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Verfahren zur Herstellung von Cystein enthaltenden Peptiden Die vorliegande Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cystein enthaltenden Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Thiolgruppe des Cysteins während der zur Herstellung der Peptidkette notwendigen Reaktionsstufen durch einen Alkylcarb- amoylrest schützt.
Bei der Synthese von Polypeptiden, die Cysteinreste enthalten -seien dies nun natürliche oder künstlich hergestellte - muss die Thiolgruppe des Cysteinrestes geschützt werden, da sonst unerwünschte Nebenreaktionen eintreten können. Die bisher meist verwendete Schutzgruppe für die Thiolgruppe ist der Benzylrest; daneben wurde auch der Triphenylmethyl-, der Carbobenzoxy-, der Benzoyl- und der Acetylrest als Thiolschutzgruppe verwendet.
Diesen Gruppen haften aber verschiedene Nachteile an: Die Benzylgruppe ist nur durch Einwirkung von Natrium in flüssigem Ammoniak abspaltbar. Diese Methode kann jedoch z. B. bei Polypeptiden, die Methionin enthalten, nicht verwendet werden und führt auch bei anderen Polypeptiden zu Spaltungen in der Peptidkette, wodurch die Ausbeute am gewünschten Endprodukt stark herabgesetzt wird. Auch die Abspaltung der Triphenylmethylgruppe (Tritylgruppe) bereitet Schwierigkeiten.
Die Verwendung von Carbobenzoxy-, Benzoyl und Acetylgruppen hat hingegen,den Nachteil, dass anwesende freie Aminogruppen durch innere Umlagerung leicht acyliert werden können.
Es wurde nun gefunden, d'ass man zum Schutze der Thiolgruppe des Cysteinrestes beim Aufbau von Poly- peptiden vorteilhafterweise eine Alkylcarbamoylgruppe verwenden kann. überraschenderweise findet hierbei im Gegensatz zu anderen Acylresten keine Wanderung dieser Gruppe an eine anwesende freie Aminogruppe statt.
Die erfindungsgemäss verwendeten Alkylcarbamoylgrup- pen können durch Reaktion eines Alkylisocyanates mit Cystein oder einem Cystein enthaltenden Polypeptid in das Molekül eingeführt werden.
Das erfindungsgemäss geschützte Cystein bzw. Cy- stein enthaltende Peptide können für alle bekannten und bewährten Methoden zur Herstellung höher molekularer Polypeptide verwendet werden, z. B. die Azidmethode, die Carbodümidmethode, die gemischte Anhydrid- methode sowie die Methoden mit aktivierten Estern wie z. B. die Nitrophenylestermethode, da die Alkylearb- amoylgruppedurch diese Verfahren nicht in Mitleidenschaft gezogen wird.
Die erfindungsgemäss in Frage kommende Schutzgruppe ist auch stabil, wenn man den Carbo-tert.-butoxy- rest, wie er zum Schutze der a-Aminogruppe verwendet wird, oder den teri.-Butylesterrest (zum Schutze der Carboxylgruppe) durch Einwirkung von Trifluoressig- säure abspaltet, wie auch bei Abspaltung des Triphenyl- methylrestes von der a Aminogruppe durch wässerige Essigsäure. Ebenso ist die erfindungsgemässe Schutzgruppe auch beständig unter Bedingungen, wie man sie bei der Abspaltung einer Reihe anderer Schutzgruppen verwendet, wie z.
B. bei der Abspaltung der Carbobenz- oxygruppe oder der Benzylestergruppe durch Einwirkung von Bromwasserstoff in Eisessig.
Die Beständigkeit der erfindungsgemässen neuen Schutzgruppe ermöglicht es somit auch, ein Cystein enthaltendes Polypeptid sowohl am Aminoende als auch am Carboxylende zu verlängern.
Die Alkylcarbamoylgruppe selbst kann durch Einwirkung einer wässerigen oder alkoholischen Lösung, einer anorganischen oder organischen Base edler durch Einwirkung einer organischen Lösung von Ammoniak, Hydrazin oder primären Aminen oder aber durch Einwirkung von flüssigem Ammoniak abgespalten werden. Die auf diese Weise erhaltenen Cystein enthaltenden Peptide können nach bekannten Methoden durch milde Oxydation in therapeutisch wertvolle Cystin enthaltende Peptide, z. B. Oxytocin, oder seine Derivate oder Analoge, umgewandelt werden.
Diese Oxydation kann auch direkt ohne vorherige Isolierung des Cystein enthaltenden Polypeptids in einem Arbeitsgang vorgenommen werden.
Die Erfindung wird in dien folgenden Beispielen beschrieben.
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Beispiel 1 S-Äthyl-carbamoyl-L-cystein Man löst 475 g L-Cystein-hydrochlorid in 4,5 1 Dimethylformamid, kühlt auf 0 , gibt 235g Äthylisocyanat zu, lässt während 16 Std. bei 20 stehen, dampft zur Trockne ab, wäscht den Rückstand mit Äthyläther, dekantiert, löst in 5 1 Wasser, wäscht mit Äthyläther, stellt auf einen pH von 6,5 ein, konzentriert die wässerige Phase auf etwa 1000 cm3, filtriert und wäscht die entstandene kristalline Masse mit Eiswasser und anschliessend mit Athanol und trocknet. Man erhält S-Äthyl-carbamoyl-L-cystein. Smp. 219 . [a] D =-37 in Salzsäure (6n).
Beispiel 2 N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cystein Zu einem auf 0 gekühlten Gemisch von 2000 cm3 10 % iger wässeriger Kaliumbicarbonatlösung und 200 em3 Chlorameisensäurebenzylester gibt man unter starkem Rühren 142 g S-Äthylcarbamoyl-Lcystein zu, rührt noch während 2 Std., gibt 2000 cm3 Wasser zu, wäscht mit Äthyläther, säuert die wässerige Phase an, extrahiert das ausgeschiedene Öl mit Äthyläther, trocknet über Natriumsulfat, dampft ab-, löst den Rückstand in 1000 cm3 siedendem Essigester, gibt 3000 cm3 Petrol- äther zu und lässt kristallisieren. Man filtriert, wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält N-CarbobenzoxyS-äthylcarbamoyl L-cystein. Smp. 122 . [a] = D -62 in Dimethylformamid.
Beispiel 3 Bis-N-carbobenzoxy-L-cystin Man löst 33 g N-Carboben7-oxy-S-äthylcarbamoyl-Lcystein in 200 cm3 25 % iger Ammoniaklösung, lässt 1 Std. bei 20 stehen, gibt 300 cm3 Wasser zu, wäscht mit Äthyläther, bläst Luft durch die Lösung bis zur negativen Nitroprussiat-Reaktion, säuert mit verdünnter Salzsäure an, extrahiert mit Essigester, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus Chloroform um. Man erhält Bis-Ncarbobenzoxy-ILcystin. Smp. 119 . [a] D = -91 in Eisessig.
Beispiel 4 Bis-N-carbobenzoxy-Lcystin Man löst 33g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cystein in 200 cm3 Natriumhydroxyd (2n) auf, lässt 1 Stdl. bei 20 stehen und arbeitet wie in Beispiel 3. Man erhält Bis-N carbobenzoxy-L-cistin. Smp. 115 . [a] D= -92 in Eisessig.
Beispiel 5 N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-Lcystein-2,4,5trichlorphenylester Man löst 163g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylLcystein und 125 g 2,4,5 Trichlorphenol in 2500 cm3 Acetonitril, kühlt auf -10 , gibt 105g Dicyclohexylcarbodiimid zu, schüttelt 16 Std. bei 20 , filtriert, wäscht den Niederschlag mit Pyrid'in, dampft die vereinigten Filtrate ab und kristallisiert den Rückstand aus Äthanol. ManerhältN-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinD 2,4,5-trichlorphenylester. Smp. l58 . [a] =-38 in Dimethylformamid.
Beispiel 6 N-Carbobenzoxy-Sr-äthylcarbamoyl-L-cYsteinyl-LprolylLrleucyl-glycinamid Man löst 33,3g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylIrcystein 2,4,5-trichlorphenylester und 19,1 g L-Prolyl-
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L-leucyl-glycinamid in 100 cm3 Dimethylformamid, lässt 16 Std. stehen, gibt 500 cm3 Äthyläther zu, filtriert die gebildeten Kristalle, wäscht mit Essigester .und trocknet. Man erhält N-Carbobenzoxy-S-äthylcabamoyl-L-cysteinyl!-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 204 . [ajD = -67 in Dimethylformamid.
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Beispiel 7 N Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cys@teinyl-LrprolylL-leucyl-glycinamid Man löst 22g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylLrcystein in 250 cm3 Chloroform, gibt 10 cm3 TriäthyPamin zu, rührt bei 0 und gibt tropfenweise 7,0 cm3 Chlorameis,ensäureäthylester zu.
Nach 10 Minuten gibt man 19,1 g L-Prolyl-L-leucyl-glycinamid in 250 cm3 Dimethylformamid gelöst zu, rührt noch während 4 Std. bei 20 , konzentriert auf die Hälfte der Volumen, giesst 1000 cm3 Wasser zu, filtriert und reinigt wie unter Beispiel 6. Man erhält N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl-L 1#eucyl-glycinamid mit den in Beispiel 6 beschriebenen FÄgenschaften.
Beispiel 8 N-Carbabenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-LprolylLleucyl-glycinanud Man löst 22 g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cystein und 19 g LProlyl-L-leucyl-glycinamid in 250 cm3 Dimethylformaniid, kühlt auf -10 , gibt 15 g Dicyclohexyl-carbod!iimid zu, schüttelt während 16 Std. bei 20 , filtriert, eng das Filtrat auf 100 ml ein und reinigt wie beim Beispiel 6. Man erhält N-Carbob.enzoxyS-äthylcarbamoyl- L -cysteinyl- L -prolyl-L-leucyl-glycinamid mit den in Beispiel 6 beschriebenen Eigenschaften.
Beispiel 9
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N-Carbobe:nzoxy-L-asparaginyl-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid Man löst 33 g von dem oben erhaltenen N-Carbobenzoxy- L, -asparaginyl- S. @äthylcarbamoyl- L -cysteinylL-prolyl-L-leucyl-@glycinamid in 300 cm3 einer 4n Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, konzentriert auf 100 cm3, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 150 cm3 Dimethylformamid, gibt 27 g N-Carbobenzoxy-Lasparagin-2,4,5-trichlorphenylester und 15,6 cm3 Triäthylanun zu und schüttelt während 12 Std., wobei eine kompakte Masse erhalten wird. Man gibt Essigester zu, filtriert, wäscht den Rückstand mit heissem Methanol, filtriert und trocknet. Man erhält N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl- S@-äthylcarbamoyl- L -cysteinyl L -prolyl- L leucyliglycinamid. Smp. 228 . [a] D = -60 in Dimethylformamid.
Beispiel 10
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N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-äthylearbamoyl-Lcys@teinyl-L-prolyl-L-lbucyl-glycinamid Man löst 27 g N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl-S- äthylcarbamoyl-Lcysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid in 300 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, konzentriert auf 100 cm-9, fällt mit Äthyläther aus, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 150 cm3 Dimethylformamid, gibt 25 g N-Carbobenzoxy-L-glutamin-2,4,5-trichlorphenylester und 14 cm3 Triäthylamin zu, entfernt das Triäthylaminhydrobromid durch Filtration, lässt das Filtrat wäh-
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rend 72 Std. bei 20 stehen, gibt Essigester zu, filtriert und wäscht den kristallinen Rückstand mit siedendem Essigester und Aceton.
Man erhält N-Carbobenzoxy-Lglutaminyl-L-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-LcysteinylL-propyl-Lleucyl-glycinamid. Smp. 218 . [a122 = -56 in Dimethylformamid.
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Beispiel 11 N-Carbobenzoxy-L-isoleucyl-LglutanänylL-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolylL-leucyl-glycinamid Man löst 21g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl- S- äthylcarbamoyl- L -cysteinyl- L -prolyl- L leucyl-glycinamid in 200 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, engt auf 100 cm@ ein, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 75 cm3 Dimethylformamid, gibt 12 g N-Carbobenzoxy-L-isoleucin-p-nitrophenylester und 7 cm3 Triäthylamin zu, filtriert das Tri- äthylaminhyd'robromid ab, lässt die Lösung während 3 Tagen stehen, gibt Essigester zu, filtriert, wäscht mit Essigester und Aceton und trocknet.
Man erhält N-Carbobenzoxy-L -isoleucyl- L -glutaminyl- L -asparaginyl-S- äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 240 . [a] -40 in Dimethylformamid.
12= Beispiel 12 N,O-Bis-carbobenzoxy-L-tyrosyl-LisoleucylL-glutaminyl-Lasparaginyl-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-Lproyl-Lleucyl-glycinamid Man löst 14g N-Carbobenzoxy-Lisoleucyl-L-glutaminyl-Lasparaginyl-S-äthylcarbamoyl-Lcisteünyl L-prolyl-L-leucyl-glycinamid in 150 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, engt auf 50 cm3 ein, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Äthyläther, löst den Rückstand in 200 cm3 Dimethylformamid, gibt 10g N,O-Bis-carbobenzoxy-Ltyrosin- 2,4,5-trichlor-phenylester und 4,2 cm3 Triäthylamän zu, filtriert, lässt das Filtrat während 72 Std. bei 20 stehen, engt auf 50 cm3 ein, gibt 500 cm3 Essigester zu, filtriert den entstandenen kristallinen Niederschlag, wäscht mit Essigester und Methanol und trocknet.
Man erhält N,OBis-carbobenzoxy-L-tyrosyl-Lisoleucyl-L-glutaminyl-Lasparaginyl-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 236 . [a] D=-42 in Dime@thylformamid.
Beispiel 13 N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinylL tyrosyl-Lisoleucyl-L-glutaminyl-LasparaginylS-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucylglycinamid Man löst 12,5 g N,O-Bis-carbobenzoxy-LtyrosylL - isoleucyl-L -glutaminyl- L asparaginyl- S -äthylcarbamoyl- L -cysteinyl- L -prolyl- L -leucyl - glycinamid in 125 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. stehen, engt auf 30 cm3 ein, fällt mit Äthyläther, filtriert, wäscht mit Essigester, löst den Rückstand in 50 ml Dimethylformamid, gibt 6 g N-Carbobenzoxy- S -äthylcarbamoyl- L -cystein-2,4,5-trschlorphenylester und 3 cm3 Triäthylamin zu, schüttelt während 72 Std., gibt Essigester zu, filtriert, wäscht mit Essigester und siedendem Methanol, filtriert und trocknet.
Man erhält N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoyl-Lcystei-
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nyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-Lasparaginyl S- äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid. Smp. 237-240 . [a] = D -64 in Dimethylformamid.
Beispiel 14 S-Äthylcarbamoyl-Lcysteinyl-Ltyrosyl-L-isoleucylL-glutan-inyl-L-a.sparaginyl-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-L-prolyl@Lleucyl-glycinamid-trihydrobromid Man löst 10 g N-Carbobenzoxy-S-äthylcarbamoylL-cysteinyl-Lrtyrosyl-Lrisoleucyl-Lglutaminyl-L-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-. L-cysteinyI L-prolyl- L -lvucylglycinamid in 100 cm3 einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, lässt 1 Std. bei 20 , konzentriert auf 50 cm3, fällt mit Äthyläther, filtriert und trocknet. Man erhält S-Äthylcarbamoyl-Lcysteinyl-Ltyrosyl-L-isol@eucyl- Lglutaminyl- L-asparaginyl-S-äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L leucyl-glycinamid-trihydrobromid. Smp. 90-93 . [a] D=-35 in Dimethylformamid.
Beispiel 15 L-Cysteinyl-Ltyrosyl-Lisoleucyl-LglutaminylL-a,sparaonyl-L#-cysteinyl:Lprodyl Lleucyl-glycinamid Man löst 5 g von dem oben erhaltenen S-Äthylcarbamoyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-T-#isoleucyl-L-glutaminyl@Lasparaginyl-S-äthylcarbamoyl,L-cysKeinyl: L-prolyl-Lleucyl-glycinamid-trihydrobromid in 1500 cm3 trockenem flüssigem Ammoniak, lässt 16 Std. in einem Druckgefäss bei 20 stehen, dampft den Ammoniak ab und trocknet im Hochvakuum. Der Rückstand enthält das L-Cysteinyl- L-tyrosy1- Lisoleucyl-Lglutaminyl-ILasparaginy14-cysbeinyl-L-prolyl Lleucyl-glycinamid.
Beispiel 16 Oxytocin L Cysteinyl- L-tyrosyl- Lisoleucyl- Lglutaminyl-L asparaginyliL:-cysteinyl-L-proly hL;leucyl-glycinamid wird in 5 Liter O,Oln-Essigsäure gelöst und bei einem pH von 6,5 bis 8,0 durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff während einer Stunde bei 0 bis 40 oxydiert. Man bringt die Lösung, die die Substanz enthält, auf einen pH von 4,0 bis 5,0 und dampft nach Zusatz von 50 g Natriumchlorid oder von 0,64g Methansulfonsäure zur Trockne ein, wobei ein trockenes Pulfer (Oxytocin) erhalten wird, das gut haltbar ist. Es kann aufbewahrt werden und bei Gebrauch klar gelöst werden. Man kann jedoch auch die Lösung direkt verwenden, eventuell nach Verdünnen mit Wasser oder einer Salzlösung.
Beispiel 17 Oxytocin Man verfährt wie in Beispiel 16. Man oxydiert aber am Ende bei 0 bis 40 durch Zusatz von 7,5 cm3 einer ln-Lösung von Wasserstoffperoxyd in Wasser bei einem pH von 4,0 bis 6,0 (anstatt der Oxydation durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff).