluble salt of celluronic acid.
These acidic polysaccharides can either be used as sodium salts, which were obtained by freeze-drying their solutions in vacuo, or as free acids, which can preferably be obtained by repeatedly reacting the dried sodium salts with an excess of ethanolic hydrochloric acid, washing with alcohol and drying in vacuum.
Carrageenan is a natural product that can be obtained from certain algae. It consists of a sulfatic polymer of galactose and anhydrous galactose. Suitable starting materials for the Her position of the molecular aggregates can, for. B. can be obtained by adding a Ca salt to a solution of carrageenan, separating the precipitate of the Ca salt formed, dissolving it by adding the disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid and dialyzing the solution against water. The solution obtained in this way is usually placed on a column which contains a strong cationic resin exchanger in the hydrogen form, and the resulting solution of the free carrageenic acid is reacted with enough sodium hydroxide solution to half-neutralize the acid groups. Finally, this solution can be freeze-dried in a vacuum.
The active component of the molecular aggregate can be any complex organic compound containing basic amino groups (as defined herein). In general, these substances are proteinaceous substances such as proteins, polypeptides, peptones or proteoses. These substances are usually subject to hydrolysis to form mixtures of α-amino acids in the presence of acids or enzymes. The protein-like substances mentioned in this description are understood to be complex organic materials that could be produced from individual amino acid segments.
It is also possible to use biochemically active starting products that contain amino groups, extracts from allergenic and antigenic substances, extracts from microorganisms, toxins, toxoids, hormones and enzymes. Specific examples of allergenic substances can be pollen extracts, e.g. B. of trees, Am brosiapfl anzen, extracts from edible proteins, mushrooms or animal skin or scales, insects or house dust. The active component can also be a small molecule, which itself is not antigenic, and only in a large, composite molecule, such as. B.
Hapten, becomes antigenic.
The new molecular aggregates produced according to the invention are produced by the methods of covalent bonding of complex organic compounds containing basic amino groups with acids or functional acid derivatives, and in this regard it is particularly important to select a production technique by which neither the biological activity of the components destroyed, nor introduces undesired groups into the molecular aggregate. These methods generally involve the use of a coupling agent.
A preferred embodiment relates to the use of a water-soluble diimide, such as metho-p-toluenesulfonate of 1-cyclohexyl-3-morpholinyl-ethylcarboimide, as a coupling agent. In carrying out this method, the acidic polysaccharide and the antigen are usually mixed in aqueous solution with the reagent mentioned, the diimide being converted into the corresponding urea compound and the acid groups of the polysaccharide reacting with the basic amino groups of the active component to form amide bonds. In a further preferred embodiment of the process, the acidic polysaccharide is first reacted with ethyl chloroformate in the presence of triethylamine to form a mixed anhydride, which is then allowed to react with the active component in order to form amide bonds.
The acidic polysaccharide can also be reacted with N-hydroxypiperidine in the presence of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide to give the N-hydroxypiperidine ester of the acidic polysaccharide. This ester is then usually reacted with the active component, which is bound to the acidic polysaccharide by amide bonds, releasing N-hydroxypiperidine.
It is also possible to react a partially esterified acidic polysaccharide with hydrazine hydrate to form the corresponding hydrazide. This hydrazide is then generally treated with nitrous acid to produce the corresponding azide which is reacted with the active component which is linked to the acidic polysaccharide by amide bonds. In a further preferred embodiment of the process according to the invention, an amine or metal salt of the polysaccharide is first reacted with a sulfur-trioxide-N, N'-dimethylformamide complex to form a mixed anhydride, which is then reacted with the active component to form amide bonds .
All these methods achieved have the advantage that they can be carried out in aqueous solution at relatively low temperatures. The use of these methods for the production of the molecular aggregates according to the invention is described in the following examples. It should be noted, however, that other coupling devices can be used.
Regardless of the method used, the desired molecular aggregate is generally obtained as an aqueous solution. It can be isolated from this solution, preferably by precipitation, as the Ca salt, which is filtered off and washed well with water in order to remove unreacted antigen. The washed calcium salt is then usually dissolved in an aqueous solution of sodium ethylenediamine tetraacetate and sodium carbonate and the resulting solution is dialyzed. This solution can then be dried and provides the molecular aggregate in the form of the Na salt.
In order to be sure that the molecular aggregate prepared according to the invention contains free acid groups, it is generally desirable to use an excess of the acidic polysaccharide so that the molecular aggregate has free acid groups and has the ability to form a water-soluble sodium salt and to form insoluble Ca salt. The amount of protein introduced into the molecule aggregate can be determined by methods of protein analysis, e.g. B. by nitrogen determination according to Kjeldahl.
It has been found that the molecular aggregates which can be prepared according to the invention are useful in reagent systems in which a soluble form of the biochemically active substance which, in situ, is insoluble or has been made insoluble, is used, and in which the molecular aggregate is used Maintains activity during the procedure. The insoluble form of the molecular aggregate can also be produced and used as such.
An example of the conversion to the insoluble state in situ comprises in particular the use of a soluble conjugated enzyme or another protein-containing substance such as protein to clarify fruit juice and then to remove the molecular aggregate by adding Ca ions. Another preferred application is based on the use of an insoluble antigen <molecule agglomerate to cause slow antigen liberation in tissues. Such a slow release in tissues is often referred to as the depot effect. The new molecular aggregates can also be used to produce toxins from antisera in animals, e.g. B.
Snakes well well (cobra poison).
The new molecular aggregates can be stored in a dry state.
Preferred embodiments of the invention are described in the following examples.
example 1
Alginic acid (10 g, 0.046 equivalents) and 1-cyclohexyl-3-morphoiinylethyl-carbodiimide-metho-p-toluenesulfonate (10 g, 0.024 mol) were treated with triethylamine (3.05 ml, 0.022 mol) and the sodium salt of chicken (1 g) stirred in water (200 ml) for seven days. Calcium acetate solution (10%, 100 ml) was then added to this mixture and the precipitate formed was filtered off. It was washed with distilled water (1 liter) for one hour and then centrifuged. This type of washing was repeated seven times, using 2 liters each
Water and stir overnight. The washed gel was then dissolved in an aqueous solution of sodium ethylenediamine tetraacetate and sodium carbonate.
The resulting solution was dialyzed against distilled water. The dialyzed solution was freeze-dried and 9 g of the product were obtained. By Kjeldahl
Analysis could determine a protein content of 5-6%. The product was useful for slow
Induction of antigenic substances to study anti-gene defense body reactions in mice for an extended period of time.
Example 2
Pectic acid (10 g, 0.046 equivalents) and 1-cyclohexyl-3-morpholinylethylcarbodiimide metho-p-toluene sulfonate (10 g, 0.024 mol) were treated with triethylamine
3.05 ml, (0.022 mol) and the sodium salt of chicken egg white (1 g) in water (200 ml) for seven days. The solution obtained was worked as in
Example 1 and received 10 g of the conjugated product, with a protein content of 3 <0/0. This product had the same useful application as that
Product of example 1.
Example 3
Celluronic acid (3 g 0.005 equivalents), the sodium salt of chicken egg white (0.3 g), triethylamine (0.33 ml, 0.0024 mol) and 1-cyclohexyl-3-morpholinyl ethyl carbodiimide metho-p-toluenesulfonate ( 3 g, 0.0072
Mol) were stirred in water (50 ml) for seven days. Then a solution of calcium acetate (100 / o, 50 ml) was added and the gel obtained was as in
Example 1 washed free from antigen. You solved that
Product then in an aqueous solution of
Sodium ethylenediamine tetraacetate and sodium carbonate, and dialyzed. It was freeze-dried the same as in Example 1, and the desired Mole kül aggregate (1.2 g), which had a protein content of
1.8% (determined by analysis).
The mother liquor, which after the precipitation of the
Molecular aggregate was obtained as the calcium salt, was treated with a solution of calcium acetate (100 / o,
20 ml) further treated. A precipitate formed, which was separated off, washed a few times with dilute calcium acetate solution and then dissolved. Dialyzed in the same way as for the main product. A second portion of the desired molecular aggregate was obtained 1.0 g), with a protein content of 2.8%. This molecular aggregate had the same application as in Example 1.
Example 4
Finely divided alginic acid (2 g) was stirred with triethylamine 1.32 mol, 0.0095 mol) and ethyl chloroformate (0.44 ml, 0.0046 mol) in dioxane at 5 ° C. for one hour. The product was filtered and added it to a solution of the sodium salt of chicken egg white (100 mg in 25 ml of water). The mixture was stirred for a few days and the molecular aggregate was precipitated by adding an excess of a calcium acetate solution (100 / a, 20 ml). The precipitate was After dissolving in an aqueous solution of sodium ethylenediamine tetraacetate and sodium carbonate and dialysis against water as in Example 1, followed by freeze-drying, 1.2 g of the desired molecular aggregate were obtained.
The compound had a protein content of 2.5%. It was useful in the same way as the compound of Example 1.
Example 5
Alginic acid (1.76 g, 0.008 equivalents) was added as a suspension in tetrahydrofuran (50 ml) with N, N'-cyclohexylcarbodiimide (1.03 g, 0.005 mol) and N-hydroxypiperidine 1 (1.5 g, 0.015 mol) for two days long stirred. The product was filtered off and washed with methanol to remove the resulting N, N'-dicyclohexylurea. The N-hydroxypiperidine ester of alginic acid was obtained in a yield of 1.9 g. Timothy pollen extract (25 mg) was dissolved in a little water and the solution was adjusted to a pH of 7-8 by adding 0.01 N sodium hydroxide solution. A suspension of the N-hydroxypiperidine ester of alginic acid (500 mg) in water (20 ml) and triethylamine (0.15 ml, 0.0011 mol) was then added to this solution. The mixture was stirred for three days. The molecular aggregate was precipitated by acidification with dilute hydrochloric acid to a pH of 4.
The precipitated compound was dissolved in sodium carbonate solution and this solution was dialyzed against water. Freeze-drying the dialyzed solution gave the desired compound (200 mg). Analysis revealed that the product contained 6-7% protein. The compound was suitable as a depot antigen to achieve prolonged desensitization in mammals.
Example 6
Pectin hydrazide was prepared by refluxing one equivalent of the sodium pectinate with two equivalents of hydrazine hydrate in methanol for two hours. The hydrazide was filtered off, washed with methanol and dried. Another way to make the hydrazide was to mix one equivalent of sodium pectinate with five equivalents of hydrazine hydrate in methanol, mix two
Left to stand for days at room temperature and then filtered off. It was then washed and the solid was dried. In both cases, the pectin hydrazide obtained had the same physical form as the original pectin.
The sodium salt of pectin hydrazide (1 g) was dissolved in water (50 ml) at 0 ° C. and sodium nitrite (0.117 g, 0.0017 mol) and 1 normal hydrochloric acid (6 mol, 0.006 mol) were added to this solution the pectin partially precipitated. The reaction was allowed to proceed for 30 minutes at 0 ° C. Sufficient sodium bicarbonate solution was then added to dissolve the product and adjust the pH of the mixture to 7-8. A freeze-dried Timothy pollen extract (50 mg) in neutral solution in water (10 ml) was added to this solution and the mixture was stirred for three days.
The product could be precipitated by adding calcium acetate solution (100 / o, 10 ml), and the gel obtained was washed well with distilled water and separated off by centrifugation.
The washing and centrifugation were repeated 10 times. The washed gel was dissolved in an aqueous solution of sodium ethylenediamine tetraacetate and sodium carbonate and the solution was dialyzed against distilled water. This was followed by freeze-drying and the desired molecular aggregate (0.52 g) which had a protein content of 6.3 e / o was obtained.
This molecular aggregate had the same use as the compound in Example 5.
Example 7
Carrageenan (2 g, 0.01 equivalent) was suspended in tetrahydrofuran (50 ml) at OOC and triethylamine (1.17 ml, 0.0085 mol) and ethyl chloroformate (0.82 ml, 0.086 mol) were added to this mixture. The mixture was stirred for 21/4 hours. The mixed anhydride formed was then separated off by filtration and added to a solution of chicken egg white (200 mg) in water (60 ml).
The mixture was left to stand for two days at 0 ° C. and a precipitate separated out by adding calcium acetate (20 ml of a 100% solution). This precipitate was washed thoroughly with dilute calcium acetate solution (0.01 mol) to remove the free The gel was dissolved by adding sodium carbonate, the pH was adjusted to 9-10 and a small excess of the disodium salt of ithylenediaminetetraacetic acid was added. The solution was dialyzed against water and freeze-dried. 300 mg of the product were obtained with a protein content of 3 4 / o. The product had the same useful application as the product of Example 1.
Example 8
The triethylamine salt of alginic acid (0.7 g, 0.0025 equivalents) was suspended in dry dimethylformamide (15 ml) and cooled to -5.degree. Ethylchloroformate (1 ml, 0.0104 mol) was added to this suspension and the mixture was stirred at 0 ° C. to -10 ° C. until the suspension of the triethylamine salt had dissolved.
A previously prepared solution of 200 mg buttercup pollen extract in 35 ml ice-cold water was added to this solution. The pH of the cold solution was adjusted to 8. The pH was kept constant at the beginning of the reaction. The mixture was stirred in the cold overnight before the molecular aggregate was excreted by adding a calcium solution (100 / o, 20 ml). The product was worked up in the same way as in Example 1 and 450 mg of the molecular aggregate were obtained. A protein content of 4% was found. The molecular aggregate had the same application as the product of Example 5.
Example 9
Dry sodium pectate (0.5 g, 0.0025 equivalents) was suspended in 20 ml of dry dimethylformamide. 0.4 ml of dimethylformamide, which removes 0.0014 mol of a sulfur trioxydidimethylformamide complex, was added to this suspension. The solution was left to stand for three weeks at room temperature, the pectate complex was separated off by filtration and added to a solution of 280 mg ragweed plant pollen extract in ice-cold water. The mixture was stirred for two days at 2 ° C. The molecular aggregate could be precipitated as the calcium salt and worked up as in the previous examples. 0.5 g of the product was obtained, which had a protein content of 3.5% o exhibited.
The aggregate molecule was just as useful as the product of Example 5.
Example 10
The triethylamine salt of alginic acid (120 mg, 0.0004 equivalents) was suspended in 15 ml of dry dimethylformamide and the mixture was cooled to -5.degree. Sithyl chloroformate (0.25 ml, 0.0026 mol) were added to this solution with stirring over two hours at -5 ° C. The resulting mixed anhydride solution was added to tetrahydrofuran (25 ml) and stirred for a few minutes. The precipitated mixed anhydride was filtered off and added to a solution of diphtheria toxin (1250Lf) in 20 ml of ice-cold water. The pH of the solution was adjusted to 8 and stirred overnight.
The molecular aggregate was precipitated as the calcium salt and worked up as in the previous examples. 90 mg of the product were obtained. This product was useful for immunizing mammals.
Examples 11-61
In the following table, molecular aggregates produced according to the invention are compiled, specifying the poly-saccharide, the antigen or the protein component and the production method.
- (MA = mixed anhydride method using ethyl chloroformate; WSD = water-soluble diimide method; S.Os = SO3 complex anhydride methods; NHP = N = hydroxypiperidine-active ester method; A. Chl = acid chloride method; azide = azide method with pectin hydrazide). The molecular aggregate had the same utility as the products of the previous examples.
Example Polysaccharide Active Component Method 11 Alginic Acid Thimotheus Pollen Extract N.H.P.
12 Alginic Acid Thimotheus Pollen Extract M.A.
13 Alginic Acid Thimotheus Pollen Extract W.S.D.
14 Alginic acid Thimothleus pollen extract SO3 15 Pectic acid Thimothleus pollen extract M.A.
16 Pectic acid Thimothy pollen extract W.S .D.
17 pectin thimothy pollen extract azide 18 celluronic acid thimothy pollen extract M.A.
19 Celluronic Acid Thimothy Pollen Extract W.S.D.
20 Carrageenan Thimotheus pollen extract W.S.D.
21 Alginic Acid Buttercup Pollen Extract M.A.
22 Alginic Acid Buttercup Pollen Extract SO3 23 Alginic Acid Buttercup Pollen Extract M.A.
24 Alginic Acid Buttercup Pollen Extract 503 25 Alginic Acid Buttercup Pollen Extract M.A.
26 Alginic Acid Buttercup Pollen Extract SOS 27 Pectic Acid Buttercup Pollen Extract SOS 28 Pectic Acid Buttercup Pollen Extract SO3 29 Pectic Acid Buttercup Pollen Extract 503 30 Pectic Acid Ambrosia Pollen Extract S03 31 Alginic Acid Birch Pollen Extract M.A.
32 alginic acid horse dandruff extract M.A.
33 Alginic Acid Cat Epithelial Cell Extract M.A.
34 Alginic Acid Chicken Egg White N.H.P.
35 Alginic acid chicken egg white M.A.
36 Alginic acid chicken protein W.S.D.
37 Alginic acid chicken protein SO3 38 Alginic acid chicken protein A. Chi 39 Pectic acid chicken protein M.A.
40 pectic acid chicken protein W.S.D.
41 Pectic acid chicken egg white SO3 42 Pectin chicken egg white azide 43 Celluronic acid chicken egg white W.S.D.
44 Carrageenan egg white M.A.
45 Carrageenan egg white W.S.D.
46 Icelandic moss acid chicken protein W.S.D.
47 alginic acid lactalbumin M.A.
48 alginic acid lactalbumin SOS 49 alginic acid haddock extract M.A.
50 alginic acid roasted flax extract M.A.
51 Alginic Acid Roasted Baker's SOs Yeast Extract 52 Alginic Acid Well-Well Poison SO3 53 Alginic Acid Bee Poison SOS 54 Alginic Acid Insulin W.S.D.
55 Alginic Acid Tetanus Toxoid SO3 56 Alginic Acid Diphtheria Poison M.A.
57 Alginic Acid Trypsin M.A.
58 Pectin Trypsin Azid 59 Alginic Acid Chymotrypsin M.A.
60 Pectin Chymotrypsin Azide 61 Alginic Acid Ficin M.A.