JPS6352892A - シユ−ドモナス アエルギノ−ザの細胞外酵素ｓに対するモノクロ−ナル抗体，その調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、免疫学の分野に属する。さらに詳しくは、シ
ュードモナス　アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎ
ａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の細胞外酵素Ｓに対する
モノクローナル抗体、その調製および使用に関する。

（従来の技術） シュードモナス　アエルギノーザは、免疫抑制治療法を
受けている患者、または９重度の火傷。

あるいは他の重傷をおった患者、嚢胞性線維症または癌
患者に感染する非常に毒性の高い病原菌である。火傷表
面における細菌のコロニー化を阻害するマフェニド　ア
セテート（ｍａｆｅｎｉｄｅ　ａｃｅｔａｔｅ）および
銀塩のような薬剤、菌血症に対する強力な抗生物質、お
よび患者の感染因子との接触を最小にするための隔離に
より、シュードモナス　アエルギノーザによる死亡率は
低下している。しかし。

そのような薬剤は、シュードモナス　アエルギノーザに
よる罹病率および死亡率をコントロールするのに部分的
に有効であるにすぎない。

シュードモナス　アエルギノーザのどのような成分が、
その毒性の原因となっているのかは明らかではない。シ
ュードモナス　アエルギノーザのもっとも広（研究され
た成分のひとつは菌体外毒素Ａである（ｔｇｌｅｗｓｋ
ｉら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　　６０ニア
８０−７９３　（１９７９））。菌体外毒素Ａは、シェ
ードモナス　アエルギノーザの産生ずる細胞外タンパク
質のうち最も量（重量）が多く、　Ｆｉｓｈｅｒ−Ｄｅ
ｖｌｉｎ−Ｇｎａｂａｓｉｋイムノタイプにもかかわら
ず臨床分離物の約９０％の割合で生産される。

細胞外酵素Ｓは、シュードモナス　アエルギノーザの毒
性に関与する別の成分である。細胞外酵素Ｓの欠損した
変異体を用いた動物実験により。

細胞外酵素Ｓは感染中に細菌を広める伝染性の強い要因
であることが示された。細胞外酵素Ｓは菌体外毒素Ａと
は性質が異なり、最近、２つの形態で精製された。１つ
の形態は、アデノシンジホスフェートリポシルトランス
フェラーゼ活性を有する９分子１４９．０００のペプチ
ドである。もう１つは。

分子量５３，０００のペプチドであり、血清学的に関連
（抗血清は、　５３００および４９ｋｄ種を反応する）
しているが２本質的に酵素活性はなく、４９ｋｄ種のわ
ずか０．１％のレベルである。

シュードモナス　アエルギノーザに対する特異的モノク
ローナル抗体は当該分野で既知である。

１１ａｎｃｏｃｋら（ｒｎｆ　ａｎｄ　Ｉｍｍ　　３７
：　１６６−１７１　（１９８２））は、シュードモナ
ス　アエルギノーザの外膜抗原に対するマウスモノクロ
ーナル抗体を記述している。Ｇａｌｌｏｗａｙら　（Ｉ
ｎｆ　ａｎｄ　Ｔｍｍ　　４４二２６２−２６７（１９
８４））は、菌体外毒素Ａに特異的なマウスモノクロー
ナル抗体を記述している。係属中の米国特許出願階７２
７．５１４　（１９８５年４月２６日出願）には、菌体
外毒素Ａに対するヒトモノクローナル抗体が記載されて
いる。細胞外酵素Ｓについては、わずかにウサギポリク
ローナル抗体が報告されているだけである。

Ｎ１ｃａｓおよびＩｇｌｅｗｓｋｉ　、　Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ旦旦４５：　４７０−４７４
　（１９８４）　ａｎｄ　　Ｐｓｅｕ並ｍｏｎａｓ　ａ
ｅｒｕ　ｉｎｏｓａＮｅｗ　Ｔｈｅｒａ　ｅｕｔｉｃ　
Ａ　　ｒｏａｃｈｅｓ　ｆｒｏｍ　　Ｂａ５ｉｃ　Ｒｅ
５ｅａｒｈ。

Ｄ、　５ｐｅｅｒｔおよびＲ，ｔｌａｎｃｏｃｋ　１３
集、　Ｐ、４０−４８．　Ｎ１ｃａｓおよびＩｇｌｅｗ
ｓｋｉ著（Ｓ、Ｋａｒｇｅｒ：Ｂａ５ｅｌ　１９８５）
）。

これらの報告は、マウスに火傷を負わせたモデルにおい
て、シュードモナス　アエルギノーザの感染をコントロ
ールするのに、ウサギポリクローナル抗体が効果的であ
ることを示している。

（発明の要旨） 本発明は、シュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵
素Ｓに対するモノクローナル抗体を提供する。このモノ
クローナル抗体は１例えば、アイソタイプｒｇ＾、　Ｉ
ｇＧまたはＩｇＦＩである。このモノクローナル抗体は
３例えば、マウスまたはヒトの抗体であり１細胞外酵素
Ｓの生物学的副作用を中和する。このモノクローナル抗
体は１例えば、ハイブリドーマｌ＋Ｂ９０１２および／
または８８９０１３により生産される。

本発明は１．上記モノクローナル抗体を生産する安定な
永久セルラインおよびその子孫を提供する。

本発明は、シュードモナス　アエルギノーザにより起こ
る感染を治療するだめの組成物を提供する。この組成物
は、薬学的に許容される主媒体と共同して上記モノクロ
ーナル抗体の治療上効果的な量を有する。

本発明は、シュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵
素Ｓを含むと思われる該試料中の細胞外酵素Ｓの存在ま
たは不在を検知する方法を提供する。この方法は、検出
可能な成分でラベルされ。

そして該成分を検出する上記抗体の存在下で試料をイン
キュベートすることを包含する。他の検知方法は、上記
抗体と共に該試料をインキュベートすること、および該
抗体が該試料と反応したかどうか、そして／または該抗
体が該試料と反応した程度を測定することを包含する。

さらに他の検知方法は、上記抗体と共に該試料をインキ
ュベートすること、そして抗体と反応性を有する検出可
能なリガンドとのインキュベーションの間に生じる何ら
かの免疫複合体を該抗体と共にインキプ、へ−卜するこ
と、およびリガンド−抗体複合体を検出することを包含
する。

本発明は、シュードモナス　アエルギノーザ細胞外酵素
Ｓに対して特異的なモノクローナル抗体を提供する。

本発明においての他の局面は、そのような抗体を産生ず
る安定で恒（永）次的なセルライン、および該セルライ
ンの子孫である。

さらに９本発明は、シュードモナス　アエルギノーザに
より引き起こされる感染の治療を行うための組成物に関
する。この組成物は、治療を行うのに有効な量のそのよ
うな抗体を含有する。その抗体は、薬学的に許容される
非経口投与手段と共同して、シュードモナス　アエルギ
ノーザ細胞外醇素Ｓの生物学的副作用を中和する。ひと
つの実施態様においては、この感染は、嚢胞性線維症患
者では、固有の慢性気管支上皮炎である。

本発明のさらに他の局面は、安定で恒久的なハイブリッ
ドセルライン（ＡＴＣＣ番号１１Ｂ　９０１２および１
１８９０１３　）　、およびそのセルラインの子孫に関
連する。

ここでは、抗体は、シュードモナス　アエルギノーザに
対する受動免疫療法、またはシュードモナス　アエルギ
ノーザ感染に対する予防、およびシェードモナス　アエ
ルギノーザ細胞外酵素Ｓを含むのではないかと考えられ
るサンプル中における該酵素の検出に関して有効に利用
され得る。

木溌泗−＠実瀦韮−式 ここで使用される“セルライン”という用語は。

個々の細胞、集められた細胞、および（ここでいうセル
ラインの細胞に由来するならば）細胞を含む培養物を意
味する。

ここでハイブリッドセルラインに関して使用される場合
には、“子孫；　Ｐｒｏεｅｎｙ“という用語は。

世代または核型の同定にかかわらず、そのセルラインの
すべての由来株、子孫（ｉｓｓｕｅ）、および子孫（ｏ
ｆｆｓｐｒｉｎｇ）を包含する。

クレームされているハイブリッドセルラインを特徴づけ
ることに関して、ここで使用される゛恒久的なｉ　ｐｅ
ｒｍａｎｅｒ＋ｔ　’および“安定な；ｓｔａ旧ｅ。

という用語は、そのラインが長ＩＵＩにわたり、典型的
には、少なくとも約６ケ月間にわたり生存できることを
意味し、そして、少なくとも約５０ｋ１代にわたり、こ
の特異的なモノクローナル抗体を産生ずる能力を維持す
ることを意味する。

ここで使用される“モノクローナル抗体”という用語は
、実質的に均一な抗体の集団を有する免疫グロブリン組
成物であり、そのうちの各々は同一の抗原決定基に結合
する。特に指示しない限り。

その用語はある特殊な哺乳動物種の抗体またはアイソタ
イプ、または、ある特定の方法で調製された抗体に限定
されない。この用語は、抗体分子全体および抗原結合断
片（例えば、Ｆａｂ、　Ｆ（ａｂ”）２゜Ｆｖ）を包含
する。

ある与えられた抗体に関してここで使用されている“機
能的同等物；　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｑｕｉｖａｌ
ｅｎｔ　”という用語は、同一の抗原決定基を認識して
その抗体であると認識し、そして、その抗体を交差的に
阻害する抗体を意味する。同一抗体または異なる免疫グ
ロブリンのクラス、および抗体の抗原結合断片（例えば
＋　Ｆａｂ＋　Ｆ（ａｂ’）ｚ、　Ｆｖ）を包含するこ
とを意図する。

患者への抗体の投与に関してここで使用される“処理；
　ｔｒｅａｔ”という用語、およびその同語源の用語は
、治療および／または予防を示す。

ここで使用される“細胞外酵素Ｓ”という用語は、細胞
外酵素Ｓの未精製の形態のもの、または。

その精製された形態のもの（例えば、前述の酵素活性を
有する４９ｋｄ種）をいう。

ここで使用される“血清型”という言葉は、　Ｆｉｓｈ
ｅｒら（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　　９８　：　８３
３−８３６　（１９６９））が記述しているシュードモ
ナス　アエルギノーザの７つのＦｉｓｈｅｒ−Ｄｅｖｌ
ｔｎ−Ｇｎａｂａｓｉｋイムツクイブの１つを意味する
。

本発明の抗細胞外酵素Ｓモノクローナル抗体は。

通常、げっ菌類またはヒト由来である。なぜならば、ネ
ズミ、ラット、およびヒト腫瘍セルライン（モノクロー
ナル抗体を分泌する永久増殖性のハイブリッドセルライ
ンを調製し得る）が入手しやすいためである。抗体はそ
のいずれのアイソタイプであってもよい。しかし、望ま
しくは、　ＩｇＧ、　ＩｇＭまたはＩｇＡであり、最も
望ましいのはＩ　ｇＧ２ａである。

ヒト抗細胞外酵素Ｓを分泌するハイブリッドセルライン
を調製するのに好ましい操作法は、マウス×ヒトを両親
とするハイブリッドセルラインおよび抗細胞外酵素Ｓ抗
体を充分に高レベルで産生するヒトのセルラインを使用
する１体細胞ハイブリダイゼーションである。このヒト
セルラインは。

抗細胞外酵素Ｓ　Ｉｇ？１．　ＩｇＧおよび／またはＩ
ｇＡの高力価の血清を有することがスクリーニングされ
た。または、そのような血清を有することが知られてい
る非免疫のボランティアから得られ得る。

例えば、ヒトセルラインは、　Ｆｏｕｎｇら（Ｊ　Ｔｍ
ｍｕｎ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　７０　：　８３−９０　（１９８４
））に記述されているように、　Ｅｐｓｔｅｉｎ−１１
ａｒｒウイルス（ＥＢＶ）で形質転換され得る。

ＥＶＢ形質転換が採用されるときに、最も満足すべき方
法は、　Ｋｏｚｂａｒら（Ｓｃａｎ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ　　１０　：　１８７−１９４　（１９７９））およ
び５ｔｅｉｎｉｔｚら（Ｊ　Ｃｌ１ｎ　Ｌａｂ　Ｉｍｍ
ｕｎ２　：　１−７　（１９７９））に記載されている
ように、形質転換されるＢセル集団をあらかじめ選択す
るか。

または、パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）または、ロゼッテ
ィング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）手法により抗原特異的な
形質転換集団をあとで選択する方法であった。

最近、　　ＥＶＢ形質転換法は、ハイプリドーマによる
免疫グロブリン分泌が、　　（ＥＶＢリンパ芽球腫と比
較したときに）不安定であること、および抗原特異的集
団の高い頻度での解放（ｒｅｓｃｕｅ）のために、ヒト
モノクローナル抗体をつくるための細胞融合法と組み合
わせて用いられている（例えば。

Ｆｏｕｎｇ　ら、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎ　Ｍｅｓｈ　　７０
　：　８３−９０　（１９８４）参照）。ＥＶＢは、最
も高頻度でＩｇＭ産生Ｂセルに感染および形質転換する
が、しかし、免疫グロブリンの他のクラスを分泌するＢ
セルは、　ＢｒｏｗｎおよびＭｉｌｌｅｒ　（Ｊ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ　　１２８　：　２４−２９　（１９８２）
）が記載しているように、　　ＥＶＢ融合手法を使用す
ることにより、長期間のラインとすることができる。

マウス抗細胞外酵素Ｓ抗体を産生ずるハイプリドーマの
調製および同定のための本発明の手法は。

以下の事柄を包含する。細胞外酵素Ｓは、　Ｎｏｖｏｌ
ＡＤＰ　Ｒｉｂｏｃ　１ａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅ　ｕ
ｌａｔｏｒ　　Ｅｎｚ　ｍｅｓ　ａｎｄＰｒｏｔｅｉｎ
ｓ、　Ｓｍｕｌｓｏｎ、　Ｓｕｇｉｍｕｒａ　ｌｐ集、
　ＥｌｓｅｖｉｅｒＮｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｉ
ｎｃ：１９８０．　ｐｐ　４２５−４３３で、　Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎらが述べている方法により得られ、精製され
る。

ハイプリドーマを調製するのに使用される抗体産生融合
パートナ−は、上記のようにして得られた細胞外酵素Ｓ
をマウスに投与（注射）することによって生産される。

宿主動物は、この細胞外酵素の抗原量を腹腔内投与され
１次に同様の量の細胞外酵素により定期的にブーストさ
れる。最終ブーストの数日後に、免疫感作マウスから肺
臓またはリンパ組織が集められ、そしてそれを用いて融
合に使用されるための細胞懸濁液が調製される。

ハイブリドーマは、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　　２５６　：４９５−４９７　（１９７５）およ
びＷｏｅｈｌｅｒら、　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏ１６
　：　５１１−５１９　（１９７６）の、一般的な体細
胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、肺臓細胞ま
たはリンパ組織および腫瘍（ミエローマ）パートナ−か
ら調製される。この目的に好ましいミエローマ細胞は、
効果的に融合し、安定して高レベルで。

選択された抗体生産細胞による抗体の発現を維持し、　
ＨＡＴ培地のような培地に感受性のミエローマ細胞であ
る。これらのうちで、より好ましいミエローマセルライ
ンは、　５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｃｅ１ｌ　
Ｄｉｓ−ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｓａｎ
　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ＾、で人手し得るＭＯＰＣ−２１お
よびＭＯＰＣ−１１マウス腫瘍、またはＡｍｅｒｉ−ｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ、　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　　Ｍ−Ｄ　。

で入手しうるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３　（６５３）
　オよびＳｐ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）ミエロ
ーマライン（それぞれＡＴＣＣＣＲＬＮｏｓ、　１５８
０および１５８１　’）に由来するマウスミエローマラ
インである。

基本的には、この技術は、ポリエチレングライコールの
ような融合促進剤を使用する。適当な腫瘍細胞と肺臓細
胞あるいはリンパ！ｌＪＩ織との融合を包含する。融合
の後、細胞を融合培地から分離し。

ＨＡＴ培地のような選択増殖培地で増殖させ、ハイブリ
ダイズしなかった親細胞を除去し１選択培地に耐性であ
って死滅しないハイブリドーマを選択する。必要に応じ
てハイブリドーマを増殖させ。

上澄液の細胞外酵素Ｓの活性を検定する。この検定は、
抗原として免疫感作剤を使用する従来の免疫検定法操作
（例えば、放射免疫定量法、ｖ！素免疫定量法、または
蛍光免疫定量法）により行われる。

抗体の抗原結合能力は、　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏでは免疫
プロット、　ＨＬＩＳＡおよび抗原中和テストで、そし
て。

ｉｎ　　ｖｉｖｏでは、マウスに火傷を負わせたモデル
使用して評価される。その機構にかかわらず、＠乳動物
におけるシュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵素
Ｓによる生物学的副作用を中和する能力を持っている抗
体が好ましい。

抗細胞外酵素Ｓモノクローナル抗体を生産するセルライ
ンは、イスコープ培地、ダルベ・ノコ改変イーグル培地
、または、　Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ
、　ＮＹのＲＰＭＩ−１６４０培地のような適当な培養
培地で増殖させられ得る。もしくは、」血では、同系の
あるいは免疫欠損実験動物で増殖させられ得る。

必要に応じて、場合によっては該抗体は、硫酸アンモニ
ウム沈澱、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、マイクロ濾過。

および超遠心分離のような従来の手法によって培養培地
あるいは体液から分離され得る。

細胞外酵素Ｓを不活性化する本発明の抗体は。

シュードモナス　アエルギノーザ敗血症にかかっている
人、あるいはシュードモナス　アエルギノーザ感染の危
険性のある人を処理（治療）するのに受動的に使用され
得る。危険性のある患者とは。

免疫抑制療法を受けている患者、ひどい火傷を負ってい
る患者、または、他のひどいけがをした患者、嚢胞性線
維症や癌の患者を包含する。１つの可能な治療は、嚢胞
性線維症患者に固有の慢性内気骨皮感染症に対してであ
る。この抗体は、典型的には、ヒト治療に使用される一
方、それらは。

家庭および農場の動物、およびスポーツ用またはペット
動物のような、他の哺乳動物種を治療するのにも使用さ
れ得る。

この抗体は、適当ないずれの手法によっても患者に投与
され得る。そのような手法は、皮下および非経口投与を
包含し、好ましくは非経口投与である。非経口投与の例
としては、静脈内、動脈内。

筋肉内、そして腹腔内投与が包含される。静脈内投薬が
好ましい。１回分の投与量、および投与量は、主として
抗体が治療を目的として投与されるかまたは予防を目的
として投与されるかということ、患者、そして患者の経
歴に依存する。１回あたり投与される抗体の薬学的効果
を示し得る全体量は、典型的には、患者の体重１　ｋｇ
あたり約０．０１〜１ｍｇの範囲にある。

非経口投与に関しては、この抗体は薬学的に受容され得
る非経口的投与媒体により注射可能な形（溶液、懸濁液
、乳濁液）の単位用量で、一般的に処方される。そのよ
うな媒体は９本質的に無毒であり、治療に影響を与えな
い。そのような媒体としては、水、生理食塩水、リンゲ
ル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アル
ブミンが例示される。調整オイルおよびエチルオレエー
トのような非水系媒体も使用され得る。リポソームがキ
ャリアーとして使用され得る。この媒体には２等張性お
よび化学的安定性を高める物質（例えば、緩衝剤および
防腐剤）のような少量の添加物が含有され得る。この抗
体は、典型的には、そのような媒体中に約０．１■／−
から１００■／ｉの濃度で処方される。

抗細胞性酵素Ｓモノクローナル抗体（中和する。

もしくは、中和しない）は、血液、血清、尿などのよう
な体液、または、バクテリアまたは動物培養物のような
！ＩＪＩ織培養物において、細胞外酵素Ｓの存否を決定
するのに使用され得る。この培養液あるいは体液は、抗
細胞性酵素Ｓモノクローナル抗体の存在下でインキュベ
ートされ、そして、その存在の有無、および／または反
応（抗体−細胞外酵素Ｓの結合）の度合が決定され得る
。これは。

抗体／抗原相互作用の検出または定量するのに用いられ
る種々の方法のいずれかにより行われ得る。

その方法とは１例えば、血球凝集反応２　ラテックス凝
集反応、補体結合反応、放射免疫定量法、酵素免疫定量
法、蛍光免疫定量法、サンドインチ定量法、蛍光顕微鏡
法などである。上記インキュベーションは、抗体／抗原
反応に適した状態（つまり、生理学的ｐ１１．温度、お
よびイオン強度）のもとで行われる。例えば、サンドイ
ンチ免疫定量法が用いられ得る。この方法では、テスト
サンプルは、第１のモノクローナル抗体とともにインキ
ュベートされる。この第１のモノクローナル抗体は。

抗原の１つのエピトープ（抗原決定基）に対するもので
あり、プラスチックチューブまたはポリスチレンビーズ
のような固体の担体に、固定化されている。そして１次
に、該テストサンプルは第２のモノクローナル抗体とイ
ンキュベートされる。

この第２のモノクローナル抗体は、該抗原の異なるエピ
トープに対するものである。そして、この抗体は、検出
可能な成分により標識化されており。

例えば、免疫学的に、酵素学的に、ペプチドの使用によ
り、または分光光学的に、化学的に、または放射医学的
手段により検出される。固定化された抗体とのインキュ
ベーションがラベル化抗体とのインキュベーションの前
１間、または後で行われ得る。または、上記第２の抗体
は、該第２の抗体と結合して検出可能なりガントとの反
応により。

間接的に検出され得る。

固相免疫定量法を実施するために、この抗体は。

例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルポン酸緩衝
液と３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドとを使用してポリスチレンビーズのような固体担体に
結合され得る。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサ
ビペルオキシダーゼのような酵素標識は、Ｎ−スクシイ
ミジル−３−（２ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）のようなカップリング試薬を使用して、抗体と接
合させられ得る。抗体に接合したこれらの酵素は２次に
。

米国特許第４，３７６．１１０号に記載されているよう
に。

酵素免疫定量法で使用され得る。

本発明の種々の局面は２次の実施例でさらに述べられる
が、それはどのような方法においても本発明を限定する
ものではない。実施例のなかで。

特に記載しない限り、固体に対するすべてのパーセンテ
ージは重量を基準とし、液体および気体に対するすべて
のパーセンテージは容量を基準とする。すべての温−度
は摂氏で示されている。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

尖用斑上 Ａ、抗生Ω里製 細胞外酵素Ｓの特異的なモノクローナル抗体を分泌する
マウスハイブリドーマは１本質的にＯｉおよびＩ（ｅｒ
ｚｅｎｂｅｒｇ＋　５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒｄ　（ＭｉｓｈｅｌおよびＳ
ｈｉｔｇｔ、　’ｔＡ集）　、　１９８０の融合法の変
法により調製した。Ｂａ１ｂ／ｃマウスに。

（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂ、　Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ、　ＭＡより購入）に、最初、０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と等容量のフロイントの完
全アジュバントと（市販品）を含むリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）中に。

２０μｇの精製した細胞外酵素Ｓを混合した混合物を、
腹腔内投与した。２週間後に、０．１％ＳＯＳと等容量
のフロイントの不完全アジュバントを含むＰＢＳ中に２
０μｇの精製した細胞外酵素Ｓを混合した混合物を、そ
れらのマウスに腹腔内投与した。

最初の投与から約１１０日後まで数週間間隔で、０．１
％ＳＯ５を含むＰＢＳ中に１０〜２０μｇの細胞外酵素
Ｓを混合した混合物を、それらのマウスに投与した。

最後の投与物は、　　ｏ、ｉ％ＳＯ５を含むＰＢＳに１
０μｇの精製した細胞外酵素Ｓを混合してなり、静脈内
に投与した。最後の投与から３日後にマウスを処理し、
それらの肺臓を取り出した。

この肺臓を、血清を含まないダルベツコの改変イーグル
培地（ＤＭＥＭ）に室温で悲濁し、３度洗浄した。６５
３または５ｐ２１０ミエローマ細胞を入手し。

それらを室温で血清を含まないＤＭＥＭで３度洗浄した
。免疫性肺臓細胞と、融合させる細胞とを、細胞数で５
：１の割合で５０ｒｎ１の遠心管中で混合し。

堅いペレット状になるまで室温で４００Ｘｇにて１゜分
間遠心分離した。上澄のすべてをペレットから除去し、
その遠心管を湯浴中で３７°Ｃに保持した。

分子ｆｆ１１０００のポリエチレングリコールの４０％
温溶液１ｄを、１分間にわたり穏やかに攪拌しながら添
加した。このペレットをさらに１分間攪拌した。次に、
血清を含まないＤＭＨＭを３７℃まで加温したちの１−
を１分間にわたって加え、そして、この操作を繰り返し
た。

最終的に、血清を含まないＤＭＥＭ　（３７℃まで加温
）を総量で７ｍｌ、２〜３分間にわたり、たえず攪拌し
ながら加えた。得られた懸濁液を、室温で４００×ｇに
て１０分間遠心分離し、上澄を除去した。ウシ胎児血清
（Ｆｅ２）を２０％の割合で含むＤＭＥＭ　（３７℃ま
で加温）を総量でｌ　Ｑ　ｍｌ　、　この細胞ペレット
に攪拌しながら加えて、懸濁液を得た。さらに、　　Ｆ
ｅ２を２０％の割合で含むＤＭＥＭ　（３７℃まで加温
）２０−を。

攪拌しながら加えた。細胞密度は、ヘマチトメーターに
より測定し、細胞濃度を、　Ｆｅ２を２０％の割合で含
むＤＭＥＭ　（加温）により、２Ｘ１０６生細胞／−に
調整した。

融合を行った日（０日目）に、マスターブレートと呼ば
れる９６個のウェルを有する組織培養用プレートに、総
量で０．１艷のこの懸濁液（総数で２×１０５個の細胞
を含む）を注入した。このプレートを、空気中に６％の
二酸化炭素を含む雰囲気下の３７℃のインキュベーター
中に設置した。１日目に、クローンを、１ウエルあたり
１００μｌの、２倍のアザセリンとヒポキサンチンとを
含む（アザセリンとヒポキサンチンとはそれぞれ２．２
Ｘ１０−’Ｍおよび２．Ｏｘ　１０−’Ｍ　）選択培地
を用いて選択した。

４日目および７日目に、プレートトを吸引し、１倍のア
ザセリンとヒポキサンチンとを含む（アザセリンとヒポ
キサンチンとはそれぞれ１．ｌＸ１０−５Ｍおよび１．
０Ｘ１０−’Ｍ　”）選択培地を再び供給した。

１０〜１４日目に上澄みの検定を始め、約５０日まで培
地の供給と検定とを続けた。

Ｂ、　　包り　　、Ｓによる２１ ５０ｍＭのトリス、　３８４ｍＭ　Ｏ）グリ’Ｊ７．　
０．１％のＳＯＳ。

１％のＮＰ４０　、そして１％の２−メルカプトエタノ
ールを含むｐＨ８，８の溶液中に、総１５００μｇの精
製した細胞外酵素Ｓ　（１５０μｇ／ｍｌりを加え、こ
れをｐＨ９，６，５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液で、　
１１００ｎ／ｍｌの濃度にまで希釈し、９６個ウェル平
底マイクロタイタープレートに１ウエルあたり１００μ
Ａ　（１ウエルあたり１０ｎｇ／ウェル）の割合で付与
した。

４℃チー夜インキュベート後、このプレートラ。

０．１ｇ／　１ＭｇＣ１ｚ、Ｏ，’１ｇ／　ｊＩＣａＣ
ｌｚ（ＰＢＳ”）、　０．０５％ツウィーン２０界面活
性剤、そして０．０１％チメロサールを含むＰＢＳで洗
浄した。

洗浄後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐ
ｉｆ　９．６（７）５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液２０
０μｊ！をそれぞれのウェルに加え、このプレートを３
７°Ｃで１時間インキュベートした。このプレートを上
記のように洗浄し、上澄み１００μｌをそれぞれのつエ
ルに加え、このプレートを３７℃にて１時間インキュベ
ートした。再びこのプレートを上記のように洗浄し、西
洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギまたはウサ
ギの抗マウス１ｇ発色試薬１００μｌをそれぞれのウェ
ルに加え、そのプレートを室温にて３０分間インキュベ
ートした。最後に、プレートを上記のように洗浄し、　
ＡＢＴＳ基質（５５■／−のＡＢＴＳ貯蔵水溶液をｐＨ
４，５，０，１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液で１：１
００に希釈し、使用前に３０％１１□０□を１：１００
０の割合で直ちに加えた）２００μｌずつを各ウェルに
加えた。そのプレートを、暗所で３７℃にて３０分間発
色させ、　４０５ｎｍにてＥＬＩＳＡ測定機により測定
した。読み取り値は、１から１０の尺度で示され、１　
＝０．００Ｄ、１０＝２．００Ｄである。

Ｃ，ハイブリドーマの’ｄＵ 培養上澄みを、この実施例のＢ項で述べた細胞外酵素Ｓ
　ＥＬＩＳＡ法により検定した。抗体生産性で選抜され
た親細胞系は、すべて抗細胞外酵素Ｓ抗体を分泌する子
孫を生じた。すべての系のクローンのほとんどが、かな
りの量の特異的な抗体を生産した。高生産性のハイブリ
ッドを選抜するために、ａハイブリドーマを限界希釈法
でクローニングし、１個の細胞に由来する子孫の抗体反
応レベルを検定した。

Ｄ、　　プロ〜−イング（ウェス　ンプロート）分析用
ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動を行った。この
ゲルは１４ａｎ　Ｘ　１２■Ｘ　ｌ　、　２　ｍｎ　、
分離用ゲルはアクリルアミド７−４／２　（７，５）％
であり。

そして、　０．４５ミリアンペアの定電流で泳動させた
。

タンパク質の染色のため、このゲルを、酢酸１０％。

クマシーブルーＲ−２５００，２５％を含む２５％メタ
ノール（５０℃）中に１５分間浸漬し、そして、１０％
メタノールに１０％酢酸を加えた液中で脱染色を行った
。

ウェスタンブロッティングとしては、精製した４９ｋｄ
細胞外酵素Ｓを、細孔径０．４５μｍのニトロセルロー
スシート上に移行させた（５５ボルトにて２時間）。そ
のニトロセルロースシートを１５０ｍＭのＮａＣ１およ
び１％ＢＳＡを含むｐＨ７，４の１０ｆｆＩＭＥリス（
緩衝液Ａ）中に３０分間浸漬した。そのシートを脱イオ
ン水ですすぎ８等量の緩衝液Ａと抗細胞外酵素Ｓモノク
ローナル抗体組織培養上澄みとともに４℃で１８８時間
インキュベートた。次いで、そのシートを再びすすぎ、
西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス
ＩｇＧ　（重鎮と軽鎖とに特異的）を１０００倍に希釈
したものを含む緩衝液Ａとともに、２５°Ｃで２時間イ
ンキュベートした。

そのシートをすすぎ、　ＢＳＡの代わりにトリトンＸ−
１００を０．０５％含有する緩衝液Ａとともに、２５°
Ｃで３０分間インキュベートした。そのシートをすすぎ
。

そして洗浄剤による洗浄を繰り返した。そのシートをす
すぎ、そして、　ｐｎ　７．４の１０ｍＭ　）リス６〇
−中に浸漬し、これに、　６０ｍｇの４−塩化ナフトー
ルと６０μｌの３０％過酸化水素水とを含むメタノール
２０ｍ１を加えた。この溶液中でシートを２５℃にて攪
拌した。そして、　１０ｍＭのアジ化ナトリウム含む冷
水ですすぐことにより反応を停止させた。

ハイブリッドのスクリーニングにより選択した４つの抗
体（４ＦＴ、　ＩＦ６．　ｌ０ＦＩＯ、そして１５０４
と命名した）は、精製した４９ｋｄの細胞外酵素Ｓに対
し結合することが上記プロットで示された。ｌ０ＦＩＯ
はＩｇＧ　１およびスイッチ変異体のＩｇＧ２ａである
と同定され、そして、　１５０４．４Ｆ７およびＩＦ６
はＩｇＧ１抗体であると同定された。

■粟恵胆底験 精製した４９ｋｄ１１１胞外酵素Ｓを、１Ｍｇ／＋ｄの
濃度にまで、対照の組織培養培地で希釈し、このうち１
０μｌを１．５−のポリプロピレン製マイクロフユージ
（微小遠心）管に入れた。同容量のモノクローナル組織
培養上清を加え、その混合物を４℃で１８時間インキュ
ベートした。次いで、この試料を標準細胞外酵素Ｓ検定
で評価した。用いた細胞外酵素Ｓの量（１検定当り１．
２５ｎｇ）およびアッセイ時間の長さは、酵素活性が直
線的反応応答である範囲となるようにした。すべてのア
ッセイは２度行われ、完全な中和実験は２度行われた（
下記の表中に実験１と実験２で表した）。

酵素アッセイは次のようにして行った。酵素試料２．５
ｔｔｌに、　ｐＨ６，０の２００ｍＭ酢酸ナトリウム２
５μｌ、および小麦胚抽出物２５μｌを混合し、２５℃
で１時間保持した。この反応は、１７μ門のＮＡＤ　（
アデノシン”Ｃ（Ｕ）：５４０ｍＣ１／ｍｍｏｌｅ）　
　５　ｕ　１を加えることにより開始させ、５分後に１
０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）　１００ｐｌを加えるこ
とにより停止させた。

この沈澱物を２５龍酢酸セルロースフイルター上に集め
、５％ＴＣΔで洗浄し、低バツクグラウンドカウンター
でカウントした。これらの試験の結果を。

次のように表にする。

対照　　　　　　　４８　　　　　　　７０　　−中和
抗体 ４Ｆ７　　　　　　３６５　　３４％　　３９２　　３
１％ＩＦ６　　　　　　３５２　　３６％　　３８１　
　３４％１０ＦＩＯ２０２６８％　　３００　　５１％
細胞外酵素Ｓ　４９ｋｄコントロールは、ブランク組織
培養培地とともにインキュベートした。

”９ｍｇ／ｍＡ’にＩｇＧを精製。

１５Ｄ４で示される中和力の欠如は、この試験には未知
力価の上清か使用されたという事実によると思われた。

次いで、精製したＩＦ６．　ｌ０ＦＩＯ（ＩｇＧ１　）
　、　ｌ０ＦＩＯ（ｒｇＧ　２ａ）および１５０４抗細
胞外酵素Ｓ抗体を用いて酵素中和検定を行った。４９ｋ
ｄ細胞外酵素Ｓと反応しないことが判明しているアイソ
タイプの特異マウスモノクローナル抗体を陰性の対照と
して用いた。中和およびアッセイの条件は、以下のこと
以外は上記と同じである。希釈用の溶液は９組織培養培
地に代えて、トリトンχ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製の膜グレード）を０．１％含む
ｐｌ＋　７．４のリン酸塩緩衝生理食塩水を用いた。中
和の間の細胞外酵素Ｓの濃度は０．５μｇ／ｍｌ、そし
て抗体の濃度は、　１５．５．１．５．０．５または０
．１５ｐｇ／ｍｌであった。表にした１分間あたりのカ
ウント（ｃｐｍ）値は、２回のアッセイの平均であり、
対照のコントロール値の４７ｃｐｍで修正する。これら
の試験の結果は以下の表に示す。

一跋粁−１バ生Ｚ屋　印Ｌ　工去Ｘ 対照　　　　　　　　　　　　　　　　４７　　−−−
−ＩｇＧ１’　　　　　　　　　　　　　　８５３　　
　８μｇＧ２ａ’　　　　　　　　　　　　　　８９８
　　　３μｇＧ２ｂ’　　　　　　　　　　　　　　９
０４　　　２抗細胞外酵素Ｓ抗体 ＩＦ５　　　　　　　　　１５　　　　５６１　　３９
１．５　　　８１３　　１２ ０．５　　　８３５　　１０ ０．１５　　９０６　　　２ １０ＦＩＯ（ＩｇＧ１）　　　　　　１５　　　　５４
　　９４１．５　　　２８０　　７０ 一成料−１１」買り乙〆　皿Ｌ　工？ｄｉＯ，５６７５
２７ ０，１５８９２３ １０ＦＩＯ（ＩｇＧ２ａ）　　　　　　　　１５　　　
　　　３４　　　９６１．５　　　　１１５　　　８８ ０．５　　　　５８６　　　　３７ ０．１５　　　　８２５　　　　１１ １．５　　　　９０３　　　　２ ０．５　　　　８７９　　　　５ ０．１５　　　　８３３　　　　１０ １細胞外酵素Ｓ　４９ｋｄコントロールは、トリトンＸ
−１００を０．１％含むｐｌ＋７．４のＰＢｓとインキ
ュベートシた。

２５種の濃度の全ての平均。

３ヒトＴ４リンパ球受容体に対するＴ３−３ＡＩマウス
モノクローナル。

４インターロイキン２に対する？？−２０８）１１２１
Ｅ８１Ｄマウスモノクローナル。

５ヒトＴ４リンパ球受容体に対する０ＫＴ４マウスモノ
クローナル。

寄託 抗細胞外酵素Ｓ抗体１０ＦＩＯおよび１５Ｄ４を分泌す
る２つのハイブリドーマの試料を、セタス　ティッシュ
　カルチャー　コレクションの共受託者（ＣＴＣＣ）お
よびアメリカン　タイプ　カルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）　、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉ
ｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＯ，Ｕ、Ｓ、Ａ、に寄託した
。ＡＴＣＣの寄託日、およびＡＴＣＣの寄託番号は、こ
れらの系列（ライン）に対し次のように与えられる。

セルライン　　　ＡＴＣＣＡＴＣＣ −各罫一　　−−３劇ＥＢ−一　　−省」ヨＥ引−１０
ＦＩＯ１９８６年２月５日　　　１１Ｂ９０１３１５０
４　　　１９８６年２月５日　　　ＨＢ９０１２これら
ＡＴＣＣ寄託物は特許手続用の微生物の寄託についての
ブタペスト条約の規定にもとづいてなされた。当該寄託
培養物が入手可能であることが、その特許法に従ってあ
らゆる政府筋のもとで認められた権利に反して２本発明
を実施することを許可されたと解釈されるべきではない
。

これらセルラインの寄託は本願の記述が本発明のあらゆ
る意味での実施を可能にするのに不適当であることを是
認することでも、これらセルラインが示す特定の例示に
特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきでもない。

（発明の要約） シュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵素Ｓに対す
るモノクローナル抗体はハイブリッドセルラインから調
製される。該抗体はいずれのアイソタイプであうでも良
く、そしてマウスまたはヒトのようないずれの起源に由
来のものでも良い。

該細胞外酵素の生物学的副作用を中和する能力を発揮す
る抗体はシュードモナス　アエルギノーザにより起こる
感染の治療に使用され得る。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵素Ｓに
   対するモノクローナル抗体。 ２、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＭである特
   許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 ３、マウスまたはヒトの抗体である特許請求の範囲第１
   項または第２項に記載のモノクローナル抗体。 ４、前記細胞外酵素Ｓの生物学的副作用を中和する特許
   請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載のモノク
   ローナル抗体。 ５、前記抗体がハイブリドーマＨＢ９０１２により生産
   される特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗
   体。 ６、前記抗体がハイブリドーマＨＢ９０１３により生産
   される特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗
   体。 ７、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４
   項に記載の前記抗体を生産する安定な永久セルラインお
   よびその子孫。 ８、ＨＢ９０１２またはＨＢ９０１３である特許請求の
   範囲第７項に記載のセルライン。 ９、薬学的に許容される主媒体と共同して特許請求の範
   囲第４項または第６項に記載の抗体の治療上効果的な量
   を有する、シュードモナス　アエルギノーザにより起こ
   る感染を治療するための組成物。 １０、シュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵素Ｓ
   を含むと思われる該試料中の細胞外酵素Ｓの存在または
   不在を検知する方法であって、検出可能な成分でラベル
   され、そして該成分を検出する特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項、第４項、第５項または第６項に記載の
   抗体の存在下で試料をインキュベートすることを包含す
   る方法。 １１、シュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵素Ｓ
   を含むと思われる該試料中の細胞外酵素Ｓの存在または
   不在を検知する方法であって、特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項、第４項、第５項または第６項に記載の
   抗体と共に該試料をインキュベートすること、および該
   抗体が該試料と反応したかどうか、そして／または該抗
   体が該試料と反応した程度を測定することを包含する方
   法。 １２、シュードモナス　アエルギノーザの細胞外酵素Ｓ
   を含むと思われる該試料中の細胞外酵素Ｓの存在または
   不在を検知する方法であって、特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項、第４項、第５項または第６項に記載の
   抗体と共に該試料をインキュベートすること、そして抗
   体と反応性を有する検出可能なリガンドとのインキュベ
   ーションの間に生じる何らかの免疫複合体を該抗体と共
   にインキュベートすること、およびリガンド−抗体複合
   体を検出することを包含する方法。