DE1770715A1 - Peptidderivate - Google Patents

Description

Peptidderivate

Di·»« Erfindung betrifft ein Verfahren eua Herstellen von tert.-Butyloxyoarbot)yl-lytiin-5-oarboiy«anhydrid und /-M-tert.-Butyloxyoarbonyl-oiOithin-iT-oarboxy-anhydrid durch ttaeetsuag der eutepreonenden I-tert.-Butyloxyoarbonylaeino-Saure «i* Pbo«««n bei einer Temperatur von etwa 15 Ut 40° C in einer fur die BMfction inerten, organischen ?meei«keit_f vie Acetonitril« und in Gfeeenvart ein·» Salsee, wie Quecksilber(II )-cyanid, das «1· ^v Chlorvaeeeretoff-Akzeptor wirkt und ein unlösliche« Qu«oksilfc«r(XI)-ohlorld bildet. Me Erfindung betrifft auch dl· Verwendung der H-Carboiy-anhydride für die Eeratellung tob Ptptiden,

Allgeeein betrifft die Erfindung Verfahren au» Heretellen von ?eptiden, die baeiaohe AainoeÄuren enthalten» eowie neuartig· Ter* binduagen· die bei eolohen Reretellungeverfahren Tenrendung finden, inabeeondere VrCarboxy-antaydrid· von lyein und Ornithin, in denen dl« endettoiige Aminogruppe durch eine

11333 *

nylgruppe gesohtttst let, sowie die Verwendung dieser Terblndungen für die Herstellung Von Peptide«.

Bei der Beschreibung dieser Erfindung wird genäse anerkannte» Brsuoh die endständlge Amlnogruppe la lysin und Ornithin als die ω-Amlnogruppe identifleiert. Der Zweekmäeslfjkeit halber wird die tert.-Btttyloxycarbonylgruppe als t-BOC-öruppe beeelchnet.

Die Synthese ron Peptiden, insbesondere von Heteropeptiden, let ein Problem» das sloh der Technik seit lange» gestellt hat· Solche Produkte sind als Zwischenstufen bei der Synthese vom Proteinen nütslloh. Einige iron Ihnen eind therapeuteloh wirksam» Sie sind auch bei der Untersuchung und Analyse ron Proteinen, insbesondere solchen Untersuchungen nütslioh» die darauf abgestellt sind» Sin· blick in die Wirkungsweise Ton Snsymen, Hormonen und anderen Proteinen mit wichtigen funktionen im Körper eu gewinnen*

Obwohl solion viele Methoden für die Peptld-Syttthese entwickelt worden sind» hat sich keine als vollständig sufriedenatellend erwiesen. Die meisten dieser Arbeitsweisen beruhen auf einer stufenweise Synthese» bei der zu Beginn die oc-Aminogruppe einer ersten Aminosäure durch eine leicht entfernbare Oruppe, wie eine Bensyl« oxyoarbonylgruppe, gesohtttst wird. Die Carboxylgruppe dieser geeohtitftten Aminosäure wird dann für die UHaetsung mit der o-Aminogruppe einer aweiten Aminosäure aktiviert. Sine typleohe Aktlriernngsmethode besteht darin« dasa die geeohütat· Amlaosaure In ein

romi/1918

, · , . ORIGINAL INSPECTED

11533 ^

S&ureehlorid übergeführt wird. Di· geschützte, aktivierte Amino« eÄure wird dann Bit einer «weiten Aminosäure oder ein·» Peptid durch Bildung einer Amidbindung awiechem der aktivierten Carboxyl* gruppe der geaohtttsten Aminosäure und einer freien Aminogruppe, gewöhnlich der a-Aminogruppe der eireiten Aminosäure, au einem neuen Peptid umgesetat. In der absohllesaendem Stufe wird die aohütsemd· Gruppe entfernt·

Si· Synthese τοη Peptlden, die basische Aminosäuren, wi·

und Ornithin, enthalten, hat sich wegen der Anwesenheit, der auafttsliohen, endetftndigen Aainogruppe ale ein besondere, eohwieriges Problem erwiesen. Im Beetreben, die Schwierigkeiten au vermeiden, wurden Teraohiedene Methoden entworfen. Bei den «eisten dieser Methoden wird die eudstttndige Amlnogruppe dadurch, da«· aie durch eine leicht entferntere Gruppe geechütst wird» daran gehindert, in die peptidhildende Reaktion einaugreifen. line solohe Oruppe ist di· t-BOC-öruppe. Biese Gruppe kann nach bekannten Methoden siemlich leicht an der ^-Aminogruppe des Lysine oder Ornithin· einge- ( führt werden. Sie ist wegen der Leichtigkeit bekannt, sit der sie in wasserfreien Medien durch di· Wirkung τοπ Chlorwasserstoff ohne unangemessenen Terluet an Produkt infolge einer Spaltung der Peptldblndtmg entfernt werden kaan.

Mne Arbeitsweise sur Herstellung τοη Peptiden, die bislang hauptsflohlich in niohtwaaarigen' Medien und nur für die Herstellung -rom niedrig-molekularen Feptiden, wie Bipeptiden oder Tripeptiden,

10ST815-/1918

ORIGINAL I

11333

angewandt worden let, let die V~(!arboxy-anhydrid-Arbettawelee (hier ale HCA-Arbeitswelse beeeiofcnet). Oeaass dieser Methode wird eine Aminoefture gewöhnlich durch Ttaeetstung alt Phoegen in ihr H-Oarboxy-enhydrid Übergeführt, und das Anhydrid wird mit einer «weiten Aminosäure oder einem Peptid unter Bildung eines Carbamate umgesetzt. Oft zersetzt sioh das Carbamat spontan unter Verlust ron Kohlenstoffdloxld unter Bildung des gewünschten neuen Peptide· Andererselts kann das Carbamat auch durch S&uresusate deoarboxyliert werden. Sie ICA-Arbeitsweise ist besonders interessant, da die Bildung des Anhydrids dem doppelten Zweck dee Sehutses der a-Aminogruppe und der .Aktirieruag d_er carboxylgruppe dient·

Tor kurzem wurden Methoden entwickelt» um die BGA-Arbeitsweise an die kontrollierte, stufenweise Synthese τοη hochmolekularen und niedermolekularen Heteropeptlden in wässrigen Medien aneupassen. Bei diesen Methoden wird das I-Oarboxy-enhydrid einer Aminosäure unter kontrollierten Bedingungen τοη Temperatur, Wasseret off ionen- * Konzentration, Mieohungsgeechwlndigkeit und Reaktanten-Konaentretion mit einer Aminosäure oder einem Peptid zusammen gebracht, um ein Carbamat-Zwisohenprodukt zu bilden, das, obgleich die Decarboxylierung spontan tot sich gehen kann, normalerweise durch Zusats τοη Säure deoarboxyliert wird. In Jedem Pelle wird das gewünschte Peptid erseugt.

Die Anpassung der kttrelioh beschriebenen Arbeitsweisen an basisch· Aminosäuren 1st oft eohwierlg, hauptsächlich deshalb, well

1098*85/1918

die zusätzliche funktionelle Gruppe die Anhydridbildung stört. Ausserden ist es gewöhnlich am besten, wenn die endständige Aminogruppe geschützt wird, ua während der ?eptidbildung eine Auebeute· einbusse infolge der Reaktion zwischen dieser Gruppe und einen Anhydridmolekül zu verhindern. Wenn beispielsweise die Herstellung ▼on Lysy!phenylalanin durch Uosetcung von H-Carboxy-lysin-^nhydrld und Phenylalanin angestrebt «rlrd, kann die Ausbeute wegen der Reaktion swisohen eine a Anhydriduolekül und der ^-Aminogruppe eines anderen Anhydridxoleküls beträchtlich herabgesetst werden* sofern nicht Jene Gruppe.gesohütat wird. Sie üblichen echüt»enden wie die Bensyloxyoarbctnylgruppe und ihre nahen Analoga oder Hoaologa, sind oft nicht befriedigend, weil eine beträchtliche Einbusee an der Peptid-Gefiamtauabeute im Laufe der Einführung und Entfernung der echüt senden Gruppe eintreten kann. Be besteht daher, •in Bedarf an einem Verfahren, duroh welches die JCA-Arbeiteweise der Herstellung r<m. Peptlden, die basische Aminosäuren enthalte», geeignet angepasst werden kann·

4/-ff-t-B00-Lyeln und«Ornithin sind bekannte Verbindungen, für die YCUUArbeitsweise wären sie wegen der Leichtigkeit, ait der die schützend© Gruppe entfernt werden kann, besonders attraktiT. Jedoch ist es bislang nicht aSglioh gewesen, diese Verbindungen en verwenden, da sie einer Anhydridbildung durch Umsetzung ait Phosgen, ohne dass die t-BOO-Gruppe duroh Einwirkung ties als Hebemprodukt ' auftretenden Chlorwasserstoffs abgespalten wird, nicht sugtnglioh sind. Ausserdem wurde angenoamen, d^ss die Entfernung der Gruppe

1098Ä/1918

11333

wasserfreie Medien erforderlloh machte; die neue ICA-Arbeitsweise wird Jedooh in wässrigen Medien durchgeführt.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden» durch welches ά/-H-1-BOC-Lysin und-Ornithin in sweokmäaslgar Welse in die neuartigen entsprechenden Carboxy-anhydrlde übergeführt werden können. Diese Anhydride sind für die neue HOA-Arbeiteweise rerwendet worden» and es wurde überraschend gefunden, dass die t-BOC-Gruppe in wässrigen ) Medien abgespaltet werden kann.

QeBäsa dieser Erfindung werden (tf-l-tert.-Butyloiyoarbonyl-lyeln-H-earboxy-anhydrid und <^-H-t ort.-Butyl oxy carbonyl-ornithin-ircarboxy--anhydrld hergestellt, indem die entsprechende, gescheitste Aminosäure in einem gegenüber der Reaktion inerten, flüssigen Medium in Gegenwart eines Chlorwasserstoff-Akseptors mit Phosgen umgesetet wird. Der in der vorliegenden Beschreibung rerwendete Ausdruck "Chlorwasserstoff«Akzeptor" besieht eioh auf einen in dem Beaktlonsmedlum vorhandenen Reaktanten, der alt dem als lebenprodukt auftretenden Chlorwasserstoff mit einer solohen öeeohwindigkeit reagiert, dass der Chlorwasserstoff In dem Masse, wie er gebildet wird, und, bevor er sich mit der t-BOC-Gruppe verbinden kann, praktisoh vollständig neutralisiert wird. Der Akseptor stellt Im wesentlichen ein Spülmittel dar, das Chlorwasserstoff entfernt, ("hydrogen ohleride soavenger").

Zahlreiche ahlqrwesseretoff-Akseptoren können bei der praktisohen

Durchführung dieser Erfindung in geeigneter Weise rerwendet werden. Vorzugsweise sind es Verbindungen, die in dem BeaktionsMedluB löslich sind und Kit Chlorwasserstoff unter Bildung unlöslicher Verbindungen oder doch wenigstens solcher Verbindungen, die sich leicht in unlösliche Verbindungen uewandeln lassen» reagieren· Die unlöslichen Verbindungen kennen duroh nitration entfernt werden. Der Chlorwasserstoff braucht nicht notwendigerweise Tollständig in dem Seaktionsmedlu« löslich su sein» da er in des flüssigen Heaktionssedlu* bei der gewählten Beaktlonstemperatur bei seiner ™ Gleiohgewiohtskonaentration reagieren kann.

Sie berorsugten Chlorvaeeerstoff-Akzeptoren sind anorganische SaIse, einsohllesslich Oxide, wie Silber-, Blei- und Quecksilbersalbe. Cyanide und Oxide dieser Metalle sind besonders «weckattssig, da sie leicht sur Verfügung stehen und YerhMltnisoässig wohlfeil sind. Cyanide werden gegenüber den Oxiden bevorzugt, weil das Hebenprodukt der Besetzung der Oxide alt Chlorwasserstoff Wasser ist. Die I-Carboiy-anhydride τοη Aminosäuren sind bekanntlich in Wasser in- i stabil. Silbereysnid 1st der berorsttgteste Saure-JLkeeptor, weil das sich als lebenprodukt bildende Silberohlorid in den normalerweise für die Durchftthrung der Beaktlon Terwendeten Reagentien äusaerst unlöslich let.

Als fieaktionssedlum kaan jede beliebige einer groeeen Vielfalt τοη organischen flüssigkeiten Terwendet werden. Diese Flüssigkeiten , sind Torsugswelse praktisch wasserfrei, dealt die Zersetsang des

109-8IS-/191 8

11333

eich bildenden H-Garboxy-anhydrlde infolge dee Angriffe von Wasser begrenzt wird. Polare, aliphatIsche, gesättigte, organische und gegenüber der Reaktion inerte Flüssigkeiten, die beispielsweise bis zu 8 Kohlenstoff atome enthalten, sind besonders geeignet. Verwendbar sind Äther, insbesondere cyclische Äther, wie Dioxan, wie auoh Ketone, Ester und Hfitrile, wie Aceton, Hethylisopropylketon, Di-n-butylketon, Äthylaoeton, Hethylpropionat, Acetonitril oder ^ Propionitril. Auch Mischungen dieser Flüssigkeiten können rexwendet werden. Die Flüssigkeit iet vorzugsweise eine solche, in der daa gebildete Produkt praktisch löslich lat, damit eine leichte Abtrennung der ale Nebenprodukt gebildeten, unlöslichen Salze durch einfache Filtration ermöglicht v.lrd· Dies 1st jedoch nicht wesentlich, da sowohl das Produkt ale auch das Vebenprodukt aue dem ursprünglichen Medium durch Filtration entfernt und durch selektive· Löeen getrennt werden können.

Sowohl Quecksilber(XI)- ale auch Queoksilber(I)-Salze können bei w dem erfindungsgemässen Verfahren Verwendung findent Quecksilber(I)-Salze werden jedooh bevorzugt, da die sich als Vebenprodukte bildenden Salze in den meisten Reaktlonsmodlen unlöslich sind. Quecksilber (II)-Salze können jedoch auoh verwendet werden, obgleich sowohl Quecksilber(II)-cyanld als auch »chlprid In vielen Lösungsmitteln löslich let. Das lösliche Salz kann durch Umsetzung mit metallischem Quecksilber in ein unlösliches Salz übergeführt werden. Gewöhnlich ist es am eweckmässlgsten, den Reaktionemedien am Snde der Seaktlon einfach Quecksilber, gewöhnlich im Überschuss,

1*348-5/1918

eususetsen und so lange asu bewegen, bis die Gesamtmenge des höhör-. wertigen Salses sur unlöslichen Form reduziert ist·

Die "bevorzugteste, gegenüber der Reaktion inerte ?lü8sigkeit«Säur*-> akzeptor-Kombinatlon ist diejenige Kombination, bei der der Säure* akseptor in dem flüssigen Medium löslich und das Reaktionsprodukt aus SSureakseptor und Chlorwasserstoff unlöslich ist. Acetonitril» Silberoyanid ist eine typische Kombination dieser Klasse.

Die Umsetzung wird vorzugsweise bei Bäumtemperatur, d. h. bei etwa 20 bis 35° C₉ ausgeführt, da dies am sweokmässigsten ist· Jedoch kann jede beliebige Temperatur im Bereich too etwa 15 bis 40° 0 angewandt werden. In diesem Temperaturbereich kann die Beaktionsdauer in weiten Grenzen variieren· Im allgemeinen sind Reaktionszeiten too 19 Hinuten bis zu 4 Stunden geeignet, obgleich das gewünschte Produkt auch während Reaktionszeiten erhalten werden kann, die merklich ausserhalb dieses Bereichs liegen.

Bas Phosgen kann duroh das Beaktionsgemisch, velohes das t-BOG-Lyein oder-Ornithin und den Sinreakaeptor enthält, geperlt oder als Lösung in der gleichen oder einer anderen flüssigkeit eugegebeu werden* Die rerwendete Hiosgenmenge kann in einem ziemlich weiten Bereioh variieren; sur Erzielung bester Srgebnisse wird jedoch mindestens ein molares Äquivalent bevorsugt, und ein molarer Über-

■ ' · · '■■)

schuss von 20 £ kann mit Torteil angewandt werden, um «ine möglichst vollständige Omaetsung siohersustellen·

109885/1918
- 9 -

Daa Beaktlonagemlsch wird vorzugsweise, obgleich nieht notwendigerweise, ror feuchtigkeit geschützt und 1« einer inerten Atmosphäre» β. B. unter Stickstoff, gehalten. Dlee fahrt Ale gefahr einea Mntretena τση lebenreaktionen, inabeaondere der Zersetzung dea Anhydride, auf ein Hindestaaae zurück. ·

Sie Reaktionsgeschwindigkeit kann durch heftiges wen dea Beak·* tionsgemlsohea, beispielsweise mittels eines magnetlachen kugel- oder eierf ursigen Rührer θ, erhöht werden. Diese BBhrer üben auf die unlöslichen Beetandteile eine mahlende Wirkung ana» so daea andauernd frische Oberfläche der Reaktion ausgaset at wird.

Die nachstehenden Beispiele dienen allein der Teranaohaaliehung der Erfindung, sollen dieselbe aber nicht begrenzen. Der Zweofcatasigkeit halber wurde Ib vorhergehenden Teil der Beschreibung τση den ^/-Derivaten des Lysine und Ornithine gesprochen. In den Beispielen und Ansprüchen wird die genauere Beselchnung -Tund € angewandt.

Beispiel 1

Insgesamt 1,23 g £-V-t-BOC-Lysin und 1,35 g Silbercyanid werden su 50 ml trockenem Acetonitril in einem 100 ml Eundkolben, der mit einem 1,905 cm groeeen(0.75 inch), kugelferaigen Magnetrührer auagerttstet let, gegeben. Das Oemiech wird vor feuchtigkeit geschtttst und ao lange gerührt, bis die Feststoffe eich au dispergieren be-

109885/1918
- 10 -

11333

ginnen. Zu diesem Zeitpunkt werden 6 ml Bioegen in Dioxan zugefügt» Bei etwa 25° 0 wird 75 Hinuten läng wettergerührt, um die Peststoffe i*a eine feine Suspension überzuführen· Phoegen let nooh vorhanden. Γββ Reaktiocsgemisch wird in einen zweiten Rundkolben filtriert uad das Lösungsmittel Ib Vakuum entfernt. Der trockene Rückstand vird etw« 16 Stunden lang in der Kälte gelagert und dann mit 25 al trookenom Äthylacetat kugelgerünrt. Hexan wird langsam bis but Trübe zugegeben; darauf tritt rasch Kristallisation ein. Insgesamt | werden 76 ml Hexan zugegeben· Man lässt die Suspension 1 Stunde lang steven und filtriert zur Gewinnung des i-H-t-BOO-Lysin-H-oarbozyanhydride, das mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet wird.

Die Verbindung X-H-t-BOC-Ornithin-H-carboiy-anhydrid wird in filmlicher Weise hergestellt·

Beispiele 2-11

Die nachfolgende Tabelle Teranecheulicht die verschiedenen Arbeite- | bedingungen für zehn unterschiedliche Darstellungen rom £-I-t-BOC-Lyein-Ä-carboiy-anhydrid. ähnliche Arbeitsweieen werden sum Herstellen der entsprechenden Ornithin-Verbindung verwendet.

10988*5/1918

11333

HOl t-ΒΟσ- Phosgen Akzeptor Lysin Hillimol Mllliaol Hilliaol

Tabelle I

$&oegenierung8~ Yerauolie- Krletalllsa-LöBimgsalttel dauer

Ag₂O

1,003

5,01

5,00

5,00
AgOV

ιυ,03

1,00

g
2,00

1,000

5,00

5,00

5,00
5,00

20,00 10,00

0,00

1,00

10,07 5,00

AgCV

21,0 10,00

1,00 5,00 5,00

5,00 5,00

10,00 1*00

1,00

6,00

12,00 Dioxan Aceton Aceton

Dioxan Aceton

Aoeton

Aoetonltrll

Acetonitril

Aoetemltrll

Acetonitril

tion*· SSeungealttel

2 Std.

1 Std.

StQAo-Hexan

StOAo-

30 »η. _Wä

30 mn* 100 Hin·

100 Hin. 40 Hin.

1 8td. 75 Hin. 75 Hin.

Hexan

OB₂Ql₂ Heien

EtOAo-Hexan

StOAo-*

StOAo-Hexan

Die nachfolgende Darstellung veranschaulicht die Verwendung von

S -H-t-BOQ-fysln-I-earboxj*-annydrld für die Herstellung elneo . loreyl-isoleuolne, welche die Stufe der Abspaltung der 4-600-Oruppe alt wttaerlger Sture

109885/1918 - 12 -

11553

. Bar a te 11u η g 1

Insgesamt 262»4 ag Isoleucin werden in 16,8 ml eines 1-molaren Kaliumborat-Pufförs, der einen Tropfen öaprylalkohol enthält, aufgenommen. Das Gemisch wird bei etwa 0° C mit 504 ag 6-I-t-B00~ Lyein-S-carboxy-anhydrid rersetst und 2 Minuten lang gerührt· Bar pH-Wert wird dann durch Zugabe rom Schwefelsaure auf 5t5 erniedrigt, üb t-BOC-iiyeyl-ieoletioin auszufallen. Des Produkt wird " durch filtration gewonnen und mit kaltem Wasser gewaschen. Bas , Produkt wird aus heiseem Äthanol umkristallisiert und hydrolyeiert. Me hydrolytisohe Entfernung der t-BOC-Gruppe fuhrt man durch, indem man das Produkt in der geringstmöglichen Renge τοη 1 normaler Chlorwasserstoffsäure auflöst und das Gemisch etwa 16 Stunden lang bei Sauateaperatur stehenltsst. Das gewünschte Peptid wird durch Eindampfen de« Gemisches unter Terminiertem Druck aar Trockne gewonnen· Bae Produkt wird durch Waschen mit Aceton gereinigt.

Ornithyl-isoleucin wird in ähnlicher Weiae hergestellt.

I^reyl-isoleuoyl-glyoyl-Yalyl-glycin wird in ihnlioher Weise herge- «tellt, indem das Isoleucin durch leoleuoyl-glycyl-Talyl-glyoin ' ereetxt wird*

109^8.5/1918

Claims (8)

11533 * 27. Juni 1968 fittnttniBrttchi

1. Verfahren im Herstellen von f^-tert.-Butyloxycarbonyllyein^^arboxy-anhydrld oder

ornlthln-I-oartooxy-enhydrid, dadurch gekennseiohnet, dass Al· entsprechende f-I-tert.-ButyloxyoarlMmyleainoHsfiare bei einer Temperatur von «torn 15 bit etwa 4O⁰ 0 in «inta gegenüber fc der Reaktion, inerten, flüssigem Medina im Gewt ein·· Ohlorwaaseretoff-Akmeptore «it Phosgen meetst.

2· Terf Ähren nach Ansyruoh I₉ dadisroh gekennselohnet» daee der Chlorvaeeeratoff-Akzeptor el« Oxid oder 8els de· Sllbere» Blei· oder Quecksilbers let·

3. Verfahren naoh Aneporuch 1₉ dadurch gekenaseichnet, das· der 0hlorvaaseretoff-4kseptor ein Oxid oder Oyanid dee Silber·» Bleie oder Queckeilbers ist·

4· Verfahren nach Anepruoh 1, dadurch gekennseiohnet, daee der (naorwaeeeretoff-Alcieptor Qaeokeilber(II)-cyanid 1st und Mn das sieh bildende, löeliche Qoeckeilber(II)-chlorid durch TJtasetsang «it Queckeilber an QaeokailberCD-chlorid redoaiert.

5« Verfahren naoh Anspruch 1, ^aduroh gekeanaielobAet» daee dear ahlorwaeeeretoff^Akseptor Bübereyaald let vnd da· nOeelge Medius Acetonitril 1st·

109885/1918

-U-

6· iTtahxm Baeh Anspruch 1, iMAoHh gefcranstlcfeottt dMi dme flüssige MMiiw ·1η LOemcMdtttl ffir 4«n Chlorwaeeepetoff-Alcseptor und «in liolrt-LCwmgtBittt·! for <tas fttrtktionsprodtikt ««β de« QhlorMUNieretoif f-JLks«ptor und dam Chlommeeeretof f 1st.

7· £ ^-yyyyyy

8. ^" ^t^Btlbllthl^bhdld

109885/1918