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Verfahren zur Herstellung von Glutamin Die Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem natürlichem Glutamin Erfindungsgemäß
setzt man einen y-Ester der L-Glutalminsäure der allgemeinen Formel
in der R eine Alkylgruppe bedeutet, mit einem Chlorameisensäureallylester der allgemeinen
Formel
in der R' Wasserstoff, Alkyl oder Phenyl bedeutet, zum N-Carboallyloxyderivat des
Esters der allgemeinen Formel
und dieses Derivat mit Ammoniak um, wobei das entsprechende y-Amid der allgemeinen
Formel
entsteht, und reduziert dieses Amid mit Natrium und flüssigem Ammoniak oder katalytisch
zu L-Glutamin.
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Obwohl man Wasserstoff in Gegenwart eines Ka,talysators wie Platin
oder Palladium auf Kohle, die verhältnismäßig sehr teuer sind, bei dieser Reduktion
benutzen kann, wurde gefunden, daß sich flüssiges Ammoniak in Gegenwart von Natrium
besonders gut zur Abspaltung der Carboallyloxygruppe eignet. In dem unten erwähnten
Verfahren von Bergmann, Zervas und Salzmann können Natrium und flüssiges Ammoniak
nicht zur Reduktion der Carbobenzoxygruppe zwecks Herstellung von Glutamin benutzt
werden. Man kann das Amid aber auch mit Wasserstoff und Raneynickel zu Glutamin
reduzieren.
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Man hat Glutamin bisher im Prinzip nach zwei Verfahren synthetisiert,
die beide in ihren einzelnen Stufen sehr umständlich sind. Die Art der jeweiligen
Reaktionen
und die Vielzahl der Verfahrensstufen bedingen, daß nur sehr geringe Ausbeuten erhalten
werden. Diese liegen im allgemeinen zwischen 5 und 15 0/o, wenn man die als die
besten bekannten Synthesen benutzt, d. h. das Carbobenzoxyverfahren von Bergmann,
Zervas und Salzmann, Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft. 66 B (1933).
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S. 1288 bis 1290, und das Verfahren von Kidd und King, Nature, 162
(1948), S. 776. Außer den Nachteilen, mit denen das Verfahren von Bergmann behaftet
ist, liegen besondere Gefahren in dem Arbeiten mit Chlorameisensäurebenzylester,
der in einer der Verfahrensstufen verwendet wird. Beim Stehen oder Trocknen zersetzt
sich diese Verbindung spontan in explosiver Weise. Nach dem Verfahren von Kidd und
King ist die Zahl der Verfahrensstufen sogar noch größer als im Verfahren von Bergmann,
und das benutzte Reagenz, das Phthalsäureanhydrid,
neigt dazu, optisch
aktive Glutaminsäure zu racemisieren, so daß das erhaltene Glutamin nicht die reine
optisch aktive Form darstellt.
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Aus dem Journal of the American Chemical Society, 72 (1950>, S.
725, ist bekannt, insbesondere auch bei der Herstellung von optisch aktiven a-Aminocarhonsäurederivaten,
die a-Aminogruppe statt durch den Carbobenzyloxyrest durch den Carboallyloxyrest
zu schützen und letzteren dann nach bekannten Verfahren katalytisch wieder abzuspalten.
Dort wird jedoch nicht die Herstellung eines N-Carboallyioxyamids oder aber die
Herstellung von Glutamin beschrieben.
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Nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 624230 wird Glutamin
dadurch hergestellt, daß man Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-y-alkylester mit Ammoniak
in Carbobenzyloxy-L-glutamin überführt und letzteres katalytisch hydrieren zu Glutamin
spaltet. Dabei wird aber zur Herstellung der Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-y-alkylester
der technisch nur schwer zu handhabende Chlorameisensäurebenzylester verwandt. Ein
weiterer Nachteil liegt darin, daß - wie gefunden wurde - die in der Patentschrift
beschriebene Umsetzung von y-Äthyl-N-carbobenzyloxyglutamat mit flüssigem Ammoniak
nicht vollständig ist und ein Gemisch von N-Carbobenzyloxyglutamin mit viel Ausgangsmaterial
liefert. Praktisch das gleiche Ergebnis wird mit wäßrigem Ammoniak erreicht. Nach
dem vorliegenden Verfahren dagegen wird mit wäßrigem Ammoniak eine vollständige
Umwandlung des y-Äthyl-N-carboallyloxyglutamats zu N-Carboallyloxyglutamin erzielt.
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Nach einer Ausführungsform deI vorliegenden Erfindung wird der y-Methylester
der L-Glutaminsäure als Ausgangs stoff verwendet und mit Chloramei sensäureallylester
in Gegenwart von Magnesiumoxyd umgesetzt. Zu der Amidierung des y-Esters kann wäßriges,
alkoholisches oder auch flüssiges Ammoniak benutzt werden. Die Amidierung wird am
besten zwischen etwa 50 und 600 C in 20 bis 24 Stunden ausgeführt. Wenn eine niedrigere
Temperatur angewandt wird, benötigt man zur vollständigen Amidierung natürlich mehr
Zeit. Zur Reduktion des 1'-Amids der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure werden die
Reaktionsprodukte zur Trockne verdampft und metallisches Natrium und flüssiges Ammoniak
zu dem Amid gegeben. Aus dem Reaktionsgemisch wird dann Glutamin gewonnen.
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Zur Umsetzung mit dem y-Ester der L-Glutaminsäure kann man außer
Allylester der Chlorameisensäure z. B. auch deren Methallyl- oder Phenallylester
benutzen. Diese Umsetzung ist exotherm. Bei ihr werden die Reaktionsteilnehmer im
allgemeinen zwischen etwa 0 und 150 C, vorzugsweise 5 und 100 C, gemischt.
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Nach der Amidierung des y-Esters der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure
zum y-Amid der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure wird letzteres dann zum Glutamin
reduziert. Bei Verwendung von flüssigem Ammoniak und Natrium ist die Reduktion praktisch
beendet, wenn die Lösung beständig blau gefärbt bleibt. Die Glutaminlösung wird
dann mit einer Säure auf ein pE zwischen etwa 4,5 und 6,0, vorzugsweise 5,5, angesäuert.
Man benutzt vorzugsweise eine Säure, deren Natrium- bzw. Ammoniumsalz in Alkohol
lös lich sind, z. B. Jodwasserstoff, Ameisensäure od. dgl.
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Man fügt einen Alkohol, z. B. Methanol oder Äthanol, oder ein Gemisch
von Methanol und Aceton oder Isopropanol hinzu. Da das Glutamin in der Alkohollösung
unlöslich ist, scheidet es sich aus. Die Gesamt-
ausbeute an Glutamin, bezogen auf
Glutaminsäure, liegt im allgemeinen zwischen etwa 31 und 360/o.
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Beispiel 1 1 Mol L-Glutaminsäure wurde mit 6 bis 10 Mol wasserfreien
Methanols gemischt. Die Veresterung wurde bei etwa Raumtemperatur in Gegenwart von
1 Mol konzentrierter Schwefelsäure durchgeführt und war im allgemeinen nach 16 bis
22 Stunden beendet.
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Das Sulfat wurde von dem y-Ester der Glutaminsäure durch Zusatz von
Diäthylamin abgetrennt, worauf der Ester durch Filtration abgeschieden wurde. Er
wurde, auf L-Glutaminsäure bezogen, in einer Ausbeute von etwa 72,5 0/o der Theorie
erhalten. Der Ester schmolz bei 159 bis 1620 C und hatte eine spezifische Drehung
von +13,50 bei 270 C (6,4g in 100 ccm Wasser. Die Verbindung enthielt die theoretische
Menge Stickstoff, 8,690/0. Der y-Ester wurde dann mic etwa 1,15 Mol Chlorameisensäureallylester
in Gegenwart von etwa 1,2 Mol Magnesiumoxyd umgesetzt. Das Chlorformiat wurde tropfenweise
zugegeben und die Temperatur des Reaktio,nsgemisches auf etwa 80 C gehalten. Nach
beendetem Zusatz wurde die Temperatur des Gemisches auf etwa Raumtemperatur ansteigen
gelassen und das Gemisch etwa t/2 Stunde bis 1 Stunde gerührt.
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Die erhaltenen Reaktionsprodukte wurden mit Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff,
Methylen- oder Äthylenchlorid extrahiert. Die zurückbleibende wäßrige Lösung wurde
mit Salzsäure auf ein pz von etwa 2,2 angesäuert. Der Ester der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure
wurde aus der angesäuerten Lösung mit Chloroform extrahiert. Die Chiloroformlösung
wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Chloroform wurde aus der erhaltenen
trockenen Lösung abgedampft, wodurch der y-Methylester der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure
in einer Ausbeute von etwa 70°/o der Theorie (auf den Ausgangsester bezogen) erhalten
wurde.
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Dieses neue Glutaminsäurederivat ist ein weißer fester I(örper mit
einem Schmelzpunkt von etwa 48 bis 500 C. Die spezifische Drehung betrug bei 280
C -16,20 (4,08 g in 100 ccm Wasser). Der Brechungsindex der Verbindung betrug 1,473
bei 26,50. Der Stilckstoffgehalt wurde zu 5,83 0/G bestimmt; berechnet 5,71°/o.
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Das Produkt wurde mit etwa 280/oigem Ammoniumhydroxyd in einem Druckgefäß
bei einer Temperatur zwischen etwa 50 und 550 C umgesetzt. Diese Reaktion war nach
etwa 20 bis 24 Stunden beendet. Das Ammoniak wurde im Vakuum bei etwa 500 C von
dem Produkt abgedampft, das sich als das y-Amid der N-Carboallyloxy-Lmglutaminsäure
erwies. Es wurde in einer Ausbeute von etwa 92,5 O/o der Theorie, auf den y-Methylester
der N-Carboallylcxy-L-glutaminsäure bezogen, erhalten.
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Diese neue Verbindung war hygroskopisch, spröde und glasähnlich;
sie hatte keinen bestimmten Schmelzpunkt. Sie besaß bei 260 C ein spezifisches Drehungsvermögen
von 2,10 (4,25 g in 100 ccm Wasser).
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Der Stickstoffgehalt der Verbindung wurde zu 16,8 ovo bestimmt (theoretischer
Wert 17,0).
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Dieses y-Amid wurde bei etwa 340 C in flüssigem Ammoniak gelöst und
diese Lösung mit metallischem Natrium versetzt. Sobald die Lösung eine beständige
blaue Farbe angenommen hatte, war die Reduktion praktisch beendet. Die Lösung wurde
dann zur Trockne verdampft, der Rückstand in Wasser gelöst und diese Lösung mit
Jodwasserstoff auf ein pH von 5,5 angesäuert. Nach Zusatz von Methanol schied sich
das Glutamin beim Abkühlen und Stehen ab. Die
Ausbeute an L-Glutamin
betrug, auf des y-Amid der N-Carboallyloxy-glutaminsäure bezogen, etwa 75 ovo der
Theorie und etwa 35,40/&, bezogen auf die angewandte Glutaminsäure. Nach einmaligem
Umkristallisieren schmolz das Produkt bei etwa 1750 C (verglichen mit 183 bis 1850
C für reines L-Glutamin).
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Beispiel 2 1 Mol L-Glutaminsäure wurde in 60,0 Mol absoluten Methanols
suspendiert. Dieses Gemisch wurde in einem Eisbad auf 120 C abgekühlt und mit 1,3
Mol 950/ger Schwefelsäure unter Rühren so langsam versetzt, daß die Temperatur unter
250 C blieb. Dann wurde das Kühlen eingestellt und die Mischung 5 Stunden bei 270
C gerührt. Danach wurde sie wieder auf 120 C abgekühlt und mit einem Gemisch aus
gleichen Teilen Diäthylamin und Methanol bis zum pH 7 neutralisiert. Nach Sstündiger
Kristallisation bei 0° C wurden die Kristalle des ;>-Methyli,-glutamats abfiltriert.
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1 Mol dieses y-Methyl-L-glutamats wurde in 33,3 Mol Wasser, das 1,2
Mol Magnesiumhydroxyd enthielt, eingerührt. Beim Rühren wurden innerhalb 25 Minuten
1,15 Mol Chlorameisensäilreallylester zu dem Gemisch gegeben. Letzteres wurde im
Eisbad so weit gekühlt, daß die Temperatur nicht über 350 C anstieg. Nach Zusatz
des gesamten Chlorameisensäureallylesters wurde das Reaktionsgemisch bei 270 C 2
Stunden gerührt und dann 15 Stunden bei 30 C stehengelassen, filtriert und das Filtrat
mit Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mit einer 1: lMischung aus Wasser
und 370/oiger Salzsäure bis zum PEE 1,8 angesäuert und wiederum mit Chloroform extrahiert.
Die vereinigten Chloroformextrakte wurden mit Wasser gewaschen und das Chloroform
unter vermindertem Druck (25 mm Hg) bei einer 650 C nicht übersteigenden Badtemperatur
verdampft. Der Rückstand bestand aus dem y-Methylester der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure.
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0,76 Mol dieses y-Methylesters der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure
wurden mit 3,3 Mol Ammoniak in Form einer wäßrigen 280/oigen NH3-Lösung in einem
Druckgefäß bei 530 C in 24 Stunden umgesetzt.
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Nach Verdampfen des wäßrigen Ammoniaks unter vermindertem Druck verblieb
als Rückstand das Am-
moniumsalz des y-Amids der Carboallyloxy- -glutaminsäure.
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Es wurde nun eine Lösung Zip von 0,05 Mol des y-Amids der N-Carboallyloxy-L-glutaminsäure
in 8,33 Mol Wasser mit 494 Teilen durch Wasserstoff aktivierten Raneynickelkatalysators
vermischt. Dieses Gemisch wurde unter Rühren 2 Stunden auf 670 C erhitzt. Es wurde
dann heiß filtriert und der Filterkuchen mit 30 Teilen Wasser gewaschen. Filtrat
und Waschflüssigkeit wurden vereinigt und mit Ammoniumsulfid behandelt. Der pB-Wert
dieser Mischung wurde mit Essigsäure auf 5,0 eingestellt. Das Nickelsulfid wurde
abfiltriert; es hinterließ eine klare, farblose, wäßrige Lösung von L-Glutamln.
Die Lösung wurde bei etwa 25 mm Hg auf ein Viertel ihres ursprünglichen Volumens
eingedampft, mit dem 3fachen ihres Volumens an absolutem Methanol versetzt und bei
00 C 2 Stunden lang stehengelassen, um das L-Glutamin auskristallisieren zu lassen.
Auf Glutaminsäure bezogen betrug die Ausbeute an L-Glutamin 22,7 0/0.