DE2846497A1

DE2846497A1 - Lysozymderivat

Info

Publication number: DE2846497A1
Application number: DE19782846497
Authority: DE
Inventors: Marc De Coninck; Yvan Looze; Arthur Georges Schnek
Original assignee: Prospa SA
Current assignee: Prospa SA
Priority date: 1977-11-01
Filing date: 1978-10-25
Publication date: 1979-05-03
Also published as: JPS5472285A; FR2407218B1; BE871487A; IT7829316A0; IT1101278B; FR2407218A1; US4202884A

Description

Patentanwälte Dipl.-Inc. H. V''e:c:cmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A."Weιckmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H.Liska OO/c/Q·?

8000 MÜNCHEN 86, DEN 2 5, OKt, 1978

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

Prospa S.A.

107, Rue de Brabant

1030 Brüssel, Belgien

Ly s ο zymde r ivat

909818/0881

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine neue Verbindung, die sich von dem enzymatischen Polypeptid Lysozym durch Methylierung in der £- Stellung an den Aminostickstofflysinresten ableitet. Die neue Verbindung wurde als jf-N-Trimethyl(lys)-lysozym bezeichnet.

Es ist bekannt, daß Lysozyme und insbesondere Lysozyme von
tierischem Ursprung kompakte Polypeptide mit einer Hydrolaseaktivität (E.C.3.2.1.17) mit einer positiven Nettoladung
und mit einem Molekulargewicht von etwa 15 000 sind. Geringe
Unterschiede in der Polypeptidkette in der Zahl der Aminosäurereste .ändern die biologische Aktivität des Enzyms nicht wesentlich. Bei der vorliegenden Erfindung kann der in der Kette vorhandene Lysinrest von einem Minimum von 6 bei Eiweißlysozym bis maximal 8 in Hundelysozym variieren.

Es ist gut bekannt, daß irgendeine chemische Behandlung, die
zu dem Verlust der basischen Funktion führt, wie eine Acetylierung, die Enzyme inaktiviert. Die derzeit geltende Meinung -ist die, daß die £-Aminogruppen des Lysins ihre basische Funktion beibehalten müssen, daß die gesamte biologische Aktivität des Moleküls erhalten bleibt oder nur geringfügig modifiziert wird. Wenn eine chemische Umlagerung eine Erhöhung in der Basizität mit sich bringt, können theoretisch einige der biologischen Eigenschaften verbessert werden.

Tierische Lysozyme sind bei sauren pH-Werten einigermaßen stabil, aber bei alkalischen pH-Werten instabil. Sie sind während einiger Minuten in schwach sauren Medien ohne bemerkenswerten Verlust der enzymatischen Aktivität wärmestabil. Diese Wärmestabilität ist auf eine Zahl von Cystinresten, die in dem Molekül vorhanden sind, zurückzuführen.

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Von einem reinen enzymatischen Standpunkt aus sind die Substrate für die Enzymaktivität der Tierlysozyme Bakterienzellwand-Mucopeptide und Tier- und Pflanzenchitin. Aus diesem Grund wurden sie auch alle als N-Acetyl-muramidglycanohydrolasen bezeichnet.

Biologisch gesehen besitzen Lysozyme eine lysierende Aktivität auf viele Bakterien und in'duzieren die Freigabe von den Zellwänden von immunologisch kompetenten Aminozuckern. Bei höheren Organismen bilden die Lysozyme einen Teil von natürlichen Zellen und/oder Körpersäfte-Immunitätssysteme oder genauer ein Antikörperkomplement-Properdinsystem.

Daß die Rolle der Lysozyme nicht nur auf die Immunaktivität und Bakterienlyse beschränkt ist, wird durch die Tatsache nahegelegt, daß Tiere bei sterilen Bedingungen die gleiche Lysozymaktivität bei einem humoralen Gehalt aufweisen wie Tiere bei nichtsterilen Bedingungen. Eine Transglycosylase- und Transferaseaktivität wurde in der Tat beobachtet, -die besonders nützlich ist beispielsweise bei Regenerationsverfahren für Verbindungsgewebe .

Die in vivo-Methylierungsverfahren von einigen Aminosäuren stehen im allgemeinen in bezug zu spezifischen enzymatischen Kontrollverfahren nach der genbedingten Transcription bzw.Aufzeichnung.

Es wurde nun gefunden, daß es chemisch möglich ist, eine Trimethylierung des Lysins durchzuführen, das in der Lysozympolypeptidkette enthalten ist, unter Bildung der neuen Verbindung £-N-Trimethyl(lys)-lysozym. Zur Herstellung der neuen Verbindung wird Lysozym in einem Natriumboratpuffer gelöst und eine wässrige Lösung eines Methylierungsmittels, wie Methylfluorsulphonat,wird portionsweise zugegeben. Nachdem die Reaktion beendigt ist, wird die Lösung durch ein geeignetes Harz perkoliert, beispielsweise "Sephadex" G 25, ^un<^ ^^as έ"N-Trimethyl (lys)-lysozym, befreit von den anderen Reaktionsprodukten, wird durch Lyophylisierung des Eluats isoliert.

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Das neue, so erhaltene Lysozymderivat besitzt eine Toxizität, die sich nicht wesentlich von dem des nativen Lysozyms unterscheidet. Dies wurde in einigen Tierspecies nach oraler Verabreichung gezeigt.

Es wurde jedoch gefunden, daß die biologischen Eigenschaften des modifizierten Lysozymmoleküls sehr interessant sind. Diese umfassen insbesondere eine schützende Aktivität des neuen Lysozymderivats auf die erythrozytische Hämolyse durch Silicagel (vgl. Depasse und Leonis Test, Environmental Research, 12, 371/1976 ), wobei gefunden wurde, daß es bis um das 100-fache aktiver ist als natives Lysozym. Die gewebeschädigende Wirkung von Siliciumdioxidpulver auf Erythrozyten hängt von der Tatsache ab, daß in Erythrozytenprotoplasma das anorganische Material physikalisch-chemische Bedingungen vorfindet, die erforderlich sind, um es zu hydratisieren und in Lösung in Form von Kieselsäure zu gehen, worauf eine Polymerisation zu Polykieselsäure folgt. Die letztere verursacht eine protoplasmische Proteindenaturierung mit der darauffolgenden Erythrozytolyse. £-N-Trimethyl(Iys)-lysozym neutralisiert die sauren Ladungen -der Polykieselsäure wirksamer als native Lysozyme, so daß die erythrozytische Hämolyse stark unterdrückt wird. - -

Es wurde weiterhin gefunden, daß das neue Lysozymderivat einen größeren Grad an Tropismus gegenüber Lipidmembranen zeigt,wenn man simulierte Systeme aus Membrancardiolipin: Phosphatidyläthanolamin verwendet. Dies könnte zu einer größeren Interferenzaktivität mittels des neuen Lysozymderivats bei gramnegativen Bakterien führen, die, wie es gut bekannt ist, in ihrer Zellwand Lipidkomponenten enthalten im Gegensatz zu grampositiven Bakterien, bei denen diese komplexen Strukturen nicht auftreten.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin pharmazeutische Zubereitungen, die das neue Lysozymderivat im Gemisch mit einem

für eine Beschreibung des Verfahrens für andere Verbindungen

festen oder flüssigen pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Träger enthalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel

Lysozymhydrochlorid wird bei Umgebungstemperatur bei einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,1M Pufferlösung von Natriumborat mit einem pH von 9,2 gelöst. Nachdem das Enzym gelöst ist, wird

Methylfluorosulphonat portionsweise

bis zu einem Molverhältnis von 100 Mol Reagens pro Mol Enzym zugegeben.

Nach etwa 30 Min., während der die Reaktionslösung heftig gerührt wird, wird die Lösung einer Gelfiltration durch" ein Harz ("Sephadex" G 25) unter Verwendung von 10. N-Essigsäure als Eluierungsmlttel perkoliert.

Anschließend wird das £-N-Trimethyl(lys)-lysozym, befreit von anderen Reaktionsprodukten, durch Lyophylisierung des Eluats erhalten: 96% Ausbeute.

Die Struktur von Lysozym und die Struktur seines trimethylierten Derivats sind sehr ähnlich. Der einzige Unterschied ist die Anwesenheit von Methylgruppen an den £-Aminogruppen der Lysozymgruppen. Die Ähnlichkeit der Strukturen wird durch die Flüoreszenzspektren und durch Zirkulardichroismus bestätigt.

Das erstere wurde mit einem Hitachi-Perkin Elmer-Spektrophotomei;er (Typ MPF 2A) gemessen und man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Natives Lysozym	A Anregungsmaximum = 290 nm flEmissionsmaximum = 340 nm
%-N-Trimethyl(lys)-lysozym	ΛAnregungsmaximum = 290 nm hEmissionsmaximum =342 um

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Das λ-Emissionsmaximum von denaturiertem Lysozym beträgt 350 nm, was bestätigt, daß nach der Trimethylierung des Lysins das erhaltene £-N-Trimethyl(Iys)-lysozym keine Denaturierung oder wichtige Änderungen in der sekundären oder tertiären Struktur erleidet.

Der Zirkulardichroismus über einem Wellenlängenintervall von 200 bis 250 nm bestätigt, daß die schneckenförmigen bzw. schleifenförmigen Stellen und die Duplikationen der Lysozymderivate sich von denen des nativen Lysozyms nicht wesentlich unterscheiden.

Das Verschwinden der freien Aminogruppen von £-N-Trimethyl(lys)-lysozym wird nach der Behandlung mit Picrylsulphonsäure spektrofotometrisch verfolgt.

Die Abwesenheit von Lysinresten und die quantitative Umwandlung von diesen in £-N-Trimethyllysin wird durch die Analyse der Aminosäureprozentgehalte nach der Gesamthydrolyse des Polypeptide mit 5,6N Wasserstoffsäure während 24 Std. bei 105⁰C in einem vakuumversiegelten Rohr entsprechend dem Verfahren von C.G.Zarkadas (Canadian Journal of Biochemistry, 5_3, 96/1975) bestimmt.

.Beispiel 2

50 g Lysozym werden in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Dann werden 10 ml Methylfluorsulphonat tropfenweise unter heftigem Rühren im Verlauf von 30 min. zugegeben, während die Temperatur bei '0⁰C gehalten wird. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird auf 7 durch Zugabe von 1N wässriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Im Verlauf dieser pH-Einstellung fällt das Trimethyllysozym aus. Die Suspension wird über Nacht bei 4°C gehalten und dann zentrifugiert (43 000 g während 30 min.). Der Niederschlag wird in 0,001 N Chlorwasserstoffsäure gelöst und schließlich lyophilisiert.

Ende der Beschreibung.

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Claims

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickhiann, Dipl.-Phys. Dr. K.Fincke

Dipl.-Iisg. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

Dr. Ing. H. Liska
- H/WE/LI

8000 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

Patentansprüche 1./f-N-Trimethy1(Iys)-Iysozym.
2. Verfahren zur Herstellung von B-N-Trimethyl(lys)-lysozym, dadurch gekennzeichnet, daß Lysozym in einem Natriumboratpuffer gelöst wird und ein Methylierungsmittel portionsweise zugegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Methylierungsmittel Methylfluorosulphonat verwendet.
_4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch durch ein geeignetes Harz perkoliert wird und das Eluat lyophilisiert wird.
5. S-N-Trimethyl(lys)-lysozym, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einem der Verfahrensansprüche 2 bis 4 erhalten worden ist.
6. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie (fi-N-Trimethyl (lys) -lysozym im Gemisch mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Träger enthält.

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ORIGINAL INSPECTED