DE2201518B2 - Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
CH CH2—
CH2-
CH2
CH2 C
N
CH CH2-
in der P ein Proteinmolekül, π eine Zahl zwischen 3
und 500 und χ eine Zahl zwischen 1 und 50 bedeutet
2. Trägergebundenes Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß π die Zahl 50 bis 300
und Jr die Zahl 1 bis 30 bedeutet
3. Verfahren zur Herstellung des trägergebundenen Proteins nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Polyvinylpyrrolidon, dessen Lactamgruppen mindestens teilweise hydrolysiert
vorliegen, am Stickstoff methyliert, anschließend die
gebildete N-methylierte Carbonsäure in einen aktiven Ester überführt und der Ester in wäßriger
Lösung mit dem Protein umgesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-
zeichnet, daß die MethyUerung mit Formaldehyd in
Gegenwart von Natriumborhydriduberschvi durchgeführt
wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch . gekennzeichnet daß die N-methylierte Carbonsäure
in den N-Hydroxysuccinimidester oder p-Nitrophenylester überführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Hydroxysuccinimidester durch
Umsetzung der N-methylierten Carbonsäure in wasserfreiem Medium mit N-Hydroxysuccinimid in
Gegenwart von N.N-Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt wird.
Die Erfindung betrifft ein neues trägergebundenes Protein, welches durch die allgemeine Formel
CH2
-CH2
CH2 ^
\ \nh-p
N-CH3""
CH
CH2-
CH2
CH2
CH2
C \
-CH—CH2-
in der P ein Proteinmolekül, η eine Zahl zwischen 3 und
500 und χ eine Zahl zwischen 1 und 50 bedeutet gekennzeichnet ist
Das erfmdungsgemiße trägergebundene Protein
gemäß obiger Formet leitet sich vom Polyvinylpyrrolidon ab und ist durch kovalente Bindung mit
Carboxylgruppen verknüpft, die durch teilweise Aufspaltung der Pyrrolidonringe gebildet wird.
Der als Träger dienende Anteil des erfindungsgemä-Qen trägergebundenen Proteins, der wie oben erwähnt
vom Polyvinylpyrrolidon abgeleitet ist, kann ein Molekulargewicht zwischen etwa 450 und 50000
aufweisen. Bevorzugt werden handelsübliche PolyvinylpyrrelidonartetT als Trager im erfmdungsgemfßen
trägergebundenen Protein eingesetzt. Besonders bevorzugt werden die wasserlöslichen Polyvinylpyrrolidonarten,
welche im allgemeinen Molekulargewichte zwischen etwa 500O und 30 000 aufweisen.
Als Proteinanteil kommen im Rahmen der Erfindung natürliche und künstlich hergestellte Proteine und
Peptide biologischer Wirksamkeit in Frage. Insbesondere besteht der Proteinanteil des erfindungsgemäßen
Produktes aus einem oder mehreren Fermenten,
so Antigenen, Antikörpern und Hormofwn mit Proteinstruktur bzw. überwiegendem Proteinanteil. Im erfindungigemäßen Produkt ist das Protein Ober eine
Aminogruppe mit der Carboxylgruppe der bei Aufspaltung des Lactamringes entstehenden y-Aminocarbon-
säure gebunden. Eine typische Kupplungskomponente
ist die Aminogruppe von Lysin innerhalb des Proteins.
Die Zahl der mit einem vom Polyvinylpyrrolidon
abgeleiteten Trägermolekül gebundenen Proteinmolekale ist vorwiegend durch die sterischen Verhältnisse
μ bedingt Während von dir chemischen Reaktivität her
jede Lactambildung des Polyvinylpyrrölfdons an sich
zur Bindung eines Proteins befähigt wäre, liegt tatsächlich aus sterischen Gründen höchstens jede
vierte Carboxylgruppe, die sich durch Spaltung der Lactamgruppe im Pyrrolidonring bilden kann, an ein
Proteip.molekül gebunden vor.
Im erfindungsgemäßen trägergebundenen Protein kann ein Teil der y-Methylaminocarbonsäuren nicht in
Form eines mit dem Protein verbundenen Säureamides,
sondern als Carboxylgruppe bzw. Carboxylat vorliegen, da bei der Herstellung des trägergebundenen Proteins
eine Hydrolyse bzw. Reaktion mit Wasser unter Bildung der freien Carbonsäure erfolgen kann.
Das erfindungsgemäße trägergebundene Protein wird hergestellt, indem ein Polyvinylpyrrolidon, dessen
Lactamgruppen mindestens teilweise hydrolysiert vorliegen, am Stickstoff methyliert, anschließend die
Carboxylgruppe in einen aktiven, d. h. leicht hydrolysierbaren
Ester überführt und der Ester in wäßriger Lösung mit dem Protein umgesetzt wird. Bevorzugt
wird der N-Hydroxysuccinimidester oder p-Nitrophenylester.
Die Herstellung eines Polyvinylpyrroüdons, dessen Lactamgruppen mindestens teilweise hydrolysiert vorliegen,
erfolgt vorzugsweise nach der von H. P. Frank in J. Polymer ScL 12, 565 (1954) beschriebenen Methode
durch Erhitzen des Polyvinylidenpyrrolidons in sehr
verdünnter AlkalOauge. Wird hierbei nach dem oben
angegebenen yei^iren z.JB.Jjnit 0,19Wger NaOH
mehrere Stunden am Rückfluß erhitzt, so Hydrolysieren
im allgemeinen zwischen 2% und 30% der Lactamgruppen
in den Pyrrolidonringen unter Bildung einer y-Aminocarbonsäure bzw. ihres Salzes.
Als Poly vinylpyrrolidon-Ausgangsmaterial kann hierbei,
wie oben bereits erwähnt, jedes Polyvinylpyrrolidon verwendet, werden, jedoch werden wasserlösliche
Polyvinylpyrrolidone bevorzugt Das Molekulargewicht des eingesetzten PotyvmylpynOlidonskann zwischen
etwa 440 und 50 000 liegen, Molekulargewichte zwischen etwa 5000 Uid 30 000 werden bevorzugt
Das teilweise hydrolysierte, ^olyvip^lpyrrolidon wird
am Stickstoff methyliert, wobei übliche Methylierungsmittel
verwendet werden könaen. v ils besonders
geeignet hat sich die Methylienlng mit Formaldehyd in Gegenwart von Natriumborhydrid erwiesen, da diese
unter schonenden Bedingungen abläuft und die Gefahr der Methylesterbildung nichtbesteht
Nach der Methylierung wird das gebildete y-(N-Methylamino)-carbonsauresalz
in einen bei Normaltemperatur reaktionsfähigen Es!«.)· überführt Als Ester kommt
hierbei der N-Hydroxysuccinimidester oder p-Nitrophenylester in Frage. Die Herstellung der Ester erfolgt
zweckmäßig durch Umsetzung eines reaktionsfähigen Derivats des N-Hydroxysuccinimids bzw. p-Nitrophenols
unter geeigneten Bedingungen mit der Carbonsäure bzw. dem Carbonsäuresalz. Vorzugsweise erfolgt die
Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel. Zur Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters wird vorzugsweise
das oben beschriebene vom Polyvinylpyrrolidon abgeleitete y-Methjlaminocarboxylat mit Succinimid
in Gegenwart von N.N-Dicyclohexylcarbodiimid
umgesetzt Als Lösungsmittel wird Chloroform bevorzugt
Es kommen jedoch auch andere Lösungsmittel wie z.B. Dioxan, Dimethoxyäthsn, Alkohol und dgl. in
Betracht Bei dieser bevorzugten Ausführungsweise des erfindungsgeinäßen Verfahrens kann die Umsetzung bei
Temperaturen Uftt 0*C unter äußerst schonenden
Bedingungen erfolgen. Mit dem Fortschreiten der Umsetzung fallt Dicyclohexylhsmstoff aus und IaBt sich
einfach abtrennen, beispielsweise durch Filtrieren.
Der erfindungsgemäß erhaltene aktive Ester wird schließlich in wäßriger Lösung mit dem zu bindenden
Protein urngesetzt, wobei lediglich eine Lösung des Proteins mit dem gelösten oder in fester Form
vorliegenden Ester zusammengegeben wird. Die Kupplung des Proteins unter Spaltung des Esters erfolgt ohne
Erhitzen auch bei niedriger Temperatur mit ausgezeichneter Ausbeute, Überraschenderweise wird bei dieser
Kupplung die biologische Aktivität des Proteins in sehr guter Ausbeute aufrechterhalten. Beispielsweise wurde
s festgestellt, daß bei Einsatz von 100 mg des aktiven
N-Hydroxysuccinimidesters zusammen mit 50 mg enzymatisch aktivem Protein etwa ein Drittel der eingesetzten
enzymatischen Aktivität an den Träger gebunden erhalten blieb. Das njchtgebundene Protein k/uin
zurückgewonnen werden und behält ebenfalls seine enzymatische Aktivität bei vorsichtiger Arbeitsweise,
& h. Einhaltung niedriger Temperaturen und geeigneter pH-Werte, aufrecht Die erfindungsgemäßen trägergebundenen
Proteine unterscheiden sich in wesentlichen Punkten sowohl von den normalen löslichen Proteinen
als auch von üblichen trägergebundenen Proteinen. Gegenüber üblichen trägergebundenen Proteinen
zeichnen sich die erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine dadurch aus, daß der Träger toxikologisch
völlig unbedenklich ist und auch von den Gesundheitsbehörden als unbedenklich zugelassen ist Das zugrunde
liegende PoiyVmyipyrfoUdon ist ein weithin gebräuchlicher
Blutersatzstoff, der in weitem Umfang für Infusionslösungen verwendet wird. Die erfindungsgemäßen
trägergebundenen Proteine können daher lebenden Organismen unbedenklich appliziert werden,
beispielsweise durch Injektion, Infusion odsr ähnliche
Methoden. Dies gut insbesondere, wenn sich die
erfindungsgemäßen Verbindungen von wasserlöslichen Polyvinylpyrrolidonen ableiten. In diesem Falle sind
auch die erfindüngsgesiäßen trägergebundenen Enzyme
selbst noch wasserlöslich und können daher in Form von Infusionslösungen, Injektionslösungen und dgL
verabreicht werden. Gegenüber nichtträgergebundenen Proteinen weisen die erfindungsgemäßen trägergebundenen
Proteine den Vorteil auf, daß sie sich wie zellgebundene biologisch aktive Proteine verhalten.
Bekanntlich sind z.B. Enzyme im Organismus zum großen Teil nicht in löslicher Form vorhanden, sondern
liegen zellgebunden vor, z.B. an Cirganellen und
Membranen fixiert Bei der Gewinnung dieser aktiven Proteine wird die Zellstruktur zerstört, beispielsweise
die Organeile aufgelöst oder die Membrane zerstückelt und die daraus gewonnenen Proteine, beispielsweise
Enzyme, ändern hierbei ihre Eigenschaften gegenüber der zellgeb t.idenen Art nicht unerheblich. Überraschenderweise
zeigen nun die erfindungsgemäßen trägergebundenen Enzyme ein Verhalten, welches dem tlei
zellgebundenen Proteine äußerst nahe kommt Erfin-
so dungsgemäße trägergebundene Proteine eignen sich daher weit besser als die nichtträgergebundenen
entsprechenden Proteine zur Verabreichung an lebende Organismen oder zur Untersuchung der Eigenschaften
der Proteine im zellfreien System, da die Veränderungen
in der Reaktivität bzw. Verhaltensweise, die bei der Herauslösung aus der Zellgebundenheit auftritt hier
nicht oder nur in wesentlich geringerem Maße vorliegt Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen trägergebunden^«
Proteine besteht darin, daß sie eine wesentlich verlängerte Lebensdauer oder Haltbarkeit
bei Applikation in den lebenden Organismus aufweisen als die entsprechenden nichtträgergebundenen Proteine,
gleichgültig, ob sie im lebenden Organismus normalerweise zellgebunden oder zellfrei auftreten. So
ist es mit den erfindungsgemäßen Proteinen möglich, Antigene, Hormone, Antikörper oder Fermente zu
verabreichen und hierbei eine wesentlich längere Wirkungsdauer zu erzielen als bei den bisher verab-
reichten nichtträgergßbundenen korrespondierenden
Proteinen.
Die »Verweilzeit« der erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine im Organismus läßt sich je nach
Wunsch variieren. Die Verweilzeit steigt hierbei mit steigendem Molekulargewicht bzw. sinkt mit sinkendem
Molekulargewicht Das Verhalten des erfindungsgemäßen trägergebundenwi Proteins ist in dieser Hinsicht
analog dem Ausscheidungsverhalten des Polyvinylpyrrolidons, welches z.B. bei Molekulargewichten von
etwa 12 000 verhältnismäßig leicht vom Organismus Dach Applikation durch Infusion und dgL wieder
ausgeschieden wird, während ein Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von etwa 30 000 nur
schwer wieder ausgeschieden wird und eine sehr lange Verweilzeit im Organismus aufweist Durch geeignete
Wahl des Molekulargewichtes des Trägers im erfinduEgsgemäßen trägergebundenen Protein bzw. geeignete Wahl von χ läßt sich daher die Verweilzeit des
Produktes im Organismus gewissermaßen »maßschneidern«.
Das folgende Beispiel erläutert das cfindungsgemäße Protein und seine Herstellung weiter.
1 g Polyvinylpyrrolidon vom Molekulargewicht 25 000 bis 30 000 wird in l%iger wäßriger Lösung mit so
viel NaOH versetzt, daß die erhaltene Lösung schließlich 0,1 Gew.-% NaOH enthält Die erhaltene
Lösung wird 25 Stunden zum Rückfluß erhitzt Nach dem Abkühlen werden der Lösung unter Rühren
abwechselnd 10 Mikroliter 35%iger Formaldehyd und 0,5 ml einer 0,2%igen Natriumborhydridlösung in
Abständen von 3 Minuten so lange zugesetzt, bis insgesamt 500 Mikroliter Formaldehyd zugegeben sind.
Anschließend wird Natriumborhydridlösung im Überschuß zugesetzt Danach wird mit Salzsäure auf einen
pH-Wert von etwa 3 angesäuert und die erhaltene Lösung über Nacht gegen destilliertes Wasser diaJysiert
Die erhaltene Lösung wird zur Trockene eingeengt, in
Chloroform aufgenommen und mit Äther gefällt Man erhält so 1 g eines Polyvinylpyrrolidons, bei dem etwa
5% der Pyrrolidonringe hydrolysiert in Form einer
y-N-Methylaminocarbonsäure vorliegen.
Dit· gewonnene Substanz (Ig) wird in 55OmI
trockenem Chloroform aufgenommen und mit einer
Lösung von 500 mg Succinimid in 5OmI Chloroform
versetzt Die Lösung wird auf - 100C abgekühlt und mit 1 g NjN-Dicyclohexylcarbociiimid in trockenem Chloroform versetzt Die Lösung wird bei dieser Temperatur
3 Stunden lang gerührt, danach auf 00C erwärmen
gelassen und bei dieser Temperatur weitere 12 Stunden
gerührt Danach wird der ausgefallene Dicyelohexylharnstoff abfiltriert Das klare Filtrat wird mit Äther
versetzt, bis kein weiterer Niederschlag ausfällt Der Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet in 5°/oiger
Natriumbicarbonatlösung pH 8 aufgenommen und mit einem gleichen Volumen einer Lösung von Trypsin im
gleichen Lösungsmittel bei 4° C gemischt Die erhaltene Lösung wird unter Rühren 48 Stunden bei 4° C gehalten.
Dann wird das nichtgebundene Trypsin durch Gelfiltra
tion üntfernt Das erhaltene trägergebundene Trypsin
weist etwa 33% der ursprüngliui eingesetzten Aktivität
auf.
Aus der DE-OS 21 06 214 sind an einen unlöslichen siliciumhaltigen Träger, wie Sand, Siliciumdioxid und
dergL gebundene Proteine bekannt, bei denen zur Verknüpfung des Proteins mit dem Träger ein
Organosilan verwendet wird.
Die Einsatzmöglichkeiten derartiger trägergebundener Enzyme sind beschränkt, einesteils aufgrund ihrer
Unlöslichkeit, andererseits aufgrund ihres unphysiologischen Trägermaterials. Erfindungsgemäße trägergebundene Enzyme können demgegenüber in wasserlöslicher
Form gewonnen und können sogar dem lebenden Organismus einverleibt werden, da das Trägermaterial
einen bewährten Blutplasmaersatzstort darstellt Hinzu
kommt, daß erfindur/gsgemäß hohe Aktivitätsausbeuten erzielt werden, sowie die Möglichkeit die Verweilzeit
der erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine nach Verabreichung im Organismus durch ey tsprechen
de Auswahl des Molekulargewichts des Trägermaterials
zu steuern.
Claims (1)
1. Trägergebundenes Protein, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel
CH,
-CH2
aO
CH2 ^
Xn-ch)nh-1
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19722201518 DE2201518C3 (de) | 1972-01-13 | 1972-01-13 | Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19722201518 DE2201518C3 (de) | 1972-01-13 | 1972-01-13 | Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2201518A1 DE2201518A1 (de) | 1973-07-19 |
| DE2201518B2 true DE2201518B2 (de) | 1980-12-18 |
| DE2201518C3 DE2201518C3 (de) | 1982-02-25 |
Family
ID=5832915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19722201518 Expired DE2201518C3 (de) | 1972-01-13 | 1972-01-13 | Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE2201518C3 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3130606A1 (de) * | 1981-08-01 | 1983-02-17 | Rolf Dr. 8700 Würzburg Siegel | Mittel zur antikoerperbildung |
-
1972
- 1972-01-13 DE DE19722201518 patent/DE2201518C3/de not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3130606A1 (de) * | 1981-08-01 | 1983-02-17 | Rolf Dr. 8700 Würzburg Siegel | Mittel zur antikoerperbildung |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2201518C3 (de) | 1982-02-25 |
| DE2201518A1 (de) | 1973-07-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OD | Request for examination | ||
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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