FR2626473A1 - Anticorps monoclonal humain contre pseudomonas aeruginosa sa production et son application - Google Patents

Abstract

Anticorps monoclonal humain ayant une propriété de liaison avec les lipopolysaccharides des souches de Pseudomonas aeruginosa classées dans les sérotypes A, F, G et M selon la classification de la Commission Japonaise et également une propriété de liaison avec le lipide A des bactéries Gram-négatives comme Escherichi, Salmonella et Pseudomonas qui est efficace dans la prévention et le traitement des infections provoquées par les bactéries comprenant Pseudomonas aeruginosaet du choc endotoxinique provoqué par les bactéries Gram-négatives; préparation d'un tel anticorps; lignées cellulaires sécrétant cet anticorps.

Description

* -'1 La présente invention concerne un anticorps

monoclonal humain contre Pseudomonas aeruginosa (appe-

lé ci-dessous "P.aeruginosa" ou "PA"), et sa production et son utilisation. Plus particulièrement, elle concerne un anticorps monoclonal humain, qui peut reconnaître une structure commune aux lipopolysaccharides dans P. aeruginosa de différents sérot-ypes, et présente une propriété de liaison à P. aeruginosa de deux ou plusieurs

sérotypes,'sa production et utilisation.-

lu L'anticorps monoclonal humain présente, comme il est dit ci-dessus, une propriété de liaison à P. aeruginosa de deux ou plusieurs sérotypes et également au lipide A des bactéries Gram-négatives, en particulier aux bactéries appartenant aux genres Escherichia, Salmonella et Pseudomonas, si bien qu'il est utile pour la prévention ou le traitement des maladies infectieuses provoquées par P. aeruginosa et également pour les chocs

d'endotoxine provoqués par les bactéries Gram négatives.

Les bactéries provoquant des maladies infec-

2u tieuses, c'est-a-dire les bactéries prophlogistiques, varient avec le développement et les modifications des antibiotiques utilisés en clinique. Il s'ensuit que

des maladies infectieuses. bactéries n'ayant origi-

nellement qu'une faible pathogéniclté ou virulence

peuvent augmenter. Ainsi, P. aeruqinosa est actuel-

lement l'une des principales bactéries pathogènes

provoquant des maladies infectieuses, dont les gra-

ves sympt8mes ménent souvent à la mort des malades,.

en particulier lorsque leurs défenses immunologiques sont

fiables à la suite d'une administration continue d'immu-

nosuppresseurs, lorsqu'ils souffrent.de-cancer ou de

brûlure, etc..

Parmi les divers procédés preventifs ou théra-

peutiques pour les.infections bactériennes, le plus

courant est la chimiothérapie par utilisation d'anti-

biotiques ou d'agents antimicrobiens. En fait, on a

mis au point divers antibiotiques, y compris la strep-

tomycine, la kanamycine, la pénicilline, la céphalo-

sporine, etc, qui sont actifs à l'égard de presque toutes les bactéries Gram-positives (p. ex. les staphylocoques)

et les bactéries Gram-negatives (p. ex. E. coli) et pro-

duisent un effet clinique important. Cependant, on ne connaît que peu de médicaments auxquels est sensible P. aeruginosa. Même les médicaments agissent sur P. aeruginosa seulement de façon bactériostatique et non bactêr cide. Ainsi, ils-peuvent prévenir la croissance de P. aeruginosa mais ne présentent cliniquement aucun

effet thérapeutique remarquable.

L'autre procédé préventif ou thérapeutique

est le traitement aux anticorps comprenant l'adminis-

tration d'immunoglobuline. Ce procédé est souvent réa-

lisé en association avec la chimiothérapie et attire

aujourd'hui de plus an plus l'attention comme substi-

tut de la chimiothérapie. On peut obtenir un sérum

à haut titre d'anticorps par immunisation active d'ani-

maux comme les chevaux ou les lapins, et l'on peut

effectuer le traitement aux anticorps par administra-

tion d'un-tel sérum. En fait son remarquable effet thérapeutique a été mis en évidence sur des infections expérimentales en utilisant divers animaux. On sait, 1l d'après les cas de la toxine de la diphtérie et de la toxine de la vipère que le traitement aux anticorps utilisant des sera provenant d'animaux est tout à fait efficace même sur les êtres humains. Cependant, l'introduction d'une protéine étrangère, d'origine animale,

dans un corps humain provoque de graves effets secon-

daires comme une anaphylaxie ou d'autres réaction aller-

giques. Il est ainsi très souhaitable de mettre au point

une immunoglobuline humaine ayant- un haut titre d'anti-

corps contre les bactéries et présentant un effet thêra-

peutique marqué sur les infections bactériennes.

On prépare les préparations d'immunoglobuli-

ne humaine classiques en recueillant du sang auprès de personnes en bonne santé ou de malades infectés

par des bactéries, en soumettant le sang a un frac-

tionnement pour obtenir une fraction d'immunoglobuli-

ne, en purifiant la fraction d'immunoglobuline et en en éliminant les matières agglutinantes par addition

d'éthylèneglycol, traitement avec des protéases, sulfoni-

sation, chromatographie sur des colonnes du type DEAE, etc, suivie par une formulation du produit résultant en -4 préparations injectables par voie intramusculaire ou intraveineuse. Ces préparations sont intéressantes en ce qu'elles ne provoquent pas d'anaphylaxie ni d'autres. effets.secondaires que ceux qui sont observes avec l'administration d'immunoglobuline provenant d'ani- maux, mais elles ont certains inconvénients. L'un de ces inconvénients est que leur titre d'anticorps contre les bactéries est si faible qu'on peut ne pas nécessairement produire un effet thérapeutique

lu suffisant. Un autre inconvénient est qu'il est diffi-

cile de les fournir de manière reproductible avectun haut titre d'anticorps en grande quantité-, car on les

prépare en utilisant le sang recueilli auprès des per-

apr, sonnes en bonne santé ou des malades infectes par des bactéries et l'obtention de sera ayant de façon constante et uniforme un haut titre en anticorps est très difficile; Un autre inconvénient est qu'elles peuvent

être contaminées par les virus de l'hépatite (p. bx.

le virus EB), le virus de la leucémie des cellules T Adultes (ATLV, HTLV), etc, car le sang utilisé comme

produit de départ est obtenu chez de nombreuses person-

nes inconnues. Pour surmonter ces inconvénients, la production d'un anticorps monoclonal humain ayant un fort effet d'inhibition sur les infections à

P. aeruqginosa est très souhaitable.

Lorsqu'un anticorps est lié à la couche superficielle d'un-corps bactérien, la phagocytose d'un macrophage sur le corps bactérien est accélérée

(c'est l'accélération de la phagocytose due à l'op-

sonisation), ou bien il se produit une lyse de corps bactérien par le complément. Comme- antigène

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cible à la surface du corps bactérien de P.aeruginosa, on connaît les lipopolysaccharides (LPS), les protéines d'enveloppe, les flagelles, les pili, etc. Parmi eux, le 0-polysaccharide qui est un constituant des LPS situé à la partie la plus extérieure de la cou- che superficielle et appelé 'antigène 0X a une forte

antigénicité, et l'anticorps correspondant à l'anti-

gène O présente généralement un effet préventif ou

thérapeutique élevé.

lu L'antigène O est diversifié dans sa structure chimique si bien que les souches appartenant à P. aeruginosa sont classées d'après la différence de réactivité immunologique avec un antisérum ou un anticorps monoclonal de souris préparé contre l'antigène O de la souche de référence de P.

aeruginosa. Cette classification est connue comme séro-

typique, et on peut citer comme exemples de cette classification sérotypique: les types 1 à 17 selon la classification de Homma et coll. (Japan. J. Exp. Med., 44, 1 (1974); les types 1 à 7 selon la classification

de Fisher et coll. J. Bacteriol. 98, 835 (1969); les ty-

pes A à M selon la classification de Nippon Ryokunoh-

kin Kenkyukai Kesseigata-betsu Kento inkal Commission d'étude sur la classification des sérotypes, -groupe d'étude japonais sur Pseudomonas aeruginosa (appelée ci-dessous "Commission japonaise") (Japan. J. Exp. Med., 329 (1976)); les types 1 à 17 selon la classification de l'International Antigenic Typing System (IATIS), etc. Ces classifications et leur correspondance sont rappe1les dans le tableau 1 (Japan. J. Exp. Med., 46,

329 (1976)>.

TABLEAU i: Classification serotypique de P. aeruginosa Commission- Homa et co!l ITATS Fisher etcoll Japonaise 1974 1983. 1969 t1976

hc _ c t. '= --=- t'= - c '... " ' -=:: ' '.

A i 3 -

c 2, 7, 13, 16, 5t-16- 3, 7

3 8 6

D 4 9 -

E 5 ll 2 |

-F 6 4-

G.. 6. 6 i | h.. 9 10 5

: 10. 1 - 4

J - 1.15.

K 12 1 -3_1

L 14 - -

M 15, 17 1

_ - _ 7, 12, 14, 17. -

-.,-.:.,,,.v-- T -]._.:...._......... J JI.... r,,,., r......._ L'antigène o de P. aeruginosa a une structure polymérique comprenant dus' motifsr6péttitifs de à saccharides, et la séquence de ces motifs

varie avec chaque sérotype.- On sait que l'anti-

corps spécifique d'un certain antigène 0 présente un

fort effet proventif ou thérapeutique pour les infec-

tions contre Pl. aeruginosa du sérotype auquel ledit

antigène O appartient mais ne préesente aucun effet con-

tre P? aeruginosa de n'importe quel autre sérotype.

Il.est également connu que l'on peut produire un anti-

corps monoclonal humain de façon continue à l'aide d'une-llcnée cellulaire établie capable de produire un anticorps spécifique.

L'établissement d'une lignée cellulaire capa-

ble de produire un anticorps monoclonal spécifique de l'antigène O du lipopolysaccharide de P. aeruainosa

peut être fait par application d'un procédé de transfor-

mation à l'aide du virus EB (Epstein,-Barr)ou d'un prdcédé de fusion cellulaire, etc. Ainsi,-la demande de brevet JP-Al-61-69796 indique que la transformation des splinocytes obtenus chez des malades ayant été infectes avec P. aeruqlnosa dans le passé, avec le. virus EB, donne des cellules transformées par le virus EB capables de produire un

anticorps monoclonal humain spécifique de 1lantigè-

ne O de P. aeruqinosa. La demande de brevet JP-A,6fi-

152281 indique également que la stimulation des cellules d'amygdale obtenues ches des malades atteints d'amygdalite avec du phytolaque ou poleweed (PWM) et la fusion des

cellules d'amygdale stimulées avec des cellules de myé-

lome de souris (souche P3-X63-Ag8-UI) donne des hy-

bridomes souris-homme capables de produire un anti-

corps monoclonal humain spécifique'de l'antigène O de P. aeruqinosa. Cependant, les anticorps monoclonaux humains tels que décrits ci-dessus sont restreints -25 aux anticorps monoclonaux humains -spécifiques des

sérotypes, c'est-à-dire ayant une propriété de liai-

son avec P. aeruginosa d'un certain sérotype et n'ayant pas de propriétés de liaison avec P. aeruginosa d'autres sérotypes. Par ailleurs, la demande de brevet JP-Al-62-187417 décrit l'obtentiond'un anticorps monoclonal à réactivité croisée et effet préventif croisé

l'égard de '. aeruqinosa de deux ou plu-

sieurs sérotypes, basée. sur- l'obtention

d'une cellule capable de produire aun anticorps mono-

clonal ayant une'rtéactivité croisée vis à vis des souches de types 2,5 et 16 de la classification de 1'IATS ainsi que. des souches des types 3 et 7 dans la classification

de Fisher. Comme on le voit d'après le tableau lci-des-

sus, cependant, toutes- ces souches tombent dans le ty-

pe B de la classification de la Commission japonaise, - et donc, ledit anticorps monoclonal reste toujours'

specifique des souches d'un seul sérotype. Ainsir le-

dit anticorps monoclonal présente seulement une pro-

priété de liaison avec seulement moins de 20% des souches d'isolats cliniques, etainsi plusieurs anticorps monoclonaux

spécifiques des sérotypes sont nécessaires pour l'.uti-

lisation pratique.

L'évolution des maladies infectieuses provo-

quées par les bactéries Gram-negatives aboutit à une

septicémie; qui fait que la vie des malades est-sou-

vent mise en danger. Les symptSnes typiques de la sbp-

ticémie sont la pyrexie, ie rigor, l'insuffisance

organique, le choc, etc. Le choc septique est appe-

14 "choc endptoxinique" et est provoqué par le LPS (lipo-

polysaccharide, qui est connu comme endotoxine et sécrété

par le corps bactêrine dans le corps humain à la sui-

te de la prolifération et de la mort d'un grand nom-

bre de bactéries Gram-négatives et/ou de la rupture

deedites bactéries sous l'action des antibiotiques ad-

ministrés. On sait que le site actif provoquant le choc endotoxinique est le lipide A du PLS. Cependant, on ne dispose actuellement d'aucun procédé préventif OU thérapeutique efficace contre le choc endotoxinique,

et la mortalité due au choc endotoxinique atteint 50%.

C'est pourquoi il existe une forte demande pour le développement d'un procédé préventif ou thérapeutique efficace. Ziegler et coll. ont administré un E. coli J5 stérilisé à la chaleur (mutant rugueux type Rc)

comme vaccin à des personnes en bonne santé pour ob-

tenir un antisérum, dont il a-été démontré qu'il est

0 efficace pour la prévention du choc fatal de à une bac-

térémie (New England J. Med., 307,-1552 - 1230, (1982).

Ultérieurement, on a procédé à diverses études

animales et cliniques et il s'est révélé que divers anti-

sera et anticorps monoclonaux spécifiques d'E. coli

J5 ou du core glycolipidique de bactéries Gram-négati-

ves sont efficaces dans la prévention du choc endo-

toxinique (WO 8404458; W08501659; EP-A-0174204; JA-A-61-130300; Mutharia et coll.: Inf. Immun., 45,

631 - 636 (1984); Teng et coll.: Proc. Natl. Ocad.

Sci., USA, 82, 1790 - 1794 (1985); Gigliotti & Shenep: J. Inf. Dis., 151, 1005 - 1011 (1985};

Braude et coll.: J. Inf. Dis., 136 (Suppl), S167 -

173 (1977); Nellesand Niswander: Inf. Immun., 46, 677 - 681 (1984); Pollack et coll. J. clin. Invest., 72, 1874 - 1881 (1983}; Young et coll. Clin. Res., , 522A (1982); Young et coll.: Clin. Res.,- 32,

518A (1984).

Comme on l'a expliqué ci-dessus, l'anticorps

connu spécifique de l'antigène O du lipopolysacchari-

de de P. aeruginosa n'est efficace que -dans la préven-

tion et le traitement des infections provoquées par - 10.

P. aeruginosa du sérotype auquel ledit antigène o ap-

partient et ne produit aucun effet préventif ou théra-

peutique pour les infections provoquées par

P. aeruqinosa de tout autre sérotype. Il est donc ne-

cessaire pour la prévention ou le traitement des in- fections à P. aeruginosa de n'importe quel sérotype

de fournir au moins 13.aà 17 types d'anticorps monoclo-

naux spécifiques de tous les sérotypes de P. aeruginosa.

A cet effet, il faut établir des lignées cellulaires

produisant des antico'rps monoclonaux humains spécifi-

ques d'au moins 13 à 17 types de sérotypes. En ou-

tre, il faut cultiver chacune des lignées cellulaires

à grande échelle ainsi que purifier l'anticorps pro-

duit, et cela pose 'un problème difficile du point de vue industriel. Il. est hautement souhaitable de mettre au point un anticorps monoclonal humain qui peut être lié non seulement à une souche sérotypique de P. aeruginosa mais à plusieursou à toutes les souches sérotypiques de manière a produire un effet préventif 2.0 ou thérapeutique sur les infections dues à

P. aeruginosa de divers sérotypes.

A la. suite d'études poussees pour obtenir à l'échelle industrielle un anticorps monoclonal humain efficace dans la prophylaxie et le traitement des maladies

infectieuses provoquées par P. aerucinosa et une immuno-.

globuline humaine de titre élevé contenant un tel anti-

corps, on a maintenent réussi à etablir une lignée cellu-

lare en utilisant un anticorps monoclonal humain venant de lymphocytes B humains qui se lie de façon spécifique à la structure chimique commune au LPS de P. aeruginosa

de divers sérotypes. En cultivant une tel-

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Le lignée cellulaire, on peut obtenir un anticorps mono-

lonal humain réactif vis à.vis de 2 ou plusieurs catego-

ries de LPS de différents sérotypes-et ayant un effet Préventif ou thérapeutique à 1 'égard.des infections à P. -aeruginosa de deux ou plusieurs s'rotypes. Plus spéc- f iquement-, l'anticorps monoclonal selon l'invention est caractéristique en ce qu'il présente une propriété de liaison spécifique avec presque toutes tes souches de

P. aeruginosa appartenant aux types A, P, G et M de..

1u la classification de la Commission Japonaise et on peut donc le distinguer clairement des anticorps monoclonaux classiques spécifiques d'une seule souche sérotypique ainsi que de l'anticorps monoclonal connu se liant

de façon croisée à des souches de sérotypes d'un sous-

groupes de ladite classification tel- que décrit dans

JP-A1-62-187417.

L'invention a donc pour objet de fournir un anticorps humain qui peut reconnaître un site an.tigénique commun au LPS de P. aeruqinosa, en particulier un anticorps monoclonal

humain ayant une seule spécificité antigénique (anti-

corps monospécifiqueS. Un autre objet de l'invention est de fournir une lignée cellulaire humaine qui est capable de produire de façon continue ledit anticorps

humain. Un autre objet de l'invention consiste à four-

nir une préparation d'immunoglobuline humaine pour la prévention ou le traitement des infections bactériennes, et notament des infections à P. aeruginosa et/ou des infections à bactéries Gram-négatives, comprenant une quantité efficace dudit anticorps humain comme ingrédient

actif. Un autre objet de l'invention est encore de-four-

nir un procéda de production dudit anticorps humain

par culture in vitro ou in vivo de ladite lignée cellu-

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laire humaine, L' invention a encore pour objet

de fournir un procédé pour obtenir ladite lignée cel-

lulaire humaine. Un--bjet de l'invention est aussi de

fournir un nouvel anticorps qui peut reconnattre la struc-

ture chimique commune au LPS des P. aeruqinosa et qui réagit de façon croisée au lipide A provenant de bactéries

Gram-négatives comme P. aeruginosa, B. coli et S. thyphi-

murium. Ces objets de l'invention, ainsi que d'autres, apparaîtront aux spécialistes d'après les indications

précédentes et la description qui va suivre.

L'anticorps monoclonal humain selon-l'inven-

tion, qui est spécifique du site antigénique commun au LPS des P.. aeruginosa désigne un seul anticorps monoclonal humain qui peut reconna tre le site antigenique commun au LPS des P. aeruginosa de deuxou plusieurs sérotypes,

p. ex. des types A, G, F-et M, et réagit de façon croi-

s e avec le lipide A du LPS provenant de bactéries Gram-

négatives. Il peut Atre produit à partir d'un seul cl8ne

producteur d'anticorps.

ZOâQ:Ledit anticorps monoclonaiL humain a une proprié-

Ité de de liaison avec les souches de P. aeruginosa de

ou plusieurs s5rotypes ou du LPS qui en dérive, c'est-

a-dire une aptitude à accélérer une propriété bactéricide en présence de complément ainsi qu'une phagocytose par un neutrophile et un macrophage (opsonisation), et peut prévenir ou traiter des maladies infectieuses à P. aeruginosa. Les déterminants antigéniques dudit anticorps monoclonal humain sont presents dans le LPS des souches des types A, G, F et M, en particulier au site lipidique A et à la partie polysaccharidique

du LPS.

Le sérotype utilisé ici est donné selon la

classification de la Commission Japonaise, qui est déter-

minée sur la différence de réaction immunochimique en

utilisant un antisérum ou un anticorps monoclonal de.

souris spécifiquement réactif avec la souche de référence

de P. aeruginosa de chaque sérotype.

Le LPS représente un lipopolysaccharide qui est un constituant de la couche de surface d'un corps

bactérien Gram-négatif-et comprend un lipide (lipi-

de-A) et une partie de core qui y est reliée, ladite

partie de core comprenant l'acide 2-céto-3-desoxyoctoni-

que, un heptose, l'acide-phosphorique, etc, comme consti-

tuants et protant une chatne latérale polysaccharidique appelée "antigène O" à son extrémité. L'antigène O a une

structure polymérique comprenant une chaine droite consti-

tuée de 2 5 monosaccharides comme-motif répétitif.

La composition, la disposition et la configuration de

la chaune sadcharidique diffèrent selon les séroty-

pes, et cette-différence est la base de la classifica-

tion en-sérotypes.

2S Telle que décrite ci-dessus, l'invention four-

nit un anticorps-monoclonal humain, qui peut reconnal-

tre le site du déterminant antigénique commun au LPS

des P. aeruginoas et qui réagit également de façon croi-

sée avec le lipide A provenant de bactéries Gram-néga-

tires. L'anticorps monoclonal humain réagissax de

façon croisée au lipide A provenant de bactéries Gram-

négatives est-un anticorps unique de type humain qui.

peut reconnaître spécifiquement le lipide A isolé et purifié à partir de bactéries Gram-négatives comme E. coli, S. typhimurium et P. aeruginosa. Comme l'an- ticorps monoclonal humain a une propriété de liaison spécifique avec le.lipide A des bactéries Gram-négatives

y compris P. aeurqinosa et une propriîté de neutrali--

sation des activités biologiques comme l'activité mito-

1'0 gène, la toxicité fatale et la réaction de SchwarZman provoquées par le lipide A en plus de ladite réactivité envers les sites antigéniques communs au LPS des P.

aeruginosa, il est utile comme agent préventif ou théra-

* peutiqpe dans le choc endotoxinique provoqué par

les bactéries Gram-négatives.

L'anticorps monoclonal humain peut également.

présenter une propriété de liaison avec le LPS obtenu de E.. coli ou S. typhimurium ou avec la partie LPS dans le cas du site lipidique A exposé comme

dans une souche déficiente enantigène O et en poly-

saccharides de core:p. ex. souche de type rugueu-

se profonde).

Le lipide A constitue une partie glycolipi-

dique du LPSe et peut être préparé à partir du LPS par clivage de la liaison cétoside dans l'acide cétodésoxyoctonique (KDO) avec un aàide. Il comprend

un squelette d'ester beta(1- disaccharide, 1,4'-di-

phosphorique et d'acides gras qui y sont attacheés, la quantité d'acides gras étant de 4 ipoles pour 1 mole de lipide A. Les types, le nombre et la position

de liaison des acides gras varient avec chaque souche.

La lignée cellulaire humaine qui peut produire

de façon continue l'anticorps monoclonal humain de lt'in-

vention spécifiquement réactif envers le déterminant

antigénique commun au LPS des P. aeruginosa et en parti-

culier ayant une réactivité croisée avec le lipide A des bactéries Gramnégatives, peut être produite par

divers procédés, dont certains exemples sont donnés ci-

dessous.

Dans le premier procédé, on infecte des lympho-

cytes B humains, sensibilisés (immunisés) avec P. aeruginosa (bactéries vivantes ou bactéries tuées au formol ou par chauffage), du LPS provenant de P. aeruginosa ou une bactérie Gram-négative,' ayant une structure lipidique A à sa surface (bactéries vivantes ou bactéries tuées avec du formol ou par chauffage) de préférence E. coli J5 ou S. typhîmurium mutants, Rc, Rd ou Re, ou du LPS ou lipide A provenant de ces souches, in vivo ou in vitro, avec le virus

d'EB (Epstein-Barr) par mélange, de façon que les-

dits lymphocytes B soient transformés en lymphocytes qui

peuvent proliférer de façon continue. A partir des cel-

-lules ainsi transformées (avant ou après clonage), on choisit les cellules produisant un anticorps ayant une réactivité spécifique et on les fait proliférer de

façon continue in vitro de manière à établir des li-

gnées cellulaires qui peuvent produire ledit anticorps

de façon continue. Pour la sélection, on peut utiliser.

un test ELISA (erîzyme, linked immunosorbent assay) avec une série de crops bactériens comprenant des souches de P. aeruginosa de 17 sortes différentes de sérotypes

et E-. Coli 0-111 B4 et J5. La sélection peut égale-

meet se faire par ELISA en utilisant le LPS et le lipide A provenant de P. aeruqinosa, E. ccli 0-111: B4 et J5 et une souche sauvage de S. typhimurium et des mutants Ra à Re comme antigènes.

Dans le second procédé, on soumet des lympha-

cytes B humains sensibilisés avec P. aeruqinosa (bac-

téries vivantes ou bactéries tuées au formol ou par chauffage), du LPS provenant de P- aeruginosa, ou d'une

t0.bactérie Gram-négative ayant une structure de lipi-

de A à sa surface (bactéries vivantes ou bactéries tuées au formol ou par chauffage), de preférence

-E. coli J5 ou S. tyPhimurium Rc, Rd ou Re mutants.

ou le LPS ou le lipide A provenant de ces souches, à une fusion cellulaire avec des cellules de myélome ou des cellules de lymphoblasto$de B pour établir des lignées cellulaires qui peuvent proliférer in vitro de façon continue et produire de façbn continue un anticorps spécifique de LPS,

20.Dans le troisième procédé, on soumet les cel-

lules transformées par le virus EB telles qu'établies dans le premier procédé à une fusion cellulaire avec

des cellules de myélome ou des cellulesde lymphoblas-

toide B afin d'établir une lignée cellulaire qui peut proliférer in vitro de façon continue et produire un

anticorps spécifique de LPS de façon continue.

Les lignées cellulaires ainsi établies peu-

vent être cultivées in vivo.(p. ex. souris nue) ou

i.n vitro cette culture suivie par une opération dé collec-

de et de purification de l'anticorps libéré dans le milieu. de culture ou dans le f luide d'ascites pour obtenir

l'anticorps en grande quantité.

La production de l'anticorps monoclonal de 1in-

vention comprend les étapes suivantes:(1) préparation

de lymphocytes.B humains sensibilisés avec un antigé-

ne; (2) établissement de lignées cellulaires productri-

ces d'anticorps spécifiques monoclonaux en immortali-

sant les cellules préparées en (1); (3> culture des lignées cellulaires telles qu'établies-en (2); (4)

purification de l'anticorps spécifique monoclonal pro-

lu venant de la culture telle qu!obtenue en (3); et (5) production d'une préparation d'immunoglobine de titre élevé comprenant l'anticorps spécifique monoclonal

tel que purifié en (4). Chacune de ces étapes sera ex-

pliquée en détail ci-dessous.

Etape (1): -

Comme lymphocytes B humains, on peut utiliser des cellules de lymphocytes humains produisant un anticorps contre le LPS de P. aeruginosa et le lipide A des bactéries Gram-négatives, qui peut être-séparé du sang périphérique par centrifugation en utilisant un liquide de séparation lymphocytaire comme Lymphoprep ou Mono-Poly Resolving.Medium (Flow Lab.) . On peut

également utiliser des lymphocytes B provenant de tis-

sus ou d'organes (p. ex. ganglions lymphatiques, rate) extraits dans un but de diagnostic ou de traitement des maladies, de sang de cordon ombilical, etc.

Il est souhaitable d'obtenir ces cellules auprès de person-

nes qui ont été autrefois infectées avec P. aeruginosa et dont les cellules sont ainsi sensibilisées. Les persolnes en question, dont on peut obtenir les cellules, peuvent

être choisies par une mesure préalable du titre d'an-

ticorps dans leurs sera'. On peut également obtenir des lymphocytes Bhumains auprès de toute personne, quels que soient ses antécédents médicaux. et lei mélanger avec P. aeruqinosa inactivée, du 1Pg provenant de P. aeruginosa

S ou de bactéries Gram-négatives ayant une structure lipi-

dique A à leur surface, de pr4férence EB. coli 5 inacti-.

vee ou mutant S. thyphimurium Rc, Rd ou Re ou du LPS ou lipide A provenant de bactéries Gram-négatives.in vitro dans un but de sensibilisation, Autrement dit,

on peut ajouter n'importe lequel de ces antigènes inacti-

ves aux lymphocytes B. En outre, on peut ajouter des solutions contenant des. lymphokines comme des facteurs

de prolifération des cellules B ou des facteurs de diffé-

renciation des cellules B (p. ex. des lectines végétales comme le mitogène de pokeweek (PWM)t, des composants de corps bactériens comme le Cowan It, une culture mixte de lymphocytes humains, une-culture de rate, de thymus ou. de cordon ombilical) à des lymphocytes B humains aux fins de sensibilisation in vitro, ce traitement étant suivi par une prolifération et une différenciation donnant des cellules productrices d'anticorps. Les lymphocytes humains B ainsi obtenus ont une molécule d'anticorps à la surface cellulaire et-peuvent sécréter une.faible quantité d'anticorps pendant une certaine période limitée,

mais ils ne sont pas immortels.

Etape (2): -

Pour transformer leslymphoaytes B humains sensibilisés ci-dessus en iignées cellulaires immortelles proliférant' de façon continue, il existe

fondamentalement deux procédés, dont la premier coam-

prend l'infection de lymphocytes B avec le virus EB

par culture mixte des lymphocytes B humains sensibili-

sés avec le virus EB préparé à partir de cellules B95-8 de Marmouset, de préférence en utilisant de 2

à 10 TD50 de virus par cellule. On inocule des micro-

plaques à 96 puits avec les cellules a raison de 0,5 a 3 x 104 par réservoir, et on effectue la culture en

vue de la transformation en utilisant un milieu habi-

tuel (p. ex. RPMI1640, MEM d'Eagle) contenant du sé-

rum de foetus de bovin, du sérum de bovin, du sérum de cheval ou du sérum humain en proportion de 2 à 20% (v/v) en présence de 5 à 10% dé CO2, à température de 32 à 37 C pendant 2 à 5 semaines, temps pendant lequel on

échange la moitié du milieu tous les 2 à 4 jours. Si néces-

saire, on peut y ajouter del à 2 pg/ml de cyclospori-

ne A et un.agent antibiotique ou antimicrobien pour la prévention de la contamination du mycoplasme. On peut observer les cellules ainsi transformées sous forme de colonies de 20 à 200 cellules au microscope

optique 10 jours ou plus après l'infection et les dis-

* tinguer facilement des cellules non transformees. On-

soumet la culture contenant les cellules transformées ayant suffisamment proliféré dans les puits à un tri pour évaluer le titre d'antidorps par ELISA, on sélectionne les puits sur lesquels on reconnaît

la production d'anticorps et on confirme la spécifi-

cité envers le LPS selon la technique du Western blot., Ensuite, on soumet la culture dontenant les amas de

cellules transformées à une aspiration et rejet ré-

pétés avec une pipette pour briser les amas, on dilue

avec la solution de culture pour obtenir une concen-

262647.3

tration cellulaire appropriée et on inocule dans une microplaque & 96 puits pour avoir de 0,5 à 100

cellules par r4servoir pour le clonage (procédé de di-

lution limitante). On. peut également effectuer le clonage en utilisant de l'agarose (p. ex. sea plaque agarose). Aihsi, on inocple les cellules transformées (environ 7 x 104 à 7 x!05) dans 'une plaque de culture (diamètre 30 mm)avec 0,36 -à 0,4% (p/v) d'agarose et

on cultive à 37QC sous CO2 à 5% pour obtenir une colo-

1D nie ayant proliféré à partir d'une seule cellule. Lors du clonage, il est souhaitable d'utiliser des cellules

péritonéales de souris, des lymphocytes de sang de cor-

don ombilical humain ou des cellules spleniques de Souris

irradiées aux rayons X comme couche d'alimentation.

A partir des lignées cellulaires clonées on choisit celles qui ont une haute productivité- en anticorps

spécifiques par mesure des titres d'anticorps des sur-

nageants de Cultures desdites lignées cellu-

laires clonées selon la technique ELISA en utilisant des

corps bactériens de P. aeruginosa de 17 sérotypes dif-

férents et d'Et coli 0-11: B4 et J5 comme antigène en phase solide et en outre en utilisant du LPS et

du lipide A provenant de P. aeruginosa de 17 sérotypes.

différentsr E. coli O-l 111.B4 et JS, S. tYPhimurium souche sauvage et mutants Ra à Re comme antigène en

phase solide. On procède au clonage et à la sélec-

tion comme ci-dessus de façon répétée deux ou trois

fois de manière à établir une lignée cellulaire trans-

formée ayant un taux de prolifération élevé et produi-

sant l'anticorps spécifique de façon stable en grande quantité. Le second procédé comprend I'étape consistant à soumettre les lymphocytes B humains sensibilisés et les cellules de

myélome à une fusion cellulaire en présence de poly-

éthylèneglycol. Les cellules de myélome utilisées sont

des mutants déficients en hypoxanthine-guanine phos-

S phoribosyl transférase (HGPRT) (p. ex.-P3X63-Ag 8 (P3),

P3X63-Ag 8.653) provenant de cellules de myélome de.

sourisi des mutants déficients en HGPRT provenant de

-ellules de myélome humain U-266, d'hétéromyélome sou-

ris-homme SHM-D33 déficient en HGPRT, etc. On peut également employer des mutants déficients en HGPRT

provenant de cellules lyphoblasto1des B humaines.

Comme polyéthylèneglycol (PEG), on peut utili-

- ser, par exemple, du PEG 1000 à 6000 à une concentra-

tion de 30 à 50% (p/w). On peut accroître l'efficacité

de la fusion en y incorporant de la lectine, de la po-

ly-L-lysine, du diméthylsulfoxyde, etc. On peut procéder à la fusion, par exemple, de la même manière qu'il est dit dans l'article de Kohler

et coll. (Nature, 256, 495 (1975) dans lequel on fusion-

ne des cellules de souris pour obtenir un hybridome produisant un anticorps monoclonal de souris. Par exemple, on mélange les lymphocytes B humains sensibilisés et les cellules de myélome déficientes en HGPRT dans une proportion de 10-1: 1, on y ajoute en plusieurs fois du PEG 3000à raison de30 à 50% (p/v)en 0,5 à!minute, et on laisse reposer le mélange résultant pendant 1 à

minutes. Au mélange résultant, on ajouteen 5 à 10 mi-

nutes 50 ml d'un milieu de culture ne contenant pas de sérum, et on ajoute encore du milieu de culture pour obtenir une concentration cellulaire de 105 à 106/ml. On inocule la suspension cellulaire ainsi obtenue dans une miCroplaque à 96 puits à raison de 2 x 104 à 2 x 105 cellules par puits. Le jour suivant, on-en remplace la moitié par un milieu contenant de l'hypoxanthinetaminopt.rine-thymidine (milieu HAT) ou

5. un milieu contenant de l'hypoxanthine-azasérine (mi-

lieu HAz.et on effectue la-culture à une température de 32

à 37"C sous CO à 5% pendant environ 2 a 3 semaines pendant les-

quelles on remplace le milieu de culture par un mi-

lieu HAT pendant environ 10 à 20 jours puis par un mi-

lieu contenant de l'hypoxanthine-thymidine (milieu HT) pendant environ 3 à 5 jours,à raison de la moiti àa

des intervailes de 3jours pour obtenir une colonie pro-

liférative, c'est-à-dire des hybridomes.11 est également pos-

sible de choisir un hybridome par l'utilisation combi-

née d'inhibiteurs du métabolisme sans utiliser un mu-

tant déficient en EGPRT; On mesure. le titre d'anticorps du milieu de culture de l'hybridome parla technique ELISA comme mentionné-ci-dessus, on choisit la lignée cellulaire produisant l'anticorps spécifique ayant la spécificité de réaction ci-dessus, et on confirme la spécificité envers le polysaccharide par la technique du Western blot. On-répète le clonage deux ou trois fois par le procédé de dilution limitante au

le procédé à l'agarose pour obtenir une lignée cel-

lulaire stable ayant une grand vitesse de

de prolifération et une productivité d'anticorps spé-

cifique élevée..

Dans le premier procédé tel qu'expliqué ci-

dessust on peut utiliser des cellules transformées

par le virus EB au lieu de lymphocytes B humains sen-

sibilisés. On peut faire proliférer de façon continue les

lignées cellulaires telles qu'établies à partir de lym-

phocytes B humains sensibilisés selon le procédé de

transformation au virus EB ou le procédé de fusion cel-

lulaire (hybridomes)et leur faire produire en grande

quantité et de façon stable l'anticorps spécifique.

Etape (3): -

On fait incuber les cellules transformées ainsi 6ta-

blies ou les hybridomes (0,5 - 5 x. 105 cellules/ml} à l'état stationnaire ou avec rotation dans un milieu

de culture habituel pour cellules animales dans un ré-

cipient tel qu t un ballonou une plaque d'incubation par utilisation d'un incubateur à C02 à 32 - 37"C

sous C0o2 à 2 - 10%. En particulier lorsqu'on fait l'in-

-cubation à grande échelle, on peut utiliser une cuve de fermentation, un système de fibres creuses, ou similaire, conçu pour les cellules animales. Le milieu de culture habituel peut être, par exemple, un milieu contenant de 2 à 20% de sérum de foetus debovin, de veau, de vache, de cheval, humain ou similaire p. ex. RPMI1640, MEM d'Eagle;, un milieu dépourvu de sérum contenant les composants sous forme de traces nécessaires pour la prolifération des cellules (p. ex. l'insuline, la tranferrine, l'éthanolamine, la sélénite, l'albumine,bovine des lipides), etc.

Etape (4) = -

La purification de l'anticorps peut s'effec-

tuer par des procédés biochimiques classiques (p. ex.

fractionnement par précipitation au sulfate d'ammo-

nium, fractionnement par precipitation à l'éethanol, fractionnement par PEG, chromatographie d'échange

d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'affini-

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tée, chromatographie en phase liquide à grande vitesse, électrophorèse). Dans le procédé de purification, il

faut prendre garde d'empêcher la productidn d'agg'luti-

nation-ou la dépression de l'activité d'anticorps. A cet effet, on peut ajouter de la sérum albumine humai-

ne {HSA) en une quantité de-0,05 à-2%. On peut quelque-

fois préférer l'addition d'acides aminés comme la gly-

cine ou l'alpha-alanine, en particulier d'acides ami-

nés basiques comme la lysine, l'arginine ou l'histidi-

- ne, les saccharides comme le glucose ou le mannitol,

les sels, comme le chlorure de sodium, etc. Une agglu-

tination tend à se produire, en particulier dans le

cas d'un anticorps IgMr, et le traitement avec la bêta-

propiolaetone, l'anhydride acétique, ou similaireest effi-

cace dans la prévention d'une 'telle agglutination.

Dans ce cas, une administration intraveineuse est ren-

due possible.

Etape (5): -

On peut formuler l'anticorps monoclonal puri-

2a. fié en une préparation biologique par un procédé connuen soi

dans lequel, par exemple, on filtre à travers un fil-

tre à membrane pour enlever les bactéries, on verse dans des flacons stérilisés avec un stabilisateur et

on lyophilise.

La préparation d'anticorps monoclonal humain

peut ne comprendre qu'un seul type d'anticorps mono-

clonal humain contre le LPS de P. aeruqginosa pour son utilisation comme agent préventif ou thérapeutique contre les infections à P. aeruginosa. De préférence, la

préparation comprend en outre au moins un type d'anti-

262647-3

corps monoclonal humain qui peut reconnattre un.

déterminant antigénique différent dans la structure moléculaire du LPS de P.aeruginosa et/ou au moins un type d'antic.prs humain classique qui peut reconnaltre les exotoxines, les exoenzymes (p. ex. élastase, pro-

téase), les protéines d'enveloppe 'ou.les endotoxines.

La préparation peut également comprendre n'importe- quel anticorps humain contre les bactéries autres que

P. aeruginosa, les virus, les champignons, les protozo-

-aires, les cellules cancéreuses, etc. En outre., l'anti-

corps monoclonal humain de I'invention peut être incor-

poré dans une.préparation d'immunoglobuline humaine

classique pour constituer une préparation d'immunoglo-

buline à titre élevé contre le LPS.

15. L'anticorps monoclonal humain de l'invention appartient surtout à la classe IgG ou IgM, mais n'y est pas limité. L'anticorps monoclonal humain a une propriété de liaison avec

P. aeruginosa de deux ou-plusieurs catégories de séro-

types, présente une activité bactéricide en présence d'un complément et a une activité d'accélération de -la phagocytose de P. aeruginosapar les neutrophiles et les macrophages

(opsonisation). On peut traiter les infections expéri-

mentales de la souris avec des P.' aeruqginosa de deuxou plusieurs catégories de sérotypes par administration

d'un seul anticorps monoclonal humain de l'invention.

L'anticorps monoclonal humain de l'invention

a une propriété de liaison spécifique avec les corps bact'-

riens de P. aeruginosa IIDi00l (ATCC.27577), ID 1006 (ATCC 27582), IIDl020 et ID 1015 parmi les souches de référence pourla classification des sérotypes de

P.-aeruginosa. En outre, il a une propriété de liai-

son au lipide A des bacteries Grsm-négatives et il per-

metde neutraliser une activité biologique comme l'activité léthale ou la réaction de Schwartzman. L'anticorps monoclonalhumain peut aussi se lier avec les liposaccharides provenant de E. coli mutant R J5 (ATCC 39355) S. minnesota type rugueux mutantsRc, Rd et Re et P. aeruqinosa IIDlOOl (ATCC 27577) mais non

à ceux qui proviennent d'E. coli souche de type lis-

se 0-11: B4,S. minnesota souche type sauvage lisse, mutant type rugueux Ra et Rb et P. aeruginosa

IIDIO02 (ATCC 27578) et'PA -103.

Tel que compris d'après ce qui précède, l'an-

ticorps monoclonal humain de l'invention-diffère de 1' anticorps monoclonal connu spécifique de sérotype et de

l'anticorps monoclonal connu à réaction croisée de sous-

groupe sértypique. Comme il peut atre lié à

P. aeruqginosa de deux ou plusieurs sérotypes diffé-

rents, on peut couvrir P. aeruginosa de tous les sé-

rotypes ou presque tous les sérotypes par un plus pe-

tit nombre d'anticorps monoclonaux y compris celui-

ci. L'anticorps monoclonal humain de l'invention est donc très intéressant-du point de vue de la prévention et du traitement des infections à P. aeruqinosa. En outre, il est utile pour la prévention et le traitement du choc endotoxinique, pour lequel on ne dispose pas

actuellement d'agents efficaces.

Les déterminants antigéniques reconnus par l'anticorps monoclonal humain de l'invention sont le

site du lipide A et le site polysaccharidique du LPS.

Le site polysaccharidique à reconnaître est limite à

celui que l'on trouve dans certaines souches séroty-

piques, à savoir les types A,F,G et M. On suppose donc que la structure commune au site du lipide A et au site polysaccharidique peut 9tre présente. Pour la prévention et le traitement, notamment chez l'homme des maladies infecticuses P.aeruginosa, des infec:r Ans mixtes avec des bactéries contenant P. aeruginosa et

du choc endotoxinique dû à des bactéries Gram-négati-

ves, on peut adminis-crer une préparation d'inimmunoglobu-

Une humaine contenant l'anticorps monoclonal humain à un malade adulte à raison d'environ 1 à g à chaque fois en cas de symptome grave ou à raison d'environ 0,2 à 5 g à chaque fois dans

en cas d e symptome bénin ou dans -un but de prevention.

La teneur en anticorps monoclonal humain de'l'invention

dans la préparation d'immunoglobuline humaine est gé-

* néralement d'environ 0,5 à à 500 mg, de preférence

environ 5 à 50 mg.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps monoclonal humain tel que défini ci-dessus comme ingrédient actif dans la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les infections bactériennes

provoquées par P. aeruginosa et de façon générale par des bac-

téries Gram-négatives,-y compris là chod endotoxinique.

Comme il est dit ci-dessus, l'anticorps mono-

clonal humain de l'invention a un titre d'anticorps élevé contre son antigène et présente un excellent effet thérapeutique dans le système des infections expérimentales de la souris..Comme il s'agit d'une protéine d'origine humaine, aucun effet secondaire

(p. ex. anaphylaxie) tel qu'on en observe après adminis-

tration d'une protéine hétéro1ogue n'est produit.Comme l'anti-

2626473.

norps est produit à partir d'une lignée cellulaire spéci-

fique, la possibilité de contamination par des corps biologiquement dangereux inconnus est bien moindre par

comparaison avec les immunoglobulines classiques prd-

duits à partir d sang humiain'provenant de

nombreuses personnes inconnues.

L'anticorps monoclonal humain de l'invention est produit avec un'haut titre d'anticorps in vitro de façon stable en grando quantité, et son" proc6dé de production'est plus intdressant que les procédés de production classiques utilisant le sang humain avec

un contrôle de qualité facile.

L'invention sera expliquée en détail ci-dessous à

l'aide d'exemples, mais i-l faut comprendre que l'in-

vention ne se limite pas à ces exemples. -

Exemplée l

Etablissement de lignées cellulaires productri-

ces d'anticorps monoclonal humain par le procéde.de transformation du virue EB: * (.I) Préparation de la solution de virus EB et mesure de son titre viral

On met en suspension des cellules B95-8 de mar-

mouset produisant et libérant le virus EB dans un mi-

lieu RPMI1640 contenant 10% do sérum de fotus de veau

(FCS) à raison de 6,5'x io5 cellules/ml'et on fait in-

cuber à l'état stationnaire dans un ballon de culture T-75 (Corning=25110) à 37vC sous atmosphère de CO2 à 5% pendant 4 jours. On recueille le surnageant de culture et on le soumet à une centrifugation à l'aide d'une centrifugeuse basse vitesse (RS-20HB;-Tommy

Precision Ind. Co. Ltd.) à 2000 tpm pendant 10 minutes'.

On filtre le surnageant à travers un filtre à membra-

ne de 0,45 u-(Millex SLHA 0250S). On met le filtrat dans des tubes-à sérum (MS-4505 Suml.tomo Banelite Co., Ltd.) et on le conserve à -80GC; Lors de l'utilisation,

on dilue le contenu de façon appropriée et on ll'utili-

se pour l'expérience de transformation des ilymphocytes

humains avec le virus EB.

-On détermine le titre viral de la solution de virus EB selon le procédéde Moss et coll. (J. General Virology, 17, 233 (1972)) en utilisant des lymphocytes de sang périphérique humain. (PBL) comme cellules inducatrices. Autrement dit, on met une-suspension de

lymphocytes du sang périphérique' humain (106 Cel--

lules/ml) dans du milieu RPMI 1640 contenant 15% de -* FCS dans une microplaque à 96 puits. (Sumitomo Bakelite) à raison de 100 P1 par puits. A chaque puits, on ajoute la solution de virus EB (20 pl)

- dans des dilutions en série au dixième (dans un inter-

valle de 100 à 107) avec le milieu ci-dessus, et on conduit l'incubation à 37 C -sous une atmosphère à 5% de C 02. On renouvelle le tiers du volume du-milieu

tous les 3 jours, et au bout de 3 semaines, on exa-

mine la présence des cellules transformées au micros-

cope optique. On procède à l'examen sur 6 puits

par dilution, et on détermine la vitesse de transfor-

- mation. On détermine de façon stochastique la dilution la plus élevée requise pour la transformation de 50% - des cellules à partir de la vitesse de transformation à chaque dilution selon la méthode de Reed et Muench, on -calcule la quantité de virus et on la prend

comme 1TD50, d'après quoi on recalcule la quantité de.

virus dans l'échantillon d'origine et on la désigne par le nombre de TD50. On obtient ainsi la solution de virus EB ayant une quantité de virus de 105- à 107 T'D50/ml. (2) mesure du titre d'anticorps anti-P. aeru2inosa selon le procédé.BLISA On m 'esure letitre d'anticorps contre l 'antigene

de surface de P. aeruginosa comme suit. On met aen suspen-

sion P. aeruîinosa dans une solution de tampon phospha- té (pH 7,2). comprenant NaCl (8 g/l), KC1 (0,2 g/1),

NaHPO4.12 I2O (2,99 g/1 et KH2PO4 (0,2 g/l) (PBS) pour obte-

nir une absorbance d 0,2 à une longueur d'onde de 600 nm. On met la suspension dans des microplaques à 96 puits (Palcon =3912)à raison de 50 P1 par

puits, puis on centrifuge à 200 tpm pendant 15 minu-

tes. On ajoute du glutaraldêhyde à 2% à chaque puits à raison de 50 pl par puits pour fixer le corps bactérien aux microplaques. Après enlèvement de la -solution bactérienne des microplaques, on introduit

dans la microplaque une solution de-PBSa 3% conte-

nant de la sérum albuminebovine (BSA) à raison de 1l par puits et on fait incuber à 37 C pendant minuteà pour bloquer les parties non liées de la plaque d'essai.. On-utilise la microplaque résultante comme

plaque rev4tue d'antigènes dans '1 opération ultérieu-

re. Si on le désire-, on peut effectuer le stockage de

cette microplaque à -20QC.

Avant le dosage, on lave la microplaque trois fois avec une solution de PBS contenant-0,05% de Tween (PBST).-On introduit du PBST contenant 1% de BSA dans les puits à raison de 50 yl par puits, et on.y ajoute un échantillon (sérum fluide ascitique ou surnageant de culture) éventuellement dilué avec PBST contenant-l% de BSA,-à raison de 50 pl par

puits, puis on fait incuber à 37"C-pendant 2 heu-

res. On enlève l'échantillon de la plaque, que l'on lave3 fois avec du PBST. On ajoute à la microplaque un anticorps anti-immunoglobine humaine marqué à la phosphatase, purifiée par chromatographie d'affinité (Kirkegaard & Perry Lab. Inc.) (second anticorps) dilué de 500 à 1000 fois avec une solution de PBS contenant 1% de BSA à raison de 100 -1 par puits

pour -incubation à 37QC pendant 2 heures. Pour mesu-

rer le titre d'anticorps IgG et le titre d'anticorps

IgM, on emploie respectivement un anticorps anti-IgG hu-

1O nmaine marqué à la phosphatase et un anticorps.

marqué à la phosphatase. Après enlèvement du second anticorps, on lave 3 fois la microplaque avec du

PBST, et on ajoute une solution de substrat, c'est-a-

dire une solution aqueuse contenant du sel disodique de l'acide pnitrophénylphosphorique (3 mg) dans du

tampon de diéthanolamine à 10% (pE 9,1; 1 ml) con-

tenant NaN3 (0,2 mg/l ml) et MgC12.6H20 (0,! mg/ml) à la microplaque, à raison de 100 P1 par puits, puis on effectue la réaction à 37 C. Au bout de 45 minutes, on ajoute NaQO 3N à raison de 20 Pi

par puits pour arrêter la réaction. On mesure l'acti-

vite de liaison de l'anticorps (OD4051 sur Multiskan (Titertek). (3) Préparation de lymphocytes à partir de sang périphérique humain On recueille du sang périphérique humain (100 ml} présentant un titre élevé d'anticorps contre

P. aeruginosa de plusieurs sérotypes. On met du mi-

lieu Mono-Poly Resolving Medium (15 mi; Flow Lab.) dans un tube de centrifugation (volume $0 ml; Sumitomo Bakelite), et on y verse lentement le sang périphérique humain ci-dessus (20 ml),'puis on procède

une cent=ifugation avec une centrifugeuse basse vi-

tesse'(Bs-20HBI, TommS Precision Ind.) à 2500 tpm (Roter-TS-7) et a la température ambiante pendant - 15 minutes, ce qui sépare les hématies et les lympho-

cytes. On recueille la fraction contenant les lympho-

cytes et on la lave avec du milieu RPMI 1640 contenant % de FCS-(appelé ci-dessous "milieu") deux fois, puis on calcule le nombre de cellules pour obtenir 1r2 x 108

lymphocytes.

(4> Etablissement de liqunes cellulaires produc-

trices d'anticorps anti-LPS de P. aeruqinosa selon la mé-

thbde de transformation du virus EB On met en suspension des lymphocytes du sang périphérique humain (2 x 107) dans le milieu (2 ml),

et on y ajoute la solution de virup EB (10 ml; quanti-

té de virus, 107 TD50/ml), puis on effectue une in-

cubation à 37*C en atmosphere a 5% de C02 pendant

2 heures.

; On met en suspension les lymphocytes humains

infectés par le virus EB dans du milieu essentiel mi-

nimum d'Eagle modifié par Dulbecco (appelé ci-dessous * "milieu d'établissement de la-lignée cellulaire") comprenant % de FCS, 10% de milieu de culture tissulaire NCTC

109, de la pénicilline (100 UI/ml) de la streptomyci-

ne (100 g/ml), de l'arginine (0,2 mg/ml), de l'aci-

de oxaloacétique ( 0tl5 mg/ml), du pyruvate de sodium

(0,05 mg/ml) et de l'insuline bovine (0,2 U/ml) pour-

obtenir une concentration d'environ 2 x l05 cellu-

les/ml, et on répartit la suspensiondans une plaque de

culture à 24 puits préalablement chargée de cel-

lules péritonéales de souris en suspension (environ 1 x 105 cellules/puits à raison de 0,5 ml/

- puits. On cultive les lymphocytes à 37 C en at-

mosphère à 100% d'humidité et 5% de C02'et on remplace la moitié du milieu par du milieu d' établissement de la li- gnee cellulaire frais tous les 3 jours en commençant

une semaine apres le début de l'incubation. Au bout.

d'un mois environ, on recueille les cellules et on les

utilise pour la fusion cellulaire.

C(5) Fusion cellulaire avec les cellules trans-

formées par le virus EB On effectue une sous-culture de cellules de myélome de souris BALB/C provenant d' une lignée MOPC-21 et déficientes en HGPRT (P3X63-AgS.653 ATCC CRL 1580) dans le milieu d'établissement de la lignée cellulaire, on prélève et on lave 1 x 107 cellules 3 fois avec du milieu essentiel minimum d'Eagle. On lave les cellules transformées par le virus EB (2 x

107 cellules) obtenues en (4) 3 fois avec du milieu essen-

liel minimum d'Eagler on mélange avec des cellules de myélome (1 x-107) dans un tube à centrifugation

(Corning =25330) et on les soumet à une centrifuga--

tion à 400 g pendant 7 minutes. Au précipiué résul-

tant on ajoute du PEG 4000 (1 ml; solution de PBS à 45%, Merck) en i minute tout en faisant tourner le tube à centrifugation et en agitant avec une pipette,

puis on laisse reposer à la température ambiante pen-

dant i minute. On ajoute du milieu essentiel mini-

mum d'Eagle (9 ml) en 5 minutes aux fins de dilution

et on maintient la dilution résultante à 37 C pen-

dant 1 heure. On met en suspension le précipité après centrifugation dans le miiieu d'établissement de la lignée cellulaire (100 ml) et on verse dans des.pl.aques à

96 puits (Falcon =3040) à raison de 1 x 104 cel-

lules de myélome par puits. Simultanément, on ajoute des cellulesspléniques desourisBALB/C comme couche d'alimentation à raison de 3 x 104 cellules par réservoir puis on effectue une incubation à 370C en atmosphère à 5% de C02. Ensuite, tous les deux ou trois jours, on remplacela moitié du volume du milieu par un milieu de selection. Après la fusion cellulaire

À pendant environ 2 semaines, on soumet les surnageants -

des puits dans lesquels on a observé une prolife-

ration à un-éxamen de la production des anticorps con-

tre P. aeruginosa de différents s4rotypes parla m4tho-

de ELISA. On sélectionne les cellules fusionnées

(hybridomes) dans les puits présentant un titre re-

lativement 4levé d'anticorps et on les soumet à une culture plus poussée tout en clonant par le procédé de dilution limitante. Au bout d'environ 2 semaines, la présence d'anticorps contre le déterminant

antig4nique commun se liant a P. aerugqinosa de plu-

sieurs s4rotypes est confirmée par aéthode'ÈLISA sur le surnageant de culture du clone. On soumet le

clone à une culture à plus grande échelle en uti-"

lisant une plaque de culture à 24 puits (MS-

30240;'Sumitomo Bakelite), un ballon de culture T-25 (=25100; Corning) et un ballon de culture T-75

(=25110; Corning). Ce clone est appelé 'Hybridome FKF-

1F3" et est dépose sous le numéro FERM P-9784 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology situé à Tsukuba, Ibaraki-ken, Japon. L'anticorps monoclonal humain FKF-lP3 est une

IgM (t, k).

Exemple 2:

*.Analyse de l'antigene reconnu par l anticorps

FKF-!F3:

(1) Préparation de LPS de P. aeruqinosa On prépare le LPS P. Aerucinosa de la même manière que dans le procédé de Westphal et coll. ("Methods in Carbohydrate Chemistry", Academic Press, N.Y., Vol. 5, pages 83 à 9.1 (1965)). Autrement dit, on traite le corps bactérien humide (4 g) avec

du phénol à 45% chauffé à 65 - 68*C, on refroi-

dit en-dessous de 10'C et on soumet à une centrifuga-

tion & 3000 tpm pendant 15 minutes, ce qui extrait le LPS vers la couche aqueuse. On dialyse la couche

aqueuse contre de l'eau pour éliminer lephénol et on con--

centre à pression réduite pour former des micelles de LPS que l'on soumet à une ultra-centrifugation pour récupérer le LPS. On obtient à chaque fois 2 mg de LPS de souche standard Type A IID1001,de souche typeE PA103 et de souche standard type G I1D1020. Le corps bactérien de d. aeruginosa utilisé provenaitde la Collection l'Institut de Recherche en Sciences Médicales de l'Université de Tokyo, au Japon. On le trouve également à l'American

Type Culture Collection (ATCC) aux Etats Unis.

(2) -Analyse de 1'antigène parlam4thode Westernblot. On soumet le LPS de types A et E de -P. aeruginosa à une électrophorèse sur gel d'acide désoxycholique (DOC)/polyacrylamide selon le-procédé

de Komuro et coll. (Résumé des rapports du 33 collo-

que sur les toxines à Osaka, pages 94 à 99 (1986)), et on plonge le gel dans un tampon de transfert (tris mM-glycine 192 mM, pR 8,3, méthagol-.à 20% {v/v)) à 4*C pendant la nuit et on transfère sur une membrane Durapore (Millipore) & la temperature ambiante, puis on fait incuber avec un tampon PBS contenant 2% de caséine à la

température ambiante pendant 1 heure pour obteni un bloca-

ge. En outre, on effectue une incubation avec une so-

lution à 0,1% de BSA et une solution de TBS contenant

du FCS à 10% à la température ambiante pendant 1 heure.

Sur la membrane Durapore bloquante résultante, on fait.incuber des. solutions aqueuses du surnageant de culture FKF-1F3 et de l'anticorps monoclonal humain HI-006 (IgM) reconnaissant spécifiquement l'antigène O d type E comme témoin à 370C pendant 1 heure puis

à 4 C pendat -la nuit. On lave la membrane de Dura-

pore avec une solution de TBS contenant 0,05% de Tween 20 (pH 8,0) 5 fois et on fait incuber avec le

second anticorps (anticorpsanti-immnunoglobine humai-

ne marqué-à la peroxydase, dilué avec 1% de BSA et du PBS contenant 0,05% de.Tween 20 au 30000) à - 37*C pendant 1 heure. De mêmer on procède à un lavage avec du PBS contenant 0,05% de Tween 20 (pH 8,D) cinq

fois, et on effectue une coloration avec un agent colo-

rant (PBS contenant 0,5 mg/ml de chloronaphtol, 20% de méthanol et 0,08% d'H202; pH 7,5). A la suite de cela, on reconnait un groupe de bandescoloréeS en échelle du. à la réaction avec l'anticorps FKF-1F3 sur le parcours d. electrophorèse de P. aeruginosa

type LPS, tandis qu'il ne se produit pas de réac-

ton sur le parcourÀ d 'électrophorese de P. aerui-

nosa type E LPS. Dans le cas de EI-006, comme témoin, les bandes en échelle sont reconnues sur le parcoure d'électrophorèse de type E LPS, mais on n'observe - pas de coloration sur un quelconque autre parcours.

Exemple 3

Etude du spectre de liaison de l'anticorps FKF-lF3 par la méthode. ELISA

(1) Propriété de liaison de l'anticorps FKFP-

1F3 aux souches sérotypiques 0e référence de P. aerugiInosa

- De la même manière que dans. l'exemple i (2},.

on examine la propriété de liaison de l'anticorps

FKF-lF3 aux souches sérotypiques de P. aeruginosa-se-

Ion la méthode ELISA, dont les résultats sont présen-

tés au tableau 2. Les souches utilisées proviennent de

la Collection de l'Institut de Recherche en Scien-

ces Médicales de l'Université de Tokyo, au Japon, et cultivées dans un milieu gélose d'infusion cùr

ou un milieu de bouillon d'infusion de coeur.

tableau 2 Activité'de liaison de l'anticorps

FKF-1F3 aux souches sérotypiques de réfé-

renc. de P. aeruqiînosa selon la classification de la Commission Japonaise i,,- -- i*Z."... l -.. '.-_.; i, 3 7. " - i]lT S'rotype Souche Activité de liaison 'OD405)

A IZZD 1001 0,6

B IID 1002' 0

B ZOID 007 0

B ID 1013.

B IID 5004 0.

C z1D 1021 O

D:Z1 1004 0

E Z.XII 1130

l TZID 1006 0-4

GI.IIJ 1020 094

J ItZ 1011 0

K MID 1012, O0

'I 53ID141 0

M ZID 5018 0t1

M - ZUD 1015 013

Note: *) Absorption apres coloration selon'la mé.tho-

de ELISA (45 minutes).

20. On révèle ainsi que l'anticorps PFKF-lF3a une propriété de liaison spécifique -avec les types A,FG et M.

(l2) Propriété de liaison de'l'anticorps FIF-

1F3 aux souches cliniquement isolées

On examine la propriété de liaison de l'anti-

corps FKF-lF3 sur les types A et G qui sont clinique-

ment isolés avec une fréquence élevée. Pour l'examen

on utilise 19 isolats cliniques de type A et 19 iso-

lats cliniques de type G. Comme résultat, 1l'anticorps se lie à 14 isolats cliniques de type A (74%) et à isolats cliniques de type G (53%) comme on le voit

dans les tableaux 3 et 4.

Tableau 3: Activitè de- liaison de l'anticorps FKF-1F3 à 19 isolats cliniques de serotype A Souche Activité de liaison(OD405) SP6745 0rs SP6746 lr6 SP6783 lr2

SP6818. -- 2,5

SP6830 0,6

SP6840 2p4 SP6708a 12_

SP9710 20O

SP9711 - r6

SP9731 0!1

SP9762 0.l.

SP9763 Orl

SP9768 1,6

SSP9780 2,1

SP10029 y 4

P$0040,4

SP1O060 0,6.

SP10618 1 7

$SP10676 0,2

Note: *) Absorption après coloration selon la methode

- ELISA (au bout de 45 minutes).

Tableau 4: Activité de liaison de l'anticorps FKF-1F3 à 19 isolats cliniques de - sàrotype G Souche- Activité de liaison(OD405)

SP9704 1,7

$P9709 16

SP9712 0,1

SP9714 1,4

$SP9717 0

SP9718 op8

SP9738 0,7

* S-78 10-

SP9785 1p1 1UO ' srP9743. 1,8

SP9792 0,1

SP9755 51 -

SP9761. 0

SP9767 - 1,3

SP9772 0

GN411187 4

-TL2378 1,7

TL.2424 'O

ZP6788 1,3

SP9728a 0,3

Note *) s Absorption après coloration selon la métho-

de ELISA (au bout de 45 minutes) On examine également l'activité de liaison de

l'anticorps FKF-lF3 avec les isolats de P. aerueinosa sero-

type M provoquant des infections. broncho-osophagien-

nes chroniques fréquentes. Les résultats sont pré-

sentés au tableau 5, d'après lequel on voit que l'ac-

tivité de liaison dépend largement de l'origine des souches et que ledit anticorps est lié aux souches

testées à raison de 10 à 99%.

Tableau 5: Activité de liaison de l*anticorps' PKP-1F3 aux isolats cliniques de sérotype M. Souche Lieu et/ou année ActivitOn de liaiso

d' isolement r$e -

*' sP9716 Sp9730 0t

-SP97441

SP9748 Tokyo 0 4

$R9749.

sP9752 1984 1 SP9775 l

SP1OO67 014

SP1067 51

tSP6763.:., r1,-

SP6764 9

0,

SP6765

1)0

$P6782

SP6794 Kyoto 0 GN6833 tr1

TL6852 1984

TL6890

SP6892

sP6895

SP6908,,7

Note *) Absorption après coloration selon la méithode ELISA ( au bout de 15 minutes)

Exemple 4

Propriété de liaison de l'anticorps FKP-1F3 avec E. coli J5 DE la même manière que dans 1'exemple 1 (2)},

on examine l'activité de liaison de 1'anticorps. FF-

1F3 avec E.col-i type Rc mutant J5 (ATCC 39355) selon la méthode ELISA. On fait incuber la souche J5 dans un milieu gélose d'infusionde coeur. Les résultats sont présentés au tableau 6, d apres lequel on comprend que l'anticorpâ FKF-1P3 se lie avec P.aeruginosa IID 1001 (sérotype A-).comme témoin positif et faiblement avec

l.,coli J5.

Tableau 6

Souche Aotivi Dde l aison ^ ".,.,."_. s1 - --.' E, coli Js 0,3 P, ateuinosa 'ID lOOl 0,6

Exemple= 5

Etude de la spécificité de liaison par un système compétitif: Comme il se confirme que l'anticorps FPKF-lF3 est lié aux corps bactériens P. aeruginosa IID 1001 (sérotype'A) et P. aerug.inosa IID 1002 (sérotype

B) on examine la spécificité de liaison par un sys-

tème compétitif, c'est à dire de la même manière que

dans l'exemple 1 (2) parlaméthode. ELISA en utili-

-sant une plaque bactérienne. Comme substance compéti-

tive, on utilise du LPS (a chaque fois 50 Pg/ml) de P. aeruginosa IID 1001 (sérotype A), P. aeruginosa IID 1002 (sérotype B), P. aeruqinosa 103 (sérotype E), P. aeruginosa 1ID 1020 (sérotype G), E. coli O-1ll

B4 et J5. Les résultats sont présentés au tableau 7.

26Z6473

Tableau 7

Plaque antigénique Origine de la. substance Activit de compétitive (LPS) liason (oD405 Souche PA IID1001 - PA iID 1001 06 PA IID 1002 2t4

PA PA 103 24'

PA IID 1020 19

EC 0-111'B4 2f5

BC J5 2,1

2t3 - r, _ -., , Souche PA IID1020 PA IoD 1001. -o,2 PA IZD 1002 ltQ

PA PA 103,

PA ID 1020 07

MC.0-11i:E4 - 1B

EC J$ 0,8

t (-) À}0,9

.;.- llm = i..

Dans les plaques de corps bactérien de P. aeruginosa IID 1001 et IID 1020, le LPS provenant de IID 1001 inhibe fortement la liaison de l'anticorps WKF-1F3, et le LPS provenant de IID 1020 présente une

faible activité d'inhibition. D'autres LPS ne présen-

tent pas d'activité, ou seulement une activité très

faible.

Exemple 6

Propriété de liaison de 1'anticorpà FKF-lF3 au LPS provenant de P. aeruginosa: On dissout du LPS provenant de P. aeruqinosa

(l g/.ml, de la phosphatidylcholine (5 gg/ml), du cho-

lestérol (2,5 ug/ml) dans l'éthanol et on répartit solution résultante dans une plaque à 96 puits

à raison de 10 Pl par -puits, puis on laisse re-

poser à 37 C pendant 2 heures pour sécha-

ge. On ajoute une solution de-BSA-PBS à 3% (100 pl)-, suivi par une réaction à la temperature ambiante pendant 2 heures aux fins de saturation pour obtenir une plaque d'antigène utilisant le LPS comme antigène (Kannagi et coll.: "Application of Immunological Methods in Biomedical Science", Blackwell Scientific, Oxford, pages 117.1 - 117.20

(1986))>

On effectue 1 test ELISA de la maq manière que dans l'exemple 1(2) en utilisant du. PBS à 045% de BSA au lieu

de PBST. Les rêsultats sont présentés au tableau 8.

Tableau 8.

-........ r-..... -..,-..-* --

T Activité de liaison Origine du LPS Sérotype D45 ::L-. 'l / - I _ i.... , 1:1J.: ! P. aeruginosa A IID i001 A '0- 7 P. aeruginosa A IID 1002 B 01 P. eruginosa PAO 1822 B 0,1 P. aeruginosa PA 103 E 0>2 P. aeruginosa!ID 1020.G 03 L'anticorps FKF-1F3 est lié fortement à LPS provenant de P. aerugqi2nosa IID 1001 (sérotype A) et faiblement à LPS provenent de P. aeruginosa IID

1020 (sérotype G).

Exemple 7

Propriété de liaison de l'anticorps PFP-1F3 avec le LPS et avec le lipide A provenant d' une Salmonella,

On examine la propriété de liaison de l'anti-

corps FKF-1F3 avec une série de LPS provenant de almone!llaminnesota par la reaction compétitive selon laméthode ELISA. On mélange l'anticorps FKF1F3 avec

du LPS provenant de S. minnesota et du lipide A (né-

cessaire de LPS très purifiée; List Biological Laboratories, Ine.) comme substances compétitives 'à des concentrations de 2,5 hIM et 25 PM, suvi par une incubation à 370C pendant i heure. on effectue le test

ELISA en utilisant une plaque à 96 puits fi-

xant les bactéries P. aeruginosa IID 1001 aux fins de mesure du taux d'inhibition. Les'résultats sont présentés au tableau 9, d'o l'on comprend que l'anticorps FKP-1F3 a une forte propriété de liaison avec

le lipide A et le LPS (Rc, Rd, et Re type rugueux).

Tableau 9

1 5 ' _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ *,__ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Chémotype de LPS Activité de liaison (OD405} 0,25 >M 25 pM LPS type sauvage 0 24 0,29 xa -0,27.,25 Rb 0,24 ' 0,22

0122 ' 0,07

R. 0c 07 0,04 Re 0r03 0 Lipide A 0,12 0_02

( _,), - -0*26 0> 26

Note: l'activité de liaison indique l'activité après déduction de la valeur pour l'essai à hlanc

(0,14).

Exemple 8

Propriété de liaison du FKP-P1F3 au lipide A des bactéries Gramnégatives:

On effectue des recherches en utilisant du li-

Z426473

pide A provepant d'E. coli, du lipide A provenant de S* t phimurium remutant (Ribi Immunochem. Research ÀInc., Hamilton; MT) et du lipide A provenant de S. minnesota R595 (List Biological Laboratories Inc.) de la même manière que dans l'exemple 7 selon la

méthode ELISA. On prepare le LPS et le lipide A prove-

nant de P. aeruginosa IID 1001 comme suit.: selon le procédé de Westphal et coll., on traite la fraction

soluble dans l'eau obtenue-par extraction avec du phé-

nol chaud à 45% avec du bromure de cétylméthylammo-

nium ("Cetavlon"; Nakarai Chemical) aux fins d'éli-

mination des acides nucléiques, et on utilise le préci-

pité à leéthanol comme spécimen de LPS (Methods Carbohydr. Chem., 5, 8391 (1965)); on hydrolyse le LPS avec de l'acide acétique a 1% à 100 C pendant minutes, et on utilise l'extrait au chloroforme comme spécimen dg lipide A (Eur. J. Biochem. 52,

331- 343 (19-75)).

De la même manière que dans l'exemple 7, on effectuele test ELISA enutilisant une plaque revêtue de

lipide A provenant de S. minnesota R595 et en utili-

sant le lipide A comme substance compétitive (50 Pg/

ml). Les.résultats sont présentés au tableau io, d'oh -

on comprend que 1'anticorps FKF-lF3 à une propriéte de liaison avec le lipide A provenant de diverses bautéries Gram-négatives.

Tableau 10

Lipide A- Activitê de liaison(00405 P. aoruginosa IID 1OQ. - 025 E. Coli. J5 0'.8 S. typhimurium Re. mutant 0,16 $. minnesota R595 0,18

(-'. 1,07-

47-

Exemple 9

Activité de liaison de l'anticorps FKP-lF3 avec

le LPS provenant de P. aeruginosa.

on compare la propriété de liaison avec le LPS pro-

S venant de P. aeruginosa lID 101 celle avec le LPS d'E. coli et de S. minnesota. On effectuele test ELISA de la même manière que dans l'exemple 8 en utilisant une plaque revêtue du lipide A de S. minnesota R595 et en utilisant du LPS intact et du lipide A provenant de P. aeruqinosa IID 1001 (Cf exemple 8) et de LPS type lisse et de lipide A provenant d'E. coli et de S. minnesota comme substances compétitives (50 Ég/ml). Les résultats sont présentés au tableau li d'o l'on comprend que l'anticorps peut être lié au lipide A provenant de n'importe quel microorganisme et au LPS de type lisse provenant seulement de P. aeruginosa. La raison pour laquelle on n'observe pas de propriété de liaison avec le LPS de type lisse est probablement due à la formation de micelles avec le

LPS en solution aqueuse, ce qui fait que la frac-

tion lipide A n'est pas exposée, l'empêchement sté-

rique de la fraction polysaocharidique. Dans le cas

de P. aeruginosa, n'importe quel site de liaison d'an-

ticorps peut être présent outre le lipide A. Tableau 11 Substance compétitive Activité de liaison (OD4} P. aeruginosa IID 1001 LPS0 P. aeruginosa IID 1001 Lipide A 0,24 E. colt 011: B4 LPS 102 E. colt J5 LPS 018 S. minnesota type sauvage LPS 1l07 S. minnesota R595 LipAde A.z20

(-) 1;12

48'

Exemple 10

Propriété de liaison de l'anticorps FKPF-F3 a la chitine:

Antérieurement, Teng et coll. ont réussi à prepa-

S rer un anticorps monoglonal humain (IgM) contre le LPS d'. c1li J5 (Proc. Natl. Acad. $ci., U.S.A., 82, 1790 - 1794 (1985}). Dans leur article, il est indiqué que l'anticorps a une propriété de liaison

a la chitine (homopolymère de N-acétylglucosamine).

Dans cet exemple, on effectue les recherches sur la propriété de liaison de.l'anticorps PKF-1F3 chitine selon la méthode ELISA en utilisant uhe plaque revêtue de lipide A provenant de S. minnesota

R595 et en utilisant de la poudre de chitine-prove-

nant de carapace de crabe (Nakarai Chemical) comme substance compétitive de là même manière que dans l'exemple 8. Les résultats sont présentés au ta-' bleau 12, d'o l'on comprend que l'on n'observe pas de réaction croisée entre l'anticorps FKF-iF3 et

la chitine. Ainsi, 1'anticorps FKF-1F3 diffère de l'an-

ticorps humain anti-LPS de E. coli J5 par 1'épitope.

reconnu.

Tableau 12

Substanc cmpétitive DOse Activrté de liaison Substance competitive (g) (QD4os n tChitin e S,05

110!

Lipide A provenant de 5 01-33 S. minnesota R595 10 0.18 {')<q. 1.07

26264 73

Exemple 11

Séparation de la fraction polysaccharidique de LPS et analyse de l'antigène: (1) Séparation de la fraction polysaccharidique du LPS provenant de P. aeruginosa IID 1001

Selon le procédé de Wilkinson et coll. (Eur.

J. Biochem, 52, 331 (1975), on sépare la fraction poly-

saccharidique du LPS provenant de P. aeruqinosa IID 1001.

Autrement dit, on dissout du LPS (10 mg) dans de l'acide

acétique à 1% et on hydrolyse à l00 C pendant 90 minutes.

on élimine le lipide A libéré par fractionnement avec du

chloroforme. On soumet, la fraction soluble dans l'eau ob-

tenue à une chromatographie sur colonne (taille de la co-

lonne 1 x 70 cm) en utilisant du dextran ("Sephadex G50";

Pharmacia, Uppsala) équilibré avec un tampon pyridine-

acétate 50 mM (pH 5,5) pour le fractionnement. On dis-

tingue par spectophotométrie les fractions auxquelles

le polysaccharide, l'oligosaccharide du noyau de type semi-

rugueux et l'oligosaccharide du noyau du type rugueux sont 2 élués. On détecte le saccharide neutre parle procédé de l'acide phénol-sulfurique (Dubois et coll.: Anal. Chem. 28, 350 (1956)), et on hydrolyse l'aminosaccharide avec de l'acide sulfurique 2N à 1000C pendant 2_heures puis

on détecte par le procédé MBTH chlorhydrate de (3-méthyl-

2-benzothiazolinone hydrazone (Tsuji et coll.: Chem.

Pharm. Bull. 17, 217 (1969)>. On recueille après lyophi-

lisation les fractions de polysaccharide, les fractions

d'oligosaccharide de core du type semi-rugueux et d'oiago-

saccharide de core du type rugueux.

2624473'

(2) Propriét4. de liaison de l'anticorps PKF-

1F3 à la fraction polysaccharidique On étudie la compétition de l'anticorps

FKF-1F3 avec le polysaccharide, l'oligosaccharide de.

core du type semi-rugueux et l'oligosaccharide du ty-

pe rugueux provenant de P. aeruginosa IID 1001 tel qu'obtenu dans l'exemple 12 (1) selon la méthode ELISA de la même manière que dans l'exemple 7, La quantité de

substance compétitive utilisée est la quantité corres-

pondant à 20 nmoles du saccharide neutre selon le procédé au phénol-acide sulfurique tel-que mentionné dans

l'exemple 12 (1). Les résultats sont présentés au ta-

bleau 13.

Tableau 13 Substance compétitive Activité de liaison

(0-405)

Polysaccharide 0.04 Oli9gosaccharxde du core 0,42

de.type semi-rugueux.

oligosaaóharzde du core o le type rUgue8 0-3r

["1* - _039.

D'après les résultats ci-dessus et l'essai de Western blot dans l'exemple 2 (1), on peut dire que

l'épitope tel que'reconnu par l'anti-

corps FKPRF-lP3 est présent dans la fraction polysac-

charidique en'plus du lipide A, dans le cas de certaines

souches de P. aeruginosa. -

ExemPle 12

Effet thérapeutique de l'anticorps PXFKF-1F3 sur les infections expérimentales à P. aeruqinosa chez les souris s (1} Effet thérapeutique sur les infections à P. aeruqinosa (sérotvpe G)

On inocule par voie intrapéritonéale-à des sou-

ris ICR-slc (âgées de 4 semaines; mAles; 10 animaux par groupe) 1,2 x 104 ou 6,2 x 104 cellules d'isolat clinique

de P. aeruginosa SP 6788 (sérotype G). Au bout d'une heu-

re, on administre par voie intrapéritonéale l'anticorps FKF-iP3 (0,1 pg). Le jugement de l'effet thérapeutique se fait sur le taux de survie au bout d'une semaine. Les résultats sont présentés au tableau 14, d'o l'on comprend que tous les animaux survivent dans les groupes traités et que l'anticorps FPXF-1F3 est efficace dans le traitement

des infections à P. aeruqinosa (sérotype G).

Tableau 14

Anticorps Dose Taux de survie (%) (quantité inoculée CUu/tate 1,2 x 1o 6, 2 x 10 ?KF-1F3 ODl Pg/tête 100 100 Aucun - 30 (2) Effet thérapeutique sur les infections a P. aeruginosa (sérotvDes A)

On inocule par voie intrapéritonéale à des sou-

3U ris 5%mutin ICR-slc (agées de 4 semainès; mâles; animaux par groupe) 3, 7 x 104, 1,5 x 105 ou 7,3 x 105 celules d'isolat clinique de P. aeruginosa SP6788 (sérotype A). Au bout dd'une heure, on administre par voie

intrapéritonéale l'anticorps PFKP-1F3. (0,l v.g). Le juge-

ment de lteffet thérapeutique se fait sur le taux de sur-

vie au bout d'une semaine. Les résultats sont presentés au tableau 15, d'o l'on comprend qu'un taux de survie significatif est produit dans les groupes traités même lorsque la quantité inoculée atteint 1,5 x 105 cellules

et que l'anticorps KF-1F3 est efficace dans le traite-

0 ment des infections à P. aeruginosa (sérotype A).

Tableau 15

Anticorps Dose-* Taux de survie (%) (quantit inooulée CrU/.tête 3*p7 X, _, 1, O:.l 75 XlO?,3 ZP-1P3 O t1)1g/%Ste 10,0 8,0 ' BSA 2 a/tet e 80 0Q 10 Sel phys. - 50 10 0 2626z473

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonal humain, qui a une pro-

priété de liaison spécifique avec les polysaccharides 0 des souches de Pseudomonas aeruginosa classées dans

deux-ou plusieurs sérotypes différents par la classifi-

cation de la Commission Japonaise et également une pro-

priété de liaisofin avec le lipide A provenant dus bactéries Gramnégatives. 2. Anticorps selon la revendication 1, pour lequel lesdits sérotypes sont choisis entre les types A, F, G et M. 3. Anticorps selon la revendication 1, ou 2,

pour lequel lesdites bactéries Gram-négatives sont choi-

sies parmi Eschirichia, Salmoneila et Pseudomônas.

4. Anticorps selon la revendication 3, qỉ réagit avec le lipide A provenant d'Escherichia coli

mutant Rc.

5. Anticorps selon la revendication 4, qui réagit avec le lipide A provenant d'Escherichia coli mutant Rc J5 {ATCC 39355)

6. Anticorps selon l'une quelconque des reven-

dications 1 à 5, qui est une IgM.

7. Anticorps monoclonal humain F"F-1F3 8. Composition prophylactique ou thérapeutique contre les infections bactériennes, qui comprend une quantité efficace de l'anticorps selon l'une quelconque

des revendications 1 à 7 comme ingrédient actif.

9. Utilisation d'un anticorps monoclonal humain

tel que défini dans l'une quelconque des revendications

1 à 7, dans la préparation d'un médicament contre les

infections bactériennes provoquées par des bactéries-

comprenant les bactéries Gram-négatives.

10. Utilisation d'uin anticorps monoclonai humain

tel que défini dans l'une quelconque des revendications

1 à 7, dans la préparation d'un médicament contre les infections bactériennes provoquées par des bactéries

comprenant Pseudomonas aeruginosa.

l1. Utilisation d'un autre corps monoclonal

humain tel que défini dans l'une quelconque des revendi-

cations 1 à 7 dans la preparation d'un médicament desti-

né à prévenir ou traiter le choc endotoxinique provoqué

par les bactéries Gram-négatives.

12. Lignée cellulaire transformée par le vi-

rus d'Epstein-Barr qui.est capable de produire l'anticorps

selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et toute

lignée cellulaire descendante qui provient d'une telle lignée. 13. Hybridome obtenu par fusion cellulaire

d'un lymphocyte B humain comprenant une cellule trans-

formée par le virus d'Epstein-Barr avec une cellule de myélome, ledit hybridome étant capable de produire

l'anticorps selon l'uee quelconque des revendications

1 à 7, et toute lignée cellulaire descendante qui pro-

vient d'un tel hybridome.

14. Hybridome FK-tF3 et toute lignée cellu-

laire descendante qui en provient.

15. Procédé de production d'un anticorps mono-

clonal humain dans lequel on soumet la lignée cellulaire

ou l'hybridome selon l'une quelconque des revendications

12 à 14 à une culture-cellulaire et on recueille l"anti-

corps produit à partir du surnageant de culture.