DE2201518C3 - Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
-CH CH2-
CH2 C
N
:h—
in der P ein Proteinmolekül, η eine Zahl zwischen 3 und 500 und χ eine Zahl zwischen 1 und 50 bedeutet.
2. Trägergebundenes Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß π die Zahl 50 bis 300
und χ die Zahl 1 bis 30 bedeutet.
3. Verfahren zur Herstellung des trägergebundenen Proteins nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Polyvinylpyrrolidon, dessen Lactamgruppen mindestens teilweise hydrolysiert
vorliegen, am Stickstoff methyliert, anschließend die gebildete N-methylierte Carbonsäure in einen
aktiven Ester überführt und der Ester in wäßriger Lösung mit dem Protein umgesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-
zeichnet, daß die Methylierung mit Formaldehyd in Gegenwart von Natriumborhydridübersi-iiuß durchgeführt
wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die N-methylierte Carbonsäure
in den N-Hydroxysuccinimidester oder p-Nitrophenylester überführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Hydroxysuccinimidester durch
Umsetzung der N-methy!ierten Carbonsäure in wasserfreiem Medium mit N-Hydroxysuccinimid in
Gegenwart von Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt
wird.
Die Erfindung betrifft ein neues trägergebundenes Protein, welches durch die allgemeine Formel
CH,
CH2
| -CH2 | O | CH2 | |
| C ' | NH- | CH2 | |
| \ CH, |
CH2- | \ | |
| N — I |
|||
| I CH |
|||
| -P | |||
-CH2
N
CH — CH2-
in der P ein Proteinmolekül, η eine Zahl zv/ischen 3 unü
500 und χ eine Zahl zwischen 1 und 50 bedeutet, gekennzeichnet ist.
Das erfindungsgemäße trägergebundene Protein gemäß obiger Formel leitet sich vom Polyvinylpyrrolidon
ab und ist durch kovalente Bindung mit Carboxylgruppen verknüpft, die durch teilweise Aufspaltung
der Pyrrolidonringe gebildet wird.
Der als Träger dienende Anteil des erfindungsgemäßen
trägergebundenen Proteins, der wie oben erwähnt vom Polyvinylpyrrolidon abgeleitet ist, kann ein
Molekulargewicht zwischen etwa 450 und 50 000 aufweisen. Bevorzugt werden handelsübliche Polyvinylpyrrolidonarten
als Träger im erfindungsgemäßen trägergebundenen Protein eingesetzt Besonders bevor"
zugt werden die wasserlöslichen Polyvinylpyrrölidonar·
ten, welche im allgemeinen Molekulargewichte zwl·
sehen etwa 5000 und 30 000 aufweisen.
Als Proteinanteil kommen im Rahmen der Erfindung natürliche und künstlich hergestellte Proteine und
Peptide biologischer Wirksamkeit in Frage. Insbesondere besteht der Proteinanteil des erfindungsgemäßen
Produktes aus einem oder mehreren Fermenten, Antigenen, Antikörpern und Hormonen mit Proteinstruktur
bzw. überwiegendem Proteinanteil. Im erfindungsgemäßen Produkt ist das Protein über eine
Aminogruppe mit der Carboxylgruppe der bei Aufspaltung des Lactamringes entstehenden y-Aminocarbon-
•55 säure gebunden. Eine typische Kupplungskomponente ist die Aminogruppe von Lysin innerhalb des Proteins.
Die Zahl der mit einem vom Polyvinylpyrrolidon abgeleiteten Trägermolekül gebundenen Proteinmoleküle
ist vorwiegend durch die sterischen Verhältnisse bedingt Während von der chemischen Reaktivität her
jede Lactambildung des Polyvinylpyrrolidons an sich zur Bindung eines Proteins befähigt wäre, liegt
tatsächlich aus sterischen Gründen höchstens jede vierte Carboxylgruppe, die sich durch Spaltung der
Lactamgruppe im Pyrrölidörinng bilden kann, an ein
Proteinmolekül gebunden vor.
Im erfindungsgemäßeri trägergebundenen Protein
kann ein Teil der y^MethylaminoGarbonsäüren nicht in
22 Ol 518
Form eines mit dem Protein verbundenen Säureamides, sondern als Carboxylgruppe bzw. Carboxylat vorliegen,
da bei der Herstellung des trägergebundenen Proteins sine Hydrolyse bzw. Reaktion mit Wasser unter Bildung
der freien Carbonsäure erfolgen kann.
Das erfindungsgemäße trägergebundene Protein wird hergestellt, indem ein Polyvinylpyrrolidon, dessen
Lactamgruppen mindestens teilweise hydrolysiert vorliegen, am Stickstoff methyliert, anschließend die
Carboxylgruppe in einen aktiven, d.h. leicht hydrolysierbaren Ester überführt und der Ester in wäßriger
Lösung mit dem Protein umgesetzt wird. Bevorzugt wird der N-Hydroxysuccinimidester oder p-Nitrophenylester.
Die Herstellung eines Polyvinylpyrrolidons, dessen Lactamgruppen mindestens teilweise hydrolysiert vorliegen,
erfolgt vorzugsweise nach der von H. P. Frank in J. Polymer Sei. 12, 565 (1954) beschriebenen Methode
durch Erhitzen des Polyvinylidenpyrrolidons in sehr verdünnter Alkal;'auge. Wird hierbei nach dem oben
_ angegebenen Verfahren z.B. mit O,l°/oiger NaOH
mehrere Stunden am Rückfluß erhitzt, so hydrolysieren im allgemeinen zwischen 2% und 30% der Lactamgruppen
in den Pyrrolidonringen unter Bildung einer y-Aminocarbonsäure bzw. ihres Salzes.
Als Polyvinylpyrrolidon-Ausgangsmaterial kann hierbei,
wie oben bereits erwähnt, jedes Polyvinylpyrrolidon verwendet werden, jedoch werden wasserlösliche
Polyvinylpyrrolidone bevorzugt. Das Molekulargewicht des eingesetzten Polyvinylpyrrolidons kann zwischen
etwa 440 und 50 000 liegen. Molekulargewichte zwischen etwa 5000 und 30 000 werden bevorzugt.
Das teilweise hydrolysiert^ Polyv <ylpyrrolidon wird
am Stickstoff methyliert, wobei übliche Methylierungsmittel
verwendet werden könnea Als besonders geeignet hat sich die Methylierung mit Formaldehyd in
Gegenwart von Natriumborhydrid erwiesen, da diese unter schonenden Bedingungen abläuft und die Gefahr
der Methylesterbildung nicht besteht.
Nach der Methylierung wird das gebildete y-(N-Methylamino)-carbonsäuresalz
in einen bei Normaltemperatur reaktionsfähigen Ester überführt. Als Ester kommt
hierbei der N-Hydroxysuccinimidester oder p-Nitrophenylester in Frage. Die Herstellung der Ester erfolgt
zweckmäßig durch Umsetzung eines reaktionsfähigen Derivats des N-Hydroxysuccinimids bzw. p-Nitrophenols
unter geeigneten Bedingungen mit der Carbonsäure bzw. dem Carbonsäuresalz. Vorzugsweise erfolgt die
Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel. Zur Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters wird vorzugsweise
das oben beschriebene vom Pol>vinylpyrrolidon abgeleitete y-Methylaminocarboxylat mit Succinimid
in Gegenwart von N.N-Dicyclohexylcarbodiimid
umgesetzt. Als Lösungsmittel wird Chloroform bevorzugt. Es kommen jedoch auch andere Lösungsmittel wie
z. B. Dioxan. Dimethoxyäthan. Alkohol und dgl. in Betracht. Bei dieser bevorzugten Ausführungsweise des
erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Umsetzung bei Temperaturen um 0°C unter äußerst schonenden
Bedingungen erfolgen. Mit dem Fortschreiten der Umsetzung fällt Dicyclöhexylharnstoff aus und läßt sieh
einfach abtrennen, beispielsweise durch Filtrieren,
Der erfindungsgemäß erhaltene aktive Ester wird schließlich in wäßriger Lösung mit dem zu bindenden
Protein umgesetzt, wobei lediglich eine Lösung des Proteins mit dem gelösten oder iri fester Form
vorliegenden Ester zusammengegeben wird, Die Kupp'
lung des Proteins tinter Spaltung des Esters erfolgt ohne Erhitzen auch bei niedriger Temperatur mit ausgezeichneter
Ausbeute. Überraschenderweise wird bei dieser Kupplung die biologische Aktivität des Proteins in sehr
guter Ausbeute aufrechterhalten. Beispielsweise wurde festgestellt, daß bei Einsatz von 100 mg des aktiven
N-Hydroxysuccinimidesters zusammen mit 50 mg enzymatisch aktivem Protein etwa ein Drittel der eingesetzten
enzymatischen Aktivität an den Träger gebunden erhalten blieb. Das nichtgebundene Protein kann
zurückgewonnen v/erden und behält ebenfalls seine enzymatische Aktivität bei vorsichtiger Arbeitsweise,
d. h. Einhaltung niedriger Temperaturen und geeigneter pH-Werte, aufrecht Die erfindungsgemäßen trägergebundenen
Proteine unterscheiden sich in wesentlichen Punkten sowohl von den normalen löslichen Proteinen
als auch von üblichen trägergebundenen Proteinen. Gegenüber üblichen trägergebundenen Proteinen
zeichnen sich die erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine dadurch aus, daß der Träger toxikologisch
völlig unbedenklich ist und auch von den Gesundheitsbehörden als unbedenklich zugelassen ist. Das zugrunde
liegende Polj'vinylpyrrolidon ist ein weithin gebräuchlicher
Blutersatzstoff, der in weitem Umfang für Infusionslösungen verwendet wird. Die erfindungsgemäßen
trägergebundenen Proteine können daher lebenden Organismen unbedenklich appliziert werden,
beispielsweise durch injektion. Infusion oder ähnliche Methoden. Dies gilt insbesondere, wenn sich die
erfindungsgemäßen Verbindungen von wasserlöslichen Polyvinylpyrrolidonen ableiten. In diesem Falle sind
auch die erfindungsgemäßen trägergebundenen Enzyme selbst noch wasserlöslich und können daher in Form
von Infusionslösungen, Injektionslösungen und dgl. verabreicht werden. Gegenüber nichtträgergebundenen
Proteinen weisen die erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine den Vorteil auf, daß sie sich wie
zellgebundene biologisch aktive Proteine verhalten. Bekanntlich sind z. B. Enzyme im Organismus zum
großen Teil nicht in löslicher Form vorhanden, sondern
-to liegen zellgebunden vor. z. b. an Organellen und
Membranen fixiert. Bei der Gewinnung dieser aktiven Proteine wird die Zelli.truktur zerstört, beispielsweise
die Organelle aufgelöst oder die Membrane zerstückelt und die daraus gewornenen Proteine, beispielsweise
Enzyme, ändern hierbei ihre Eigenschaften gegenüber der zellgebundenen Art nicht unerheblich. Überraschenderweise
zeigen nun die erfindungsgemäßen trägergebundenen Enzyme eir Verhalten, welches dem der
zellgebundenen Protfine äußerst nahe kommt. F.rfin dungsgemäße trägerge-bundene Proteine eignen sich
daher weit besser als die nichtträgergebundenen entsprechenden Proteine /ur Verabreichung an lebende
Organismen oder zur Untersuchung der Eigenschaften der Proteine im zellfreien System, da die Veränderun
gen in der Reaktivität bzw. Verhaltensweise, die bei der Herauslösung aus der Zellgebundenheit auftritt, hier
nicht oder nur in wesentlich geringerem Maße vorliegt. Em weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen trägerge
bundenen Proteine besteht darin, daß sie eine wesentlich verlängert« Lebensdauer oder Haltbarkeit
bei Applikation in den lebenden Organismus aufweisen als die entsprechenden nichtträgergebundenen Pro*
teine, gleichgültig, ob sie im lebenden Organismus normalerweise zellgebunden oder zellfrei auftreten. So
ist es mit den erfindungsgemäßen Proteinen möglich, Antigene, Hormone, Antikörper oder Fermente zu
verabreichen und hierbei eine Wesentlich längere Wirkungsdauer zu erzielen als bei den bisher verab-
reichten nichtträgergebundenen korrespondierenden Proteinen.
Die »Verweilzeit« der erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine im Organismus läßt sich je nach
Wunsch variieren. Die Verweilzeit steigt hierbei mit steigendem Molekulargewicht bzw. sinkt mit sinkendem
Molekulargewicht Das Verhalten des erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteins ist in dieser Hinsicht
analog dem Ausscheidungsverhalten des Polyvinylpyrrolidons, welches z. B. bei Molekulargewichten von
etwa 12 000 verhältnismäßig leicht vom Organismus nanh Applikation durch Infusion und dgl. wieder
ausgeschieden wird, während ein Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von etwa 30 000 nur
schwer wieder ausgeschieden wird und eine sehr lange Verweilzeit im Organismus aufweist Durch geeignete
Wahl des Molekulargewichtes des Trägers im erfindungigemäßen trägergebundenen Protein bzw. geeignete
Wahl von χ läßt sich daher die Verweilzeit des Produktes im Organismus gewissermaßen »maßschneidern«.
Das folgende Beispiel erläutert das erfndungsgemä-Be
Protein und seine Herstellung weiter.
1 g Polyvinylpyrrolidon vom Molekulargewicht 25 000 bis 30 000 wird in 1 %iger wäßriger Lösung mit so
viel NaOH versetzt, daß die erhaltene Lösung schließlich 0,1 Gew.-°/o NaOH enthält Die erhaltene
Lösung wird 25 Stunden zum Rückfluß erhitzt Nach dem Abkühlen werden der Lösung unter Rühren
abwechselnd lOMikroliter 35°/oiger Formaldehyd und 0,5 ml einer Q,2o/oigen Natriumborhydridlösung in
Abständen von 3 Minuten so lange zugesetzt, bis insgesamt 500 Mikroliter Formaldehyd zugegeben sind.
Anschließend wird Natriumborhydridlösung im Überschuß zugesetzt. Danach wird mit Salzsäure auf einen
pH-Wert von etwa 3 angesäuert und die erhaltene Lösung über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Die erhaltene Lösung wird zur Trockene eingeengt, in Chloroform aufgenommen und mit Äther gefällt Man
erhält so 1 g eines Polyvinylpyrrolidons, bei dem etwa 5% der Pyrrolidonringe hydrolysiert in Form einer
jj-N-Methylaminocarbonsäure vorliegen.
Die gewonnene Substanz (Ig) wird in 150ml
trockenem Chloroform aufgenommen und mit einer Lösung von 500 mg Succinimid in 50 ml Chloroform
versetzt Die Lösung wird auf — 100C abgekühlt und mit
! g Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid in trockenem Chloroform
versetzt Die Lösung wird bei dieser Temperatur 3 Stunden lang gerührt, danach auf 0°C erwärmen
gelassen und bei dieser Temperatur weitere 12 Stunden gerührt Danach wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff
abfiltriert Das klare Filirat wird mit Äther versetzt bis kein weiterer Niederschlag ausfällt Der
Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, in 5%iger Natriumbicarbonatlösung pH 8 aufgenommen und mit
einem gleichen Volumen einer Lösung von Trypsin im gleichen Lösungsmittel bei 4° C gemischt Die erhaltene
Lösung wird unter Rühren 48 Stunden bei 4C C gehalten. Dann wird das nichtgebundene Trypsin durch Gelfiltration
eiitfernt Das erhaltene trägergebundene Trypsin
weist etwa 33% der ursprünglich iingesetzten Aktivität
auf.
Aus der DE-OS 21 06 214 sind an einen unlöslichen siliciumhaltigen Träger, wie Sand, Siliciumdioxid und
dergl. gebundene Proteine bekannt, bei denen zur Ve-Tinüpfung des Proteins mit dem Träger ein
Organosilan verwendet wird.
Die Einsatzmöglichkeiten derartiger trägergebundener Enzyme sind beschränkt, einesteils aufgrund ihrer
Unlöslichkeit, andererseits aufgrund ihres unphysiologischen Trägermaterials. Erfindungsgemäße trägergebundene
Enzyme können demgegenüber in wasserlöslicher Form gewonnen und können sogar dem lebenden
Organismus einverleibt werden, da das Trägermaterial einen bewährten Blutplasmaersatzstoff darstellt Hinzu
kommt daß erfindungsgemäß hohe Aktivitätsausbeuten erzielt werden, sowie die Möglichkeit, die Verweilzeit
der erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine nach Verabreichung im Organismus durch enisprechende
Auswahl des Molekulargewichts des Trägermaterials zu steuern.
Claims (1)
- Patentansprüche: 1. Trägergebundenes Protein, gekennzeichnet durch die allgemeine FormelCH2 CHi CH2 CH2,0CH2 C '\ \mh tN-CH3"" i
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19722201518 DE2201518C3 (de) | 1972-01-13 | 1972-01-13 | Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19722201518 DE2201518C3 (de) | 1972-01-13 | 1972-01-13 | Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2201518A1 DE2201518A1 (de) | 1973-07-19 |
| DE2201518B2 DE2201518B2 (de) | 1980-12-18 |
| DE2201518C3 true DE2201518C3 (de) | 1982-02-25 |
Family
ID=5832915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19722201518 Expired DE2201518C3 (de) | 1972-01-13 | 1972-01-13 | Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE2201518C3 (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3130606C2 (de) * | 1981-08-01 | 1985-03-21 | Rolf Dr. 8700 Würzburg Siegel | Verfahren zur Isolierung von an der Antikörperbildung beteiligten Zellen |
-
1972
- 1972-01-13 DE DE19722201518 patent/DE2201518C3/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2201518B2 (de) | 1980-12-18 |
| DE2201518A1 (de) | 1973-07-19 |
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