AT234906B - Verfahren zur Herstellung eines neuen immunogenen Polysaccharids - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines neuen immunogenen Polysaccharids

Info

Publication number
AT234906B
AT234906B AT391162A AT391162A AT234906B AT 234906 B AT234906 B AT 234906B AT 391162 A AT391162 A AT 391162A AT 391162 A AT391162 A AT 391162A AT 234906 B AT234906 B AT 234906B
Authority
AT
Austria
Prior art keywords
polysaccharide
sep
water
solution
immunogenic
Prior art date
Application number
AT391162A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Parke Davis & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US234906XA priority Critical
Application filed by Parke Davis & Co filed Critical Parke Davis & Co
Application granted granted Critical
Publication of AT234906B publication Critical patent/AT234906B/de

Links

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Herstellung eines neuen immunogenen Polysaccharids 
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polysaccharidverbindungen, die fähig sind, gegen Staphylokokken-Infektionen zu immunisieren. Im besonderen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids, das als Polysaccharid II identifiziert wird, von dessen Salzen und von Antigen- und Vaccinprodukten, welche dasselbe enthalten. 



   Gemäss der Erfindung können immunogene Polysaccharide, beispielsweise das Polysaccharid n sowie Antigen- und Vaccinprodukte, welche dasselbe enthalten, hergestellt werden, indem man immunogenes Protoplasmamaterial von gewissen Stämmen von Staphylococcus aureus mit einer wässerigen Säure bei einem pH-Wert von etwa 4 oder darunter umsetzt, wobei eine wässerige Lösung erhalten wird, die das genannte Polysaccharid enthält. 



   Die besonderen Stämme von Staphylococcus aureus, die hiebei verwendet werden können, sind solche, die die morphologische Eigenschaft besitzen, bei Kultivierung in einem halbfesten oder weichen, Plasma, Serum oder deren Proteinkomponenten enthaltenden Agar-Kulturmedium lose zusammenhängende, diffuse, halbopake Kolonien zu bilden. Dies ist eine besonders charakteristische Eigenschaft, denn die Mehrzahl der Stämme von Staphylococcus aureus bildet unter denselben Kulturbedingungen dichte, kompakte, opake, zusammenhängende Kolonien und ist als Ausgangsmaterial im erfindungsgemässen Verfahren ungeeignet. Beispiele von geeigneten Stämmen von Staphylococcus aureus sind die Stämme UC76, Smith, S193N4, H & D, Castellani,   MCD138,     SK4473,   K6, K93 und K93M. Von diesen Stämmen werden die Stämme K93M, MCD138, S193N4 und UC76 bevorzugt.

   Jeder dieser Stämme von Staphylococcus aureus ist unter den in der folgenden Tabelle angegebenen Nummern in der Kulturensammlung von Parke, Davis & Company in Detroit, Michigan, und in der Kulturensammlung des Fermentation Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division,   U. S. Depanment of Agriculture in   Peoria,   Illinols,   hinterlegt. 
 EMI1.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Stamm <SEP> Parke, <SEP> Davis <SEP> & <SEP> Co. <SEP> Northern <SEP> Utilization <SEP> Research
<tb> - <SEP> Sammlung <SEP> Nr. <SEP> Laboratory <SEP> Sammlung <SEP> Nr.
<tb> 



  UC76 <SEP> 05068 <SEP> NRRL <SEP> B-2467
<tb> Smith <SEP> 05067 <SEP> NRRL <SEP> B-2468
<tb> S193N4 <SEP> 05089 <SEP> NRRL <SEP> B-2469
<tb> H & D <SEP> 05087 <SEP> NRRL <SEP> B-2471
<tb> Castellani <SEP> 05088 <SEP> NRRL <SEP> B-2472
<tb> MCD138 <SEP> 05085 <SEP> NRRL <SEP> B-2473
<tb> SK4473 <SEP> 05086 <SEP> NRRL <SEP> B-2474
<tb> K6 <SEP> 05090 <SEP> NRRL <SEP> B-2475
<tb> K93 <SEP> 05091 <SEP> NRRL <SEP> B-2476
<tb> K93M <SEP> 05092 <SEP> NRRL <SEP> B-2477
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
Das im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial verwendete immunogene Protoplasmamaterial können intakte Zellen des besonderen Organismus oder ein   Zellfragment,   ein Bestandteil oder einDerivat mit   immunogenenEigenschaften   sein.

   Wenn das immunogene Protoplasmamaterial. aus intakten Zellen besteht, so können diese entweder lebende Zellen   (entwicklungsfähig),"abgetötete"Zellen     (entwicklungsunfähig)   oder eine Mischung derselben sein. Die genaue Methode der Bereitung   der"abge-   
 EMI2.1 
 



   Andere Beispiele für im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial verwendbares immuno- genesProtoplasmamaterial sind immunogene Stoffe, die aus den Zellen der besonderen Stämme von Sta- phylococcus aureus durch eine physikalische oder chemische Behandlung gewonnen werden, die die Zellen zerstört, ohne dass dadurch die immunogenen Eigenschaften im wesentlichen verlorengehen. Solche wei- tere als Ausgangsmaterial im erfindungsgemässen Verfahren geeignete immunogene Protoplasmamateria- lien sind z.

   B. : der durch mechanische Zerstörung der intakten Zellen erhaltene Brei ; das phenolunlös- liche, wasserunlösliche feste Material, das man durch Extraktion der intakten Zellen mitPhenol und einem wässerigen Lösungsmittel   erhält ;   die durch Extraktion der intakten Zellen mit Phenol und einem wässerigen
Lösungsmittel   gewonnene- wasserlösliche Fraktion ; -und   andere   Zel1fragmente   und-extrakte der besonde- ren Stämme von Staphylococcus aureus. Die oben erwähnte wasserlösliche Fraktion, die man bei der Ex- traktion der intakten Zellen mit Phenol und einem wässerigen Lösungsmittel erhält, enthält ein weiteres immunogenes Polysaccharid, das als Polysaccharid I bezeichnet wird und im folgenden genauer beschrieben ist. 



   Erfindungsgemäss kann die Behandlung des immunogenen Protoplasmamaterials mit einer wässerigen Säure bei einem pH-Wert von etwa4 und darunter mit einer Vielzahl von organischen oder anorganischen Säuren durchgeführt werden. Einige Beispiele der vielen geeigneten Säuren sind ; wässerige Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Monochloressigsäure, Trichloressigsäure und Salzsäure. Die Zeit und die Temperatur der Behandlung mit der wässerigen Säure wird jedoch je nach der besonderen Stärke der verwendeten Säure so geregelt, dass das Ausgangsmaterial in das gewünschte Polysaccharid umgewandelt wird, ohne dass durch übermässige Hydrolyse eine Aufspaltung in einzelne Saccharideinheiten erfolgt.

   Im allgemeinen wird beim Arbeiten im pH-Bereich von 2 bis 4 die Suspension oder Lösung des Ausgangsmaterials erwärmt, während beim Arbeiten unter pH 2, insbesondere in Gegenwart von Mineralsäuren und andern starken Säuren, wie Trichloressigsäure, die Behandlung vorzugsweise bei Raumtemperatur erfolgt. 



  Obwohl eine Kurzbehandlung bei pH-Werten unter 0 angewendet werden kann, sind solche Bedingungen nicht zu empfehlen, weil sie eine weitere Hydrolyse des gewünschten Produktes verursachen. Ein Beispiel für eine   bevorzugte Säure   ist verdünnte Essigsäure, und die typischen Arbeitsbedingungen bei der Verwendung dieser Säure sind das Erhitzen der Suspension oder Lösung des Ausgangsmaterials in 0, 1 n-Essigsäure während 5-60 min unter Druck bei etwa   121 C,   obwohl man auch bei beträchtlicher Abweichung von diesen spezifischen Reaktionsbedingungen zu zufriedenstellenden Ergebnissen gelangt. 



   Nach der Behandlung mit wässeriger Säure bei einem pH-Wert von etwa 4 oderdarunter liegt das ge-   wünschte Produkt   in der   wässerigenLösung   vor. Die wässerige Lösung wird, falls erforderlich, gekühlt und von etwaigem unlöslichem Rückstand durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren oder ähnliche Mittel getrennt. 



   Die in dieser Weise erhaltene wässerige Lösung enthält Polysaccharid II und kann als Vaccinprodukt oder zur Isolierung von gereinigtem Polysaccharid II verwendet werden. Für die Verwendung als Vaccin wird der pH-Wert der Lösung auf einen für Injektionszwecke zulässigen Wert eingestellt. Normalerweise wird der pH-Wert zwischen 6 und 8 eingestellt, vorzugsweise auf etwa 7, 2. Ist das Vaccin nicht isotonisch, so kann man es vorzugsweise durch Zugabe von Natriumchlorid isotonisch machen. Das fertige Vaccin kann in verschiedener Weise sterilisiert werden. Zum Beispiel kann es durch Hitze, UltraviolettBestrahlung oder durch Zugabe von chemischen Schutzmitteln sterilisiert werden ; vorzugsweise erfolgt die Zugabe derselben zum fertigen Vaccin.

   Einige Beispiele solcher Schutzmittel sind : Thimerosal   (1     : 10000),   Benzethoniumchlorid (1 : 20000) oder Phenol   (0. 20/0)'   Es kann auch eine Klärung mit einem Seitz-Filter vorgenommen werden. 



   Vaccine, die Polysaccharid II enthalten und wie oben hergestellt sind, bewirken bei parenteraler Verabreichung eine hochgradige Immunität nicht nur gegen eine Infektion durch den Stamm von Staphylococcus aureus, der zu ihrer Herstellung verwendet wurde, sondern auch gegen Infektion durch andere Stämme von Staphylococcus aureus. 



   Erfindungsgemäss kann ferner aus den oben beschriebenen, bei der Hydrolyse mit wässerigen Säuren 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 erhaltenen wässerigen Lösungen sowie aus den oben beschriebenen Vaccinen durch Isolations- und Reini- gungsmassnahmen Polysaccharid II und seine Salze erhalten werden. Man erhält das Polysaccharid durch
Entfernen des Wassers aus der wässerigen Lösung oder dem Vaccin als rohe feste Masse. Vorzugsweise wer- den die   wässerigen Lösungen   bzw. die Vaccinprodukte nach Dialyse gefroren und dann aus dem gefrorenen
Zustand getrocknet, wobei man ein rohes festes Produkt mit einem Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei etwa 256-261   m1J   erhält, was auf das Vorhandensein von Nucleinsäuren als Verunreinigung deutet.

   Das
Polysaccharidprodukt wird gereinigt durch Chromatographie, durch Bildung eines unlöslichen quaternären
Ammoniumkomplexes, durch Fällung der Verunreinigungen mit einem Alkohol, insbesondere einem niedrigen Alkanol, wie Äthanol, in Gegenwart von Salzen, wie Natriumacetat oder Natriumsulfat, oder durch eine Kombination dieser Methoden. 



   Bei chromatographischer Reinigung wird eine wässerige Lösung des Polysaccharids durch eine Aktiv- kohle-Säule geleitet und das Produkt durch Eindampfen oder Lyophilisieren der austretenden Flüssigkeit gewonnen. 



   Bei einer Reinigung durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes wird eine wässerige Lösung des Polysaccharids mit einem langkettigen quaternären Ammoniumsalz, wie Cetylpyri-   dinchlorid, oder Cetyltrimethylammoniumbromid,   umgesetzt. Bei richtiger Regelung des pH-Wertes und der Ionenstärke sondert sich ein unlöslicher quaternärer Ammonium-Polysaccharid-Komplex ab (Glick "Methods of Biochemical Analysis", Band 8,   S. 145-197).   Der unlösliche Komplex wird sodann in einer
Calciumchloridlbsung gelöst und das Polysaccharid durch Zugabe von Äthanol gefällt. Dann kann das
Produkt beliebig oft umgefällt werden, indem man es wiederholt in Wasser löst und Äthanol zugibt.

   Bei der Reinigung durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammonium-Polysaccharid-Komplexes ist es ratsam, zuerst die Nucleinsäuren zu entfernen, da sonst diese Verbindungen unter gewissen Bedingungen mit den sauren Polysacchariden mitgefällt werden. Die Entfernung der Nucleinsäuren kann durchgeführt werden durch Vorbehandlung der Polysaccharidlösungen mit neutralisierten Diatomeenerde oder Aktivkohle, bis das zurückbleibende Produkt in Ultraviolett wenig oder keine selektive Absorption zeigt. 



   Bei der Reinigung durch Fällung der Verunreinigungen mit einem Alkohol wird eine genügende Menge Alkohol zugegeben, um die Hauptmasse der Verunreinigungen niederzuschlagen, ohne dass eine wesentliche Menge des gewünschten Polysaccharids ausfällt. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, müssen die Konzentrationen an Polysaccharid, den zugegebenen Salzen und Alkohol sorgfältig kontrolliert werden. 



  Befriedigende Ergebnisse erhält man durch Zugabe von 5 bis 10   Vol.-Teilen   absolutem Äthanol zu einer   0, 15molaren Natriumsulfatlösung,   die nicht mehr als etwa 5 mg/ml Polysaccharid enthält. Die gefällten Verunreinigungen werden dann   z. B.   durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. 



   Nach der Reinigung durch Chromatographie, durch Bildung eines quaternären Ammoniumkomplexes oder   durch Fällung   der Verunreinigungen mit Alkohol liegt das Polysaccharid als Salz in wässeriger Lösung vor und wird   nach Dialyse der Lösung und Eindampfen   oder Lyophilisieren als gereinigte weise feste Masse isoliert. Die durch Lyophilisieren erhaltenen Produkte sind teilweise hydratisiert und werden normalerweise in dieser Form für physikalische, chemische und biologische Messungen und Anwendungen herangezogen. Ein gründliche getrocknetes Produkt erhält man durch Trocknen bei   50 C ;   dieses Produkt wird gewöhnlich für Elementarmikroanalysen und gelegentlich für andere Bestimmungen verwendet.

   Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die in dieser Beschreibung angegebenen Daten auf lyophilisierte, nicht aber auf anders getrocknete Proben. 



   Was das im   erfindungsgemässenverfahren als Ausgangsmaterial verwendete immunogene Protoplasma-   material anlangt, sind zwei Beispiele für vorteilhafte Ausgangsstoffe : intakte Zellen der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus und das phenolunlösliche, wasserunlösliche feste Material, das man bei Extraktion der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus mit Phenol und einem wässerigen Lösungsmittel erhält. Diese Ausgangsmaterialien werden bevorzugt, weil sie eine hohe Ausbeute des gewünschten Polysaccharids von befriedigender Reinheit und mit hochgradiger Reproduzierbarkeit gewährleisten. 
 EMI3.1 
 



   Soll das phenolunlösliche, wasserunlösliche feste Material als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, so kann es durch Extraktion lebender   oder"abgetöteter"Zellen   der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus mit Phenol gewonnen sein. Üblicherweise werden die besonderen Stämme von Staphylococcus aureus sowohl mit einem wässerigen Lösungsmittel als auch mit Phenol extrahiert und die in beiden Lösungsmitteln unlösliche Fraktion verwendet. Die zwei Extraktionen können entweder gleichzeitig 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 durchgeführt werden, vorzugsweise wird aber die Phenol-Extraktion vor der Extraktion mit dem wässerigen
Lösungsmittel durchgeführt. 



   Das zur Extraktion verwendete wässerige Lösungsmittel ist vorzugsweise Wasser, obwohl auch phy- siologisch verträgliche   wässerigeSaIzlosungen,   wie physiologische Salzlösung, Hank'sche Lösung   u. dgl.,   verwendet werden können. Wenn beide Extraktionen gleichzeitig durchgeführt werden, muss genügend
Phenol verwendet werden, um eine phenolische Phase zu bilden, aber nicht so viel, dass das wässerige
Lösungsmittel gelöst wird. Wenn die Phenol-Extraktion vor der Extraktion mit dem wässerigen Lösungs- mittel durchgeführt wird, so versteht sich von selbst, dass die Phenolphase genügend Wasser enthalten muss, um das Phenol flüssig zu machen, aber nicht genügend, um die Abtrennung einer gesonderten wäs- serigen Phase zu bewirken, d. h. zwischen etwa 5 und   30%   Wasser.

   Da die als Ausgangsmaterial verwen- deten intakten Staphylokokken-Zellen feucht sind und Wasser enthalten, ist es gewöhnlich nicht erfor- derlich, sehr viel Wasser zum Phenol zuzugeben, um es zu verflüssigen. Die normale und bevorzugte
Arbeitsweise ist die Verwendung von Phenol, welches am Schluss nicht mehr als etwa   15%   Wasser   enthält.  
Nach der Extraktion mit Phenol und einem wässerigen Lösungsmittel enthält der wässerige Extrakt die als
Polysaccharid I   identifizierte Antigensubstanz. Dieser Stoff   kann als Ausgangsmaterial bei der Herstellung von Polysaccharid II verwendet werden. Der in Phenol und in Wasser unlösliche Zellbrei ist für die Berei- tung von Polysaccharid   n   eines der bevorzugten   Amgangsmaterialien.   



   Die erfindungsgemäss hergestellten Polysaccharidverbindungen sind Stoffe mit hohem Molekularge- wicht, die viele einzelne   S   accharid-Einheiten umfassen. Polysaccharid II enthält Carboxyl-Gruppen und ist daher sowohl als freie Säure als auch in Form vieler Salze beständig ; es kann   z. B.   als Natrium-, Ka- lium-, Calcium-, Magnesium-, Ammonium- und Aminsalz sowie in Mischungen davon vorliegen. Die   freieSäureform   und die einfachen Salze haben ähnliche chemische, physikalische und biologische Eigen- schaften, sind bei richtigen pH-Bedingungen leicht ineinander umwandelbar und sind daher für die Zwecke der Erfindung als gleichwertig anzusehen. Wenn nicht anders vermerkt, wird hier zwischen Polysaccharid II als freie Säure und in der Form von einfachen Salzen keine Unterscheidung getroffen. 



   Allgemeine Kennzeichnung :
Polysaccharid   TI   ist weiss, wasserlöslich, hitzebeständig und nicht dialysierbar. Es enthält Carboxyl-
Gruppen und weist in Form der freien Säure nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und
Stickstoff   auf. AL- freiegäure   und in Form einfacher Salze ist es stark linksdrehend. Die der freien Säure- 
 EMI4.1 
 ==-79, 4 bestimmt, ist die empirische Formel der freien Säureform    : C HgJNgO.   Polysaccharid II ist von polymerer Natur und hat sehr hohes Molekulargewicht. 



   Spektroskopische   Kennzeichnung :  
In der Zeichnung zeigt   Fig. 1   das Infrarot-Absorptionsspektrum eines als Polysaccharid I bezeichneten Polysaccharids (freie Säureform) in einer Kaliumbromid-Scheibe (Mikrobestimmung). Infrarot-Absorptionsmaxima treten auf bei   : 2, 97, 3, 22, 3, 40, 5, 78, 6, 08, 6, 41, 6, 47, 7, 02, 7, 28, 7, 64, 8, 09,     8, 85, 9, 49, 10, 83, 11, 13   und   11, 52 je.   Polysaccharid I ist dem Polysaccharid II in gewissen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften ähnlich ; physikalische Messungen zeigen jedoch, dass sich diese Stoffe im Polymerisationszustand unterscheiden. Fig. 2 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Polysaccharid   n   (freie Säureform) in einer Kaliumbromid-Scheibe.

   Infrarot-Absorptionsmaxima treten auf bei: 2,95, 3,22, 3,33, 3,37, 5,73, 6,00 6,43, 6,96, 7,24, 7,61, 8,04, 8,77, 9,49, 10,83,   11, 13   und   11, 52 j.   Auch die Salzformen haben charakteristische Absorptionsspektren, wie im experimentellen Abschnitt beschrieben wird. 



   Polysaccharid   n   hat keine selektive Absorption in Ultraviolett. Jedoch sind Messungen der Ultraviolett-Absorption bei der Untersuchung auf Vorhandensein von Verunreinigungen, wie   Nucleinsäuren,   die eine charakteristische Ultraviolett-Absorption haben, nützlich. 



   Chemisches Verhalten :
Polysaccharid II ergibt negative   Molisch-und Anthron-Tests,   was darauf hinweist, dass übliche Hexosen und Pentosen nicht vorhanden sind. Tests für das Vorhandensein von Neuraminsäure und üblichen Uronsäuren sind negativ. Nach Hydrolyse erhält man einen positiven Elson-Morgan-Test, was anzeigt, dass das Hydrolysenprodukt eine oder mehrere Aminosaccharide enthält. Durch Erwärmen mit Diphenylamin in Essigsäure-Schwefelsäure-Mischungen (Dische's Test) erhält man ein Produkt mit blauer Farbe ; Absorptionsmaximum bei 575   m1J.   DieEmpfindlichkeit dieses Tests ist verhältnismässig gering, und Verunreinigungen können eine Rolle spielen.

   Durch Erwärmen in   79% figer   Schwefelsäure bei   IOOOC während   15 min wird eine Lösung erhalten, die ein einziges Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei 290 mu besitzt 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
Polysaccharid II zeigt unter Standardbedingungen keine bedeutende Aufnahme von   Perjodat,   was auf eine hocbsubstituierte Struktur hinweist. 



   Durch Umsetzung mit verdünntem methanolischem Chlorwasserstoff oder Diazomethan wird Polysaccharid II in einen Methylester umgewandelt. Die Methylester-Gruppierung wird durch Reduktion mit Natriumborhydrid in einer Natriumbicarbonat-Lösung zur Alkohol-Gruppe umgewandelt. 



   Quantitative 0-Acetyl-Bestimmungen zeigen das Vorhandensein von 5,5 bis   7, 0%   Acetyl-Gruppen, die an Sauerstoff gebunden sind. Die Acetoxyl-Gruppen werden mit 0,   ln-Natriumhydroxyd-Lösung   bei Raumtemperatur hydrolysiert. 



   Ausgedehnte Strukturbestimmungsstudien, die auf der Untersuchung der Hydrolysenprodukte von Polysaecharid II bzw. seinen Derivaten basierten, haben gezeigt, dass Polysaccharid II chemisch als ein Polymer der D-Glucosaminuronsäure, die Amid-verkettetes L-Alanin (wahrscheinlich N-acyliert, da freie Amino -Gruppen nicht vorhanden sind) und von 5, 5 bis 7, 0% Sauerstoff-gebundenes Acetyl   enthält,   beschrieben werden kann. Die Stoffe, die   nachHydrolyse vonPolysaccharidII mitMineraIsäuren   identifizierbar sind, sind : Alanin, Ammoniumchlorid und D-Glucosaminuronsäure. Das Vorhandensein von D-   Glucosaminuronsäure-Einheiten   ist ein sehr charakteristisches Strukturmerkmal von Polysaccharid II. 
 EMI5.1 
 



   Colorimetrische Probe :
Polysaccharid II ruft in einer   Essigsäure-Schwefelsäure-Lösung   eine gelbe Färbung hervor, was für quantitative Bestimmungen ausgewertet werden kann. 2 ml wässerige Polysaccharid-Lösung werden zu 4 ml   10% Schwefelsäure   enthaltendem Eisessig zugegeben und die Mischung in einem kochenden Wasserbad 30 min erhitzt. Nach Abkühlen hat die Lösung Absorptionsmaxima bei 283, 410 und 470   mli.   Die Ablesungen im 283   m). t-Bereich   werden durch die einfachen Zucker gestört, aber die Absorptionsspitzen 
 EMI5.2 
 standardisierten Probe verglichen werden. Diese Verfahrensweise kann zur quantitativen Analyse angewendet werden. 



   Elektrophoretisches Verhalten :
Polysaccharid II kann auf Glasfaser-Streifen nachgewiesen und seine elektrophoretische Beweglichkeit studiert werden. Wenn   50 - 100 Jlg Polysaccharid II   auf solche Streifen aufgebracht und einer Elektrophorese unterworfen werden, kann man das Polysaccharid nachweisen, indem man die Streifen mit einer Lösung, die l% p-Anisidin in 2% konzentrierte Schwefelsäure enthaltendem feuchtem Butanol enthält, besprüht und 10 - 15 min auf   1000C   erhitzt. Das Polysaccharid erscheint gegen einen farblosen Hintergrund als rosa Fleck. Das Polysaccharid bewegt sich als Anion bei PH-Werten von 4 und darüber zur Anode bzw. zum positiven Pol hin.

   Ein gutes Auflösungsvermögen erzielt man mit 0, 05-molarer Phosphat-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 6 und   0, 05-molarer   Borat-Pufferlösung bei einem PH-Wert von   8, 6   bei hoher Spannung (300 V) und niedriger Stromstärke (weniger als 20 Milliampere). Bei PHWerten zwischen 3 und 4 bewegt sich das Polysaccharid als ungeladenes Teilchen durch Endosmose. 



   Das elektrophoretische Verhalten von Polysaccharid II (als gemischtes Calcium -Natrium-Salz) wurde in einer elektrophoretischen Einrichtung nach Tiselius bestimmt, und es wurden die folgenden elektro- 
 EMI5.3 
 
Besondere physikochemische Kennzeichnung :
Physikochemische Bestimmungen haben gezeigt, dass Polysaccharid I und Polysaccharid II sehr hohes Molekulargewicht besitzen. 



   Polysaccharid I und Polysaccharid II können auch durch übliche Viskositätsmessungen bestimmt werden. Bei   230C   ist die Viskosität von Polysaccharid I in Form der freien Säure mit   0. 0198 Poise (0. 3166%   in Wasser) bestimmt ; die Viskosität von Polysaccharid II in Form der freien Säure ist mit 0, 0151 Poise (0,   30/0   in Wasser) bestimmt. Der entsprechende Wert für die Viskosität von reinem Wasser   bei 230C   ist 0, 00938 Poise. 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 



   Biologische Probe :
Es gibt eine feststehende Einheit für immunologische Wirksamkeit, die bei Laboratoriumsproben der rohen und gereinigten Polysaccharidzubereitungen sowie der wässerigen Lösungen, aus denen sie herge- leitet werden, wertvoll ist. Die Wirksamkeitseinheit, die   als"Mausschutzeinheit"bezeichnet wird,   ist die Menge des Stoffes. die fähig ist,   50%   einer Anzahl von Mäusen gegen. eine Reiz-oder Erregerdosis von   10000   Mal die Menge von Staphylokokken, die 50% einer Anzahl von Kontrollmäusen töten würde, zu schützen. Die immunogene Substanz wird sieben Tage vor dem Erreger subcutan verabreicht ; der
Staphylokokken-Erreger wird intraperitoneal in Mucin verabreicht. Bei der Standardprobe wird der
UC76-Stamm von Staphylococcus aureus als Erreger verwendet.

   Die Wirksamkeit eines Präparats kann ausgedrückt werden als die Zahl der "Mausschutzeinheiten" pro Milligramm oder pro Milliliter Lösung oder als PD50-Wert (Dosis schützend für   500/0)   pro Milligramm oder pro Milliliter Lösung gegen eine Er- regerdosis von   10000   LD50 (Dosis letal für   500/0).   Es wurde gefunden, dass gereinigte Zubereitungen von
Polysaccharid   II. ungefähr 300000 "Mausschutzeinheiten"   (oder PD50) pro Milligramm oder 300 pro Mi- krogramm enthalten. Bei der Beurteilung der Reinheit nach der biologischen Probe muss man auf experimentelle Fehler bei biologischen Messungen die übliche Rücksicht nehmen. 



   Polysaccharid II und seine Salze sowie die Vaccine, die dasselbe enthalten, vermögen die Bildung eines schützenden Antikörpers zu fördern und rufen bei parenteraler Verabreichung eine hochgradige Im- munität nicht nur gegen Infektion durch den bei ihrer Herstellung verwendeten Stamm von Staphylococcus aureus hervor, sondern auch gegen Infektion durch andere Stämme von Staphylococcus aureus. Da Poly- saccharid II und seine Salze gereinigt und genau charakterisiert und standardisiert werden können, haben diese Produkte hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung und der klinischen Wirksamkeit eine hohe
Reproduzierbarkeit. 



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. 



   Beispiel 1 : Eine   Stammkultur   des Stammes UC76 vonStaphylococcus aureus wird auf einem Kul- turmedium mit der folgenden Zusammensetzung gehalten : 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> Bestandteil <SEP> Menge
<tb> Durch <SEP> tryptischen <SEP> Abbau <SEP> aus <SEP> Kasein
<tb> gewonnenes <SEP> Pepton <SEP> (Trypticase) <SEP> 17, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Mit <SEP> Papain <SEP> aufgeschlossenes
<tb> Sojamehl <SEP> (Phyton) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Dikaliumphosphat <SEP> 2. <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000, <SEP> 0 <SEP> ml
<tb> 
 
Vor der Verwendung wird dieses Medium durch Behandlung im Autoklaven bei   118 - 1210C   während 15 min sterilisiert.

   Der Organismus wird 18 - 24 h bei 35-37 C kultiviert und durch einmal wöchentliche Übertragung auf dem gleichen Medium gehalten. 



   Aussaatkulturen werden bereitet, indem man grosse Proberöhren, die 30 ml des obigen Kulturmediums enthalten, mit etwa 0, 3 ml der Stammkultur beimpft und bei   35-370C   während   6 - 24   h bebrütet. Für jedes   Gefäss, in   dem die Verarbeitung zum fertigen Produkt stattfindet, wird eine Röhre der Saatkultur genommen. Es wird eine Reihe solcher Verarbeitungsgefässe mit je einem Gehalt von 1000   ml.   des wie oben sterilisierten Mediums vorbereitet. Jedes Gefäss bzw. Kolben wird mit 30 ml der   6 - 24 halten   Kultur beimpft und bei   35 - 370C 24 h   bebrütet. Phenol (gereinigt) wird zugegeben, bis eine Konzentration von 1% (Gewicht/Volumen) erreicht ist, und nach Mischen wird die Kultur zur Inaktivierung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen.

   Darauf wird die Zellsuspension in einer   Sharples-Luftturbi-     nen-Zentrifuge (Laboratoriumsmodell)   bei Raumtemperatur und bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 250 ml/min zentrifugiert. Der Zellkuchen wird entfernt, in einem Waring-Mischer in einem Zehntel des ursprünglichen Kulturvolumens in 0,   850/piger   Salzlösung neuerlich suspendiert und durch Zentrifugieren wieder gesammelt. Die Zahl der erhaltenen Zellen wird auf Grund des Umwandlungsfaktors be- 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
 EMI7.1 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 triumsalzes der Äthylendiaminotetraessigsäure und dann mit Wasser gewaschen, bis sie neutral ist.

   Das aus der vorhergehenden Säule erhaltene teilweise gereinigte   Polysaccharid Ir (174mg)   wird in 15 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit Essigsäure auf 4, 1 eingestellt. Darauf wird die Lösung durch die KohleSäule geleitet und die Säule mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen. Die gesamte austretende Flüssigkeit wird gesammelt, mit Alkali auf einen pH-Wert von 5, 8 bis 6, 0 eingestellt und über Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die zurückbleibende Lösung, die einen PH-Wert von 4, 5 hat,'wird über Diatomeenerde filtriert und aus dem gefrorenen Zustand getrocknet, wobei man gereinigtes Polysaccharid II mit etwa 300 000 "Mausschutzeinheiten" pro mg erhält. Das so erhaltene Produkt ist ein gemischtes Calcium-Natrium-Salz.

   Das Produkt zeigt in Ultraviolett keine selektive Absorption und enthält, wie ein negativer Biuret-Test und eine quantitative Proteinprobe zeigen, kein Protein. Die spezifische 
 EMI8.1 
 
Flüchtigkeitsverlust von 13, 2% bei 500C. Eine Analyse des Produktes ergibt   : 38, 86% Kohlenstoff, 6, 29%  
Wasserstoff,   7, 47, 7, 30% Stickstoff, 2, 0% Calcium, 0, 47% Natrium,   Spuren von Phosphor und   5, 55%  
Asche. 



   Die Reinigung von Polysaccharid II kann auch unter Bildung eines unlöslichen quaternären Ammo- niumkomplexes erfolgen. 100 mg rohes Polysaccharid II mit 94500 "Mausschutzeinheiten" pro mg wer- den in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung durch Zentrifugieren geklärt. Die Lösung wird mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,4 eingestellt und auf ein Volumen von 11 ml gebracht, worauf 10 min mit
52 mg Aktivkohle (Norit) gerührt und dann filtriert wird. Das Filtrat wird durch Ultraviolett-Spektroskopie untersucht, um die vollständige Entfernung von Nucleinsäuren zu prüfen. Dann werden weitere Behandlungen mit Aktivkohle durchgeführt, bis das Filtrat im wesentlichen keine selektive Absorption in Ultra- violett mehr zeigt. In der Regel sind zwei weitere Behandlungen mit 50 mg-und 30 mg-Mengen Aktivkohle erforderlich.

   Das zum Schluss-nach Lyophilisieren erhaltene Filtrat erbringt 63 mg teilweise gereinigtes Polysaccharid II mit 126000 "Mausschutzeinheiten" pro mg. Zu einer Lösung von 60 mg dieses Pulvers in 5 ml Wasser und   0, 9 ml In-Natriumchlorid-Lösung   werden 8 ml einer   1%gen   Cetylpyridinchlorid-Lösung zugegeben. Es sondert sich ein viskoses, öliges Produkt ab. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann zentrifugiert. Das gesammelte Produkt wird zweimal durch Zentrifugieren mit 1 ml-Portionen Wasser gewaschen und in 1 ml   0. 5-molarer Calciumchlorid-Lösung   gelöst. Äthanol (4 - 10 Volumina) wird zugegeben und das gefällte Calciumsalz gesammelt und dreimal mit Äthanol gewaschen.

   Das Produkt wird in 1 ml Wasser, das 0, 05 ml der Calciumchlorid-Lösung enthält, neuerlich   gelöst,   nochmals mit Äthanol gefällt, gesammelt und dreimal mit Äthanol gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist das Calciumsalz von Polysaccharid II, dessen Untersuchung 239   000"Mausschutzeinheiten"pro   mg ergab. Einige phosphorylierte saure Polysaccharide bleiben in dieser Probe. 



   Die Reinigung von Polysaccharid II kann auch* durch Fällung der Verunreinigungen mit einem Alkohol durchgeführt werden. 590 mg rohes Polysaccharid II mit einem durch colorimetrische Bestimmung festgestellten   52% igen Reinheilsgrad   werden in 55 ml 0, 15-molarer Natriumsulfat-Lösung gelöst. Absolutes Äthanol (165 ml) wird tropfenweise unter Rühren zugegeben ; der sich abscheidende unlösliche Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, mit   5 - 10   ml   95% Lgem Äthanol   gewaschen und verworfen. Die überstehende Flüssigkeit, einschliesslich der Äthanol-Waschflüssigkeit, wird mit weiteren 110 ml Äthanol verdünnt und'zentrifugiert.

   Eine kleine Menge einer unlöslichen Verunreinigung wird entfernt und die überstehende Flüssigkeit im Vakuum auf ein Volumen von etwa 15 bis 20 ml konzentriert, mit Wasser auf 50 ml verdünnt und über Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die zurückbleibende Lösung wird über Diatomeenerde filtriert und lyophilisiert, wobei man 307 mg Polysaccharid II (gemischtes Calcium-Natrium-Salz) als weisses Pulver   erhält, dessen colorimetrische   Bestimmung eine Reinheit von   1000/0   zeigt. 



   Bei der Arbeitsweise dieses Beispiels kann anstatt des Stammes UC76 von Staphylococcus aureus auch jeder beliebige folgende Stamm Verwendung finden : Smith, S193N4, H & D, Castellani, MCD138. SK4473, K6, K93 und K93M. 



   Beispiel 2 : 300 mg des nach der Extraktion des Stammes UC76 von Staphylococcus'aureus mit Phenol und Wasser gewonnenen phenolunlöslichen, wasserunlöslichen festen Materials wird 24 h mit 10 ml   5o/aiger Trichloresstgsäure   bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Suspension wird durch Zentrifugieren und Filtrieren über Diatomeenerde geklärt. Das Filtrat wird mit Alkali neutralisiert, dialysiert, filtriert und lyophilisiert, wobei man rohes immunogenes Polysaccharid als weisses Pulver erhält, dessen Untersuchung durch colorimetrische Prüfung und biologische Tests   20% igue   Reinheit ergab. Das Produkt wird wie in Beispiel 1 gereinigt. 

 <Desc/Clms Page number 9> 

 
 EMI9.1 
 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 



    Absolutes Äthanol (10 Volumina) wird zugegeben und das sich abscheidende unlösliche Produkt durch Zentrifugieren gesammelt, dreimal mit Äthanol gewaschen und darauf wiederum in 1 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von Äthanol gefällt. Das Produkt wird in Wasser gelöst, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhält 22 mg Polysaccharid II (Calciumsalz), dessen colorimetrische Prüi füng 92% Lge Reinheit ergibt. Das Produkt wird in die freie Säure umgewandelt, indem man es in einer kleinen Menge destilliertem Wasser löst und durch eine Säule leitet, die 2. 5 ml Kationenaustauscher- Harz in freier Säureform enthält. Die wässerige Lösung wird lyophilisiert, wobei Polysaccharid II (freie Säure) erhalten wird, dessen colorimetrische Prüfung 100% ige Reinheit ergibt und dessen Viskosität 0, 0159 (0, 316% in Wasser) beträgt. 



  Beispiel 6 : Durch Kohlechromatographie, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliertes, gereinigtes Polysaccharid II, welches als gemischtes Calcium-Natrium-Salz vorliegt, wird in folgender Weise in das Calciumsalz umgewandelt. Das Polysaccharid (177 mg) wird in 8 ml Wasser gelöst und der PH - Wert mit Alkali auf 7, 0 eingestellt. Zu dieser Lösung werden 1,8 ml 1-molare Natriumchlorid-Lösung und dann 260 mg Cetylpyridinchlorid in 8 ml Wasser zugegeben. Die Mischung wird mit Wasser auf 30 ml verdünnt und bei Raumtemperatur 1 h stehen gelassen, worauf man den entstandenen gummiartigen Niederschlag durch Zentrifugieren sammelt und einmal mit 4 ml Wasser wäscht.

   Man lässt den Niederschlag abtropfen und löst ihn dann unter Rühren mit 5 ml 0,5-molarer Calciumchlorid-Lösung. Äthanol (40 ml) wird zugegeben, und das gefällte Polysaccharid-Calciumsalz durch Zentrifugieren gesammelt und dreimal mit Äthanol gewaschen. Um ein Calciumsalz mit höherem Reinheitsgrad zu erhalten, wird das Produkt in 5 ml Wasser, das 0, 1 ml 0, 5-molare Calciumchlorid-Lösung enthält, gelöst und durch Zugabe von 40 ml Äthanol wieder gefällt. Das Produkt wird durch Zentrifugieren gesammelt, zweimal mit Äthanol gewaschen, wieder in Wasser gelöst und die Lösung 16 h gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die   
 EMI10.1 
 ; cud6, 0% Wasserstoff, 7,77% Stickstoff, 4, 83% Calcium (durch Flamme) und 6, 2% Asche.

   Bei potentiometrischer Titration in   Wasser ist pK'a 3, 35, was einem Äquivalentgewicht von etwa 600 entspricht ; kor-   rigiert, um Calciumverluste und Flüchtigkeitsverluste zu kompensieren, ergibt sich ein Äquivalentgewicht des Polysaccharids als freie Säure von etwa 510. In einer Kaliumbromid-Scheibe zeigt das Cal- 
 EMI10.2 
 nigtes Polysaccharid II, das als gemischtes Calcium-Natrium-Salz vorliegt, wird durch folgendes Verfahren in das Natriumsalz umgewandelt. Das Polysaccharid (100 mg) wird in 10 ml Wasser gelöst und 1, 8 ml 1-molare Natriumchlorid-Lösung und dann 150 mg Cetylpyridinchlorid in 10 ml Wasser unter Rühren zugegeben. Nach zweistündigem Stehen bei Raumtemperatur wird das gefällte Produkt durch Zentrifugieren gesammelt und mit 3 ml Wasser gewaschen.

   Das Produkt wird in 2   mu 1-molarer   Natriumacetat-Pufferlösung (PH 5, 6) wieder gelöst. Die Lösung wird mit 1 ml Wasser verdünnt, und dann werden 30 ml absolutes Äthanol tropfenweise unter Rühren und Erwärmung zugegeben, um das Polysaccharid-Natriumsalz zu   fällen,   Die Mischung wird auf Raumtemperatur gekühlt und das Produkt durch Zentrifugieren gesammelt und dreimal mit Äthanol gewaschen. Um ein Natriumsalz von grösserer Reinheit zu gewinnen, wird das Produkt nochmals in 3 ml Wasser, welches 0, 5 ml Natriumacetat-Pufferlösung enthält, gelöst und durch Zugabe von 30 bis 35 ml Äthanol umgefällt.

   Das unlösliche Salz wird in einer Zentrifuge gesammelt, mit Äthanol gewaschen, wieder in Wasser gelöst und die Lösung 16 h gegen entionisiertes 
 EMI10.3 
 Stickstoff, 3, 5% Natrium (durch Flamme),   0, 35% Calcium (Spurenverunreinigung, durch Flamme) und   7, 93% Asche. In einer Kaliumbromid-Scheibe zeigt das Natriumsalz Infrarot-Absorptionsmaxima bei etwa   2, 93, 3, 24, 3, 41, 5, 78, 6, 05, 6, 43, 6, 70, 7, 10, 7, 27, 7, 65, 8, 02, 8, 85, 9, 53, 10, 70, 11, 20   und 11,57   jn.   



   Beispiel 8 : Polysaccharid II kann als freie Säure erhalten werden, indem ein Salz davon einem Ionenaustausch unterworfen wird. Eine Lösung von 35 mg des wie in Beispiel 6 erhaltenen PolysaccharidCalciumsalzes in 5 ml destilliertem Wasser wird durch eine Säule geleitet, die 2,5 ml Kationenaustau- 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 
 EMI11.1 
 stantem Gewicht bei   500C   sind die analytisch gefundenen Werte dieses Produktes folgende : 44, 64% Kohlenstoff, 6,27% Wasserstoff, 8,15% Stickstoff und 40,9% Sauerstoff als Differenz. Die biologische Prüfung zeigte 313   000"Mausschutzeinheiten"pro   mg. 



   Polysaccharid II zeigt in der freien Säureform die folgenden Infrarot-Absorptionsmaxima in einer Kaliumbromid-Scheibe : 2,95, 3,22, 3,33, 3,37, 5,73, 6,00, 6,43 6,96, 7,24, 7,61, 8,04, 8,77, 9, 49, 10, 83, 11, 13 und 11,   52 1J.   



   Polysaccharid II als freie Säure kann durch Titration mit einer ausgewählten Base, wie Natriumhydroxyd, Kaliumcarbonat oder Calciumhydroxyd, in jedes gewünschte Salz umgewandelt werden. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen immunogenen Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, dass nach an sich bekannten Methoden gewonnenes immunogenes Protoplasmamaterial von Stämmen von Staphylococcus aureus, wie NRRL B-2467, B-2468, B-2469, B-2471, B-2472, B-2473, B-2474, B-2475, B-2476 oder B-2477, welche in halbfestem bis weichem, serum- oder plasmahaltigem Agarmedium lose   zusammenhängende.   diffuse, halbopake Kolonien bilden, mit einer wässerigen Säure, vorzugsweise Essigsäure, bei einem PH-Wert von etwa 4 oder darunter, gegebenenfalls unter Erwärmen, behandelt und das nach Abtrennen vom festen Rückstand in der wässerigen Lösung enthaltene immunogene Polysaccharid gegebenenfalls durch Chromatographie, durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes,

   durch Fällung der Verunreinigungen mit Alkohol oder durch eine Kombination dieser Methoden gereinigt und gegebenenfalls in ein Salz übergeführt wird.

Claims (1)

  1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass als immunogenes Protoplasmamaterial ganze Bakterienzellen verwendet werden.
    3. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass als immunogenes Protoplasmamaterial der nach der Extraktion intakter Bakterienzellen mit Phenol und einem wässerigen Lösungsmittel verbleibende feste Rückstand verwendet wird.
    4. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Protoplasmamaterial mit 0, In-Essigsäure 5 - 60 min bei etwa 1210C unter Druck erhitzt wird.
    5. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung des immunogenen Materials der Stamm Staphylococcus aureus NRRL B-2467 verwendet wird.
AT391162A 1961-05-15 1962-05-14 Verfahren zur Herstellung eines neuen immunogenen Polysaccharids AT234906B (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US234906XA true 1961-05-15 1961-05-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
AT234906B true AT234906B (de) 1964-07-27

Family

ID=21815400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
AT391162A AT234906B (de) 1961-05-15 1962-05-14 Verfahren zur Herstellung eines neuen immunogenen Polysaccharids

Country Status (1)

Country Link
AT (1) AT234906B (de)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2659808C3 (de) Proteingebundene Polysaccharide und deren Verwendung zur Bekämpfung von Tumoren
EP0095682B1 (de) Verfahren zur Herstellung zell- und geweberegenerierender Stoffe
DE2024586C3 (de)
DE2701312C2 (de) Polysaccharid mit gelbildenden Eigenschaften und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2457090C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen sowie Antibronchialimpfstoff
DE69731891T2 (de) Verfahren zur reinigung von gbs-toxin/cm101
DE2457047C3 (de) Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dessen Verwendung zur Tetanusprophylaxe
DE2307051C3 (de) Verfahren zum Reinigen von langsamen a - und ß -Glykoproteinen aus Mikrobenkörpern und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
AT234906B (de) Verfahren zur Herstellung eines neuen immunogenen Polysaccharids
DE2749961C2 (de)
DE1185335B (de) Verfahren zur Herstellung von neuen Staphylococcen-Antigenen
DE2803681C2 (de)
DE2519937A1 (de) Acetylierte extrakte von corynebakterien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in arzneimittelzubereitungen
DE1076888B (de) Verfahren zur Gewinnung atmungsfoerdernder Wirkstoffe fuer therapeutische Zwecke
CH639667A5 (de) Verfahren zur herstellung von peptidkomplexen aus dns-haltigen organismen.
CH640244A5 (en) Biologically active substance
DE2613943A1 (de) Verfahren zur herstellung von vaccinen auf ribonucleinsaeurebasis
EP0257418B1 (de) Oxiran-Pseudooligosaccharide, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate
DE2815758C3 (de) Peptidkomplexe aus DNS-haltigen Organismen
DE2364317C3 (de) Verfahren zur Isolierung von Choleragen
AT224807B (de) Verfahren zur Gewinnung eines neuen tumorhemmenden Polysaccharids
EP0173948A2 (de) Neue Pseudooligosaccharide mit alpha-Glukosidase-hemmender Wirkung, Verfahren zur deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate
AT200257B (de)
AT389516B (de) Neue oxiran-pseudooligosaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung und sie enthaltende pharmazeutische praeparate
AT221713B (de) Verfahren zur Herstellung zweier neuer Antibiotika und ihrer Gemische