DE69731891T2

DE69731891T2 - Verfahren zur reinigung von gbs-toxin/cm101

Info

Publication number: DE69731891T2
Application number: DE69731891T
Authority: DE
Inventors: G. Carl HELLERQVIST
Original assignee: Vanderbilt University
Current assignee: Vanderbilt University
Priority date: 1996-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-10-01
Also published as: EP0932696B1; DE69731891D1; US6407069B1; NO991529D0; BR9712167A; WO1998014603A1; HK1025602A1; ES2235228T3; CN1192115C; AU4802697A; EP0932696A1; DK0932696T3; CN1235642A; KR20000048757A; US6136789A; NO991529L; AR011238A1; CA2265696A1; US5939396A; IL129162A0

Description

EINFÜHRUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Reinigung eines Polysaccharids.
Hintergrund
CM101, ein GBS-Toxin, ist ein pathogenes Molekül, das aus β-hämolytischen Streptokokken-(GBS-)Bakterien der Gruppe B isoliert wurde. Neugeborene können mit GBS infiziert werden, ein medizinisches Leiden, das als GBS-Lungenentzündung oder "early-onset disease" (eine Frühform der Erkrankung) bekannt ist, und leiden unter Sepsis, Granulozytopenie und Atmungsstörungen, d. h. pulmonaler Hypertonie und proteinisches Lungenödem (Hellerqvist, C. G., et al., Studies on group B β-hemolytic streptococcus I. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin, Pediatr. Res. 12, 892–898 (1981)).
Obwohl bei Neugeborenen, die GBS ausgesetzt wurden, Schädigungen zu beobachten sind, ist für CM101 bei älteren Menschen keine toxische Wirkung bekannt. Ganz im Gegenteil zeigten Forschungsarbeiten an diesem Toxin, dass es eine bedeutende therapeutische Anwendung finden kann. Siehe US-Patent Nr. 5.010.062 und Hellerqvist, C. G., et al., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995), worin CM101 verwendet wird, um Gefäßbildung von Tumoren zu verhindern. Das Erhalten von gereinigtem CM101 ist sowohl für Forschungs- als auch für Therapiezwecke schwierig.
CM101 ist ein komplexes Polysaccharidtoxin mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 Dalton, das N-Acetylgalactosamin-, N-Acetylglucosamin-, Glucose-, Galactose- und Mannosereste umfasst. Ergebnisse der NMR (kernmagnetische Resonanz) lassen darauf schließen, dass Alditolreste auch vorhanden sein können.
Auch von Carbonsäure-funktionelle Gruppen, eventuell Galacturonsäure, wird angenommen, dass sie ein wichtiger Teil des Moleküls sind. Sich wiederholende aktive Epitope spielen sehr wahrscheinlich eine wichtige Rolle für die pathophysiologische Reaktion auf CM101 durch Vernetzen von Rezeptoren am Zielendothel (Hellerqvist, C. G., et al., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995); DeVore, R. F., et al., A Phase I Study of the Antineovascularization Drug CM101, J. Clin. Can. Res. 3, 365–372 (1997)).
Das US-Patent Nr. 5.010.062 stellt ein Verfahren zur Reinigung eines GBS-Toxins bereit. Das darin erläuterte Verfahren ist arbeitsintensiv, da es zahlreiche Schritte erfordert, in denen die biologische Aktivität kontinuierlich absinkt.
Die Reinigung von CM101, wie sie gegenwärtig auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, stellt ein Endmaterial bereit, das gemäß Messungen mittels chemischer Analysen und biologischen Tests nur zu 40% rein ist. Die anderen 60% umfassen Pflanzen- und Hefepolysaccharide und endogene bakterielle Polysaccharide. Die Verunreinigungen von Pflanzen und Hefe stammen größtenteils von den Additiven her, die den im Handel erhältlichen Kulturmedien zugesetzt werden, die für optimales Wachstum der GBS-Bakterien verwendet werden. Die endogenen Verunreinigungen umfassen GBS-Polysaccharide, umfassend Gruppen- und Typ-spezifische Antigene (Paoletti, L. C., et al., Neonatal mouse protection against infection with multiple groupe B streptococcal (GBS) serotypes by maternal immunization with a tetravalent GBS polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine, Infect. Immun. 62 (8), 3236–3243 (1994); Michon, F., Multiantennary group-specific polysaccharide of Group B Streptococcus, Biochem. 27, 5341–5351 (1988)). CM101 mit diesem 40%igen Reinheitsgrad stellt die derzeitige klinische Reinheit dar. Es gibt daher Bedarf an einem Reinigungsverfahren für CM101, das in einem Endprodukt mit erhöhter Gesamtreinheit resultiert, vorzugsweise unter Entfernung fremder Pflanzen- und Hefepolysaccharide und GBS-Antigen-Polysaccharide.
Weiters umfasst das auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Reinigungsschema Verfahrensschritte, die mit der Umwelt nicht vereinbar sind, wie beispielsweise die Verwendung eines großen Volumens an Phenol in einer Phenol/Wasser-Extraktion. Phenol ist ein bekanntes, ätzendes Material.
Daher sind Ziele der vorliegenden Erfindung, ein Reinigungsverfahren bereitzustellen, dass (i) zu einem Material hoher Reinheit, (ii) zur Verwendung einer minimalen Anzahl an Verfahrensschritten, (iii) zum Minimieren der Verwendung ätzender oder toxischer Materialien wie Phenol und (iv) zum Steigern der Materialausbeute führt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die oben genannten Ziele wurden durch die hierin beschriebene Erfindung erreicht. Insbesondere führt ein Reinigungsschema, das ein Hydrophobchromatographie-(HIC-)Harz zur Reinigung von CM101 aus GBS-Bakterien-Nährmedium umfasst, zu einem Produkt mit zumindest 60%iger Reinheit.
Ein Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung eines Polysaccharidtoxins aus GBS-Bakterien, wobei das Verfahren die Verwendung eines HIC-Harzes umfasst. Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein im Wesentlichen reines Polysaccharidtoxin aus GBS-Bakterien, das durch das hierin offenbarte Verfahren hergestellt wurde, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein im Wesentlich reines Toxin und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Behandlung eines Patienten verwendet werden, der ein medizinisches Leiden aufweist. Beispielsweise kann ein Krebspatient mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht ein CM101-Reinigungsschema der vorliegenden Erfindung.
2 veranschaulicht ein bekanntes CM101-Reinigungsschema.
3 ist eine quantitative Hydrolyse-Standardkurve, die die Dosiswirkung eines PAD-Detektors bei 5, 20 und 50 μg Dextran (ein Glucosepolymer) mit 6-Desoxyglucose als einem konstanten inneren Standard zeigt.
4 zeigt die Trennung von Standard-Zuckerproben.
Die 5a–b sind Elutionsprofile eines Mediumkonzentrats auf einer Butylsepharose-HIC-Säule. 5a wird bei einer UV-206-Absorption gemessen. 5b wird bei einer UV-280-Absorption gemessen.
6a ist ein HPLC-Profil einer HIC-gereinigten, wassereluierten Fraktion, die CM101 (16-min-Peak) enthält und bei einer UV-203-Absorption an einem Millennium 2000 Diodo-Ray-Detektor (Waters, Millford, MA) beobachtet wurde.
6b ist ein Diodo-Ray-Spektrum entsprechend 6a, das minimale Gegenwart von 260-Absorption (RNA und DNA) und 280-Absorption (Tyrosin-hältiges Protein) für den CM101 enthaltenden (16-min-) Peak darstellt.
7a ist ein Elutionsprofil, das bei 203 nm beobachtet wurde und die Reinheit des HIC-wassereluierten Peaks aus 6a, der weiters Phenol/Salz-Extraktion und anschließender DEAE-Chromatographie unterzogen wurde, zeigt.
7b ist ein Diodo-Ray-Spektrum, das die Reinheit des CM101-enthaltenden Peaks aus 7a zeigt, die durch den schmalen, symmetrischen Peak und durch die fehlende Absorption bei 260 nm (RNA/DNA) und bei 280 nm (Protein) belegt wird.
8 ist ein Profil von IL-6-Aktivität durch ANA-1-Test von Fraktionen, die aus einer HIC-Säule erhalten wurden, und noch spezifischer ein IL-6-Aktivitätsprofil von Fraktionen, die aus 10K5P6-Konzentrat erhalten wurden, das auf 100 ml Butylsepharose laufen gelassen wurde (FT = Durchfluss; 1 M = 1 M Phosphatfraktion; 0,25 M = 0,25 M Phosphatfraktion; H₂O = Wasserfraktion, EtOH = Ethanolfraktion).
9 veranschaulicht eine Zuckeranalyse von CM101, gereinigt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
10 ist ein HPLC-Profil von CM101 der derzeitigen klinischen Reinheit, das weiters HIC-Chromatographie unterzogen wurde.
11 veranschaulicht eine Zuckeranalyse einer Probe von CM101 der derzeitigen klinischen Reinheit, das weiters durch HIC und HPLC gereinigt wurde.
12a ist ein HPLC-Profil von CM101, das durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer, pH 8,4, gereinigt wurde.
12b ist ein HPLC-Profil von CM101, das durch das Verfahren der Erfindung unter Verwendung derselben Laufbedingungen wie für das HPLC-Profil aus 12a gereinigt wurde.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
GBS-Toxin, wie es hierin verwendet wird, ist definiert als jede beliebige Fraktion oder Komponente, die aus natürlichen oder lysierten GBS-Bakterien isoliert oder von Medienüberständen lysierter und/oder autoklavierter GBS-Bakterien abgeleitet wurde und die eine biologische Aktivität aufweist, die durch Induktion von Atmungsstörungen in Schaftests (Hellerqvist, C. G., et al., Studies on group B β-hemolytic streptococcus I. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin, Pediatr. Res. 12, 892–898 (1981)) oder Komplementaktivierung und Binden an neugebildete Gefäße, wie durch einen Peroxidase-Antiperoxidase-(PAP-)Test an einem Tumorgewebemuster gezeigt wurde, belegt wurde (Hellerqvist, C. G., et al., Anti-tumor effects of GBS toxin: a polysaccharide exotoxin from group B β-hemolytic streptococcus. J. Canc. Res. Clin. Oncol. 120, 63–70 (1993); und Hellerqvist, C. G., et al., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995)).
Im Wesentlichen reines GBS-Toxin bezeichnet ein Präparat, worin GBS-Toxin zu mehr als 40% rein (z. B. in einer Konzentration von zumindest etwa 40 Gew.-% vorhanden), vorzugsweise zumindest etwa zu 60% rein, noch bevorzugter zumindest etwa zu 90% rein und am meisten bevorzugt zumindest etwa zu 95% rein, ist.
Eine Quelle für GBS-Ausgangsmaterial zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durch Kultivieren von Stämmen von β-hämolytischen Streptokokken-Bakterien der Gruppe B erhalten werden, die kurz davor Neugeborene infiziert haben oder in der Lage sind, sie zu infizieren. Isolate solcher Stämme können aus dem Blut von infizierten Säuglingen gewonnen werden.
Hohe Produktion von CM101 erfordert im Allgemeinen Fermentation mit dem komplexen Medium THB, das hochmolekulares Material in Form von Polysacchariden und Proteinen für optimales GBS-Wachstum und CM101-Produktion enthält. Während des Fermentationsprozesses produzieren die Bakterien aus den Nährstoffen Mengen an Proteinen, Nucleinsäuren und Polysacchariden, die kein CM101 sind. Die geschätzte Konzentration an CM101 in der Fermentations-Kulturlösung beträgt weniger als 0,1 Gew.-%.
Das Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet Hydrophobchromatographie (HIC), die den Großteil der endogenen und exogenen verunreinigenden Proteine, Nucleinsäuren und Polysaccharide effizienter eliminiert als bekannte Verfahren und in einem Endprodukt resultiert, das 10–50% reines CM101 enthält. In nur einem Schritt des Kontaktierens des GBS-Ausgangsmaterials und des HIC-Harzes wird somit eine 100- bis 500fache Reinigung des Ausgangsmaterials erreicht.
Die Verwendung eines HIC-Harzes zur Reinigung eines Polysaccharids ist überraschend und neu, da HIC-Säulen für die Reinigung hydrophober Proteine bestimmt sind und nicht erwartet wurde, dass sie für Polysaccharide, die frei von Proteinen und Lipiden sind, nützlich sein können. Polysaccharide werden aufgrund ihrer zahlreichen Hydroxylgruppen im Allgemeinen als hydrophil charakterisiert. Die Aufbringung eines Ausgangsmaterials an einer HIC-Säule unter den seitens der Hersteller empfohlenen und seitens der Fachleute in der Praxis eingesetzten Bedingungen würde daher in der Absicht erfolgen, Proteine zurückzuhalten und Polysaccharide ungebunden durch die Säule durchwandern zu lassen.
Die überraschende Entdeckung ist nun, dass CM101 hydrophobe Eigenschaften aufweist, die die Verwendung des vorliegenden Reinigungsschemas ermöglichen, um hochprozentige Reinheit zu erlangen. Besonders überraschend ist, dass CM101 signifikant mehr hydrophobe Eigenschaften aufweist als die meisten Proteine und Polysaccharide, die im Überstand vorhanden sind, aus dem CM101 isoliert wird. Mehr als 98% dieser Protein- und Polysaccharid-Verunreinigungen wandern durch die HIC-Säule durch. Obwohl das HIC-Harz im Allgemeinen in einer HIC-Säule verwendet wird, kann dieser Schritt alternativ dazu durch Kontaktieren des Harzes und des Ausgangsmaterials auf eine andere Weise durchgeführt werden. Beispielsweise können die GBS-Quelle und das Harz zusammen in einem Chargenverfahren in ein Gefäß gegeben werden, und der Toxin-hältige Abschnitt kann anschließend vom Harz durch Zentrifugieren getrennt werden.
Zusätzliche Reinigungsschritte können eine Phenol/Salzlösung-Extraktion in einem im Vergleich zu den älteren Verfahren geringen Volumen (etwa um das 1.000fache reduziert) und eine Ionenaustauschsäule umfassen. Diese zusätzlichen Reinigungsschritte tragen zu einem Endprodukt mit mehr als 95% Reinheit bei.
HIC ist ein Verfahren, das zum Trennen von Proteinen wie Membranproteinen, basierend auf ihrer hydrophoben Beschaffenheit, verwendet wird. Ein HIC-Harz ist als ein Harz definiert, das wechselwirkende hydrophobe Gruppen aufweist, die im Allgemeinen kovalent an einen Träger gebunden sind, sodass die hydrophoben Gruppen frei sind, um mit Substanzen, die mit dem Harz in Kontakt stehen, wechselwirken können. Beispiele für hydrophobe Gruppen umfassen Alkyl-, Alkoxy- und Arylgruppen. Das bevorzugte HIC-Harz, das gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, weist einen Träger mit gebundenen aliphatischen Gruppen mit zwei oder mehr Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Alkylgruppen im Bereich von 2 bis 12 Kohlenstoffatomen und noch bevorzugter normale oder verzweigte Butylgruppen, auf. Phenylgruppen oder Alkoxygruppen mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen sind auch bevorzugte, wechselwirkende, hydrophobe Gruppen. Die interaktiven hydrophoben Gruppen werden vorzugsweise von Sepharose (Pharmacia), Acrylamid (Toso Haas, Montgomeryville, PA) oder Siliciumdioxid getragen. Gemäß dem Standardverfahren zur Verwendung einer HIC-Säule wird das Ausgangsmaterial, das das Protein von Interesse enthält, auf die Säule in bis zu 2 M wässriger Salzsäure aufgetragen, und die gebundenen Proteine werden dann eluiert und durch Herabsetzen der hydrophoben Wechselwirkungen durch Reduzieren der Ionenstärke des Entwicklungspuffers abgetrennt. Änderungen des pH und/oder der Temperatur können auch verwendet werden, um die hydrophoben Wechselwirkungen zu variieren.
CM101-Reinigung von Streptokokken der Gruppe B erfordert den Erhalt einer bakteriellen Kultur von GBS. Bakterielles Impfmaterial wird zur späten log-Phase in Todd-Hewitt-Broth (THB), modifiziert durch Ergänzung mit 2 g/l oder mehr Glucose und Na₂HPO₄, inkubiert. Wie in 1 angegeben wird die Kultur anschließend autoklaviert. CM101 ist im Überstand von GBS-Fermentationskulturen in einer Konzentration von 2–15 mg/l nach dem Autoklavieren vorhanden. Das Medium enthält etwa 15 g/l an anderen Bakterien- und Medienkomponenten. So stellt CM101 etwa 0,01–0,1% der Komponenten im Überstand dar. Nach dem Autoklavieren wird das Medium filtriert. Das Filtrat wird vorzugsweise über ein 10.000-Dalton-(10-kD-)Cutoff-Filter konzentriert, wobei auch ein Filter mit einem Cutoff von 50.000 Dalton (50 kD) oder weniger verwendet werden kann.
CM101 wird dann gemäß dieser Erfindung, wie in 1 dargestellt, durch Auftragen eines Überstandkonzentrats oder eines wiederhergestellten Alkoholpräzipitats davon, hergestellt in 0,75–2 M Kaliumphosphat oder einem anderen Salz, wie beispielsweise Natriumphosphat, Natrium- oder Kaliumsulfat, -chlorid oder -acetat, auf eine HIC-Säule gereinigt, die vorzugsweise mit demselben Salz derselben Molarität äquilibriert wurde. Das Verfahren, worin das Mediumkonzentrat oder das Ausgangsmaterial von 10 kD–50 kD ohne Alkoholausfällung und Wiederherstellung verwendet wird, ist bevorzugt, da das Mediumkonzentrat als Ausgangsmaterial höhere Ausbeuten an CM101 liefert als wiederhergestellte Alkoholpräzipitate.
Das CM101-hältige Ausgangsmaterial wird auf die HIC-Säule aufgetragen und mit wässrigem Phosphat bei 0,75–2 M gewaschen. Nach einem Waschschritt mit 0,75–2 M wird die Säule mit 0,5–1 M und dann 0,25 M Salz, vorzugsweise Phosphat, weiter entwickelt. In der bevorzugten Ausführungsform wird das CM101 aus der Säule mit Wasser als ein einzelner Peak eluiert, der 10–50% CM101 enthält. Alternativ dazu wird das Wasser zur CM101-Elution aus der HIC-Säule durch 10 mM Phosphat, pH 6,8, in 10% Ethanol in Wasser (Puffer A), gefolgt von 20% Ethanol in Wasser, ersetzt. CM101-Aktivität wird sowohl in Puffer A als auch in 20%-Ethanolfraktionen erhalten. Die Verwendung von Puffer A ist im Allgemeinen nicht ausreichend, um das gesamte CM101 aus der HIC-Säule zu entfernen, sodass dem Waschschritt mit Puffer A ein zusätzlicher Waschschritt in 20%igem Ethanol folgt. In größerem Maßstab stellt Ethanol jedoch eine Umweltgefährdung dar, und die folgende Phenol/Salzlösung-Extraktion der Wasser-Peak- oder der Puffer-A- und 20%-Ethanol-Peak-Fraktionen ergibt CM101 mit etwa gleicher Reinheit. Das HIC-Verfahren entfernt mehr als 98% der Proteine und Medien-Polysaccharide, die im 10-k-Konzentrat oder dem wiederhergestellten Alkoholpräzipitat verbleiben.
Das angereicherte CM101 von der HIC-Säule kann durch eine Extraktion in Phenol und einer wässrigen Salzlösung, vorzugsweise 0,05 M Salzlösung, weiter gereinigt werden. Dieser zusätzliche Schritt liefert eine CM101-Fraktion von etwa 95%iger Reinheit.
Die Wasser- oder die kombinierten Puffer-A- und 20%-Ethanol-Fraktionen, die von der HIC-Säule eluiert wurden, werden entweder gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert und in 0,05 M Salzlösung wiederhergestellt oder nach Konzentration gegen Salzlösung dialysiert. Typischerweise wird dem Material Phenol zugesetzt, und die Lösung wird rasch auf 70–80°C erhitzt. Bildet sich eine einzelne Phase, so wird die Lösung auf 4°C abgekühlt. Die resultierende Salzlösungsphase der Phenol/Salzlösung-Extraktion enthält CM101 und kann dann auf eine Kationenaustauschsäule wie DEAE aufgetragen werden.
Für das DEAE-Säulenverfahren wird die DEAE-Säule in Wasser äquilibriert und anschließend mit 0,1 M Salzlösung, 0,05 M NaOAc, pH 7,4, gewaschen und mit einem Schrittgradienten bis zu 0,34 M NaCl entwickelt. Elution von CM101 wird beobachtet und mit einem ANA-1-Test quantifiziert. Wie beim HIC-Harzschritt kann ein Ionenaustauschharz mit dem Toxin-hältigen Material unter Verwendung einer anderen Vorrichtung als einer Säule kontaktiert werden. Die CM101-hältige Fraktion wird dann gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Nach den Schritten der Phenol/Salzlösung-Extraktion und des Ionenaustausches ist CM101 zu mehr als 95% rein.
Die Säuleneluate oder das Material, das aus den Harzkontaktschritten resultierte, wurden mit dem ANA-1- und/oder Dot-Blot-Test auf biologische Aktivität getestet. Die biologische Aktivität wird dann mit einem Schaftest bestätigt. Tabelle 1 zeigt mehrere Trennungen von AP und 10-k-Material, das aus verschiedenen Chargen an Ausgangsmaterial erhalten und auf die HIC-Säule aufgetragen wurde. Das Entfernen von denaturiertem Protein und Medien-Polysacchariden und anderem Material verläuft ähnlich.
Obwohl die bevorzugte Abfolge des Reinigungsverfahrens zuerst die Durchführung des HIC-Schritts vorsieht, dem die Phenol/Salzlösung-Extraktion und anschließend der Ionenaustauschschritt folgen, kann Reinigung auch in einer anderen Reihenfolge durchgeführt werden.
2 stellt ein Beispiel für ein bekanntes Verfahren von CM101-Reinigung dar. Insbesondere gilt hierbei anzumerken, dass ein Präzipitationsschritt mit 70% Ethanol verwendet wird, woraufhin rasch danach eine Phenol/Wasser-Extraktion folgt. Durch die großen Volumina an Ethanol und Phenol, die in diesen frühen Phasen des bekannten Reinigungsverfahrens erforderlich waren, war dieses Verfahren mit der Umwelt nicht vereinbar. Das in 2 dargestellte Verfahren erfordert auch eine Ionenaustauschsäule, eine Gelfiltrationssäule und eine Linsenlectinsäule.
Das obige Verfahren umfasst zahlreiche Schritte, die teilweise umweltschädlich sind. Im Gegensatz dazu ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung effizient, ergibt höhere Reinheit und 2- bis 25fache Ausbeute und minimiert den Einsatz von umweltschädlichen Materialien.
Der die Umwelt gefährdende Schritt der Phenol/Wasser-Extraktion wird im Vergleich zu den bisher verwendeten Verfahren um das 1.000fache reduziert. Weiters ist zusätzliche Reinigung wie beispielsweise durch ein Gelfiltrationsverfahren nicht mehr erforderlich. Der Schritt der Linsenlectinchromatographie des älteren Verfahrens wird auch gestrichen. Das Endprodukt der Verfahrensschritte HIC-Säule, Phenol/Salzlösung-Extraktion und Ionenaustauschsäule weist eine Reinheit von etwa 95% auf, sodass andere Behandlungen nicht mehr notwendig sind.
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigte CM101 kann für Forschungs- oder Therapiezwecke verwendet werden. Das CM101 ist besonders nützlich, wenn es mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert wird, z. B. in Salzlösung wiederhergestellt und dem Patienten intravenös verabreicht wird. Andere Dosierungsformen zur Verabreichung von gereinigtem CM101 können auch verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung umfasst das im Wesentlichen reine GBS-Toxin dieser Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Im Allgemeinen wird ein Träger ausgewählt, der mit dem Toxin leicht vermischt werden kann, um eine Zusammensetzung zu bilden, die auf intravenösem (IV) Weg verabreichbar ist. So ist der Träger vorzugsweise Wasser, das andere, pharmazeutisch annehmbare Arzneimittelträger eingeschlossen haben kann, um seine Eignung zur intravenösen Verabreichung sicherzustellen. Die resultierende Zusammensetzung ist steril und weist annehmbare osmotische Eigenschaften auf. Im Allgemeinen wird eine geeignete IV-Formulierung gemäß Fachleuten bekannten Standardverfahren hergestellt. Beispielsweise stellt Kapitel 85 mit dem Titel "Intravenous Admixtures" von Salvatore J. Turco in der 18. Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences, Mach Publishing Co. (1990), das durch Verweis hierin aufgenommen ist, Standardverfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren IV-Zusammensetzung bereit, die gemäß dieser Erfindung nützlich ist.
Weiters kann ein Patient mit einem medizinischen Leiden, für den festgestellt wurde, dass er positiv auf CM101 reagiert, mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Beispielsweise kann ein Patient, der an einem Tumor leidet, durch intravenöse Verabreichung der hierin erläuterten pharmazeutischen Zusammensetzung gut behandelt werden. Das US-Patent Nr. 5.010.062 diskutiert die Behandlung bestimmter Tumoren bei Menschen und ist durch Verweis hierin aufgenommen.
Quantitative und qualitative Analyse
HPLC-Analyse
Reinheit und Menge von CM101, das aus einer Probe nach der HIC-Chromatographie erhalten wurde, werden durch Hochdruckflüssigchromatographie-(HPLC-)Gelfiltrationsanalyse ermittelt. Die Gelfiltrationssäule wird typischerweise mit 10% Acetonitril in Wasser äquilibriert, und das biologisch aktive CM101 wird als ein eingeschlossener homogener schmaler Peak eluiert. Alternativ dazu kann die Säule in 10 mM Phosphatpuffer, pH 8,4, entwickelt werden, was einen stärker eingeschlossenen Peak ergibt. Ein Ammoniumacetat-(NH₄OAc-)Puffer, pH 8,4, kann als eine weitere Alternative zum 10-mM-Phosphatpuffer verwendet werden.
Eine typische Detektorenreaktion (UV-203-Absorption) unter Verwendung von 30, 50 und 100 μg reinen CM101-Standards, die in 100 μl Entwicklungspuffer auf einer Hydragel-1000-Säule (Waters, Millford, MA) injiziert werden, beläuft sich auf 26 × 10⁶, 48 × 10⁶ bzw. 97 × 10⁶ Flächeneinheiten, die eine Dosiswirkungskurve zur Quantifizierung unbekannter Proben ergibt.
Das Molekulargewicht von CM101 kann auch durch Gelfiltrationschromatographie gemessen werden. Ein nicht-denaturierender Puffer wie Acetonitril-, Phosphat- oder Ammoniumacetatpuffer, die zuvor beschrieben wurden, werden zum Betreiben der Säule verwendet. Die CM101-Elution wird mit jener der Standard-Dextran-Polysaccharid-Marker mit unterschiedlichem Molekulargewicht verglichen. Das CM101 hat unter diesen Bedingungen ein Molekulargewicht von etwa 300.000 Dalton.
Aminosäureanalyse
Quantitative und qualitative, automatisierte Aminosäureanalyse kann mittels herkömmlicher, im Handel erhältlicher Vorrichtungen, z. B. PicoTag, erhältlich bei Waters, Millford, MA, durchgeführt werden.
ANA-1-Test
Um die biologische Aktivität der verschiedenen Fermentations- und Reinigungsschritte zu beobachten, kann ein In-vitro-Test, der eine transformierte Maus-Makrophagen-Zelllinie einsetzt, verwendet werden. Der Test misst IL-6-Produktion des Maus-Makrophagen-ANA-1 als Reaktion auf CM101-Exposition.
Insbesondere induziert CM101 raf/myc-transformierte Mausknochenmarks-Makrophagenzelllinie ANA-1, um in vitro durch IL-6-Produktion zu reagieren. Andere Makrophagen-ähnliche Zelllinien und frische periphere Blutleukozyten können auch verwendet werden.
Um den ANA-1-Test durchzuführen, werden Proben zuerst auf Werte in einem geeigneten Bereich verdünnt (je nach erwartetem Niveau der CM101-Aktivität), und vier bis acht Konzentrationen werden bei 1 : 4-Verdünnungen getestet. Eine CM101-Standardkurve wird unter Verwendung von CM101 klinischer Reinheit, das in PBS aufgelöst ist, gebildet. Eine 4.000-ng/ml-Lösung, die eine Endkonzentration von 2.000 ng/ml ergab, nachdem die Zellen zugesetzt worden waren, wurde in PBS zusammen mit sechs 1 : 2-Reihenverdünnungen hergestellt. Zellen können beispielsweise in einer Konzentration von 2 × 10⁶/ml verwendet werden. Die Empfindlichkeit des Tests wurde durch Zusatz von 200 Einheiten/ml Maus-IFN-γ zu den ANA-1-Zellen erhöht. Die Endkulturen entsprachen 100 Einheiten/ml IFN-γ.
Die Mikrotiterplatte mit Kulturen sollte in einen befeuchteten Inkubator, 37°C, 5% CO₂-in-Luft, über Nacht (16–18 Stunden) gegeben werden, woraufhin ein ELISA-IL-6-Test (R. D. Systems, Minneapolis, MN) folgt. Insbesondere werden Kulturüberstände auf die IL-6-Testplatte transferiert, und die Platte wird auf 4°C gehalten, bis der IL-6-Test abgeschlossen ist.
Dot-Blot-Test
Ein alternatives, rasches Verfahren, um das CM101 in Lösungen oder biologischen Flüssigkeiten quantitativ nachzuweisen, ist, Proben auf Polyvinylidendifluorid-(PVDF-)Membranen in Reihenverdünnungen zu blotten. Die Menge an CM101 wird unter Verwendung entweder eines Fluoreszenz-markierten, monoklonalen Maus-Antikörpers gegen CM101 oder eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen CM101, gefolgt von einem Fluoreszenz-markierten Anti-Maus-IgG, quantifiziert. Antikörper 7A3, der gegen CM101-Antigen gerichtet ist, ist für diesen Zweck nützlich. Die Mengen an CM101 in den verschiedenen Fraktionen werden durch Vergleich mit einer Standardkurve eines reihenverdünnten CM101-Standards ermittelt.
Schaf-Lungenarteriendrucktest
Das Toxin beeinflusst Schaflungen durch Erhöhen pulmonaler Hypertonie, die sich durch erhöhten Pulmonalarteriendruck und durch erhöhte Lungengefäßdurchlässigkeit widerspiegelt.
CM101-Proben in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) können Lämmern durch Infusion verabreicht werden, und Veränderungen des Pulmonalarteriendrucks wird in 15-Minuten-Abständen aufgezeichnet. Diese Veränderungen hinsichtlich des Drucks stehen mit der CM101-Aktivität in Verbindung. (Hellerqvist, C. G., et al., Studies on group B β-hemolytic streptococcus I. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin, Pediatr. Res. 15, 892–898 (1981).)
Zuckeranalyse
Eine Menge von 100 μg einer Probe wird zwei Stunden lang bei 100°C in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (TFA), Essigsäure (HOAc) und Wasser in einem Verhältnis von 5 : 70 : 25 hydrolysiert. Die Lösung wird eingedampft, und die Probe wird weitere zwei Stunden lang bei 100°C in einem Gemisch von TFA und Wasser in einem Verhältnis von 2 : 8 weiter hydrolysiert. Dieses Verfahren hydrolysiert alle glykosidischen Bindungen in der Probe vollständig. Die N-Acetylgruppen, die ursprünglich in den Aminozuckern vorhanden sind, werden auch entfernt.
Die Proben werden anschließend im Dionex-Zuckeranalyse-System unter Verwendung eines PAD-(Pulsed Amperometric Detection)Detektors analysiert. Die Auflösung ist in 4 dargestellt.
Die Reinheit der Probe wird anhand von quantitativer und qualitativer Zuckeranalyse ermittelt. Das Verfahren ist in den 3 und 4 dargestellt. Eine Probe von Polysaccharid, die durch HPLC quantifiziert wurde, wird mit einer hydrolysierten und anaylsierten 6-Desoxy-D-Glucose als internem Standard ergänzt. Das in diesem Abschnitt beschriebene Verfahren ergibt im getesteten Bereich eine lineare Dosiswirkung, und qualitative Analyse erfolgt durch Vergleichen der Retentionszeiten von Unbekannten mit Standards.
BEISPIELE
Beispiel 1: Ein Reinigungsschema von CM101 im großen Maßstab
Ein Streptokokken-Serotyp-III-Isolat-Arbeitsmaterial der Gruppe B wurde in Verbindung mit einem 3.000-Gallonen-Fermenter verwendet. Ein 25-ml-Impfgut der Bakterienkultur wird für ein 80-Liter-Gefäß mit einem Arbeitsvolumen von 65 Litern (65 lwv) verwendet, das anschließend eingesetzt wird, um ein 750-lwv-Gefäß zu beimpfen, welches wiederum in den 7.500-lwv-Endfermenter (3.000 Gallonen) kommt. Alternativ dazu können die 65 lwv verwendet werden, um den 7.500-lwv-Fermenter direkt zu beimpfen.
Die Kulturen werden in der späten log-Phase durch Autoklavierung abgeschlossen. Die Bakterien werden dann durch kontinuierliche Zentrifugation bei 10.000 × g entfernt, woraufhin eine 0,45-μm-Kassetten-Filtration (Millipore Corporation, Bedford, MA) folgt.
Der resultierende Kulturüberstand wird dann durch die Kassettenfiltration unter Verwendung von 10 kD- bis 50 kD-Cutoff-Kassetten (Millipore) 15fach auf 500 Liter konzentriert. Das konzentrierte Material wird dann in Salz, vorzugsweise Natriumphosphat, pH 7,4 (Ladepuffer), durch Dialyse auf 2 M eingestellt.
Der konzentrierte Überstand wird anschließend Hydrophobchromatographie mittels einer 60-Liter-n-Butylsepharose-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) unter Verwendung eines BioPilot-Systems (Pharmacia) unterzogen. Die Kapazität des n-Butylsepharose-Harzes für die biologische CM101-Aktivität im Mediumkonzentrat unter keinem Durchfluss von Aktivität beträgt etwa 80 Liter Medium auf einen Liter Harz. Nachdem der konzentrierte Überstand auf die Säule geladen wurde, wird die Säule mit dem Ladepuffer und anschließend 0,5–1 M und dann 0,25 M Phosphatpuffer, pH 7,4, gewaschen. Die CM101-enthaltende Fraktion wird mit Wasser zu etwa 120 Liter oder zwei Säulenvolumina eluiert und auf 2 Liter in einer Cutoff-Kassette im Bereich von 10 kD bis 50 kD konzentriert. Die Säulenelution wird durch ein im Vorfeld erstelltes Programm im BioPilot gesteuert, und das Eluat wird durch UV-Absorption bei 206 und 280 nm, Leitfähigkeit und pH kontrolliert.
Die CM101-enthaltende 2-Liter-Fraktion wird gegen 0,05 M Salzlösung, pH 7,0, dialysiert und dann auf eine Temperatur im Bereich von 75–80°C erhitzt, und 0,2–2 Liter Phenol werden zugesetzt. Das Gemisch wird dann auf 80°C erhitzt und auf dieser Temperatur 5 Minuten lang gehalten. Hiernach wird das Gemisch auf 4°C abgekühlt. Die aus diesem Schritt resultierende Wasserphase wird vorzugsweise zweimal mit 0,2 Volumina Chloroform extrahiert, bevor sie auf eine DEAE-Sephacel-FF-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), äquilibriert in Wasser, aufgetragen wird. Die Säule wird mit 100 mM Salzlösung, 0,05 M NaOAc, pH 7,4, gewaschen, und das biologisch aktive Material, CM101, wird dann von der DEAE-Säule mit einem NaCl-Gradienten eluiert. Die biologische Aktivität wird durch II-6-Test und HPLC-Analyse nachgewiesen. Die Qualität des durch dieses Verfahren gereinigten CM101 wird durch HPLC und Zuckeranalyse sowie durch Tests zur biologischen Aktivität durch II-6 und Schaftests ermittelt.
Dieses Reinigungsschema im größeren Maßstab hat den Vorteil, den Einsatz des frühen Phenol/Wasser-Extraktionsverfahren des Alkoholpräzipitats mit großem Volumen, das in älteren Verfahren verwendet wurde, zu vermeiden.
Ergebnisse
Die 5a–b zeigen Elutionsprofile eines Mediumkonzentrats auf einer Butylsepharose-HIC-Säule in 2 M K₂HPO₄, pH 7,2. Die verschiedenen Peaks sind die Ergebnisse zeitlich definierten, schrittweisen Änderungen des Elutionsgradienten. 5a zeigt das Profil, das bei UV-Absorption bei 206 nm gemessen wurde, welches die Peak-Fraktionen für das gesamte organische Material quantifiziert, und zeigt das CM101 im letzten schmalen Peak (etwa 383 Minuten). 5b zeigt das Profil, das bei UV-Absorption bei 280 nm gemessen wurde, welches die Menge an Protein in den verschiedenen Fraktionen quantifiziert.
Durch Durchführen des HIC-Säulenschritts wird CM101 dazu veranlasst, sich an die Säule zu binden, während bis zu 99,7% des Proteins und bis zu 98,5% neutraler und geladener Polysaccharide durch die Säule durchwandern, wie in Tabelle 1 dargestellt ist.
Tabelle 1. Reinigung von CM101-Aktivität durch HIC-Chromatographie Quantifizierung durch Integration von UV-280- und UV-206-Profilen
In Tabelle 1 werden verschiedene Fermentationschargen wie Alkoholpräzipitat (AP), AP1, AP2 und AP6 und 10-k-Konzentrate HIC-Chromatographie unterzogen und entweder mit Wasser oder Puffer A eluiert. Beide Verfahren ergeben etwa dieselbe wirksame Entfernung von exogenem und endogenem Protein (UV 280) und Polysacchariden und allgemeinen organischen Verbindungen (UV 206).
Die 6a–b zeigen ein HPLC-Profil und ein Diodo-Ray-Spektrum einer HIC-gereinigten, wassereluierten Fraktion, die CM101 enthält und bei UV-Absorption bei 203 nm beobachtet wurde. Diese Fig. veranschaulichen die minimale Gegenwart von 260-nm-Absorption (RNA und DNA) und 280-nm-Absorption (Protein) für den CM101-enthaltenden Peak.
Nachdem die HIC-Fraktion weiters Phenol/Salzlösung-Extraktion und Ionenaustauschschritten unterzogen wurde, wird die Reinheit des wassereluierten HIC-Peaks weiter verbessert, wie in den 7a–b ersichtlich ist. Es gilt hier den schmalen symmetrischen Peak bei etwa 16 Minuten vom Zeitpunkt null weg und das Fehlen an Absorption bei 260 nm (RNA/DNA) und 280 nm (Protein) zu beachten. Für die Elutionsprofile aus den 6a–b und 7a–b wurde die HPLC mit 10% Acetonitril in Wasser durchgeführt, und die Durchflussrate betrug etwa 0,3 ml/min.
Diese Elutionsprofile sowie die biologische Aktivität sind jenen ähnlich, die erhalten wurden, wenn das Alkoholpräzipitat als Ausgangsmaterial für die HIC-Säule verwendet wurde.
Die Fähigkeit der HIC-Fraktionen aus dem 10-k-Ausgangsmaterial, IL-6-Synthese in ANA-1-Zellen zu veranlassen, ist in 8 dargestellt. HIC-Chromatographie ergab laut Messungen durch einen ANA-1-Test einen Erhalt von etwa 50% der gesamten biologischen Aktivität im Medienüberstand. Dot-Blot-Tests am selben Material, das in Gegenwart von CM101-Antigen Immunreaktivität zeigt, wurden verwendet, um die ANA-1-Testergebnisse zu bestätigen.
Die verschiedenen Fraktionen, die nach HIC-Chromatographie aus dem 10-k-Konzentrat erhalten wurden, wurden auch im Schafmodell auf biologische Aktivität getestet. Die Menge an CM101-Aktivität wird auf Grundlage einer Dosiswirkungskurve unter Verwendung von herkömmlichem klinischem CM101 (1 Aktivitätseinheit entspricht 7,5 μg/kg) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, worin HIC-Fraktionierungen von Alkoholpräzipitat (AP) und Mediumkonzentrat (10 k) verglichen werden.
Tabelle 2: Menge von CM101, erhalten aus HIC-Chromatographie von AP und 10-k-Material, basierend auf Quantifizierung biologischer Aktivität im Schafmodell
Die biologische Aktivität von CM101, wenn es durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt wurde, wurde auch mit dem Pulmonalarteriendrucktest an Schafen getestet und dann mit der Aktivität von CM101 verglichen, das durch das alte Verfahren, wie beispielsweise im US-Patent Nr. 5.010.062 gelehrt, gereinigt wurde. Das gemäß der Erfindung gereinigte Material wies eine spezifische Aktivität auf, die zwei- bis dreimal so intensiv war wie jene des Materials, das durch das alte Verfahren gereinigt wurde, d. h. ein Material, das mit keinem HIC-Harz in Kontakt gebracht wurde.
Die Produktausbeute aus dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch durch die obigen Zahlen belegt, da die bekannten Verfahren im Vergleich zu einem Wert von 7.520 μg/l, der zuvor gezeigt wurde, nur etwa 300 μg CM101 pro Liter Fermentationsvolumen ergaben.
Das gereinigte CM101, das in den 7a–b gezeigt ist und durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, wurde ebenfalls einer Zuckeranalyse unterzogen. Die Zuckerausbeute ist in 9 dargestellt.
Quantitativ gemessen ist das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene CM101 zu mehr als 95% reines Kohlenhydrat und enthält weniger als 5% an Protein, wie durch quantitative und qualitative Messungen, wie zuvor gezeigt, und durch automatische Aminosäureanalyse (PicoTag, Waters, Millford, MA) ermittelt wurde.
Beispiel 2: Vergleich der herkömmlichen klinischen Reinheit und jener der neuen Zusammensetzung
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene CM101 weist im Vergleich mit CM101 der herkömmlichen klinischen Reinheit eine Verbesserung auf. Insbesondere zeigt das HPLC-Elutionsprofil aus 10 im Vergleich zu 7a höhere Reinheit in der Probe auf, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. 7a zeigt einen schmalen und symmetrischen Hauptpeak anstelle mehrerer Peaks.
Um die vorteilhafte Verwendung der HIC-Säule noch näher aufzuzeigen und um einen weiteren Beweis für die Reinigung des Toxins, das als CM101 bekannt ist, bereitzustellen, wurde CM101 der herkömmlichen klinischen Reinheit einer HIC-Säule und HPLC-Reinigung unterzogen, und eine Zuckeranalyse wurde durchgeführt. Die Ergebnisse, in 11 dargestellt, können mit jenen aus 9 verglichen werden. Die Zuckeranalyse zeigt quantitativ und qualitativ ähnliche Endprodukte und veranschaulicht, dass das HIC-Chromatographie-Verfahren Zucker entfernt, der nicht mit biologisch aktivem CM101 verwandt ist. Dieses Ergebnis ist auch in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3: Kohlenhydratzusammensetzung von CM101 (dargestellt als integrale Kohlenhydratverhältnisse)
Die oben gezeigte Tabelle der Zuckerreste gibt ungefähre Molverhältnisse an. Die tatsächlichen Reste des gemäß dem vorliegenden Verfahren gereinigten CM101 (erste Spalte) liegen im Bereich von (0,2–1 Mannose) : (2,5–3,5 Galactose) : (0,5–1 Glucose) : (1 N-Acetylglucosamin) : (0,5–1 Acetylgalactosamin). Die Zahlen sind auf N-Acetylglucosamin normiert; somit ist N-Acetylglucosamin auf 1 festgelegt.
Für einen weiteren Vergleich zeigen die 12a–b HPLC-Profile von CM101, hergestellt durch das alte Verfahren (12a) und gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung (12b). Die Gelfiltrationssäule (Ultragel 100, Waters, Milford, MA) wurde in 10 mM Phosphatpuffer, pH 8,4, entwickelt. Wie in 12b ersichtlich eluiert das gemäß dem Verfahren der Erfindung gereinigte CM101 in einem relativ schmalen Peak über einen Bereich von etwa 5 Minuten. Die Elutionszeit beträgt etwa 24 Minuten vom Zeitpunkt null bei einer Durchflussrate von 0,3 ml/min. Das durch das alte Verfahren gereinigte Material eluiert dahingegen in einem breiten Peak über einen Zeitbereich von etwa 12 Minuten.
Beispiel 3: Analyse von CM101 durch SDS-PAGE/Western-Blot
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde unter Verwendung eines 4–20%igen Gradientengels durchgeführt. CM101-Proben in einem Puffer von 2% SDS, 0,5 M Tris-HCl, 5% Glycerin, 0,05 Bromphenolblau und 5% β-Mercaptoethanol pH 0,8 wurden bei 55°C 10 Minuten lang inkubiert und in einem 4%igen Sammelgel auf das 4- bis 20%ige SDS-PAGE-Laufgel aufgetragen. Das Gel wurde bei 200 Volt 90 Minuten lang laufen gelassen.
Das Gel wurde in einem Western-Blotting-Puffer (25 μ Tris, 192 mM Glycin und 20% Methanol) entwickelt und bei 100 Volt 2 Stunden lang geblottet. Das Gel wurde mit 5%iger entrahmter Milch in PBS bei Raumtemperatur 1 Stunde lang blockiert und zweimal mit einem Bindungspuffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung, 2% fötales Rinderserum und 0,5% TWIN-20-Detergens (BBT)) gewaschen und anschließend 1 Stunde lang mit 10 μg/ml von 7A3 (monoklonaler Antikörper gegen CM101) inkubiert.
Das Gel wurde viermal 10 Minuten lang mit BBT inkubiert und 45 Minuten lang mit dem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti-Maus-Antikörper inkubiert, viermal mit BBT gewaschen und mit Pierce Single-Step AP Developer 50 Minuten lang entwickelt.
Die SDS-PAGE/Western-Blot-Analyse ließ darauf schließen, dass CM101 eine Komponente von 26.000 Dalton oder ein Vielfaches davon aufweist, wenn sie unter diesen Bedingungen analysiert wird.
Somit stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Reinigung bereit, das die Schwierigkeit gefährlicher Verfahrensschritte minimiert und ausgezeichnete Reinheit des Endprodukts bereitstellt. Darüber hinaus weist das mittels des hierin gelehrten Verfahrens hergestellte Produkt im Vergleich zu dem gegenwärtig erhältlichen CM101 verbesserte Eigenschaften auf.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen in dieser Beschreibung sind durch Verweis hierin so aufgenommen, als ob für jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angemerkt worden wäre, dass sie durch Verweis hierin aufgenommen sei.

Claims

Verfahren zur Reinigung eines Polysaccharid-Toxins von β-hämolytischen Streptokokken-Bakterien der Gruppe B (GBS-Bakterien), wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren eines das Toxin enthaltenden wässrigen Gemischs mit einem Hydrophobchromatographie-(HIC-)Harz und (b) Abtrennen des Toxins vom HIC-Harz.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reinheit des aus dem Schritt des Abtrennens des Toxins vom HIC-Harz resultierten Toxins in Bezug auf die Reinheit des Toxins im wässrigen Gemisch etwa um das 100- bis 500fache erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das weiters das Extrahieren des Toxins mit einem wässrigen Phenolgemisch umfasst, um eine wässrige Phase zu bilden, die das Toxin enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, das außerdem Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren des Toxins mit einem Ionenaustauschharz und (b) Abtrennen des Toxins vom Ionenaustauschharz.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin Schritt: (b) ein Schritt des Eluierens der HIC-Säule ist, um ein das Toxin enthaltendes HIC-Eluat zu erhalten, auf den Folgendes folgt: (c) Extrahieren des HIC-Eluats mit einer Kombination aus Phenol und einer wässrigen Lösung, um eine das Toxin enthaltende wässrige Phase zu bilden, (d) Aufgeben der wässrigen Phase auf eine Ionenaustauschsäule, (e) Eluieren der Ionenaustauschsäule, um ein Ionenaustauscheluat zu erhalten, wobei das Ionenaustauscheluat ein im Wesentlichen reines Toxin enthält.
Polysaccharid-Toxin von β-hämolytischen Streptokokken-Bakterien der Gruppe B (GBS-Bakterien), das durch ein Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche gereinigt wurde.
Toxin nach Anspruch 6, das außerdem ein durch Gelfiltrationschromatographie unter nichtdenaturierenden Bedingungen gemessenes Molekulargewicht von etwa 300.000 Dalton aufweist und Zuckerreste von Mannose, Galactose, Glucose, N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin in einem Molverhältnis von (0,2–1 Mannose) : (2,5–3,5 Galactose) : (0,5–1 Glucose) : (1 N-Acetylglucosamin) : (0,5–1 N-Acetylgalactosamin) umfasst.
Toxin nach Anspruch 6 oder 7 zur Verwendung in einem Therapieverfahren.
Toxin nach Anspruch 6, 7 oder 8 mit einer mittels eines Tests für erhöhten Lungenarteriendruck bei Schafen gemessenen spezifischen Aktivität, die etwa zwei- bis dreimal höher ist als die spezifische Aktivität von GBS-Toxin, das nicht mit einem HIC-Harz in Kontakt stand.
Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus Polysaccharid-Toxin von β-hämolytischen Streptococcus- Bakterien der Gruppe B (GBS-Bakterien) besteht, worin das Toxin zu zumindest 60% rein ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin das Toxin zu zumindest etwa 90% rein ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, worin das Toxin Zuckerreste von Mannose, Galactose, Glucose, N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin in einem Molverhältnis von (0,2–1 Mannose) : (2,5–3,5 Galactose) : (0,5–1 Glucose) (1 N-Acetylglucosamin) : (0,5–1 N-Acetylgalactosamin) enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, worin das Toxin ein durch Gelfiltrationschromatographie unter nichtdenaturierenden Bedingungen gemessenes Molekulargewicht von etwa 300.000 Dalton aufweist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin das Toxin bei HPLC-Messungen in einem 10%-Acetonitrilpuffer mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,3 ml/min bei einer Absorption von 203 nm als schmaler, symmetrischer Peak etwa 16 Minuten nach dem Zeitpunkt Null eluiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, worin das Toxin bei HPLC-Messungen in einem 10-mM-Phosphatpuffer, pH 8,4, bei einer Absorption von 203 nm als schmaler, symmetrischer Peak etwa 24 Minuten nach dem Zeitpunkt Null eluiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Polysaccharid-Toxin von β-hämolytischen Streptococcus-Bakterien der Gruppe B (GBS-Bakterien) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin das Toxin zu zumindest 60% rein ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung eines medizinischen Leidens, insbesondere eines Tumors, geeignet ist, wobei das Verfahren die Kombination einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 15 mit einem pharmazeutisch annehmbar Träger umfasst.