CH681011A5 - - Google Patents

Description

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CH 681 011 A5

Beschreibung

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper auf Pseudomonas aeruginosa (im folgenden bezeichnet als «P. aeruginosa» oder «PA»), dessen Herstellung und Verwendung sowie Hybridzellinien. Insbesondere betrifft sie einen humanen monoklonalen Antikörper, der eine bei Lipopolysacchariden in P. aeruginosa verschiedener Serotypen übliche Struktur erkennen kann, und eine Bindungsfähigkeit an P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen besitzt, sowie dessen Herstellung und Verwendung.

Der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung besitzt, wie vorstehend angegeben, eine Bindungsfähigkeit an P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen und auch an Lipid A von Gram-negativen Bakterien, insbesondere Bakterien, die zu Escherichia, Salmonella und Pseudomonas gehören, so dass er geeignet ist zur Verhinderung und Behandlung infektiöser Erkrankungen, die von P. aeruginosa verursacht werden, und auch von Endotoxin-Schock, der von Gram-negativen Bakterien verursacht wird.

Bakterien, die infektiöse Erkrankungen verursachen, i.e. prophlogistische Bakterien, variieren mit der Entwicklung und dem Wechsel von klinisch verwendeten Antibiotika. Als Ergebnis davon können infektiöse Erkrankungen durch Bakterien zunehmen, die ursprünglich nur eine geringe Pathogenität oder Virulenz besassen. P. aeruginosa sind derzeit eine der wesentlichen pathogenen Bakterien, die infektiöse Erkrankungen hervorrufen, deren emsthafte Symptome häufig zum Tode der Patienten führen, insbesondere dann, wenn deren immunologische Widerstandsfähigkeit aufgrund einer dauernden Verabreichung von Immunsuppressiva gering ist, nämlich Patienten, die an Krebs erkrankt sind oder Verbrennungen oder dergleichen haben.

Unter den präventiven und therapeutischen Methoden gegen bakterielle Infektionen ist die Chemotherapie unter Verwendung von Antibiotika oder antimikrobiellen Agenzien am bedeutendsten. Es wurden hierzu verschiedene Antibiotika entwickelt, einschliesslich Streptomycin, Kanamycin, Penicillin, Cephalosporin, etc., die gegen fast alle Gram-positiven Bakterien (z.B. Staphylococci) und Gram-negativen Bakterien (z.B. E.coli) wirken und einen überzeugenden klinischen Effekt hervorrufen. Es gibt jedoch nur wenige medizinische Produkte, die gegen P. aeruginosa wirksam sind. Auch diese medizinischen Produkte wirken auf P. aeruginosa nur bakteriostatisch und nicht bakteriozis. Sie können daher das Wachstum von P. aeruginosa verhindern, zeigen jedoch klinisch keinen bemerkenswerten therapeutischen Effekt.

Eine weitere präventive oder therapeutische Methode stellt die Antikörper-Therapie dar, die die Verabreichung von Immunglobulin umfasst. Dieses Verfahren wird oft in Kombination mit einer Chemotherapie durchgeführt; heute gilt es auch als ein Ersatz für die Chemotherapie. Ein Serum mit hohem Antikör-pertiter kann durch aktive Immunisierung von Tieren, wie Pferden oder Kaninchen, erhalten werden; die Antikörper-Therapie erfolgt unter Verabreichung von einem solchen Serum. Die damit zu erzielenden bedeutenden therapeutischen Wirkungen hat man an experimentellen Infektionen an verschiedenen Tieren bestätigt. Im Falle von Diphtherietoxin und Vipertoxin weiss man, dass die Antikörper-Therapie unter Verwendung von Seren, die von Tieren stammen, auch am Menschen äusserst wirksam ist. Die Einführung eines heterogenen Proteins, das von Tieren stammt, in einen menschlichen Körper führt jedoch zu einem ernsthaften Nebeneffekt, wie einer Anaphylaxe oder zu anderen allergischen Reaktionen. Es ist daher äusserst wünschenswert, ein menschliches Immunglobulin mit einem hohen Antikörpertiter gegen Bakterien zu entwickeln, das einen deutlichen therapeutischen Effekt gegen bakterielle Infektionen zeigt.

Konventionelle humane Immunglobulin-Präparationen gewinnt man durch Sammeln von Blut von gesunden Personen oder von Bakterien-infizierten Patienten, wobei das Blut einer Fraktionierung unterworfen wird, um eine Immunglobulinfraktion zu erhalten; diese Immunglobulinfraktion wird gereinigt und durch Zugabe von Ethylenglykol agglutinierendes Material entfernt; darauf folgt eine Behandlung mit Protease; Sulfonisierung; DEAE-Säulenchromatographie, etc., sowie die Formulierung des erhaltenen Produktes zu intramuskulär oder intravenös injizierbaren Präparationen. Diese Präparationen erweisen sich als geeignet, indem sie nicht zu einer Anaphylaxe oder einem anderen Nebeneffekt führen, wie man ihn bei der Verabreichung von Immunoglobin, das von Tieren stammt, beobachtet. Sie haben jedoch einige Nachteile. Einer der Nachteile ist, dass ihr Antikörpertiter gegen Bakterien so niedrig ist, dass eine ausreichende therapeutische Wirkung nicht notwendigerweise einsetzt. Ein weiterer Nachteil ist, dass es schwierig ist, sie in stabiler Form mit einem hohen Antikörpertiter in grossen Mengen zur Verfügung zu stellen, da sie durch das Sammeln von Blut von gesunden Personen oder von Bakterien-infizierten Patienten gewonnen werden, und das konstante und kontinuierliche Gewinnen von Seren mit einem hohen Antikörpertiter sehr schwer ist. Ein weiterer Nachteil ist, dass sie mit Hepatitisvirus (e.g. HB-Vi-rus), AduJt-T-Zellen-Leukämie-Virus (ATLV, HTLV), etc. kontaminiert sein können, da das Blut, das das Ausgangsmaterial darstellt, von einer Vielzahl unbekannter Personen erhalten wird. Um diese Nachteile zu überwinden, ist es in hohem Masse wünschenswert, einen humanen monoklonalen Antikörper mit einem stark inhibierenden Effekt auf Infektionen durch P. aeruginosa zur Verfügung zu stellen.

Wenn ein Antikörper an die Oberflächenschicht eines Bakterienkörpers gebunden wird, so beschleunigt sich die Phagocytose des Bakterienkörpers durch einen Makrophagen (i.e. es findet eine Beschleunigung der Phagocytose aufgrund von Opsonierung statt), oder es erfolgt eine Lyse des Bakterienkörpers durch ein Komplement. Als Target-Antigen auf der Oberflächenschicht des Bakterienkörpers P.

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aeruginosa kennt man Lipopolysaccharid (LPS), Hüllprotein, Flagellum, Pilus, etc. Unter diesen besitzt das O-Polysaccharid, das einen Bestandteil von LPS darstellt, und sich an der äussersten Seite der Oberfiächenschicht befindet und als »O-Antigen» bezeichnet wird, eine starke Antigenität, und der Antikörper, der dem O-Antigen entspricht, zeigt im allgemeinen eine stark präventive oder therapeutische Wirkung.

Das O-Antigen ist in seiner chemischen Struktur unterschiedlich, so dass die zu P. aeruginosa gehörenden Stämme aufgrund ihres Unterschiedes in der immunologischen Reaktionsfähigkeit mit einem AntiSerum oder einem Maus-monoklonalen Antikörper, die auf das O-Antigen des Standardstammes von P. aeruginosa hergestellt wurden, klassifiziert werden. Diese Klassifizierung bezeichnet man als Serotyp. Typische Beispiele der Serotyp-Rlassifizierung sind folgende: Typen 1 bis 17 gemäss der Klassifizierung durch Homma et al (Japan. J. Exp. Med., 44, 1, [1974]): Typen 1 bis 7 gemäss der Klassifizierung durch Fisher et al (J. Bacteriol., 98, 835 [1969]), Typen A bis M gemäss der Klassifizierung durch Nippon Ryo-kunoh-kin Kenkyukai Kesseigata-betsu Kento linkai (Committee of Study on Serotype Classification, Japanese Study Group on Pseudomonas aeruginosa [im folgenden als «Japanisches Komitee» bezeichnet] (Japan. J. Exp. Med., 45, 329 [1976]); Typen 1 bis 17 gemäss der Klassifizierung durch das International Antigenic Typing System (IATS), etc. Diese Klassifizierungen und ihre Querverbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt (Japan. J. Exp. Med., 46, 329 [1976]).

Tabelle 1 :

Serotyp-Klassifizierung von P. aeruginosa

Japanisches

Homma et al

IATS

Fisher et al

Komitee

1974

1983

1969

1976

A

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B

2,7,13,16

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K

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M

15,17

7,12,14,17

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P. aeruginosa O-Antigen hat eine Polymerstruktur, welche wiederkehrende Einheiten von zwei bis fünf Sacchariden umfasst; die Sequenz dieser wiederkehrenden Einheiten unterscheidet sich bei jedem Serotyp. Man weiss, dass ein Antikörper, der auf ein bestimmtes O-Antigen spezifisch ist, eine starke präventive oder therapeutische Wirkung gegen Infektionen von P. aeruginosa des Serotyps zeigt, zu dem das genannte O-Antigen gehört, jedoch keinen Effekt gegen P. aeruginosa eines beliebigen anderen Serotyps bewirkt. Es ist auch bekannt, dass man einen humanen monoklonalen Antikörper kontinuierlich durch Verwendung einer etablierten Zellinie, die in der Lage ist, einen spezifischen Antikörper zu bilden, herstellen kann.

Eine etablierte Zellinie, die in der Lage ist, einen auf das O-Antigen des Lipopolysaccharids von P. aeruginosa spezifischen humanen monoklonalen Antikörper zu produzieren, kann durch Anwendung eines EB (Epstein-Barr)-Virus-Transformationsverfahrens, einer Zellfusions-Methode und dergleichen erhalten werden. So offenbart z.B. JP-A1 61-69 796, dass die Transformation von Milz-Lymphozyten, die von Patienten erhalten wurden, die in der Vergangenheit mit P. aeruginosa infiziert worden waren, mit EB-Virus zu EB-Virus-transformierten Zellen führt, die einen auf das O-Antigen von P. aeruginosa spezifischen humanen monoklonalen Antikörper produzieren können. JP-A1 61-152 281 offenbart, dass die Stimulierung von Zellen den Mandeln, die von Patienten mit Tonsillitis erhalten wurden, mit (Poke-Weed-Mitogen (PWM) und Fusionierung der stimulierten Zellen von Mandeln mit Maus-Myelomzellen (P3-X63-Ag8-Ul-Stamm) zu Human-Maus-Hybridomen führt, die einen auf das O-Antigen von P. aeruginosa spezifischen humanen monoklonalen Antikörper produzieren können. Die vorstehend offenbarten humanen monoklonalen Antikörper sind jedoch auf Serotyp-spezifische humane monoklonale Anti3

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körper begrenzt, i.e. sie besitzen eine Bindungsfähigkeit an P. aeruginosa eines bestimmten Serotyps und zeigen kein Bindungsvermögen an P. aeruginosa anderer Serotypen.

Andererseits offenbart JP-A1 62-187 417 eine monoklonale-Antikörper-Kreuzbindung und ein Kreuz-Präventiv auf P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen, was auf eine Zelle zurückgeht, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der mit den Stämmen vom Typ 2,5 und 16 nach der lATS-Kiassifizie-rung sowie den Stämmen der Typen 3 und 7 nach der Fisher-Klassifizierung kreuzreagiert. Wie aus der vorstehenden Tabelle 1 hervorgeht, fallen alle diese Stämme unter Typ B nach der Klassifizierung des Japanischen Komitees. Somit ist der genannte monoklonale Antikörper immer noch spezifisch auf die Stämme eines einzelnen Serotyps. Der genannte monoklonale Antikörper zeigt somit nur eine Bindungsfähigkeit an weniger als 20% der klinisch isolierten Stämme; aus diesem Grunde ist für praktische Zwecke eine grosse Anzahl von Serotyp-spezifischen monoklonalen Antikörpern erforderlich.

Die von den Gram-negativen Bakterien verursachten infektiösen Erkrankungen führen zu Septik-ämie, wobei das Leben des Patienten häufig in Gefahr gerät. Typische Symptome der Septikämie sind Pyrexie, Steifheit, Organinsuffizienz, Schock, etc. Der septische Schock wird als «Endotoxin-Schock» bezeichnet und ist von LPS (Lipopolysaccharid) verursacht, das als Endotoxin bekannt ist; Endotoxin wird als Ergebnis von Wachstum und Absterben einer grossen Zahl Gram-negativer Bakterien und/oder dem Aufbrechen der genannten Bakterien aufgrund der Wirkung von verabreichten Antibiotika vom Bakterienkörper in den menschlichen Körper abgegeben. Die aktive Stelle, die den Endotoxin-Schock verursacht, ist bekannt und stellt Lipid A in LPS dar. Derzeit ist keine wirksame oder therapeutische Methode gegen Endotoxin-Schock verfügbar; die Mortalität aufgrund von Endotoxin-Schock beträgt etwa 50%. Aus diesem Grunde besteht ein starker Bedarf für die Entwicklung einer wirksamen präventiven oder therapeutischen Methode.

Ziegler et al haben wärme-sterilisierte E. coli J5 (Rc-Typ rauhe Mutante) als Vaccine an gesunde Personen zum Erhalt eines Antiserums verabreicht, das sich bei der Prävention von tödlichem Schock aufgrund von Bacterämie als wirksam erwies (New England j. Med., 207,125-1230 [1982]).

Daraufhin wurden verschiedene Tierversuche und klinische Versuche unternommen, und es zeigte sich, dass verschiedene Antiseren und monoklonale Antikörper, die spezifisch auf E. coli J5 oder das Kerngiykolipid der Gram-negativen Bakterien sind, sich bei der Verhinderung von Endotoxin-Schock als wirksam erweisen (WO 8 404 458; WO 8 501 659; EP-A 0 174 204; JÄ-A 61-130 300; Mutharia et al.: Inf. Immun., 45, 631-636 (1984); Teng et al: Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 82, 1790-1794 (1985); Giglioni & Shenep: J.lnf.Dis., 151,1005-1011 (1985); Braude et al: J. Inf. Dis. 136 (Erg.), 167-173 (1977); Nelles and Niswander: Inf. Immun., 46,677-681 (1984); Pollack et al: J. Clin. Invest., 72,1874-1881 (1983); Young et al: Clin. Res., 30,522A (1982); Young et al: Clin. Res., 32,518A (1984)).

Wie vorstehend angegeben ist, ist der auf O-Antigen von P. aeruginosa-Lipopolysaccharid bekannte spezifische Antikörper nur wirksam zur Verhinderung und Behandlung von Infektionen, die von P. aeruginosa des Serotyps verursacht sind, zu dem das genannte O-Antigen gehört; dieser Antikörper ergibt keinen präventiven oder therapeutischen Effekt bei Infektionen, die von P. aeruginosa eines anderen Serotyps verursacht sind. Dementsprechend ist es zur Prävention und Behandlung von Infektionen durch P. aeruginosa von beliebigem Serotyp erforderlich, mindestens 13 bis 17 Arten monoklonaler Antikörper, die gegen sämtliche Serotypen von P. aeruginosa spezifisch sind, zur Verfügung zu stellen. Zu diesem Zweck müssen Zellinien zur Verfügung gestellt werden, die humane monoklonale Antikörper produzieren, welche mindestens auf 13 bis 17 Arten von Serotypen spezifisch sind. Ausserdem ist die Kultivierung einer jeden Zellinie in grossem Massstab sowie die Reinigung des produzierten Antikörpers erforderlich; dies führt vom industriellen Standpunkt her zu grossen Problemen. Es ist deshalb wünschenswert, einen humanen monoklonalen Antikörper zu entwickeln, der nicht nur an einen Serotyp-Stamm von P. aeruginosa gebunden werden kann, sondern an eine Vielzahl oder an alle Serotyp-Stämme, um so einen präventiven oder therapeutischen Effekt gegen Infektionen, die von P. aeruginosa verschiedener Serotypen verursacht werden, zu ergeben.

Als Ergebnis einer umfangreichen Untersuchung zum Erhalt eines humanen monoklonalen Antikörpers, der bei der Prävention und Behandlung infektiöser Erkrankungen, die von P. aeruginosa verursacht werden, wirksam ist, und eines human-lmmunglobulins mit hohem Titer, welches denselben enthält, im industriellen Massstab, konnte man nun mit Erfolg aus humanen B-Lymphocyten eine Zellinie schaffen, die einen humanen monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch an die gemeinsame chemische Struktur von LPS in P. aeruginosa verschiedener Serotypen bindet. Durch Kultivierung einer derartigen Zellinie ist ein humaner monoklonaler Antikörper erhältlich, der auf zwei oder mehr Arten von LPS verschiedener Serotypen reagiert und einen präventiven oder therapeutischen Effekt gegen Infektionen durch P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen zeigt. Genauer ausgedrückt ist der monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung dadurch charakterisiert, dass er ein spezifisches Bindungsvermögen auf fast alle Stämme von P. aeruginosa, die zu den Typen A, F, G und M nach der Klassifizierung des Japanischen Komitees gehören, zeigt, und dadurch deutlich von üblichen monoklonalen Antikörpern, die nur auf einen Serotyp-Stamm spezifisch sind, wie auch von dem bekannten monoklonalen Antikörper, der zu Stämmen von Serotypen innerhalb einer Untergruppe nach der genannten Klassifizierung kreuzreagiert, wie dies in JP-A1 62-187 417 offenbart ist, unterschieden werden kann.

Dementsprechend ist es die grundlegende Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen humanen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der eine Antigen-spezifische Stelle, wie sie LPS von P. aeruginosa ei4

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gen ist, erkennt, insbesondere ein humaner monoklonaler Antikörper mit einer einzigen Antigen-Spezifität (monospezifischer Antikörper). Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine humane Zellinie zu schaffen, die in der Lage ist, den genannten humanen Antikörper kontinuierlich zu produzieren. Nach einer weiteren Aufgabe der Erfindung soll eine humane Immunglobulin-Präparation zur Verhinderung oder Behandlung von Infektionen durch P. aeruginosa zur Verfügung gestellt werden, welche den humanen Antikörper umfasst. Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung des genannten humanen Antikörpers durch in vitro oder in vivo Kultivierung der genannten humanen Zellinie. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Erhalt der genannten humanen Zellinie zur Verfügung zu stellen. Nach einer weiteren Aufgabe der Erfindung soll ein neuer Antikörper zur Verfügung gestellt werden, der die chemische Struktur, wie sie dem LPS in P. aeruginosa eigen ist, erkennt und mit dem Lipid A, das von Gram-negativen Bakterien stammt, wie P. aeruginosa, E. coli und S. typhimurium, kreuzreagiert. Diese und weitere Aufgaben gemäss der Erfindung ergeben sich für den Fachmann aufgrund der vorstehenden sowie nachfolgenden Beschreibung.

Der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung, der spezifisch ist auf die Antigen-deter-minierende Stelle, wie sie dem LPS in P. aeruginosa eigen ist, soll einen einzelnen humanen monoklonalen Antikörper darstellen, der die Antigen-determinierende Stelle, die dem LPS von P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen, z.B. den Typen A, G, F und M, eigen ist, erkennt und mit Lipid A in dem LPS, das von Gram-negativen Bakterien stammt, kreuzreagiert. Er kann von einem einzigen Antikörper-produzie-renden Clon hergestellt werden.

Der genannte humane monoklonale Antikörper hat ein Bindungsvermögen (Bindungsaktivität) zu Stämmen von P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen oder zu dem darauf vorkommenden LPS, i.e. eine Fähigkeit zur Beschleunigung einer bakterioziden Eigenschaft in Gegenwart eines Komplements, sowie einer Phagozytose durch ein Neutrophiles oder einen Makrophagen (Opsonierung), und kann infektiöse Erkrankungen durch P. aeruginosa verhindern oder behandeln. Die Epitope des genannten humanen monoklonalen Antikörpers liegen in dem LPS der Stämme vom Typ A, G, F und M vor, insbesondere an der Lipid A-Stelle und dem Polysaccharidteii in LPS.

Der hier verwendete Serotyp ist in Übereinstimmung mit der Klassifizierung nach dem Japanischen Komitee und wird bestimmt aufgrund des Unterschiedes in der immunochemischen Reaktion, und zwar unter Verwendung eines Antiserums oder eines Maus-monoklonalen Antikörpers, die spezifisch auf den Standardstamm von P. aeruginosa eines jeden Serotyps reagieren.

LPS bedeutet ein Lipopolysaccharid, das einen Bestandteil der Oberflächenschicht eines Gram-nega-tiven Bakterienkörpers darstellt, und ein Lipid (Lipid A) und einen daran gebundenen Kemteii umfasst, wobei der Kernteil 2-Keto-3-desoxyoctonsäure, Heptose, Phosphorsäure, etc. als Bestandteile umfasst, und eine Polysaccharid-Seitenkette an seinem Ende trägt, die als «O-Antigen» bezeichnet wird. Das O-Antigen hat eine polymere Struktur, die eine gerade Kette, bestehend aus 2 bis 5 Monosacchariden als wiederkehrende Einheit, umfasst. Die Zusammensetzung, Anordnung und Konfiguration der Saccharidkette ist unter den Serotypen verschieden; dieser Unterschied stellt die Basis für die Klassifizierung mit Serotypen dar.

Wie vorstehend angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung einen humanen monoklonalen Antikörper, der die übliche Antigen-spezifische Stelle in LPS von P. aeruginosa erkennt und mit Lipid A, das von Gram-negativen Bakterien stammt, kreuzreagiert.

Der humane monoklonale Antikörper, der mit dem von Gram-negativen Bakterien stammenden Lipid A kreuzreagiert, stellt einen einzelnen Antikörper vom human-Typ dar, der spezifisch Lipid A, das aus Gram-negativen Bakterien, wie E. coli, S. typhimurium und P. aeruginosa, isoliert und gereinigt wurde, erkennen kann. Da der humane monoklonale Antikörper ein Bindungsvermögen (Bindungsaktivität) spezifisch für Lipid A von Gram-negativen Bakterien, einschliesslich P. aeruginosa und eine neutralisierende Fähigkeit (neutralisierende Aktivität) im Hinblick auf die biologischen Aktivitäten, wie Mitogenaktivi-tät, tödliche Toxizität und Schwarzman-Reaktion, wie sie von Lipid A verursacht werden, neben der genannten Reaktivität auf die gemeinsame Antigen-spezifische Stelle in LPS von P. aeruginosa besitzt, eignet er sich als präventives oder therapeutisches Agens gegen Endotoxin-Schock, der von Gram-ne-gativen Bakterien verursacht wird.

Der humane monoklonale Antikörper kann auch eine Bindungsfähigkeit an LPS, das von E. coli oder S. typhimurium freigesetzt wird, oder an den LPS-Teil im Falle der exponierten Lipid A-Stelle, wie in einem an O-Antigen und Kern-Polysaccharid defizienten Stamm (e.g. Stamm vom tief rauhen Typ), aufweisen.

Lipid A besteht aus einem Glykolipidteil in LPS und kann aus LPS hergestellt werden durch Spaltung der Ketosid-Bindung in Ketodesoxyoctonsäure (KDO) mit Hilfe einer Säure. Es umfasst ein Skelett aus ß-(1-6)-Disaccharid-1,4'-diphosphorester und daran befindlichen Fettsäuren, wobei die Menge der Fettsäuren 4 Mol pro 1 Mol Lipid A beträgt. Die Art, Anzahl und Bindungsstelle der Fettsäuren variiert mit jedem Stamm.

Die humane Zellinie, die kontinuierlich den humanen monoklonalen Antikörper gemäss der Erfindung, der spezifisch mit der gemeinsamen Antigen-bestimmenden Stelle in LPS von P. aeruginosa reagiert und insbesondere mit Lipid A von Gram-negativen Bakterien kreuzreagiert, produzieren kann, kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden, wobei einige typische Beispiele nachstehend angegeben sind.

Bei dem ersten Verfahren werden humane B-Lymphocyten, die mit P. aeruginosa (lebende Bakterien

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oder mit Formalin oder durch Erhitzen abgetötete Bakterien), LPS, das von P. aeruginosa stammt, oder Gram-negativen Bakterien, die auf ihrer Oberfläche eine Lipid A-Struktur aufweisen (lebende Bakterien oder mit Formalin oder durch Erhitzen abgetötete Bakterien), vorzugsweise E. coli J5 oder S. typhimurium Rc-, Rd- oder Re-Mutanten, oder LPS oder Lipid A, die von diesen Stämmen stammen, sensibilisiert (immunisiert) wurden, in vivo oder in vitro mit EB (Epstein-Barr)-Virus durch Vermischen infiziert, wobei die genannten B-Lymphocyten zu solchen transformiert werden, die kontinuierlich proliferieren. Aus diesen transformierten Zellen (vor oder nach dem Cionieren) werden diejenigen selektiert, die einen Antikörper mit einer reaktionsfähigen Spezifität produzieren, und kontinuierlich in vitro gezüchtet, um Zelli-nien zu schaffen, die den genannten Antikörper kontinuierlich produzieren können. Die Selektion kann mit Hilfe von ELISA (Enzym-Immunosorbent-Bestimmung) unter Verwendung einer Auswahl von Bakterien zum Screenen erfolgen, wobei diese P. aeruginosa-Stämme 17 verschiedener Serotyp-Arten und E. coli 0-111 :B4 und J5 umfassen. Die Selektion kann auch mit Hilfe von ELISA unter Verwendung von LPS und Lipid A, die von P. aeruginosa, E. coli 0-111 :B4 und J5 und von S. typhimurium-Wildstamm und Ra- bis Re-Mutanten stammen, ais Antigen erfolgen.

Nach dem zweiten Verfahren werden humane B-Lymphocyten, die sensibilisiert sind mit P. aeruginosa (lebende Bakterien oder mit Formalin oder durch Erhitzen abgetötete Bakterien), LPS, das von P. aeruginosa stammt, oder Gram-negativen Bakterien, die auf ihrer Oberfläche eine Lipid A-Struktur aufweisen (lebende Bakterien oder mit Formalin oder durch Erhitzen abgetötete Bakterien), vorzugsweise E. coli J5 oder S. typhimurium Rc-, Rd- oder Re-Mutanten, oder LPS oder Lipid A, das von diesen Stämmen stammt, einer Zellfusion mit Myelomzellen oder B-Lymphobiastoidzellen zur Etablierung von Zellinien unterworfen, die in vitro kontinuierlich proliferieren können und kontinuierlich einen LPS-spezifischen Antikörper produzieren.

Nach dem dritten Verfahren werden die EB-Virus-transformierten Zellen, wie sie in dem ersten Verfahren erhalten wurden, einer Zellfusion mit Myelomzellen oder B-Lymphoblastoidzellen unterworfen, um eine Zellinie zu schaffen, die in vitro kontinuierlich gezüchtet werden kann, und dabei kontinuierlich einen LPS-spezifischen Antikörper produziert.

Die auf diese Weise hergestellten Zellinien können in vivo (e.g. nackte Maus) oder in vitro kultiviert werden, worauf das Sammeln und die Reinigung des in das Kulturmedium oder die Aszites-Flüssigkeit freigesetzten Antikörpers erfolgt, wobei man den Antikörper in einer grossen Menge erhält.

Die Herstellung des humanen monoklonalen Antikörpers gemäss der Erfindung umfasst die folgenden Schritte: (1) Herstellung von humanen B-Lymphocyten, die mit einem Antigen sensibilisiert sind; (2) Hersteilung von Zellinien, die einen monoklonalen spezifischen Antikörper produzieren, und zwar durch Im-mortalisieren der in (1) hergestellten Zellen; (3) Kultivieren der in (2) hergesteilten Zellinien; (4) Reinigung des spezifischen monoklonalen Antikörpers aus der Kultur, wie sie in (3) erhalten wird; und (5) Herstellung einer Immunglobulin-Präparation mit hohem Titer, welche den in (4) gereinigten spezifischen monoklonalen Antikörper umfasst. Jeder dieser Schritte wird im folgenden im Detail erläutert.

Schritt (1^:

Als humane B-Lymphocyten können humane Lymphocytenzellen verwendet werden, die einen Antikörper auf LPS von P. aeruginosa und Lipid A von Gram-negativen Bakterien produzieren, wobei die Lym-phocyten durch Zentrifugation unter Verwendung einer Lymphocyten-Trennflüssigkeit, wie Lympho-prep® oder Mono-Poly-Resolving Medium® (Flow Lab.) aus peripherem Blut abgetrennt werden. Es können auch B-Lymphocyten verwendet werden, die aus Geweben oder Organen (z.B. Lymphknoten, Milz), die für Diagnosezwecke oder zur Therapie der Erkrankungen extrahiert wurden, oder aus dem Blut der Nabelschnur oder dergleichen stammen. Es ist wünschenswert, dass diese Zellen von Personen stammen, die in der Vergangenheit mit P. aeruginosa infiziert wurden, so dass deren Zellen sensibilisiert sind. Geeignete Personen, von denen man diese Zellen erhält, kann man durch vorheriges Messen des Antikörpertiters ihrer Seren auswählen. Alternativ können humane B-Lymphocyten von beliebigen Personen, ungeachtet ihrer Krankengeschichte in der Vergangenheit, erhalten und mit inaktivierten P. aeruginosa, LPS, das von P. aeruginosa stammt oder Gram-negativen Bakterien, die eine Lipid A-Struktur auf ihrer Oberfläche aufweisen, vorzugsweise inaktivierte E. coli J5 oder S. typhimurium Rc-, Rd-oder Re-Mutanten, oder LPS oder Lipid A, das von solchen Gram-negativen Bakterien stammt, in vitro zur Sensibilisierung vermischt werden. Das heisst, sämtliche dieser Antigene, die inaktiviert sind, können zu B-Lymphocyten zugegeben werden. Ausserdem können Lösungen, die Lymphokine enthalten, wie B-Zellen-Proliferationsfaktoren und B-Zellen-Differenzierungsfaktoren (e.g. Pflanzenlektine, wie Poke-Weed-Mitogen (PWM), Komponenten des Bakterienkörpers, wie Cowan I, human-Lymphocyten-Mischkultur, eine Blutzellenkultur aus der Nabelschnur, Milz oder Thymus) zu den humanen B-Lym-phocyten zur in vitro-Sensibilisierung zugegeben werden; dann erfolgt die Proliferierung und Differenzierung unter Erhalt von Antikörper-produzierenden Zellen. Die auf diese Weise erhaltenen humanen B-Lymphocyten weisen ein Antikörper-Molekül auf der Zelloberfläche auf und können für begrenzte Zeit eine geringe Menge an Antikörper freisetzen; sie sind jedoch nicht unsterblich.

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Schritt (2):

Zur Umwandlung der vorstehenden sensibilisierten humanen B-Lymphocyten zu kontinuierlich proliferierenden unsterblichen Zellinien gibt es grundsätzlich zwei Verfahren, wobei das erste darin besteht, dass man B-Lymphocyten mit EB-Virus infiziert, und zwar durch Mischkultivierung der sensibilisierten humanen B-Lymphocyten mit EB-Virus, hergestellt aus Marmoset-Zellen B95-8, vorzugsweise unter Verwendung von 2 bis 10 TD50 Virus pro Zelle. Mikroplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 0,5 bis 3 x 104 Zellen pro Vertiefung inokuliert; die Kultivierung zur Transformation erfolgt unter Verwendung eines üblichen Mediums (e.g. RPMI1640, Eagle's MEM), welches Fötal-Rinderserum, Rinderserum, Pferdeserum oder Humanserum in einer Menge von 2 bis 20% (VA/) in Gegenwart von 5 bis 10% CO2 bei 32 bis 37°C enthält; die Kultivierung erfolgt über einen Zeitraum von 2 bis 5 Wochen; während dieser Zeit wird das Medium in Intervallen von 2 bis 4 Tagen zu jeweils der halben Menge ausgetauscht. Sofern dies erforderlich ist, können 1 bis 2 ng/ml Cyclosporin A und ein antibiotisches oder antimikrobielles Agens zur Verhinderung einer Mykoplasma-Kontaminierung zugegeben werden. Die auf diese Weise transformierten Zellen können in Form von Kolonien mit 20 bis 200 Zellen unter einem optischen Mikroskop 10 oder mehr Tage nach der Infektion beobachtet und ohne weiteres von den nichttransformierten Zellen unterschieden werden. Die Kultur, die transformierte Zellen enthält und in den Vertiefungen ausreichend proliferiert ist, wird einem Screenen auf Antikörpertiter mit Hilfe von ELISA unterworfen. Vertiefungen, in denen die Antikörperherstellung beobachtet wird, werden selektiert und die Spezifität auf LPS wird mit Hilfe der Western-Blotting-Methode bestätigt.

Daraufhin wird die Kultur, die den transformierten Zellhaufen enthält, wiederholt abgesaugt und mit einer Pipette aufgesaugt, um die Zellhaufen aufzubrechen, dann mit der Kulturlösung verdünnt, um eine geeignete Zellkonzentration einzustellen, und damit wird eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen mit 0,5 bis 100 Zellen pro Vertiefung zum Cionieren inokuliert (limitierende Verdünnungsmethode). Alternativ kann das Cionieren unter Verwendung von Agarose (e.g. Meeres-Plaque-Agarose) erfolgen. Die transformierten Zellen (ca. 7 x 104 bis 7 x 105) werden z.B. in eine Kulturschale (30 ml Durchmesser) mit 0,36 bis 0,4% (G/V) Agarose inokuliert und unter 5% CO2 bei 37°C kultiviert, um aus einer einzelnen Zelle eine Kolonie zu proliferieren. Beim Cionieren ist es wünschenswert, Bauchfellzellen der Maus, humane Blut-lymphocyten der Nabelschnur oder Röntgenstrahl-behandelte Milzzellen der Maus als Beschickungsschicht zu verwenden. Von den clonierten Zellinien werden diejenigen durch Bestimmung des Antikör-pertiters im Überstand der Kulturen der geclonten Zellinien selektiert, die eine hohe Produktivität des spezifischen Antikörpers zeigen, wobei die Bestimmung des Titers nach der ELISA-Methode unter Verwendung der Bakterienkörper von P. aeruginosa 17 verschiedener Serotypen und E. coli 0-111:B4 und J5 als das Festphasen-Antigen, und unter weiterer Verwendung von LPS und Lipid A, die von P. aeruginosa von 17 verschiedenen Serotypen, E. Coli 0-111 :B4 und J5, S. typhimurium Wildstamm, und Ra- bis Re-Mutanten stammen, als Festphasen-Antigen. Das vorstehend beschriebene Clonen und Selektieren wird nacheinander zwei- oder dreimal durchgeführt, um eine' transformierte Zellinie zu erhalten, die eine hohe Proliferationsrate besitzt und den spezifischen Antikörper in stabiler Weise und in grossen Mengen produziert.

Beim zweiten Verfahren unterwirft man die sensibilisierten humanen B-Lymphocyten und Myelomzellen einer Zellfusion in Gegenwart von Polyethylenglykol. Die verwendeten Myelomzellen sind Hypoxan-thin-guanin-phosphoribosyl-Transferase (HGPRT)-Mangelmutanten (z.B. P3X63-Ag 8 (P3), P3X63-Ag 8.653), die von Mausmyelomzellen abstammen, HGPRT-Mangelmutanten, die von der humanen Myelom-zelle U-266 abstammen, HGPRT-defiziente human-Maus-Heteromyelomzellen SHM-D33 etc. HGPRT-Mangelmutanten, die von humanen B-Lymphoblastoidzellen abstammen, können ebenfalls verwendet werden.

Als Polyethylenglykol (PEG) verwendet man z.B. PEG 1.000 bis 6.000 in einer Konzentration von 30 bis 50% (GA/). Die Fusionseffizienz kann durch Zugabe von Lectin, Poly-L-lysin, Dimethylsulfoxid etc. gesteigert werden.

Die Fusion kann z.B. in der gleichen Weise ausgeführt werden, wie dies in der Publikation von Kohler et al (Nature, 256, 495 [1975]) beschrieben ist, wobei Mauszellen miteinander fusioniert werden, um ein Hybridom zu erzeugen, das einen monoklonalen Antikörper der Maus produziert. Die sensibilisierten humanen B-Lymphocyten und HGPRT-defizienten Myelomzellen werden z.B. miteinander in Anteilen von 10 - 1:1, 30 bis 50% (GA/) vermischt. PEG 4.000 wird innerhalb 0,5 bis 1 Minute portionsweise zugegeben, und das erhaltene Gemisch ein bis 10 Minuten stehengelassen. Zu diesem Gemisch gibt man innerhalb von 5 bis 10 Minuten 9 bis 50 ml eines Kulturmediums, das kein Serum enthält; im weiteren wird Kulturmedium zugegeben, um eine Zellkonzentration von 105 bis 106/ml einzustellen. Eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wird mit der auf diese Weise erhaltenen Zellsuspension inokuliert, und zwar mit 2 x 104 bis 2 x 105 Zellen pro Vertiefung. Am folgenden Tag wird die halbe Menge durch ein Hypoxanthin-Aminopte-rin-Thymidin-haltiges Medium (HAT-Medium) oder ein Hypoxanthin-Azaserin-haitiges Medium (HAz-Medium) ersetzt; die Kultivierung erfolgt ca. 2 bis 3 Wochen lang unter 5% CO2 bei 32 bis 37°C; während dieser Zeit wird jeweils die halbe Menge des Kulturmediums in Intervallen von 3 Tagen ersetzt, wobei ein HAT-Medium ca. 10 bis 20 Tage und dann ein Hypoxanthin-Thymidin-haltiges Medium (HT-Me-dium) ca. 3 bis 5 Tage eingesetzt wird, um eine proliferierende Kolonie zu erhalten, i.e. ein Hybridom. Es ist auch möglich, ein Hybridom durch kombinierten Einsatz von Stoffwechselinhibitoren ohne Verwen-

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dung einer HGPRT-Mangelmutante zu selektieren. Der Antikörpertiter des Kulturmediums des Hybri-doms wird, wie vorstehend erwähnt, mit Hilfe der ELISA-Methode bestimmt; die Zellinie, die den spezifischen Antikörper mit der vorstehenden Reaktionsspezifität produziert, wird selektiert, und die Spezifität auf Polysaccharid wird mit Hilfe der Western-Blotting-Methode bestätigt. Man wiederholt das Clo-nieren mit Hilfe der limitierenden Verdünnungsmethode oder der Agarosemethode zwei- bis dreimal, um eine stabile Zellinie mit einer hohen Proliferationsrate und einer hohen Produktion des spezifischen Antikörpers zu erhalten.

In dem vorstehend genannten ersten Verfahren können EB-Virus-transformierte Zellen anstelle von sensibilisierten humanen B-Lymphocyten verwendet werden.

Die nach der EB-Virus-Transformationsmethode oder der Zellfusion (Hybridom)-Methode aus sensibilisierten humanen B-Lymphocyten erhaltenen Zellinien können kontinuierlich proliferiert werden und produzieren den spezifischen Antikörper in stabiler Weise und in grossen Mengen.

Schritt (3Ì:

Die auf diese Weise erhaltenen transformierten Zellen oder Hybridzellen (Hybridome) (0,5 bis 5 x 105 Zellen/ml) werden im stationären Zustand oder unter Rotation in einem üblichen Kulturmedium für tierische Zellen in einem Behälter, wie einem Inkubationskolben oder einer entsprechenden Platte, unter Verwendung eines C02-lnkubators bei 32 bis 37°C unter 2 bis 10% CO2 inkubiert. Insbesondere dann, wenn die Inkubation in grossem Massstab erfolgt, können ein Kolbeninkubator, ein Hohlfasersystem oder dergleichen, wie sie für tierische Zellen geeignet sind, verwendet werden. Das übliche Kulturmedium kann z.B. ein Medium darstellen, das 2 bis 20% Serum von Rinderfötus, Kalb, Rind, Pferd, dem Menschen etc. (e.g. RPMI1640, Eagle's MEM) enthält, oder es kann ein Serum-freies Medium darstellen, welches die für die Proliferation der Zellen erforderlichen Spurenkomponenten enthält (e.g. Insulin, Transferrin, Ethanolamin, Selenit, Rinderalbumin, Lipid) oder dergleichen.

Schritt (4):

Die Reinigung des Antikörpers kann nach konventionellen biochemischen Verfahren erfolgen (e.g. Fraktionierung durch Ammoniumsulfat-Fällung, Fraktionierung durch Ethanol-Fällung, PEG-Fraktionie-rung, lonenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration, Affinitäts-Chromatographie, Hochgeschwindig-keits-Flüssigkeitschromptographie, Elektrophorese). Beim Reinigungsverfahren ist darauf zu achten, dass eine Agglutinierung oder eine Senkung der Antikörperaktivität vermieden wird. Zu diesem Zweck kann human Serumalbumin (HSA) in einer Menge von 0,05 bis 2% zugegeben werden. Manchmal ist es bevorzugt, Aminosäuren, die Glycin oder alpha-Alanin, insbesondere basische Aminosäuren, wie Lysin, Arginin oder Histidin, Saccharide, wie Glucose oder Mannit,.Salze, wie Natriumchlorid etc., zuzugeben. Es kann zu einer Agglutination kommen, insbesondere im Falle eines IgM-Antikörpers. Zur Verhinderung einer solchen Agglutination eignet sich eine Behandlung mit ß-Propiolacton, Essigsäureanhydrid oder dergleichen. In einem solchen Fall ist die intravenöse Verabreichung möglich.

Schritt (5):

Der gereinigte monoklonale Antikörper kann nach einem an sich bekannten konventionellen Verfahren zu einer biologischen Präparation formuliert werden; diese Verfahren umfassen z.B. das Filtrieren durch ein Membranfilter zum Entfernen von Bakterien, das Abfüllen in sterilisierte Ampullen mit einem Stabilisator und Gefriertrocknen.

Die Präparation des humanen monoklonalen Antikörpers gemäss der Erfindung kann aus nur einer Art von humanem monoklonalem Antikörper auf LPS von P. aeruginosa zur Verwendung als präventives oder therapeutisches Agens gegen Infektionen durch P. aeruginosa bestehen. Bevorzugt umfasst die Präparation ausserdem mindestens eine Art von humanem monoklonalen Antikörper, der eine Anti-gen-bestimmende Stelle erkennt, die sich in ihrer Molekularstruktur von LPS von P. aeruginosa unterscheidet, und/oder mindestens eine Art eines konventioneilen humanen Antikörpers, der Exotoxine, Exo-enzyme (e.g. Elastase, Protease), Hüllproteine und Endotoxine erkennt. Die Präparation kann auch jeden beliebigen humanen Antikörper auf ein von P. aeruginosa verschiedenes Bakterium, eines Virus, Fungi, Protozoen, Krebszellen etc. enthalten. Ausserdem kann der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung in eine konventionelle humane Immunglobulin-Präparation inkorporiert werden, um eine Immunglobulin-Präparation auf LPS mit hohem Titer zu bilden.

Der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung gehört zur Klasse IgG oder IgM, ist jedoch nicht auf dieselben beschränkt. Der humane monoklonale Antikörper besitzt ein Bindungsvermögen (Bindungsaktivität) zu P. aeruginosa von zwei oder mehr Arten von Serotypen, weist in Gegenwart eines Komplements eine bakteriozide Aktivität auf (Komplement-bakteriozide Aktivität) und besitzt die Eigenschaft zur Beschleunigung der Phagocytose von Neutrophilen und Makrophagen auf P. aeruginosa (Opsonierung). Experimentelle Infektionen an Mäusen mit P. aeruginosa von zwei oder mehr Arten von Serotypen können durch Verabreichung eines einzelnen humanen monoklonalen Antikörpers gemäss der Erfindung behandelt werden.

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Der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung besitzt eine spezifische Bindungsfähigkeit an die Bakterienkörper von P. aeruginosa IID1001 (ATCC 27577), IID1006 (ATCC 27582), IID1020 und IID1015 unter den Standardstämmen zur Serotyp-Klassifizierung von P. aeruginosa. Ausserdem weist er ein Bindungsvermögen an Lipid A von Gram-negativen Bakterien auf; die biologische Aktivität, wie die letale Aktivität oder Schwartzman-Reaktion, können dadurch neutralisiert werden.

Der humane monoklonale Antikörper kann an Lipopolysaccharide von E. coli Rc-Mutante J5 (ATCC 39355), S. minnesota rauher Typ Rc-, Rd- und Re-Mutanten und P. aeruginosa IID1001 (ATCC 27577) binden, jedoch nicht an Lipopolysaccharide von E. coli glatter Typ Stamm 0-111 :B4; S. minnesota glatter Typ Wildstamm, rauher Typ Ra- und Rb-Mutanten und P. aeruginosa IID1002 (ATCC 27578) und PA 103.

Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, unterscheidet sich der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung von bekannten Serotyp-spezifischen monoklonalen Antikörpern und bekannten Serotyp-Untergruppen-kreuzreagierenden monoklonalen Antikörpern. Da er an P. aeruginosa von zwei oder mehr verschiedenen Serotypen bindet, kann P. aeruginosa aller oder fast aller Serotypen mit einer geringeren Anzahl monoklonaler Antikörper, einschliesslich demselben, erfasst werden. Der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung ist daher vom Gesichtspunkt der Prävention und Therapie von P. aeruginosa-lnfektionen äusserst wertvoll. Ausserdem eignet er sich zur Prävention und Behandlung von Endotoxin-Schock, gegen den es zur Zeit kein wirksames Mittel gibt.

Die Epitope, die von dem humanen monoklonalen Antikörper gemäss der Erfindung erkannt werden, sind die Lipid A-Stelle und die Polysaccharid-Stelle in LPS. Die zu erkennde Polysaccharid-Stelle ist in bestimmten Serotyp-Stämmen, i.e. Typen A, F, G und M, auf eine limitiert. Es wird deshalb angenommen, dass eine Struktur, die die Lipid A-Stelle und die Polysaccharid-Stelle gemeinsam haben, vorliegt.

Zur Prävention und Therapie infektiöser Erkrankungen durch P. aeruginosa, gemischten Infektionen durch Bakterien, die P. aeruginosa enthalten, und von Endotoxin-Schock, der durch Gram-negative Bakterien verursacht wird, kann eine Präparation von human-lmmunglobulin, die einen humanen monoklonalen Antikörper umfasst, an erwachsene Patienten in einer Menge von ca. 1 bis 10 g jeweils im Falle eines ernsthaften Symptoms oder in einer Menge von ca. 0,2 bis 5 g jeweils im Falle eines nicht-ernst-haften Symptoms oder zu Präventivzwecken verabreicht werden. Der Gehalt an humanem monoklonalem Antikörper gemäss der Erfindung in der Präparation von human-lmmunglobulin beträgt gewöhnlich 0,5 bis 500 mg, vorzugsweise ca. 5 bis 50 mg.

Wie vorstehend angegeben, besitzt der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung einen hohen Antikörpertiter auf dessen Antigen und zeigt einen ausgezeichneten therapeutischen Effekt bei experimentellen Infektionen von Mäusen. Da er ein Protin menschlichen Ursprungs darstellt, kommt es nicht zu irgendwelchen Nebeneffekten (z.B. Anaphylaxe), wie dies bei der Verabreichung eines heterogenen Proteins beobachtet wird. Da er von einer bestimmten spezifischen Zellinie produziert wird, ist die Möglichkeit einer Kontaminierung durch unbekannte Biorisiken im Vergleich zu konventionellen Immunglobulinen, die aus menschlichem Blut einer Anzahl unbekannter Personen hergestellt werden, weit geringer.

Der humane monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung wird in stabiler Weise und in einer grossen Menge mit einem hohen Antikörpertiter produziert; sein Herstellungsverfahren ist dem konventioneller Herstellungsverfahren unter Verwendung von menschlichem Blut im Hinblick auf eine leichte Qualitätskontrolle überlegen.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, die jedoch die Erfindung nicht beschränken sollen.

Beispiel 1

Herstellung von humanen monoklonalen Antikörper-produzierenden Zellinien durch die EB-Virus-Transformations-Methode:

(1) Herstellung der EB-Virus-Lösuna und Bestimmung des Virustiters derselben

EB-Virus-produzierende und freisetzende Marmoset-Zellen B95-8 wurden in einem RPMI1640-Me-dium suspendiert, welches 10% Fötal-Kälberserum (FCS) bei einer Konzentration von 6,5 x 105 Zellen/ml enthielt, und unter stationären Bedingungen in einem Kulturkolben T-75 (Corning Nummer 25110) bei 37°C in 5% C02-Atmosphäre 4 Tage lang inkubiert. Der Kulturüberstand wurde gesammelt und mit Hilfe einer Low-Speed-Zentrifuge (RS-20BH; Tommy Précision Ind. Co., Ltd.) bei 2 000 UpM 10 Minuten lang zentri-fugiert. Der Überstand wurde durch ein 0,45 n Membranfilter (Millex SLHA 0250S) filtriert. Das Filtrat wurde in Serumgläser (MS-4505; Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) gegeben und bei -80°C gelagert. Bei Verwendung des Inhalts, der für Experimente zur Transformation humaner Lymphocyten mit EB-Virus diente, wurde entsprechend verdünnt.

Der Virustiter der EB-Virus-Lösung wurde nach der Methode von Moss et ai (J. General Virology, 17, 233 [1972]) unter Verwendung von peripheren Biutlymphocyten (PBL) als Indikatorzellen bestimmt. D.h., eine Suspension von humanen peripheren Biutlymphocyten (106 Zellen/ml) in RPMI1640-Medium, welches 15% FCS enthielt, wurde in die Vertiefungen einer Mikroplatte (96 Vertiefungen) (Sumitomo Bakelite) gegeben, und zwar 100 (il/Vertiefung. In jede Vertiefung wurde die EB-Virus-Lösung (20 p.l) in

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zehnfachen Serienverdünnungen (im Bereich von 10° bis 107) mit dem vorstehenden Medium gegeben; die Inkubation erfolgte bei 37°C in 5% C02-Atmosphäre. Alle drei Tage wurde ein Drittel des Mediumvolumens erneuert; nach drei Wochen wurde die Anwesenheit transformierter Zellen mit Hilfe des optischen Mikroskops geprüft. Die Bestimmung erfolgte an 6 Vertiefungen pro Verdünnung; dabei wurde die Transformationsrate bestimmt. Die höchste Verdünnung, die für eine Transformation von 50% der Zellen erforderlich war, wurde stochastisch aus der Transformationsrate einer jeden Verdünnung nach der Methode von Reed und Muench bestimmt; die darin enthaltene Virusmenge wurde berechnet und galt als ITD50, woraus die Virusmenge in der ursprünglichen Probe zurückgerechnet und mit Hilfe der TDso-Zahl bezeichnet wurde. Die EB-Virus-Lösung mit einer Virusmenge von 105 bis 107 TDso/ml wurde auf diese Weise erhalten.

(2) Bestimmung des Anti-P. aeruoinosa-Antiköroertiters nach der ELISA-Methode

Der Antikörpertiter gegen P. aeruginosa-Oberflächenantigen wurde wie folgt gemessen. P. aeruginosa wurde in einer Phosphatpufferlösung (PBS) (pH 7,2; welche NaCI (8 g/l), KCl (0,2 g/l), NaHP04.12H2Ü (2,99 g/l) und KH2PO4 (0,2 g/l) enthielt) suspendiert bis zu einer Extinktion von 0,2 bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Suspension wurde in die Vertiefungen von Mikroplatten (Falcon Nummer 3912) (96 Vertiefungen) gegeben, und zwar in einer Menge von 50 [il/Vertiefung; daraufhin wurde 15 Minuten bei 2 000 UpM zentrifugiert. Es wurde 2%iger Glutaraldehyd zu jeder Vertiefung in einer Menge von 50 jil/Vertiefung gegeben, um den Bakterienkörper an die Mikroplatten zu fixieren. Nach Entfernung der Bakterienlösung aus den Mikroplaten wurde eine 3%ige PBS-Lösung, die Rinder-serumalbumin (BSA) enthielt, auf die Mikroplatte gegeben, und zwar in einer Menge von 120 nl/Vertiefung, und es wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert, um den nicht-gebundenen Teil der Assay-Platte zu blockieren. Die erhaltene Mikroplatte wurde als Antigen-beschichtete Platte beim folgenden Verfahrensschritt verwendet. Sofern dies gewünscht wurde, erfolgte die Lagerung dieser Mikroplatte bei -20°C.

Vor dem Assay wurde die Mikroplatte mit 0,05% Tween 20, welches PBS-Lösung (PBST) enthielt, dreimal gewaschen. 1%iges BSA, welches PBST enthielt, wurde in einer Menge von 50 nl/Vertiefung zugegeben; daraufhin erfolgte Zugabe einer Probe (Serum, Ascites, oder Kulturüberstand), gegebenenfalls verdünnt mit 1%igem BSA, welches PBST enthielt, und zwar in einer Menge von 50 |il/Vertiefung; dann wurde 2 h bei 37°C inkubiert. Die Probe wurde von der Platte entfernt, die mit PBST dreimal gewaschen wurde. Daraufhin wurde zur zweistündigen Inkubierung bei 37°C Phosphatase-markierter, durch Affinitätschromatographie gereinigter Anti-human-lmmunglobulin-Antikörper (Kirkegaard & Perry Lab. Inc.) (zweiter Antikörper), verdünnt mit 1%igem BSA, welches PBS-Lösung enthielt, in 500- bis 1000fachem Überschuss zu der Mikroplatte zugegeben, und zwar 100 jil/Vertiefung. Zur Messung des IgG-Antikör-pertiters und des IgM-Antikörpertiters wurden jeweils Phosphatase-markierter Anti-human-lgG-Anti-körper und Phosphatase-markierter Anti-human-lgM-Antikörper verwendet. Nach Entfernung des zweiten Antikörpers wurde die Mikroplatte dreimal mit PBST gewaschen, und Substratiösung, i.e. eine wässrige Lösung von p-Nitrophenylphosphorsäure-dinatriumsalz (3 mg) in 10% Diethanolamin-Puffer (pH 9,1; 1 ml), welcher NaN3 (0,2 mg/i ml) und MgCl2.6H20 (0,1 mg/ml) enthielt, auf die Mikroplatte gegeben, und zwar 100 (il/Vertiefung; daraufhin erfolgte die Umsetzung bei 37°C. Nach 45 Minuten wurden 3 N NaOH zugegeben, und zwar 20 nl/Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Die Bindungsaktivität des Antikörpers (OD405) wurde an Muitiskan® (Titertek) gemessen.

(3) Herstellung von Lvmphocvten aus humanem peripherem Blut

Humanes peripheres Blut (100 ml) mit einem hohen Antikörpertiter auf P. aeruginosa mehrerer Serotypen wurde gesammelt. Mono-Poly-Resolving-Medium® (15 ml; Flow Lab.) wurde in ein Zentrifugenglas gegeben (50 ml Volumen; Sumitomo Bakelite); das vorstehende humane periphere Blut (20 ml) wurde langsam zugegossen und dann mit einer Zentrifuge niedriger Geschwindigkeit (BS-20BH, Tommy Précision Ind.) bei 2500 UpM (Rotor-TS-7) 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, wodurch die roten Blutzellen und Lymphocyten getrennt wurden. Der Anteil, der die Lymphocyten enthielt, wurde gesammelt und mit 10% FCS, welches RPMI1640-Medium enthielt (im folgenden als «Medium» bezeichnet), zweimal gewaschen, und dann einer Berechnung unterzogen, wobei 1,2 x 108 Lymphocyten erhalten wurden.

(4) Herstellung von Anti-P. aeruainosa-LPS-Antiköroer-produzierenden Zellinien nach der EB-Virus-Transformationsmethode

Humane periphere Biutlymphocyten (2 x 107) wurden in dem Medium (2 ml) suspendiert, und EB-Virus-Lösung (10 ml; Virusmenge: 107 TDso/ml) zugegeben und dann 2 h bei 37°C in 5%iger C02-Atmosphäre inkubiert.

Die EB-Virus-infizierten humanen Lymphocyten wurden in einem Dulbecco-Modified-Eagle-Minimum-Essential-Medium (im folgenden als «Medium zur Herstellung der Zellinie» bezeichnet) suspendiert, welches 15% FCS, 10% NCTC109 Gewebekulturmedium, Penicillin (100 IE/ml), Streptomycin (100 ng/ml), Argi-

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nin (0,2 mg/ml), Oxalessigsäure (0,15 mg/ml), Natriumpyruvat (0,05 mg/ml) und Rinder-Insulin (0,2 E/ml) umfasste, wobei die Zellkonzentration ca. 2 x 105 Zellen/ml betrug; die Suspension wurde in eine Kulturplatte mit 24 Vertiefungen, die zuvor mit suspendierten peritonealen Mauszellen belegt worden war (ca. 1 x 105 Zellen/Vertiefung) gegeben, und zwar in einer Menge von 0,5 ml/Vertiefung. Die Lymphocyten wurden bei 37°C in 100% Feuchtigkeit und 5% C02-Atmosphäre kultiviert; die Hälfte des Mediums wurde alle drei Tage durch frisches Medium zur Herstellung von Zellinien ersetzt, und zwar beginnend eine Woche nach dem Start der Inkubation. Nach ca. einem Monat wurden die Zellen gesammelt und für die Zellfusion verwendet.

(5) Zeilfusion mit EB-Virus-transformierten Zellen

Maus BALB/C-Myelomzellen, die von der MOPC-21 -Linie abstammen und HGPRT-defizient sind (P3X63-Ag8.653; ATCC CRL 1580) wurden in dem Medium zur Herstellung von Zellinien subkultiviert; 1 x 107 Zellen davon wurden dreimal mit einem Eagle-Minimum-Essential-Medium gewaschen. Die EB-Virus-transformierten Zellen (2 x 10? Zellen), die in (4) erhalten wurden, wurden mit einem Eagle-Minimum-Essential-Medium dreimal gewaschen, mit Myelomzellen (1 x 107 Zellen) in einem Zentrifugenröhrchen (Corning Nummer 25330) vermischt und 7 Minuten bei 400 x g zentrifugiert. Zu dem erhaltenen Pellet wurde innerhalb einer Minute, während des Rotierens des Zentrifugengläschens und Rührens mit einer Pipette, PEG 4000 (1 ml; 45% PBS-Lösung, Merck) zugegeben; daraufhin wurde das Ganze 1 Minute bei Raumtemperatur stehengelassen. Ein Eagle-Minimum-Essential-Medium (9 ml) wurde in 5 Minuten zur Verdünnung zugegeben und die erhaltene Verdünnung 1 h bei 37°C gehalten. Das durch Zentrifugation erhaltene Pellet wurde in dem Medium zur Herstellung der Zellinie (100 ml) suspendiert und in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon Nummer 3040) gegeben, und zwar 1 x 10+ Myelomzellen/Vertiefung. Gleichzeitig wurden Maus-BALB/C-Milzzellen als Beschickungszellen zugegeben, und zwar 3 x 104 Zellen/Vertiefung; dann wurde bei 37°C in 5%iger CC>2-Atmosphäre inkubiert. Jeweils nach 2 oder 3 Tagen wurde das halbe Volumen des Mediums durch ein Selektionsmedium ersetzt. Nach 2wöchiger Zellfusion wurden die Überstände in den Vertiefungen, in denen eine Proliferierung beobachtet wurde, im Hinblick auf die Produktion von Antikörpern auf P. aeruginosa verschiedener Serotypen mit Hilfe der ELISA-Methode untersucht. Die fusionierten Zellen (Hybridome) in der Vertiefung, die einen verhältnismässig hohen Antikörpertiter zeigten, wurden gesammelt und einer weiteren Kultivierung durch Clonierung mit Hilfe der limitierenden Verdünnungsmethode unterworfen. Nach ca. zwei Wochen wurde die Anwesenheit von Antikörpern auf die gemeinsame Antigen-bestimmende Stelle und die Bindung an P. aeruginosa mehrerer Serotypen mit Hilfe der ELISA-Methode am Kulturüberstand des Clons bestätigt. Der Clon wurde unter Verwendung einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen (MS-30240; Sumitomo Bakelite), einem T-25-Kulturkolben Nummer 25100; Corning) und einem T-75-Kulturkolben Nummer 25110; Corning) in jeweils grösserem Massstab kultiviert. Dieser Clon wurde als «Hybridom FKF-1F3» bezeichnet und am 23. Dezemer 1987 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-9784 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, in Tsukuba, Ibaraki-ken/Japan, hinterlegt. Der humane monoklonale Antikörper FKF-1F3 stellt ein IgM (n, k) dar.

Beispiel 2

Analyse des Antigens, das vom Antikörper FKF-1 F3 erkannt wird:

(1) Herstellung von LPS von P. aeruginosa

Die Herstellung von LPS von P. aeruginosa erfolgte auf die gleiche Weise, wie nach der Methode von Westphal et al («Methods in Carbohydrate Chemistry», Academic Press, N.Y., Band S, S. 83-91 [1965]). D.h.: der feuchte Bakterienkörper (4g) wurde mit 45%igem Phenol, das auf 65 bis 68°C erwärmt worden war, behandelt, unter 10°C abgekühlt und 15 Minuten bei 3.000 UpM zentrifugiert, wodurch LPS als wässrige Schicht extrahiert wurde. Die wässrige Schicht wurde zur Eliminierung von Phenol gegen Wasser dialysiert und unter reduziertem Druck unter Bildung von LPS-Miceilen konzentriert, die zur Gewinnung von LPS ultra-zentrifugiert wurden. Als Ergebnis wurden jeweils 2 mg LPS vom Typ A Standardstamm IID1001, Typ E Stamm PA103 und Typ G Standardstamm IID1020 erhalten. Der verwendete Bakterienkörper von P. aeruginosa wurde von der Hinterlegungsstelle des Medicai Science Research Institute, Tokyo Universität, Japan, erhalten. Er ist auch von der American Type Culture Collection (ATCC) in den Vereinigten Staaten erhältlich.

(2) Analyse des Antigens mit Hilfe der Western-Blottino-Methode

LPS der Typen A und E von P. aeruginosa wurden einer Elektrophorese an Desoxycholsäure (DOC)/Poiyacrylamidgel nach der Methode von Komuro et al (Zusammenfassung der Berichte für das 33. Symposium über Toxine in Osaka, S. 94-99 [1986]) unterworfen; das Gel wurde in Transferpuffer (25mM tris-192mM-Glycine, pH 8,3; 20% (VA') Methanol) bei 4°C über Nacht eingetaucht und auf Durali

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pore®-Membran (Millipore) bei Raumtemperatur transferiert. Dann folgte Inkubation mit einer 2% Ka-sein-haltigen PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 1 h, um eine Blockierung zu bewirken. Im weiteren wurde eine Inkubation mit einer 0,1%igen BSA-Lösung und einer 10% FCS-haitigen TBS-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Auf der erhaltenen blockierenden Durapore®-Membran wurden wässrige Lösungen des FKF-1 F3-Kulturüberstandes und des humanen monoklonalen Antikörpers HI-006 (IgM), der spezifisch das Typ E O-Antigen erkennt, als Kontrolle 1 h bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Durapore® Membran wurde mit 0,05% Tween 20-haltiger TBS-Lösung (pH 8,0) fünfmal gewaschen und mit dem zweiten Antikörper (Peroxidase-markierter Anti-human-lmmunglobulin-Anti-körper, verdünnt mit 1% BSA und 0,05% Tween 20-haltiger PBS im 3.000fachen Überschuss) 1 h bei 37°C inkubiert. In gleicher Weise wurde fünfmal mit 0,05% Tween 20-haltigem PBS (pH 8,0) gewaschen; mit einem Farbagens (PBS, welches 0,5 mg/ml Chlornaphthol, 20% Methanol und 0,08% H2O2 enthielt, pH 7,5) wurde angefärbt. Als Ergebnis wurde in der Elektrophoresebahn von P. aeruginosa Typ A LPS eine Gruppe hintereinanderliegender Banden aufgrund der Reaktion mit dem Antikörper FKF-1 F3 beobachtet, während in der Elektrophoresebahn von P. aeruginosa Typ E LPS keine Reaktion stattfand. Im Falle von HI-006 als Kontrolle wurden die hintereinanderliegenden Banden in der Elektrophoresebahn vom Typ E LPS beobachtet, während in keiner anderen Bahn eine Färbung festgestellt wurde.

Beispiel 3

Untersuchung des Bindungsspektrums des Antikörpers FKF-1 F3 durch die ELISA-Methode: (1) Bindunasvermöaen des Antikörpers FKF-1 F3 an die Standard-Serotvo-Stämme von P. aeruginosa

Auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) wurde mit Hilfe der ELISA-Methode das Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an die Standard-Serotyp-Stämme von P. aeruginosa untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Die verwendeten Stämme wurden von der Hinterlegungsstelle des Medicai Science Research Institute, Tokyo University, Japan, erhalten und in Herz-Infusions-Agar-Me-dium oder einem Herz-Infusions-Nährflüssigkeits-Medium kultiviert.

Tabelle 2:

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1 F3 an die Standard-Perotyp-Stämme von P. aeruginosa nach der Klassifizierung des Japanischen Komitees

Serotyp

Stamm

Bindungsaktivität (OD405)*

A

HD 1001

0,6

B

HD 1002

0

B

HD 1007

0

B

HD 1013

0

B

HD 5004

0

C

HD 1021

0

D

HD 1004

0

E

HD 1130

0

F

HD 1006

0,4

G

HD 1020

0,4

H

HD 1009

0

I

HD 1010

0

J

HD 1011

0

K

HD 1012

0

L

HD 5141

0

M

HD 5018

0,1

M

HD 1015

0,3

Anmerkung: * Extinktion nach Anfärbung gemäss der ELISA-Methode (45 Minuten).

Es zeigte sich somit, dass der Anitkörper FKF-1 F3 ein auf die Typen A, F, G und M spezifisches Bindungsvermögen besitzt.

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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(2) Bindunasvermöaen des Antikörpers FKF-1 F3 an klinisch isolierte Stämme

Das Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an die Typen A und G, die klinisch mit hoher Häufigkeit isoliert wurden, wurde untersucht. Zur Untersuchung dienten 19 klinische Isolate vom Typ A und 19 klinische Isolate vom Typ G. Es zeigte sich, dass der Antikörper von 14 klinischen Isolaten vom Typ A (74%) und 10 klinischen Isolaten vom Typ G (53%) gebunden wurde; dies ist in Tabellen 3 und 4 wiedergegeben.

Tabelle 3

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1 F3 an 19 klinische Isolate vom Serotyp A

Stamm Bindungsaktivität (OD405)*

SP6745

0,8

SP6746

1,6

SP6783

1,2

SP6818

2,5

SP6830

0,6

SP6840

2,4

SP6708a

1,2

SP9710

2,0

SP9711

1,6

SP9731

0,1

SP9762

0,1

SP9763

0,1

SP9768

1,6

SP9780

2,1

SP10029

1,4

SP10040

0,2

SP10060

0,6

SP10618

1,7

SP10676

0,2

Anmerkung: * Extinktion nach Anfärben gemäss der ELISA-Methode (nach 45 Minuten).

13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 681 011 A5

Tabelle 4

Bindungsaktivrtät des Antikörpers FKF-1 F3 an 19 klinische Isolate vom Serotyp G

Stamm

Bindungsaktivität (OD405)*

SP9704

1.7

SP9709

1,6

SP9712

0,1

SP9714

1,4

SP9717

0

SP9718

0,8

SP9738

0,7

SP9785

1.1

SP9743

1.8

SP9792

0,1

SP9755

0,1

SP9761

0

SP9767

1.8

SP9772

0

GN11187

0

TL2378

1,7

TL2424

0

SP6788

1,3

SP9728a

0,3

Anmerkung: * Extinktion nach Anfärben gemäss der ELISA-Methode (nach 45 Minuten).

Es wurde auch die Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1 F3 an klinische Isolate von P. aeruginosa Serotyp M, der häufig chronische broncho-oesophageale Infektionen verursacht, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt, wobei zu ersehen ist, dass die Bindungsaktivität weitgehend vom Ursprung der Stämme abhängig ist und der genannte Antikörper an die untersuchten Stämme zu 10 bis 99% gebunden wird.

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 681 011 A5

Tabelle 5

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1 F3 an klinische Isolate vom Serotyp M

Stamm

Ort der Isolierung und/oder Jahr

Bindungsaktivität (OD405)

SP9716

0,1

SP9730

0,1

SP9744

0,1

SP9748

Tokyo

0,4

SP9749

0,1

SP9752

1984

0,1

SP9775

0

SP10067

1,1

SP10675

0,1

SP6763

1,0

SP6764

0,9

SP6765

0,9

SP6782

1,2

SP6794

Kyoto

1,0

Gn5833

0,6

TL6852

1984

1.1

TL6890

0,1

SP6892

1,1

SP6895

0,8

SP6908

0,8

Anmerkung: ** Extinktion nach Anfärben gemäss der ELISA-Methode (nach 45 Minuten).

Beispiel 4

Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an E. coli J5:

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) wurde die Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1 F3 an E. coli Rc-Typ Mutante J5 (ATCC 39355) nach der ELISA-Methode untersucht. Der J5-Stamm wurde in einem Herz-Infusions-Agar-Medium inkubiert. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 6 hervor und zeigen, dass der Antikörper FKF-1 F3 stark an P. aeruginosa HD 1001 (Serotyp A) als positive Kontrolle und schwach an E. coli J5 bindet.

Tabelle 6

Stamm

Bindungsaktivität (OD405)

E. coli J5

0,3

P. aeruginosa HD 1001

0,6

(-)

0

Beispiel 5

Untersuchung der Bindungsspezifität durch ein kompetitives System:

Da bestätigt werden konnte, dass der Antikörper FRF-1F3 an die Bakterienkörper von P. aeruginosa HD 1001 (Serotyp A) und P. aeruginosa HD 1002 (Serotyp B) bindet, wurde die Bindungsspezifität durch ein kompetitives System untersucht, i.e. in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (2) nach der ELISA-Methode unter Verwendung einer Bakterienplatte. Als kompetitive Substanz dienten LPS (jeweils 50 ng/ml) von P. aeruginosa HD 1001 (Serotyp A), P. aeruginosa HD 1002 (Serotyp B), P. aeruginosa 103 (Serotyp E), P. aeruginosa HD 1020 (Serotyp G), E. Coli 0-111:B4 und J5. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben.

15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

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Tabelle 7

Antigenplatte

Ursprung derkompetitiven Substanz (LPS)

Bindungsaktivität (OD405)

PA HD 1001-Stamm

PA HD 1010

0,6

PA HD 1002

2,4

PA PA 103

2,4

PA HD 1020

1,9

EC0-111:B4

2,5

ECJ5

2,1

H

2,3

PA HD 1020-Stamm

PA HD 1001

0,2

PA HD 1002

1,0

PA PA 103

0,9

PA HD 1020

0,7

EC 0-111 :B4

1,0

ECJ5

0,8

H

0,9

In den Bakterienkörper-Platten von P. aeruginosa HD 1001 und HD 1020 inhibierte das von HD 1001 stammende LPS die Bindung des Antikörpers FKF-1 F3 stark; das von HD 1020 stammende LPS zeigte eine schwache Inhibierungsaktivität. Andere LPS ergaben keine oder nur eine sehr schwache Aktivität.

Beispiel 6

Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an LPS, das von P. aeruginosa stammt:

Von P. aeruginosa stammendes LPS (1 ng/ml), Phosphatidylcholin (5 jig/ml), Cholesterin (2,5 ng/ml) wurden in Ethanol aufgelöst; die erhaltene Lösung wurde auf eine Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, und zwar 10 nl/Vertiefung; darauf wurde das Ganze 2 h bei 37°C zum Trocknen stehengelassen. 3%ige BSA-PBS-Lösung (100 p.l) wurde zugegeben; die Reaktion zum Blockieren wurde 2 h lang bei Raumtemperatur ausgeführt, wobei eine Antigenplatte unter Verwendung von LPS als Antigen (Kannagi et al: «Application of Immunological Methods in Biomedicai Science», Blackwell Scientific, Oxford, Seiten 117.1-117.20 [1986]) erhalten wurde.

Die ELISA-Methode wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) unter Verwendung von 0,5% BSA-PBS anstelle von PBST durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8

Ursprung von LPS

Serotyp

Bindungsaktivität (OD405)

P. aeruginosa A HD 1001

A

0,7

P. aeruginosa A HD 1002

B

0,1

P. aeruginosa PA01822

B

0,1

P. aeruginosa PA 103

E

0,2

P. aeruginosa HD 1020

G

0,3

Der Antikörper FKF-1 F3 wurde stark an das von P. aeruginosa HD 1001 (Serotyp A) stammende LPS gebunden; an das von P. aeruginosa HD 1020 (Serotyp G) stammende LPS erfolgte nur eine schwache Bindung.

Beispiel 7

Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an LPS und Lipid A, welche von Salmonella stammen: Das Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an eine Reihe von LPS, die von Salmonella minnesota stammen, wurde durch kompetitive Reaktion mit Hilfe der ELISA-Methode untersucht. Der Antikörper FKF-1 F3 wurde mit LPS, das von S. minnesota stammt, und Lipid A (hoch gereinigte LPS-Kits; List Biological Laboratories, Inc.) als kompetitive Substanzen in Konzentrationen von 2,5/nM und 25 p.M vermischt und dann 1 h bei 37°C inkubiert. ELISA wurde unter Verwendung einer Platte mit 96 Vertiefun16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 681 011 A5

gen durchgeführt, wobei der Bakterienkörper von P.aeruginosa HD 1001 auf die Piatte zur Bestimmung der Inhibierungsrate fixiert wurde. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 9 hervor und zeigen, dass der Antikörper FKF-1 F3 eine starkes Bindungsvermögen an Lipid A und LPS (rauher Typ Rc, Rd und Re) besitzt.

Tabelle 9

LPS-Chemotyp

Bindungsaktivität (OD405)

0,25 nM

25 jxM

LPS Wildtyp

0,24

0,29

Ra

0,27

0,25

Rb

0,24

0,22

Rc

0,22

0,07

Rd

0,17

0,04

Re

0,03

0

Lipid A

0,12

0,2

H

0,26

0,26

Anmerkung: Die Bindungsaktivität ist diejenige nach Abzug des Kontrollwertes (0,14).

Beispiel 8

Bindungsvermögen von FKF-1 F3 an Lipid A von Gram-negativen Bakterien:

Die Untersuchung wurde unter Verwendung von Lipid A, das von E. coli stammt, Lipid A, das von S. typhimurium Re-Mutante stammt (Ribi Immunochem. Research Inc., Hamilton, MT), und Lipid A, das von S. minnesota R595 stammt (List Biological Laboratories Inc.) auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 nach der ELISA-Methode durchgeführt. LPS und Lipid A, die von P. aeruginosa HD 1001 stammen, wurden wie folgt hergestellt: Methode nach Westphal et al, wobei die wasserlösliche Fraktion, die durch Extraktion mit 45% heissem Phenol erhalten wurde, mit Cetylmethylammoniumbromid («Cetavlon»; Nakarai Chemical) zur Eliminierung von Nucleinsäure behandelt wurde: das Ethanolpräzipitat diente als LPS-Specimen (Methods Carbohydr. Chem., 5, 83-91 [1965]): LPS wurde mit 1%iger Essigsäure 90 Minuten bei 100°C hydrolysiert; der Chloroformextrakt diente als ein Lipid A-Specimen (Eur. J. Biochem., 52, 331-343 [1975]).

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 wurde ein ELISA durchgeführt unter Verwendung einer mit Lipid A von S. minnesota R595 beschichteten Platte und unter Verwendung von Lipid A als kompetitive Substanz (50 ng/ml). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt, woraus hervorgeht, dass der Antikörper FKF-1 F3 ein Bindungsvermögen auf Lipid A, welches von verschiedenen Gram-negativen Bakterien stammt, besitzt.

Tabelle 10

Lipid A Bindungsaktivität (QD405)

P. aeruginosa HD 1001 0,25 E. coli J5 0,18 S. thyphimurium Re-Mutante 0,16 S. minnesota R595 0,18 _H W

Beispiel 9

Bindungsvermögen des Antikörpers FRF-1F3 an LPS, das von P. aeruginosa stammt:

Das Bindungsvermögen an LPS, weches von P. aeruginosa HD 1001 stammt, wurde mit dem von LPS von E. coli und S. minnesota verglichen. ELISA wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 ausgeführt, wobei eine mit Lipid A von S. minnesota R595 beschichtete Platte verwendet wurde und intaktes LPS und Lipid A, welche von P. aeruginosa HD 1001 stammen (siehe Beispiel 8) und LPS vom glatten Typ und Lipid A von E. coli und S. minnesota als kompetitive Stubstanzen (50 ng/ml) dienten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 wiedergegeben und zeigen, dass der Antikörper an Lipid A, das von einem beliebigen Mikroorganismus stammt, und LPS vom glatten Typ, welches allein von P. aeruginosa stammt, bindet. Der Grund, warum das Bindungsvermögen an LPS vom glatten Typ nicht festgestellt wurde, liegt wahrscheinlich an

17

CH 681 011 A5

einer Mycellen-Bildung durch LPS in wässriger Lösung, wodurch die Lipid A-Komponente auf dem Poly-saccharid-Teil durch sterische Hinderung nicht exponiert ist. im Falle von P. aeruginosa kann zusätzlich zu Lipid A jede Antikörper-Bindungsstelle vorliegen.

5

Tabellen

Kompetitive Substanz

Bindungsaktivität (OD405)

P. aeruginosa HD 1001

LPS

0,16

10

P. aeruginosa I11001

Lipid A

0,24

E. coli 0-111:B4

LPS

1,02

E. coli J5

LPS

0,18

S. minnesota Wildlyp

LPS

1,07

15

S. minnesota R595

Lipid A

0,20

(-)

1,12

Beispiel 10

20

Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an Chitin:

Teng et al gelang die Herstellung von humanem monoklonalen Antikörper

(IgM) auf LPS von E. coli J5 (Proc. Nati. Acad. Sei., USA 82, 1970-1974 [1985). In diesem Artikel ist angegeben, dass der Antikörper ein Bindungsvermögen auf Chitin (N-Acetylglucosamin-Homopolymer) 25 besitzt.

In diesem Beispiel wurde das Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1 F3 an Chitin mit Hilfe der ELISA-Methode unter Verwendung einer mit Lipid A von S. minnesota R595 beschichteten Platte sowie mit Chitin-Pulver aus Krebsschalen (Nakarai Chemical) als kompetitive Substanz auf die gleiche Weise untersucht wie in Beispiel 8. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst und zeigen, dass keine 30 Kreuzreaktion zwischen Antikörper FKF-1 F3 und Chitin beobachtet werden kann. Somit unterscheidet sich der Antikörper FKF-1 F3 in seinem Epitop von dem Antikörper auf LPS, das von E. coli J5 stammt.

Tabelle 12

Kompetitive Substanz

Dosis (ng)

Bindungsaktivität (OD405)

Chitin

5

1,05

10

1,01

Lipid A, weiches von

5

0,33

S. minnesota R595 stammt

10

0,18

H

-

1,07

Beispiel 11

45

Trennung des Poiysaccharidteils von LPS und Analyse des Antigens:

rn Trennung des Polvsaccharidteils von LPS. welches von P. aeruginosa IIP 1001 stammt

50 Nach der Methode von Wilkinson et al (Eur. J. Biochem., 52, 331 [1975]) wurde der Polysaccharidteil von LPS, welches von P. aeruginosa HD 1001 stammt, abgetrennt. Es wurde so verfahren: LPS (10 mg) wurde in 1%iger Essigsäure aufgelöst und 90 Minuten bei 100°C hydrolysiert. Das freigesetzte Lipid A wurde durch Fraktionierung mit Chloroform eliminiert. Die erhaltene wasserlösliche Fraktion wurde einer Säulenchromatographie (Säulengrösse: 1 x 70 cm) unter Verwendung von Dextran («Sephadex G50»;

55 Pharmacia, Uppsala), equilibriert mit 50 mM Pyridin-Acetat-Puffer (pH 5,5) zur Fraktionierung unterworfen. Mit Hilfe der Spektralfotometrie wurden die Positionen bestimmt, bei denen das Polysaccharid, das Kernoligosaccharid vom semi-rauhen Typ und das Kernoligosaccharid vom rauhen Typ eluiert wurden. Das neutrale Saccharid wurde mit Hilfe der Phenol-Schwefelsäure-Methode nachgewiesen (Dubois et al, Anal. Chem., 28, 350 [1956]): das Aminosaccharid wurde mit 2N Schwefelsäure 2 h bei

60 100°C hydrolysiert und dann mit der MBTH (3-MethyI-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid)-Me-thode (Tsuji et al, Chem. Pharm. Bull., 17, 217 [1969]) nachgewiesen. Die Fraktionen des Polysaccharids, des Kernoligosaccharids vom semi-rauhen Typ und das Kernoligosaccharid vom rauhen Typ wurden nach dem Gefriergetrocknen erhalten.

65

18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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(2) Bindunasvermöaen des Antikörpers FKF-1 F3 an die Polvsaccharidfraktion

Mit Hilfe der ELISA-Methode wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 die Kompetition des Antikörpers FKF-1 F3 mit dem Polysaccharid, dem Kernoligosaccharid vom semi-rauhen Typ und dem Kernoligosaccharid vom rauhen Typ, die von P. aeruginosa HD 1001 stammen; und in Beispiel 11 (1) erhalten wurden, untersucht. Die Menge der verwendeten kompetitiven Substanz war diejenige, die 20 nMol des neutralen Saccharids gemäss der Phenol-Schwefelsäure-Methode, wie sie in Beispiel 11 (1) genannt wird, entsprach. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 aufgeführt.

Tabelle 13

Kompetitive Substanz

Bindungsaktivität (OD405)

Polysaccharid

0,04

Kernoligosaccharid vom semi-rauhen Typ

0,42

Kernoligosaccharid vom rauhen Typ

0,39

(-)

0,39

Aus den vorstehenden Ergebnissen und dem Western-Blotting in Beispiel 2 (1) kann gefolgert werden, dass das von dem Antikörper FKF-1 F3 erkannte Epitop im Falle bestimmter Stämme von P. aeruginosa zusätzlich zu Lipid A im Polysaccharidteil vorliegt.

Beispiel 12

Therapeutische Wirkung des Antikörpers FKF-1 F3 auf experimentelle Infektionen mit P. aeruginosa in Mäusen:

(1) Therapeutische Wirkung auf Infektionen durch P. aeruginosa /Serotvp G)

ICR-sIc-Mäuse (4 Wochen alt; männlich; 10 Tiere pro Gruppe) wurden intraperitoneal mit 1,2 x 104 oder 6,2 x 104 Zellen von klinischem P. aeruginosa-lsolat SP6788 (Serotyp G) inokuliert. Nach 1 h wurde der Antikörper FKF-1 F3 (0,1 ng) intraperitoneal verabreicht. Die Beurteilung des therapeutischen Effektes erfolgte auf Basis der Überlebensrate nach einer Woche. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 aufgeführt, und zeigen, dass in der behandelten Gruppe alle Tiere überlebten, und dass der Antikörper FKF-1 F3 wirksam ist zur Behandlung von Infektionen durch P„ aeruginosa (Serotyp G).

Tabelle 14

Antikörper Dosis Überlebensrate (%)

(inokulierte Menge, CFU pro Maus)

1,2x104 6,4 x104

FKF-1 F3 0,1 ng/Maus 100 100

Keine - 20 20

(2) Therapeutischer Effekt auf Infektionen durch P. aeruginosa (Serotvp A)

ICR-sIc-Mäuse (5% Mutin) (4 Wochen alt; männlich; 10 Tiere pro Gruppe) wurden intraperitoneal mit

3,7 x 104, 1,5 x 105 oder 7,3 x 105 Zellen von klinischem P. aeruginosa-lsolat SP6788 (Serotyp A) inoku liert. Nach 1 h wurde der Antikörper FKF-1 F3 (0,1 ng) intraperitoneal verabreicht. Die Beurteilung der therapeutischen Wirkung erfolgte auf Basis der Überlebensrate nach einer Woche. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 aufgeführt und zeigen, dass in der behandelten Gruppe die Überlebensrate signifikant ist, selbst wenn die inokulierte Menge bis zu 1,5 x 105 Zellen beträgt. Der Antikörper FKF-1 F3 ist wirksam zur Behandlung von Infektionen durch P. aeruginosa (Serotyp A).

19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

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Tabelle 15

Antikörper

Dosis

Überlebensrate {%)

inokulierte Menge, CFU pro Maus)

3,7 x 104 1,5x 105 7,3 x105

FKF-1 F3

0,1 (ig/Maus

100 80 0

BSA

2 ng/Maus

80 20 10

physiolog. Kochsalzlösung

-

50 10 0

Claims (16)

Patentansprüche

1. Humaner monoklonaler Antikörper, der spezifisch an O-Polysaccharide von Stämmen von Pseudomonas aeruginosa, welche nach der Klassifizierung des Japanischen Komitees in zwei oder mehrere verschiedene Serotypen unterteilt sind, und auch an Lipid A, welches von Gram-negativen Bakterien stammt, bindet.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Serotypen ausgewählt sind aus den Typen A, F, G und M.

3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gram-negativen Bakterien ausgewählt sind aus Escherichia, Salmonella und Pseudomonas.

4. Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass dieser auf Lipid A, das von einer Escherichia coli Rc Mutante stammt, reagiert.

5. Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieser auf Lipid A, das von Escherichia coli Rc Mutante J5 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 39355 stammt, reagiert.

6. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass dieser IgM darstellt.

7. Präventives oder therapeutisches Mittel gegen bakterielle Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass dieses eine wirksame Menge des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als Wirkstoff umfasst.

8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die bakteriellen Infektionen durch Bakterien verursacht werden, die Gram-negative Bakterien umfassen.

9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die bakteriellen Infektionen von Bakterien verursacht werden, die Pseudomonas aeruginosa umfassen.

10. Präventives oder therapeutisches Mittel gegen von Gram-negativen Bakterien verursachten Endotoxin-Schock, dadurch gekennzeichnet, dass dieses eine wirksame Menge des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als Wirkstoff umfasst.

11. Mit Epstein-Barr-Virus transformierte Zellinie zur Herstellung von Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass diese in der Lage ist, den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zu produzieren.

12. Hybridom aus einer Zellfusion eines Human-B-Lymphozyten, der eine mit Epstein-Barr-Virus transformierte Zelle umfasst, mit einer Myelomzelle zur Herstellung von Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Hybridom in der Lage ist, den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zu produzieren.

13. Hybridom FKF-1 F3 nach Anspruch 12 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-9784.

14. Verfahren zur Herstellung eines humanen monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellinie nach einem der Ansprüche 11 bis 13 als Zellkultur züchtet und aus dem Kulturüberstand den gebildeten Antikörper gewinnt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellinie das Hybridom FKF-1 F3 nach Anspruch 13 ist.

16. Humaner monoklonaler Antikörper FKF-1 F3, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 15.

20