JPH02231096A

JPH02231096A - ヒトモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH02231096A
Application number: JP1052733A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Yokota; 伸一横田; Hiroshi Otsuka; 浩史大塚; Hiroshi Ochi; 宏越智; Hiroshi Noguchi; 浩野口
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1989-03-03
Filing date: 1989-03-03
Publication date: 1990-09-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｌ１上二且亙ユ１本発明はダラム陰性菌のエンドトキシンの本体であるリ
ポ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）中のリビドＡを認識するヒトモノ
クローナル抗体産生株ＮＭ−３Ｄ７とその製造方法及び
その用途に関する。ＮＭ−　３　Ｄ７の産生ずる抗体は
、グラム陰　菌による感染症、更に具体的には、それら
感染症によって引き起こされる敗血症及び敗血症性ショ
ックの予防治療剤として有用である。

及豆立宣１最近の医学の進歩によって、易感染患者すなわち、免疫
抑制剤投与により免疫能の低下した患者、または癌患者
、術後創をもつ患者、熱傷患者および新生児などの免疫
不全、免疫低下症の患者が増加している。それに伴って
易感染患者への細菌感染症も増加の傾向にあり、特に抗
生物質耐性の頻度の多い大腸菌、緑膿菌、クレブジエラ
などのダラム陰性菌による感染症の予防治療が問題とな
っている。

細菌感染症の治療には従来から抗生物質が用いられてい
るが、本来抗生物質は細菌の増殖を鎮静させる作用をも
つものであり、血液中もしくは体内に遊離して存在する
エンドトキシンを中和する効果はない。更には、近年、
緑膿菌をはじめとして、抗生物質が有効に働かない菌に
よる感染が問題となってきている。血液中もしくは体内
に存在する毒素を中和する方法、又は細菌感染症に対す
る抗生物質以外の予防治療方法としては、免疫グロブリ
ンの投与いわゆる抗体療法があり、抗生物質療法と併用
され、又はそれに代わるものとして注目されている。

ヒト以外の動物由来の血清を用いた抗体療法がヒトにお
いても有効性を示すことは、ジフテリア毒素や蛇毒の例
で周知のことである。しかしながら、ヒト以外の動物か
ら得られた異種蛋白をヒト体内へ移入するこの方法は、
アナフィラキシーや、その他のアレルギー反応などの重
篤な副作用を引き起こすので、一般細菌感染症、更にそ
れに伴う敗血症に対する治療法として採用されるに至っ
ていない。

しかしながら、健常人又は、細菌感染既応患者から血液
から得ている従来のヒト免疫グロブリン製剤は、ヒト以
外の異種動物由来の免疫グロブリンを投与した時に見ら
れるアテフィラキシー等の副作用は無い等の利点をもつ
が、幾つかの欠点を持つ。第一に、毒素に対する抗体価
が低く、必ずしも十分な治療効果を期待しえない。第二
に、高力価の免疫グロブリンを大量に安定して供給する
ことが難しい。健常人ボランティアや患者より採取され
た血液を材料に製造されており、高い力価の血清を一定
して入手することは極めて難しく、製造ロット毎に、抗
体価が変動することがある。

第三に、任意のヒトの血液を材料に製造されることによ
り、免疫グロブリン製剤にＨＢウィルスなどの肝炎ウィ
ルス、Ａｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋａｅｍｉａ
　ｖｉｒｕｓ（ＡＴＬＶ．　ＨＴＬＶ）やエイズウイル
ス（ＨＩＶ）などが混入することがあり得る。

以上の欠点を克服するために、本発明者らは、細菌内毒
素に対して高い抗体力価を有し、すぐれた毒素中和能を
有するヒトモノクローナル抗体の作製及びそれを用いた
グロプリン製剤の開発に着手した。

本明細書中のモノクローナル抗体とは、単一な抗体産生
細胞クローンにより産生される、均一な分子構造を有す
る抗体を指す。

その結果、本発明者らはダラム陰性菌内の毒素としての
活性を担っているリビドＡ部位を認識し、カブトガニ血
液凝固系中のリポ多糖感受性プロテアーゼの活性化を中
和すること、及びグラム陰性菌ラフ株の菌体に結合し、
菌を凝集させる能力をもつことを特徴とするヒトモノク
ローナル抗体を産生ずるヒトモノクローナル抗体産生株
ＮＭ−３Ｄ７を樹立するを樹立することに成功した。ま
た、さらにその株の抗体の産生量が約１００ｍｇ＃’　
−ｄａｙ舎１０’　　ｃｅｌｌｓと非常に高かった。

従遂Ｊ四文術現在まで、ダラム陰性菌エンドトキシンに対するマウス
モノクローナル抗体もしくはヒトモノクローナル抗体を
産生ずる細胞株が樹立され、それらの一部については、
特にエンドトキシンショックに対する効果を動物を用い
た実験的感染症治療実験、または臨床の場において検討
がなされている。（アッペルメルクら、　Ｊ，Ｍｅｄ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２６、１０７−１１４　　（１
９８８）　）。これら゜の文献において、モノクローナ
ル抗体のエピトープは同じリビドＡでありながら実験的
感染症治療実験の結果については、効果の認められてい
る報文と全く認められない報文とに別れており、抗リビ
ドＡ抗体を取得したとしても、エンドトキシン中和能は
必ずしも期待できないのが現状である。エンドトキシン
ショック治療用として、モノクローナル抗体が臨床の場
で用いられた例は、唯一、特開昭６２−２２８２９５に
フエイズＩ臨床試験の４例が開示されているが投与され
たのはマウスモノクローナル抗体であり、前述の通り、
ヒト以外の蛋白に起因するアナフィラキシーやその他の
アレルギー反応などの副作用の危険性は避けられない。

一方、ヒトモノクローナル抗体についても多くの文献が
公知である。（ポラックら、Ｊ．ＣＩｉｎ．　　［ｎｖ
ｅｓｔ　．７９．１４２１−１４３０（１９８７）　）
　．これらのヒトモノクローナル抗体についても、エン
ドトキシン中和能は、ガラクトサミン感作マウスでの致
死活性中和が２例（特開昭６１−７２８００及び、特開
昭６１−５００３５５），　ウサギでのシュワルツマン
反応の中和が１例（テンら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　
Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　８２．１７９０−１
７９４（１９８５））で示されているにすぎない。

更に、試験管内培養によって得られるヒトモノクローナ
ル抗体を静注用免疫グロブリン製剤として用いる場合に
問題となるのは、細胞培養用培地中に存在する異種蛋白
である。この異種蛋白を除去するためには、通常の生化
学的手法を用いた精製を行う必要があるが、多くのハイ
ブリドーマは、血清由来の蛋白、例えばウシ胎児血清や
ウシ血清アルブミンなどが培養の際に必須なことが多く
、イムノグ口プリンの精製の効率を大きく下る。以上の
状況はインシュリン、トランスフエリンなどの限られた
蛋白しか含有しない無血清培地を用いて培養することに
より、解決されるが、ハイブリドーマを抗体産生量や増
殖速度の低下を伴わずに無血清培地へ馴化することは必
ずしも容易ではない。前述のヒト抗エンドトキシンモノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマのうち無血清
化がなされていることを報告しているのは、２例にとど
まる。うち一例はテンら（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ　Ｉ．　
Ａｃａｄ．　Ｓｃ　ｉ．ＵＳＡ．　８２．　１７９０−
１７９４（１９８５））の報文であるが、これらハイブ
リドーマのイムノグロブリン産生量は、２　〜３　０　
ｕ　ｇ／１０’　ｃｅｌｌｓ−ｄａｙであり、本発明に
よって得られるヒトモノクローナル抗体産生細胞ＮＭ−
３Ｄ７の約１００ｍｇ／ｊ’−ｄａｙ／１０＠ｃｅｌｌ
ｓに比較すると非常に低いものである。残り一例は、特
開昭６１−７２８００に開示されている。本例において
は無血清培地ＨＬ−１　（ベントレックス）にて培養し
、細胞数ＩＸＩＯ’から８〜９Ｘ１０’個において５　
０−７　０μｇ／ｄのモノクローナル抗体を産生ずる細
胞株について言及している。しかしながら該抗体を産生
ずる細胞株は、ヒト末梢血リンパ球をエプスタイン・バ
ーウィルスにより形質変換させた後に、マウス・ヒトヘ
テロハイブリドーマとの細胞融合によって得ている。し
かしながら、エプスタイン・バーウィルスには、感染性
があり、特にＥＢＶ抗体陰性の人（日本人では成人の５
％以下）は、その感染によって重篤な伝染性単核症にな
る可能性がある。動物細胞が産生ずるヒトモノクローナ
ル抗体を製剤とする場合、産生細胞株中のウイルス由来
ＤＮＡの混入はバイオハザードの面から完全に否定され
なければならない。

以上のように、本発明で取得したヒトモノクローナル抗
体産生株ＭＮ−３Ｄ７はその抗体産生量、中和活性、安
全性、無血清培地での増殖可能の点からこれまでにない
性質を備えている。

通常モノクローナル抗体産生株は、生体内もしくは生体
外にて任意のダラム陰性菌（生菌または、ホルマリンや
加熱による死菌菌体）、もしくはＬＰＳまたはそのＬＰ
Ｓに由来するリビドＡによって感作されたヒトリンパ球
Ｂ細胞を骨髄腫細胞（ミエローマ：ｍｙｅｌｏＩＩｌａ
）又はＢリンバ芽球様細胞（ＢＩｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ
ｏｉｄ　ｃｅｌｌ）と細胞融合することにより、試験管
内にて連続的に細胞増殖し、かつ所望の特異抗体を連続
的に産生ずる細胞株を樹立する。

これらの樹立株を試験管内培養し、培地中に分泌される
抗体を精製することにより抗体を大量に製造する。

ＬＰＳ　（リポ多糖）は、ダラム陰性菌外膜の主要構成
成分であり、細菌内毒素の本体である。その生物活性は
、致死毒性、発熱、シュヮルッマン反応など多岐に及ぶ
。ＬＰＳ分子は、〇一特異側鎖、コアオリゴ糖、リビド
Ａの三部位から構成されている。〇一特異側鎖は、ダラ
ム陰性菌の熱安定性抗原（〇一抗原）を担っている部位
であって、緑膿菌で数十種、大腸菌で百十種存在するこ
とが知られている。〇一特異側鎖の種類が多いのに比較
して、コアオリゴ糖、リビドＡは共通性の高い部位であ
る。コアオリゴ糖は内部コア（ｉｎｎｅｒ　　ｃｏｒｅ
）及び外部コア（ｏｕｔｅｒ　ｃｏｒｅ）に分けること
ができる。内部コアはダラム陰性菌全般に共通で、２一
ケトー３−デオキシオクトン酸、ヘプトース、エタノー
ルアミン、リン酸等から成っている。また、リビドＡは
β１→６結合で連結したグルコサミン２糖を主骨格とし
た糖脂質であって、この部位もダラム陰性菌全般に共通
性が高い。即ち、細菌内毒素を中和する抗体とは、ＬＰ
ＳのリビドＡもしくは、内部コアを認識する抗体である
。

モノクロ′−ナル抗体とは、単一な抗体産生細胞クロー
ンにより産生される、均一な分子構造を有する抗体を指
す。

本発明を以下、更に詳細に説明する。

本発明に含まれるヒトモノクローナル抗体の製造方法は
、基本的に、以下の諸過程にわけることができる。

■抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の調製■無制限増
殖能力の賦与によるモノクローナルな特異抗体産生細胞
株の樹立 ■モノクローナルな特異抗体産生細胞の培養■培養液か
らのモノクローナルな特異抗体の精製■モノクローナル
な特異抗体を含む高力価免疫グロブリン製剤の調製順次、以下に説明する。

ヒトのリンパ球Ｂ細胞とは、ＬＰＳの共通部位に対する
抗体を産生ずるヒトリンパ系細胞で、主として末梢血液
よりリンフォプレップ、モノボリ分離液などのリンパ球
分離液を用いた遠心分離法によって分離されるが、各種
疾患の診断および治療の目的で摘出されたリンパ節、牌
臓などの臓器や稠帯血由来のリンパ球Ｂ細胞を材料に用
いることもできる。細菌感染症を患ったことがあり、生
体内で感作された既応症のヒト由来のリンパ球Ｂ細胞を
用いることが望ましい。あらかじめ、血清中のＬＰＳあ
るいは、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｊ５，　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
　ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５などのラフ変異株のホ
ルマリン死菌に対する抗体価を測定することにより適切
なリンパ球提供者を選別することができる。また別の方
法として、細菌感染症の有無を問わず、ヒトリンパ球Ｂ
細胞を採取し、試験管内にてラフ変異株のホルマリン死
菌もしくはＬＰＳを抗原として感作せしめることができ
る。更にアメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）などの
植物生レクチン、Ｃｏｗａｎ■などの菌体成分、又はヒ
トリンパ球の混合培養液や胛臓、胸腺細胞や請帯血細胞
培養液など、Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分化因子等の
リンフォカイン類を含む溶液を同時に、又はそれぞれの
組み合わせで添加することによって試験管内にて抗原感
作し、引き続ぎ抗体産生細胞へと増殖・分化させたヒト
リンパ球Ｂ細胞を用いることができる。

これらのヒトリンパ球Ｂ細胞は、その細胞表面に抗体分
子を有し、ある限られた期間少量の抗体を分泌すること
が可能であるが、無制限に増殖することはできないこと
を特徴とする。抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞を無
限に連続して増殖可能な細胞株とする方法としては、抗
原感作されたヒトリンパ球細胞と骨髄腫細胞とをポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）の存在下に細胞融合する方
法を用いる。用いられる骨髄腫細胞はＰ３Ｘ６３−Ａｇ
８　（Ｐ３）　、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３などの、
マウス骨髄腫細胞由来のヒポキサンチン・グアニン・ホ
スホリポシルトランスフエラーゼ（以下ＨＧＰＲＴと略
する）欠如変異株、ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６由来のＨ
ＧＰＲＴ欠如変異株又は、マウス骨髄腫細胞とヒト骨髄
腫細胞、もしくは、ＳＨＭＤ−３３などのマウス骨髄腫
細胞とヒトリンパ球Ｂ細胞との細胞融合により得られる
マウス・ヒトへテロ骨髄腫細胞由来のＨＧＰＲＴ欠如変
異株などを指す。骨髄腫細胞の代わりに、ヒトＢリンパ
芽球細胞由来のＨＧＰＲＴ欠如変異株を用いることもで
きる。ＰＥＧどしては、ＰＥＧＩ．０００　〜６，００
０を３０〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度で用いる。レクチン
、ポリーＬ−リジンやＤＭＳＯなどを添加することによ
り融合効率を高めることもできる。融合方法は、マウス
細胞どうしを融合し、マウスモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマを取得したケーラーとミルシュタイ
ンらの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５．　１９
７５）に準する。簡単に記述すれば、抗原感作されたヒ
｝　ＩＪンパ球細胞とＨＧＰＲＴの欠如した骨髄腫細胞
もしくは、マウス・ヒトへテロ骨髄腫細胞とを３〜ｌ：
１（７）割合ニテ混合し、４　５％　（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ
１５００〜６０００を０．５〜１分間に少量ずつ加え、
３０秒〜３分間静置する。その後、５〜ＩＯ分間に１０
〜５０−の無血清培地を加え、２一のＦＣＳを加え３７
℃にて１０〜６０分間インキユベートする。遠心後、培
地を加え１０’〜１０６Ｃｅｌｌｓ　／一の濃度に調製
し、９６穴マイクロプレートに１ウエルあたり２Ｘ１０
’〜２Ｘ１０’個の細胞を播種する。翌日、ヒポキサン
チン・アミノプテリン・チミジン含有培地（以下ＨＡＴ
培地と略する）又は、ヒボキサンチン・アザセリン含有
培地（ＨＡｚ培地と略）に半量交換し、５％ＣＯ２　３
２〜３７℃にて培養する。約１０〜２０日間新しいＨＡ
Ｔ培地又はＨＡｚ培地に、続いて約３〜５日間ヒポキサ
ンチン・チミジン含有培地（以下ＨＴと略する）又は、
ヒポキサンチン含有培地（以下Ｈ培地と略する）に、３
日毎に半量ずつ交換を続け約２〜３週間培養して、増殖
してくるコロニー、いわゆるハイブリドーマを得る。

ＨＧＰＲＴ欠如変異株を用いることはなく、代謝阻害剤
を組み合わせることによってハイブリド？マを選択する
ことも可能である。ハイブリドーマの培養液の１７種類
の血清型別パネルから成る１７種類の緑膿菌ホルマリン
死菌あるいはＬＰＳに対する抗体価をＥＬＩＳＡ法又は
ラジオイムノアッセイ（以下ＲＩＡと略する）によって
測定し、更には、ウエスタン・プロッティングの手法を
併用することにより、緑膿菌ＬＰＳの外コア部位に対す
る特異抗体産生株を選別する。限界希釈法又は軟寒天法
によって、２〜３回クローニングを繰り返し、増殖の早
い、特異抗体産生量の多い、安定した細胞株を得る。

以上、細胞融合法を用いて、抗原感作ヒトリンパ球Ｂ細
胞より樹立された細胞株は、連続的に増殖することがで
きること、しかも、特異抗体を安定的に、かつ大量に産
生じ得ることを特徴とする。

これら樹立されたハイブリドーマ（０．５〜５×ｌＯｓ
個細胞／一）を通常の動物細胞培養培地にてＣＯ■イン
キュベーターを使用して２〜１０％Ｃ○２３２〜３７℃
の条件のもとて培養フラスコやプレート等の容器内で静
置培養又は回転培養する。特に大量に培養する時は、動
物細胞用に設計されたジャーファーメンターやホロファ
イバーシステム等を用いることもできる。通常の動物細
胞培養用培地とは、ウシ胎児、仔ウシ、ウシ、ウマおよ
びヒトなどの血清を２〜２０％含有するＲＰＭＩＩ６４
０、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭに代表される培地、又は、
インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン、
セレナイト、ウシアルブミ．ン、リビドなど細胞の増殖
に必要な微量成分を含む無血清培地を指す。

上記の試験管内細胞培養以外に、ハイブリドーマをヌー
ドマウスなどの動物体内へ接種することによって細胞を
腹腔などの体内にて培養することも可能である。マウス
やヌードマウスの場合、１匹あたり０．５〜２．５Ｘ１
０’個の細胞を腹腔内投与する。この場合、細胞接種前
に、ブリスタンや抗アシアロＧＭ，抗体を投与すること
が望ましい。Ｘ線照射や摘牌手術も有効の場合がある。

抗体の精製は通常の生化学的手法を組み合わせることに
よってなされる。すなわち、硫安沈澱分画法、エタノー
ル沈澱分画法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過法、アフィニディクロマトグラフィー
、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法等である。

精製過程において、凝集物の形成や抗体活性の低下を防
ぐ工夫が必要である。例えば、ヒト血清アルブミン（以
下ＨＳＡと略する）を０．０５〜２％の濃度で添加する
。その他グリシンやＬ−アラニンなどのアミン酸類、特
にリジン、アルギニンやヒスチジンの塩基性アミノ酸、
グルコースやマンニトールなどの糖類、塩化ナトリウム
などの塩類を添加することが好ましい場合がある。Ｉｇ
Ｍ抗体の場合、特に凝集しやすいことが知られているの
で、βブロピオニラクトンや無水酢酸などで処理するこ
とで、凝集を阻止することができ静脈内投与も可能とな
る。

精製されたヒトモノクローナル抗体は、基本的には、メ
ンプレンフィルター等による濾過除菌操作の後に、安定
化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥される方法で製剤
化される。

更には、精製された該ヒトモノクローナル抗体をセルロ
ース樹脂やヒドロキシアバタイトなどの担体（マトリッ
クス）に結合せしめ、カラム形状として、体外循環型の
血液浄化装置の材料としての使用も可能である。

該ヒトモノクローナル抗体は、エンドトキシンショック
予防治療剤としてＬＰＳリビドＡ部位を認識する１種類
のヒトモノクローナル抗体より成ることも可能であるが
、更に好ましくは、該モノクローナル抗体とは異なる抗
原決定基を有する２種類以上のヒトモノクローナル抗体
と混合して用いるのが望ましい。これらのヒトモノクロ
ーナル抗体の決定基はリビドＡに限らず内部コア部位で
もかまわない。更には、他の細菌表層抗原、例えばＬＰ
Ｓ中の〇一抗原、外膜蛋白、鞭毛あるいは繊毛、または
、病原因子である外毒素、外酵素、更には、ウイルス真
菌、原虫、癌細胞に対するヒトモノクローナル抗体、あ
るいは従来型のヒト免疫グロブリン製剤と混合して使用
することも可能である。更には、従来のヒト免疫グロブ
リン製剤に、本発明により、得られるヒトモノクローナ
ル抗体を添加しても、エンドトキシンショックに対する
高力価免疫グロブリン製剤とされる。

エンドトキシンショックの治療および予防に用いられる
ときには該ヒトモノクローナル抗体は、通常成人に対し
、約５〜１００ｍｇ，好ましくは５〜５０ｍｇが投与さ
れることが望ましい。

以上、詳細に述べた様に、本発明によって得られるヒト
モノクローナル抗体は、同抗原に対して高い抗体力を有
することを第一の特徴とする。更には緑膿菌の本間血清
型Ｍ型に属する菌株、大腸菌をはじめとする腸内細菌の
ラフ型菌株の菌体に強く結合することを特徴とする。更
には、リビドＡのみならず、その類縁化合物であるリビ
ドＸ１モノホスホリルリビドＡとも結合し、カブトガニ
血液凝固系を担う血球中のリポ多糖感受性プロテアーゼ
の活性化を中和する能力をもつことを特徴とする。その
他、ヒト由来の蛋白であることより、異種蛋白の投与時
にみられるアナフィラキシー等の副作用の少ないことが
期待されるし、特定の細胞より生産・精製される抗体で
あることより、不特定多数のヒト血液より製造された従
来の免疫グロブリン製剤に比べ、未知のバイオハザード
が混入してくる可能性の低いことが特徴である。また、
本ヒトモノクローナル抗体の製造方法としては、無血清
培地中で抗体産生量が多く、且つ増殖性のよいハイブリ
ドーマを試験管内で培養することによって、生体外で、
大量に、高力価の抗体を安定して製造することが特徴で
あり、従来のヒト血液より製造する方法に比べ高力価な
ど生物活性の点で、安定的供給ができるなど品質管理の
点で優れる。

次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、
本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもない
。

（１）　　ヒト末梢血からのリンパ球調製、及び培養Ｌ
ＰＳに対する血清中の抗体価が高い健常人ボランティア
より末梢血ｌ００−を採取した。５〇一容遠心管（住友
ベークライト）に１５ｄのモノポリ分離液（Ｆｌｏｗ　
Ｌａｂ）を入れ、その上に末梢血２〇一を静かに重層し
た。低速遠心機（トミー精工、ＲＳ−２０ＢＨ）を用い
、１．５０Ｏｒｐｍで室温３０分間遠心し、赤血球とリ
ンパ球を分離した。

リンパ球を含む部分を回収し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｂ
ａｇ　１ｅ’ｓＭＥＭ（以下Ｄ−ＭＥＭと略する）で、
３回洗浄した。

得られた末梢血リンパ球１．ＯＸＩＯ’細胞を、抗原と
して大腸菌Ｊ５株（ＡＴＣＣ３９３５５）のホルマリン
死菌０．　０００２％（Ｗ／　Ｖ　）を含む後述のリン
パ球培養用培地に懸濁し、１ウエルあたり２．ＱＸ１０
６個のリンパ球細胞となる様に、２４ウエルマイクロプ
レート（ファルコン、＃３０４７）に分注し、５％Ｃｏ
ｔ，３７℃にて６日間培養した。

上記のリンパ球培養用地とは、非働化したウシ胎児血清
（以下ＦＣＳと略す）を２０％（Ｖ／Ｖ）、ピルビン酸
ナトリウム（０．０５Ｂ／１ｄ）　、２−メルカプトエ
タノール（５　Ｘ　１　０−’Ｍ）　、ヒト血漿由来ト
ランスフエリン（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．）３０μｇ／ｙｎｌｌ、
アメリカヤマゴボウ由来植物レクチン（以下ＰＷＭと略
す）　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ．）０．０１Ｘ　（ｖ／ｖ
）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を指す。

（２）細胞融合ヒト・マウスーヘテロミエローマＳＨＭ　　Ｄ−３　３
　（ＡＴＣＣＮａ．ＣＲＬ　１　６　６　８）をｌ５％
ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭで継代しておき、そのうち２．ｏ
ｘｔｏ’個の細胞をＤ−ＭＥＭにて２回洗浄した。

一方、実施例１−（１）の記載通り、末梢血リンパ球を
６日間培養後、２４ウエルマイクロプレートより回収し
、細胞数を計算したところ、８．ＯＸ１０’個のリンパ
球が回収された。このリンパ球をＤ−ＭＥＭにて３回洗
浄し、上記のヒト・マウス・ヘテローミエローマ細胞と
混合し、遠心により細胞を沈査とした。

この沈査に、ｌ艷のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
溶液（０．４５ｇ　　ＰＥＧ４０００　（Ｍｅｒｃｋ）
，０．４　５ＪＰＢＳ　（−）．０．１ｉジメチルスル
フォキシド）を約１分ぐらい、遠心管を回転しつつ添加
し、室温にて１分間静置した。

次に、Ｄ−ＭＥＭを１分間２ｄの割合で遠心管を回転し
つつ添加し、これを４回繰り返し、更に１０％ＦＣＳを
Ｄ−ＭＥＭで同様の操作を３回繰り返す。最後に１．５
ＪＦＣＳを加えた後、３７℃にて２０分間静置した。静
置後、遠心により細胞を沈査として集め、ｌ５％ＦＣＳ
，０．０５ｎ＋ｇ／ｄピルビン酸ナトリウム、０．２μ
／，，ｄインシュリン、０．　１５ｍｇ／−オキザ口酢
酸、ｌμｇ／−アザセリン、１００μＭヒポキサンチン
を含む４ｏ一のＤ−ＭＥＭ培地（以下ＨＡｚ選択培地と
略す）に懸濁して、ｌウェルあたり５．２ＸＩＯ’個の
ミエローマ細胞となるように、９６ウエルマイクロプレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３０４０）に１００ｔｌｊ２ず
つ分注した。マイクロプレートには、あらかじめ、保護
細胞として各ウエルマウスＢＡＬＢ／Ｃ牌臓細胞ＩＸＩ
Ｏ５個、及びマウスＢＡＬＢ／Ｃ腹腔浸出細胞ＩＸＩＯ
’個となる様に前出の培地に対する懸濁液を１００μβ
ずつ分注し、５％ｃｏ２３７℃にて１日培養してお《。

このマイクロプレートを、５％ＣＯ２３７℃にて培養し
、２〜３日ごとにＨＡｚ選択培地にて半量を培地交換し
た。１週間後に、ＨＡｚ選択培地に替えて、ＨＡｚ選択
培地よりアゼセリンを除いたＨ一培地にて、半蛍を培地
交換した。その後は、アゼセリン・ヒポキサンチンを含
まないハイブリドーマ培養用Ｄ−ＭＥＭ培地（１５％Ｆ
ＣＳ，−０．０５ｄ／ｄ、ピルビン酸ナトリウム、０２
μ／−インシュリン、０．１５ｍｇ／−オキザ口酢酸を
含むＤ−ＭＥＭ培地）にて、２〜３日ごとに半量を培地
交換した。融合後約３週間の時点に増殖のみられたウエ
ルの培養上清について、大腸菌Ｊ５株、緑膿菌ｆＩＤ５
０１８株（本間血清型Ｍ）をグルタルアルデヒドにより
固定した９６ウエルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　
＃３９１２）を用いて酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　
Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａ
ｙ：以下ＥＬＩＳＡと略する）により、ダラム陰性菌表
層の共通抗原に対する抗体産生の有無を調べた。ｌウエ
ルで大腸菌Ｊ５株、緑膿菌ＩＩＤ５０１８株両方に強く
反応するＩｇＭ抗体の産生を確認できた。このウエル中
のハイブリドーマを拡大培養及び、限界希釈法（ｌｉｍ
ｉｔｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によってクローニン
グを行い安定にヒトＩｇＭ抗体を産生ずる細胞株ＮＭ−
３Ｄ７が得られた。以下、細胞株ＮＭ−　３　Ｄ・７が
産生ずるヒトモノクローナル抗体に対してもＮＭ−３Ｄ
　７の名称を用いる。

ハイブリドーマＮＭ−３Ｄ７は工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１０５１７号として寄託した。

ヒトモノクローナル抗体ＮＭ−　３　Ｄ７はＩｇＭ（μ
、λ）であった。　細胞株ＮＭ−３Ｄ７は無血清培地セ
ルグロッサーＨ（住友製薬）に馴化され、特異抗体Ｉｇ
Ｍ産生量は、組織培養用フラスコ（コーニング、＃２５
１１０）での培養で、１　０　０　ｍｇ／　１　−ｄａ
ｙ−１　０　’ｃｅｌｌｓであった。

ｆｌｌＥＬＩｓＡ法菌体に対するＮＭ−３Ｄ７の結合性は以下に示すＥＬ　
Ｉ　ＳＡ法によって検討した。波長６００ｎｍにおける
吸光度が０．２となる様に菌体をリン酸緩衝液（ｐＨ７
．２、組成ＮａＣ１　　（８ｇ／１）、ＫＣＬ　（０．
２　ｇ／１’）　、ＮａＨＰＯｔｌ　２Ｈ２０（２。９
９ｇ／ｌ）およびＫＨ２ＰＯ．（０．２ｇ／ｌ）：以下
ＰＢＳと略する）へ懸濁し、９６ウエルマイクロプレー
ト（ファルコン＃３９ｌ２）（以下マイクロプレートと
略する）にｌウエル当たり５０μｌずつ分注、２，００
０ｒｐｍ１５分間遠沈した。２％グルタールアルデヒド
をｌウエル当たり５０μβずつ添加し菌体をマイクロプ
レートに固定した。

マイクロプレートから菌体溶液を除去した後３％ウシ血
清アルブミン（以下ＢＳＡと称する）含有ＰＢＳ溶液を
１ウェルあたり１２０μｌずつ分注し３７℃にて３０分
間インキユベートすることにより菌体の未吸着部分をブ
ロッキングした。このようにして作成したマイクロプレ
ートを抗原吸着プレートとして以後の操作に用いた。必
要に応じてこの段階で−２０℃に保存した。アッセイ前
に抗原吸着プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２　０含
有ＰＢＳ　（以下ＰＢＳＴと略する）で３回洗浄した。

その後ｌ％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴを１ウエルあたり５０μ
β分注、必要に応じｌ％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで適宜希釈
した試料（血清腹水又は培養上清）をｌウェルあたり５
０μｌ加え、３７℃で２時間インキユベートした。その
後試料を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。続いて第２
抗体液をｌウエルあたり１００μｌずつ加え、３７℃で
２時間インキユベートした。第２抗体としてｌ％ＢＳＡ
含有ＰＢＳで５００〜１，０００倍希釈したホスファタ
ーゼ標識アフィニティ精製抗ヒト免疫グロブリン抗体（
Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ．　Ｉ
ｎｃ．）を用いた。

ＩｇＧ，ＩｇＭ抗体価の測定にはそれぞれホスタファタ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体を用いた
。

第２抗体を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄後、発色基ｉ［
　溶液（　３　ｍｇのＰ−ニトロフエニルリン酸一２−
ナトリウム塩をｌｍｌのＮ．ａＮ３（０．２ｍｇ／ＩＪ
）　ＭｇＣ　Ｌ−　６Ｈ．０　（０．１ｍｇ／ｄ）を含
む１０％ジエタノールアミン緩衝液ｐＨ９．１に溶解し
た水溶液）を１ウェルあたり１００μｌずつ加え、３７
℃で反応させた。反応後ＯＤ．。，をマルチスキャン（
Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）で測定した。

（２）　　スムース型、ラフ型菌体に対する結合性の差
異ＮＭ−３Ｄ７の菌体への結合性をＮＭ−　３　Ｄ　？培
養上清を用いて実施例２−（１）にあるＥＬ　Ｉ　ＳＡ
法を用いて検討した。大腸菌Ｒｅ型変異株Ｊ５（ＡＴＣ
Ｃ３９３５５）、緑膿菌Ｍ型標準株１（Ｄ５０１８　（
東大医科研菌株保存施設より分与）、緑膿菌ＰＡＣ　Ｉ
Ｒ及びその変異株（ＰＡＣ　６　０　８、ＰＡＣ６０９
、ＰＡＣ６　１　１，ＰＡＣ５　５　６、ＰＡ　Ｃ　５
　５　７　）　（Ｄｒ．　Ｍｅａｄｏｗ（Ｌｏｎｄｏｎ
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃｏ１１ｅｇｅ）より分与）
はすべてハートインフユージョン寒天培地（日水製薬）
を用いて３７℃で培養した。　結果を表１に示す。モノ
クローナル抗体ＮＭ−　３　Ｄ　７は〇一多糖鎖を持つ
スムー゜ス型菌体に対して、ほとんど結合しない、もし
くはごく弱い結合しか認められなかった。一方、〇一多
糖鎖を持たないラフ型菌体に対しては強い結合がみられ
た。

表Ｉ　　ＮＭ−３０７の各種ケモタイブ菌への結合性（３）緑膿菌Ｍ型臨床分離株への結合性本間血清型別の
Ｍ型に分類される緑膿菌はラフの性質をもつことが知ら
れている（半間ら，　Ｊｐｎ．　Ｊ．Ｂｘｐ．Ｍｅｄ．
　５２，　３１７−３２０（１９８２））。そこで、当
所保存のＭ型臨床分離株の菌体への結合性をＥＬＩＳＡ
によって検討した。具体的な方法は実施例２一《１》に
従った。結果を表２に示す。

表２　　ＮＭ−３Ｄ７の緑膿菌Ｍ型臨床分離株への結合
性菌　　株結合活性（ＯＤａｏｉ）“ することを示す。

（４）菌体凝集反応による結合性の検討ＮＭ−３Ｄ７の
凝集活性をホルマリン死菌を用いて、最少凝集抗体濃度
として求めた。結果を表３に示す。

表３　　ＮＭ−３Ｄ７の菌体別最少凝集濃度〃　　ｒｌ
Ｄ１０２０　　　　　　Ｇ　　　　　　スムース　　　
　〉５０以上の結果、ヒトモノクローナル抗体ＮＭ−　
３　Ｄ７は、検討菌株中、緑膿菌１１Ｄ５０１８にのみ
強い凝集活性を有する。

以上の結果は、ヒトモノクローナル抗体ＮＭ−３Ｄ７が
緑膿菌Ｍ型株すなわちラフ株に広《結合ＮＭ−３Ｄ？の
リビドＡ及びその類縁化合物への結合性を、大腸菌Ｊ５
菌体をコートしたプレートを用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡにお
ける競合反応系で検討した。競合物質として、大腸菌Ｊ
５、サルモネラ・ミネソタＲ５９５、サルモネラ・ティ
フィムリウムおよび緑膿菌ｒ＋ｏｉｏｏｉ由来リビドＡ
１モノホスホリルリビドＡ及びリビドＸを各々１００μ
ｇ／ｄ用いた。緑膿菌１１０１００１株のＬＰＳを１％
酢酸で１００℃、９０分加水分解後、クロロホルムによ
って抽出したものをリビドＡ標品とした。リビドＸは西
島博士（国立予防衛生研究所）より分与された。それ以
外のリビドＡは、Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｒｎ
．　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，
　ＭＴ）より入手した。競合反応によるＥＬＩＳＡは、
競合物質溶液とＮＭ−３０７培養上清のｌＯ倍希釈液（
抗体量５μｇ　／　ｄ　）を等量混和、３７℃、１時間
インキベートした後、この反応混液を大腸菌Ｊ５菌体を
コートしたプレートを用い実施例２−（１）に従って残
存抗体価を調べた。結果を表４に示す。

一合物質０阻害率（Ｘ）　” 以上の結果、ＮＭ−３Ｄ７は検討したすべてのリビドＡ
に結合し、エピトーブがダラム陰性菌のリビドＡに存在
することが示された。更には、リビドＡの類縁化合物で
あるリビドＸおよびモノホスホリルリビドＡにも結合し
た。

（１）ＬＰＳプレートによるＥＬＩＳＡサルモネラ・ミ
ネソタの野生型、ＲａＳＲｂ、Ｒｃ，Ｒｄ及びＲｅ型Ｌ
ＰＳ及びリビドＡのＮＭ一３Ｄ７への結合性をＬＰＳも
しくはリビドＡをコートしたプレートを用いたＥＬＩＳ
Ａによって検討した。サルモネラ・ミネソタ由来のＬＰ
Ｓ及びリビドＡは、Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｌａｂ．　　Ｉｎｃ．　（Ｃａｍｐｂｅｌｌ．　ＣＡ）
より購入した。

ＬＰＳ，　　リビドＡ吸着プレートの作製は以下の様に
行った。サルモネラ・ミネソタ野生型ＬＰＳ（１　０　
０μｇ／ｄ）　、ラフ型（Ｒａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄ及び
Ｒｅ型）　ＬＰＳ　（２　０μｇ／ｍＡ’）　、リビド
Ａ（１０μｇ／ｒｎ！）をカーポネート・コーティング
バッフｙ　　（　１　５　ｍＭＮａ．ｃｏ＋．　　３０
ｍＭＮａＨＣＯ＊，３　ｍＭＮａＮｓ．　ｐＨ９　．　
　５　５　）にカツコ内にある濃度になる様に各々溶解
して、９６ウエルマイクロプレ−１　（７ｙル：＋ン＃
３９１２）ｌ：５０ｔ１ｊ７ずっ分注し、４°Ｃに一夜
放置しておく。抗原溶液を除去後１％ＢＳＡ溶液で３７
℃、２時間インキユベートすることによりプロツキング
を行う。以後のＥＬＩＳＡ操作は実施例２−（１）に従
った。結果を表５に示す。

ＬＰＳ化学型結合活性９（２）競合反応系を用いたＥＬＩＳＡによる検討サルモ
ネラ・ミネソタ各種化学型ＬＰＳ及びリビドＡへの結合
性を検討した。

実施例３と同様に、ＬＰＳ及びリビドＡを競合物質とし
てヒトモノクローナル抗体ＮＭ−　３　Ｄ　７と大腸菌
Ｊ５菌体間の結合阻害活性によってその結合性を検討し
た。方法は、大腸菌Ｊ５菌体をコートしたプレートを用
い、競合物質であるサルモネラ・ミネソタ野生型、Ｒａ
型、Ｒｂ型、Ｒｃ型、Ｒｄ型及びＲｅ型ＬＰＳ及びリビ
ドＡを各５０μＭの溶液とし、ＮＭ−３Ｄ７培養上清の
１０倍希釈液と等量混和、３７°ＣＩ時間後インキユベ
ートした後、この反応混液中のＮＭ−３Ｄ７残存活性を
ＥＬＩＳＡで測定し、競合反応による阻害率として計算
した。結果を表６に示す。

表６　競合反応を用いたＮＭ−３Ｄ７の各種化学型のサ
ルモネラ・ミネソタＬＰＳ及びリビドＡへの結合性の比
較鎖が長くなるに従ってＮＭ−３Ｄ７の結合強度が低くな
る傾向にあることを示している。このことは、ＬＰＳが
プレート上に吸着している場合あるいは溶液中でミセル
の状態にあっても、多糖鎖が外側に露出しているため、
抗体のリビドＡへの結合を立体化学的に阻害しているこ
とを示している。

＊競合物質の濃度は、５０μＭ＊＊阻害率（Ｘ）・（１−［（競合物質存在下の吸光度
）−（競合物質非存在下での吸光度））ＸＩＯＯ実施例
４（１）及び（２）の結果は、ＮＭ−３Ｄ７がリビドＡ
に強く結合し、リビドＡに結合している糖カブトガニの
血球中にはＬＰＳと極めて鋭敏に反応する複数のプロテ
アーゼによるカスヶード機構から成る血液凝固系が依存
する。この凝集活性はＬＰＳの定量に用いられており、
近年、凝集活性の代わりに合成の発色基質を用いて比色
定量も行われている。本例では、市販のＬＰＳ定量キッ
｝　Ｐｙｒｏｄｉｃｋ■（生化学工業）を用いてヒトモ
ノクローナル抗体ＮＭ−３Ｄ７がカブトガニ血球中のＬ
ＰＳ一依存性プロテアーゼのＬＰＳによる活性化を中和
できるかについて検討しｈ。

実験方法を以下に示す。実験例４−（１１で用いたサル
モネラ・ミネソタＬＰＳ　（野生型、Ｒａ，Ｒｂ，Ｒｃ
，Ｒｄ，Ｒｅ）を吸着させた９６ウェルプレートを用い
た。ヒトモノクローナル抗体ＮＭ一３Ｄ７の培養上清を
ＩｇＭ量５μｇ／ｄ、５０μｇ／一となる様に各々希釈
し、ウエルに分注、３７℃、２時間インキスベートする
。プレートをＰＢＳＴにて洗浄した後、Ｐｙｒｏｄｉｃ
ｋ＠の血球抽出液と合成基質の混合溶液をウェルに分注
、３７°Ｃで２５分間インキユベートした後０．５Ｎ酢
酸で反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し
た。中和能は阻害率（％）＝　（１−　（ＮＭ−３Ｄ７
存在下での吸光度）／（ＮＭ−３Ｄ？非存在下での吸光
度）３　ＸＩＯＯとして求めた。結果を表７に示す。

５μｇ／ｍｇ５０μｇ／ｄ以上の結果、ＬＰＳの生物活性のひとつであるカブトガ
ニ血球中のＬＰＳ一依存性プロテアーゼの活性化がＮＭ
−３Ｄ７によって中和可能であることが示された。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）無血清培地での培養が可能であり、抗体の産生量
が約１００ｍｇ／ｌ・ｄａｙ・１０＾８ｃｅｌｌｓであ
ることを特徴とする、ヒト・マウスヘテロハイブリドー
マ法によって得られるヒトモノクローナル抗体産生細胞
株
（２）特許請求の範囲第１項記載のヒト・マウスヘテロ
ハイブリドーマＮＭ−３Ｄ７（微工研菌寄第１０５１７
号）およびその子孫細胞系
（３）グラム陰性菌リポ多糖分子中のリビドＡ部位を認
識し、更にはリビドＸ、モノホスホリルリビドＡと結合
すること、更にはカブトガニ血液凝固系中のリポ多糖感
受性プロテアーゼの活性化を中和することを特徴とする
特許請求の範囲第１項および第２項記載の細胞が産生す
るヒトモノクローナル抗体
（４）特許請求の範囲第２項記載のヒト・マウスヘテロ
ハイブルドーマＮＭ−３Ｄ７が産生するＩｇＭであるこ
とを特徴とするヒトモノクローナル抗体