DE2364317C3 - Verfahren zur Isolierung von Choleragen - Google Patents

Description

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet daß für die Gewinnung des Choleragens ein Kulturfiltrat verwendet wird, das nach Abtötung der Choleravibrionen mit 0,2 bis O,9°/o Phenol oder mit 0,05 bis 0,3% 2-Athoxi-6,9-diaminoacridinlactat in der Kulturlösung gewonnen wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Choleragen, das insbesondere für den Einsatz im technischen Maßstab geeignet ist.

Es wird heute weitgehend anerkannt, daß die Diarrhöe als Folge der Cholera-Erkrankung von einem Exoenterotoxin des Cholera-Erregers Vibrio cholerae ausgelöst wird. Dieses auch als Choleragen bezeichnete Cholera-Toxin ist über einen komplexen Mechanismus Anlaß für die Hypersekretion von Wasser und Salzen, die bei der Cholera bekannt und für die Erkrankung charakteristisch ist.

Im Rahmen von Überlegungen, die Cholera durch eine Immunprophylaxe zu bekämpfen, hat das Choleragen eine vordringliche Bedeutung gewonnen.

Die handelsüblichen Cholera-Vaccinen bestehen aus einer Aufschwemmung von abgetöteten Vibrio cholerae. Die nach parenteraler Injektion dieser Impfstoffe in den Probanden erzeugte Immunität ist nachweislich fast nur antibakterieller Natur. Feldversuche haben bewiesen, daß eine parenterale Vaccination mit keimhaltigen Impfstoffen einen Schutz gegen die Cholera für die Dauer von wenigen Monaten verleiht.

In Tierversuchen konnte gezeigt werden, daß ein entgiftetes Choleragen, parenteral oder oral verabreicht, zu einer Resistenz der Tiere gegen virulente Choleravibrionen führte. Die erst im Laufe von Monaten abklingende Immunität konnte durch die orale Gabe des entgifteten Choleragens wiederhergestellt werden. Obwohl diesen Befund auch widersprechende Ergebnisse gegenüberstehen, so weisen sie doch auf einen steigenden Bedarf nach einem im technischen Maüstab durchführbaren Verfahren /ur Gewinnung des Choleragens hin.

Die bisher bekanntgewordenen Prozesse zur Gewinnung vein Choleragcn sind als Laborverfahren ausgearbeitet und in den technischen Maßsiab nur bedingt übertragbar. Die als technisch durchführbar bezeichneten Verfahren sind durch aufwendige Fällungsschritte mit Äthanol bei tiefen Temperaturen und durch verschiedene chromatographische Maßnahmen gekennzeichnet. Insbesondere läßt sich mit Hilfe dieser Arbeitsweisen nicht die größte Schwierigkeit, die bei der Herstellung von Choleragen auftritt, überwinden, die darin besteht, daß die gesuchte Substanz in sehr geringer Konzentration in einer Lösung beträchtlicher Ionenstärke, dem Kulturfiltrat des Choleravibrio,. vorzuliegen pflegt

Bei der Suche nach einer Lösung für dieses Problem wurde Aluminiumhydroxid in Gelform für die Adsorption des Choleragens eingesetzt (J. Infect Diseases 121 Suppl. [1970] siehe Seite 96).

Das relativ große Volumen pro Gewichtseinheit und die Konsistenz des Adsorbens führt jedoch zu aufarbeitungstechnischen Nachteilen.

Es wurde nun ein Verfahren zur Isolierung von Choleragen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist,

säureaerogel zugibt, das durch Hydrolyse von Siliciumtetrachlorid zu einer Knallgasflamme hergestellt wurde, aus amorphen kugelförmigen Teilchen aufgebaut ist, einen mittleren Durchmesser von 5-50 Millimikron und eine Oberfläche von über 30 qm pro g hat, die Suspension rührt, das Kieselsäureaerogel abtrennt, zur Elution mit einer wäßrigen Salz- oder Pufferlösung behandelt, das Choleragen-haltige Eluat von dem Kieselsäureaerogel abtrennt und gegebenenfalls durch lonenaustausch-Chromatographie und/oder Molekularsieb-Techniken weiterreinigt.

Als Adsorbens werden Kieselsäure-Präparate verwendet, die durch Hydrolyse von Siliciumtetrachlorid in einer Knallgasflamme hergestellt werden. Diese haben in der Regel einen SiO2-Gehalt von über 99%, sind aus amorphen kugelförmigen Teilchen aufgebaut, haben einen mittleren Durchmesser von 5-50 Millimikron und eine Oberfläche von über 30 qm pro g (gemessen nach Brunauer, Emmet und Teller, J. Amer. Chem. Soc. 60, 309-319, 1938). Es können auch solche Kieselsäurepräparate verwendet werden, die einen geringen Zusatz von AbO₃ enthalten, wie sie z. B. in der Schrift Anwendungstechnik Pigmente der DEGUSSA, Nr. 16, 2. Auflage, 15.10. 1969 unter der Bezeichnung MOX 80 beschrieben sind, wie sie beispielsweise als Aerosil(^R) von der Firma Degussa, Frankfurt, im Handel erhältlich sind. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, anders formulierte Kieselsäuren für d°n angegebenen Zweck einzusetzen, wenn sie als entscheidende Merkmale insbesondere im Vergleich mit dem Gewicht eine relativ große Oberfläche und auf der Oberfläche SiOH-Gruppen besitzen.

Eine bevorzugte Maßnahme für die Gewinnung des Choleragens stellt die Behandlung des Choleragen-haltigen Kuiturfiltrats mit einer Kieselsäure dar, deren Oberfläche 50±l5qm pro g Siliciumdioxid beträgt. In einer Menge von 1—5 g/l, vorzugsweise 2 g/l, bindet dieses Adsorbens in Choleragen-haltigen Lösungen, insbesondere in Kulturfütraten, in einem pH-Bereich von 6,0-7,0, vorzugsweise bei pH 6,5, das Choleragen reversibel.

Die gleichen Adsorptionsverhältnissc werden in Choleragenhaltigen Lösungen gefunden, deren Gefrierpunktserniedrigung durch Elektrolytzusätze mit der eines Kuiturfiltrats vom Vibrio cholerae vergleichbar gestellt wurde. Im Grunde ist jedoch die Kieselsäure als Adsorbens für jede ( holeragen haltige Lösung eiii/.u-

setzen. Dabei gilt, daß ein niedriger pH-Wert und eine niedrige Leitfähigkeit der Lösung die Bindung des Choleragens an das Adsorbens begünstigt, während ein hoher pH-Wert und eine hohe Leitfähigkeit der Lösung die Ablösung des Choleragens vom Adsorbens begünstigL

Kieselsäuren mit größerer Oberfläche binden das Choleragen stärker als die mit kleineren Oberflächen. Bei pH-Werten wesentlich unterhalb des beispielhaft ' angegebenen Bereichs ist die Adsorption aus Kulturlösungen nicht reversibel, d.h. eine Desorption ist nur unter Verlusten an Ausbeute und An tigenität durchführbar, während bei pH-Werten deutlich oberhalb des angegebenen Bereichs eine Bindung von wesentlichen Anteilen des Choleragens nicht mehr stattfindet

Für die Elution kommen wäßrige Salz- oder Pufferlösungen infrage, die geeignet sind, Choleragen von der Kieselsäure zu eluieren. Geeignet in diesem Sinne sind wäßrige Lösungen, deren Elektrolyte den schwachen Säurf.n zuzuordnende negativ geladene Ionen enthalten und/oder den pH-Bereich von 7,0-9,0 ausreichend konstant halten. Es können deshalb einerseits Lösungen von Natriumacetat oder Natriumcitrat, andererseits in der Enzymologie gebräuchliche Puffergemische wie Trisliydroxymethylaminomethan-Phosphorsäure als Elutienslösungen zur Wiedergewinnung des Choleragens eingesetzt werden. Vorzugsweise wird die Elution bei pH 8,5 durchgeführt Die Leitfähigkeit der Elutionslösungen liegt bei mindestens 5, vorteilhaft bei 15 Millisiemens.

Zur Steigerung d>-^r Ausbeute ist es zweckmäßig, der Elutionslösung zusätzlich Elektrolyt«, vorteilhaft in Form stark dissoziierender Salze zuzusetzen. Dabei wird die erforderliche Menge des Zusatzes vom pH-Wert der Elutionslösung in der Weise bestimmt, daß js bei hohem pH-Wert weniger Elektrolyte erforderlich sind als bei niedrigerem pH-Wert wenn die gleiche Ausbeute erreicht werden soll. Die Konzentration an dem beispielhaft angegebenen Kochsalz liegt zwischen 1 und 15%: bei pH 8,5 und Verwendung eines 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-Phosphorsäure-Puffers zwischen 5 und 7,5%. Dabei ist das Choleragen in einer Ausbeute von 70 — 90% eluierbar. Das Elutionsvolumen kann einen Bruchteil des ursprünglichen Volumens betragen, wodurch sich der erfindungsgemäße Adsorptionsschritt für die Reduktion der im technischen Maßstab vorliegenden großen Volumina auf leichter zu bewältigende Mengen besonders eignet.

Das eluierte Choleragen ist noch weiter konzentrierbar, vorteilhaft mit Hilfe von Choleragen-tindurchlässi- -,o gen Membranen. Es ist zur Reduktion des Salzgehaltes und zur Oberführung in andere Puffergemische dialysierbar und in geeigneten Puffergemischen lyophilisierbar. Es ist gewünschtenfalls weiter zu reinigen.

Nachdem das eluierte Choleragen mittels Membran- « filtern konzentriert und durch hochtourige Zentrifugation von mukosen bzw. viskosen Verunreinigungen befreit worden ist, kann es über ein Molekularsiebgel auf der Basis von Polyhydroxy-Verbindungen wie Dextran, Zellulose und Agarose oder geeigneten (,0 Kunststoffen wie Polyacrylamid fraktioniert werden, vorteilhaft in einer Säule, die gefüllt ist mit Epichlorhydrin-vernetztem Dextran, dessen Ausschlußgrenze bei Molgewichten von etwa 150 000 liegt, beispielsweise Sephadex<^R> G 150 der Firma Pharmacia, Uppsala. Die f,--, das Choleragen in hoher Reinheit enthaltende Fraktion kann danach durch Sammeln der dieses enthaltenden Fraktionen (Prüfung nach den weiter unten beschriebenen Methoden) gewonnen und nach Dialyse gegen ein geeignetes Puffersystem gefriergetrocknet werden.

Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Choleragen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dient vorteilhaft ein keimfreies Filtrat einer Kultur eines aus der Literatur als Choleragenbildner bekannten Vibrio cholerae, z. B. Vibrio cholerae 569 B Inaba, Vibrio cholerae 12 Ogawa, Vibrio cholerae B 1307 und anderen, der in ebenfalls in der Literatur beschriebenen hierfür geeigneten halbsynthetischen Kulturlösungen vermehrt worden ist Dabei wird Choleragen in die Kulturlösung abgeschieden.

Vor der Gewinnung des Kulturfiltrats ist es aus Sicherheitsgründen zum Schutz des Bearbeiters vor einer Cholera-Infektion zweckmäßig, die Kultur abzutöten. Nicht alle antibakteriellen Mittel, die das Choleravibrio abzutöten vermögen, sind dafür geeignet So führt beispielsweise 0-propioIacton zu Schädigungen des Choleragens. Außerdem kann nicht vorausgesehen werden, ob das verwendete Abtötungsmittel nicht in uciTi Adsorbens in ucf WciSc inicrfcficri, daß däS Choleragen nicht adsorbiert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Adsorption von Choleragen aus Kulturfiltraten ist besonders gut durchführbar, wenn die Abtötung von Vibriu cholerae beispielsweise durch Einwirkung von 0,2 bis 0,9, vorzugsweise 0,5% Phenol, oder von 0,05 bis 0,3, vorzugsweise 0,1% 2-Äthoxi-6,9-diaminoacridinlactat, erfolgt ist. Die Abtötung der Keime oder die Verminderung der Keimzahl kann jedoch auch durch andere bekannte bakterizide Mittel einer den genannten Substanzen vergleichbaren Struktur erreicht werden. Die Abtötung der Keime ist jedoch für die Adsorption des Choleragens aus dem keimfreien Filtrat nicht erforderlich. Wenn bei entsprechenden technischen Vorkehrungen das Kulturfiltrat ohne vorherige Abtötung der Vibrionen gewonnen wurde, kann die Adsorption durch Kieselsäure in der gleichen erfindungsgemäß beschriebenen Weise durchgeführt werden.

Der Nachweis und die Messung des Gehalts in Lösungen erfolgt einerseits immunologisch mit Hilfe eines Haemagglutinationshemmungstest, wie sie von Finkelstein (J. of Infections Diseases 121 S. 63-72 [1970]) für den besonderen Fall des Choleragens beschrieben wurde, andererseits durch den Nachweis einer erhöhten Permeabilität des Gewebes durch das Choleragen durch die Messung der sogenannten Bläuungsdosis.

Haemagglutinationshemmungstest (HAH) zur Bestimmung von Choleragen:

Eire in Anlehnung an Finkelstein mit Choleragen beladene Erythrozytensuspension wird gegen eine Verdünnungsreihe von Anti-Choleragen-Serum vom Kaninchen auf Reaktivität geprüft. Auf einer Mikrotiter-Platte wird dazu eine Verdünnungsreihe des Antiserums hergestellt und zu jeweils 0,05 ml jeder Verdünnung werden 0,025 ml der Erythrozyten-Suspension gegeben. Die Platte wird einige Sekunden auf einem Vibrator geschüttelt, Nach 1 -2 Stunden ist als Endpunkt die Verdünnung, die als letzte eine gute Agglutination zeigt, abzulesen. Für den Haemagglutinationshemmungstest (HAH) wird die Verdünnung des Antiserums gewählt, die 8mal niedriger ist als die abgelesene Endverdünnung, also beim Ablesen von z. B. I : 3200 wird eine Verdünnung von 1 : 400 gewählt.

Auf der Mikrotiter-Platte werden Verdünnungsreihen (0,05 ml) der zu untersuchenden 1 bis 80 um/ml

Choleragen-haltigen Losung und einer Standardprobe von 20 μηι/ml Choleragen hergestellt. Danach werden zu jeder Verdünnung 0,025 ml der vorher bestimmten Konzentration des Antiserums gegeben. Es wird geschüttelt, eine Stunde stehengelassen und schließlich 0,025 ml der mit Choleragen beladenen Erythrozytensuspension zugegeben und wieder geschüttelt. Nach 1 bis 2 Stunden zeigt sich eine Hemmung der Agglutination bei den niedc^rigen Verdünnungen der zu uniersuchenden Choleragen-Proben und eine Agglutination bei den hohen Verdünnungen. Zur Auswertung wird der KAH-Titer der Probe mit dem HAH-Titer des 20 μΓη/ml Choleragen Standards, der meist zwischen 1 : 32 und 1 :64 liegt, in Beziehung gesetzt.

Bestimmung der Bläuungsdosis von Choleragen mit dem Intracutantestbeim Meerschweinchen:

Von Choleragen werden geeignete Verdünnungsreihen in 2er Stunden hergestellt.

Bei Albino-Meerschweinchen werden die seitlichen Bauchwände enthaart. 6 intracutane Injektionen von je 0,1 rrt! der Cholersgenverdünnungcn werden jcdcrn Meerschweinchen verabreicht. Nach 18 jis 20 Stunden werden 1 ml einer 1% Evans Blue Lösung in isotoner Lösung intravenös gegeben. Die Durchmesser der gefärbten Zonen werden nach 1 Stunde gemessen. 1 Bläuungsdosis ist die Menge Choleragen, welche in einem Bereich von 8x8 mm Bläuung erzeugt. Die Bläuungsdosis pro ml ist durch den lOfachen reziproken Wert der Verdünnung gegeben, die einen 8 χ 8-mm-Hof erzeugt hat.

Die Erfindung soll nachstehend an Beispielen erläutert werden.

Beispiel 1

300 Liter Choleragen-haltiges Kulturfiltrat, das nach Inaktivierung mit 0,5% Phenol von Kultur Cholera Inaba 569 B und anschließender Zentrifugation über eine Separator der Fa. Westphalia gewonnen wurde, wird in einem mit Kühlmantel und Rührer versehenen Kessel auf +15°C gekühlt. Dann werden 600 g AcrosillK) OX 50 (Kieselsäure, 50 qm Oberfläche pro Gramm, der Fa. Degussa) die in !0I destilliertem Wasser suspendiert sind, unter Rühren zugegeben. Der pH-Wert der Suspension, der bei 7,8 liegt, wird durch Zugabe von 1 N Salzsäure auf 6.5 eingestellt. Es wird 3-4 Stunden weitergerührt und danach der Rührer abgestellt. Innerhalb von 8 Stunden sedimentiert das AerosilW OX 50, so daß etwa 270 I Überstand, der frei von Aerosil ist, abgehebert werden kann. Die verbleibenden 30 1 Suspension werden mit einer Durchlaufzentrifuge zentrifugiert. Das erhaltene Sediment mit einem Volun.en von 2,5 I wird unter Rühren in 15 I folgenden Puffers resuspendiert:

0,1 M Phosphorsäure
0,06 M Trishydroxymethylaminomethan
0,001 M Äthylendiamintetraessigsäure
mit NaOH auf pH 8,5 eingestellt

Nach dem Suspendieren werden noch 1125g Natriumchlorid zugegeben, das sind 7,5% bezogen auf die 15 1 Puffer, pH 8,5. Die Suspension wird 20 Stunden bei 20⁰C gerührt und dann 45 Minuten bei 9000 g zentrifugiert. Es werden 15 1 zentrifugierter Überstand erhalten, welcher das Choleragen enthält.

Dieser Überstand wird nun mit destilliertem Wasser auf 30 1 verdünn! und bei 4°C mit einem Ultrafilter iuf 31 ankonzentrier·.. Das Ultrafilterkonzentrat wird anschließend 4 Stunden gegen fließendes entsalztes Wasser und dann gegen 20 1 folgenden Pulfers dialysiert:

5 mM Phosphorsäure
0,5 mM Äthylendiamintetraessigsäure
' eingestellt auf pH 8,0 mit 1 N Natronlauge

Die dialysierte Lösung wird dann lyophilisiert.
Das Lyophilisat wird anschließend in 500 ml ά< iiillertem Wasser gelöst und 20 Stunden bei 18 00J _; und ίο einer Temperatur von + 5°C zentrifugiert.

Der Überstand der Zentrifugation wird auf eine Säule

(30 cm Breit, 50 cm Lang) gefüllt mit Sephadex<^R) G-150 (Pharmacia, Uppsala) gegeben. Das Sephadex»^K) G-150 ist mit folgendem Puffer equilibriert, d. h. mehrfach gewaschen:

0,1 M Trishydroxymethylaminomethan
0,1 M Natriumchlorid
0,5 mM Äthylendiamintetraessigsäure
eingestellt auf pH 8,0 mit Salzsäure
-"' 0,02 % Natriumazid

Eluiert wird mit dem Puffer, mit dem auch equilibriert wurde. Die Absorption des Eluats bei 280 nm wird in einem Durchflußphotomotor gemessen. Es werden 2

j-> Peoks registriert. Die hochmolekulare Fraktion, dargestellt durch den 1. Peak, enthält kein Choleragen. Das Choleragen wird in dem 2. Peak wiedergefunden. Die Choleragen-haltige 2. Fraktion wird am Ultrafilter auf etwa 1 Liter ankonzentriert und djnn gegen folgenden

ίο Puffer dialysiert:

0,02 M Phosphorsäure

0,5 mM Äthylendiaminte raessigsäure

eingestellt auf pH 8,0 mit 1 N Salzsäure

r> Es folgt Lyophilisation. Ausbeute 1,76 g an reinem Produkt.

Beispiel 2

3001 Choleragen-haltiges Kulturfiltrat, das durch Inaktivierung von Kultur Cholera Inaba 569 B mit 0,1 % 2-Äthoxi-6,9-diaminoacridinlactat und anschließender Zentrifugation der Kultur über einen Separator der Fa.

Westphalia gewonnen wurde, wird wie in Beispiel 1 beschrieben mit Aerosil versetzt, jedoch mit der

4-, Veränderung, daß zuerst 300 g Aerosil'^R> OX 50 in 2 I Wasser suspendiert zugegeben wurden und 1 Stunde später weitere 600 g AerosilC) OX 50, suspendiert in 8 1 Wasser. Weiter wird bei dem Schritt der Desorption des Choleragens von AerosiK") OX 50 2250 g Natriumchlo-

vi rid anstelle von 1125 g zugegeben.

Die Ausbeuten und Reinheitsgrade der einzelnen Reinigungsschritte entsprechen weitgehend denen von Rcispiel 1.

Beispiel 3,4 und 5

Jeweils 250 ml eines am Ultrafilter um das Dreifache konzentrierten Kulturfiltrats des Vibrio cholerae Inaba 569 B werden mit

nach Beispiel 3 - 1 g AerosiH«) 200 V
^b" (200 nV Oberfläche pro g)

nach Beispiel 4 - 1 g AerosiK") MOX 80

(80 m² Oberfläche pro g)
nach Beispiel 5 — 1 g AerosiK^R)OX 50

(50 m² Oberfläche pro g)

unter Rühren versetzt und der pH-Wert der Suspension mit 1 N Salzsäure auf 63 eingestellt. Die Suspension wird 3 Stunden bei + 15° C eerührt. Nach weiteren 15

7 8

Stunden wird I Stunde bei bOOO g zentrifugiert. Die Natriumchlorid zugesetzt. V.s wird 20 Stti

Sedimente der Zcntrifugationen werden in 30 ml der in gerührt und dann 45 Minuten bei 9000 g .

Beispiel I beschriebenen Phosphorsäure. Tris(hydroxy- Die Bilanz der Aufarbeitung an Choleragi

methyl)-:iminomethan, RDTA Puffer, vom pH 8Λ resu- erhaltenen pll 8.5-F:!uatcn ist in der Tabelle

spendiert und zu jeder Suspension werden 2,2'"> g ;

Tabelle

(holeragen Menge ('hnkragcn Gesamt Ausheuu

I raktion nach HAU {'holeragen

I ηιμ/Ι mg "..

Kulturnittiit 3liich konzentriert 0,250 30 7,50 (K)O)

Kluate nach Beispiel 3 Beispiel 4 Beispiel 5

0.033	XO	2,64	35
0.02S	80	2.64	30
0.023	320	7.35	m

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isolierung von Choleragen, dadurch gekennzeichnet, daß man zu einer choleragenhaltigen Lösung Kieselsäureaerogel zugibt, das durch Hydrolyse von Siliciumtetrachlorid in einer Knallgasflamme hergestellt wurde, aus amorphen kugelförmigen Teilchen aufgebaut ist, einen mittleren Durchmesser von 5 —50 Millimikron und eine Oberfläche von über 30 qm pro g hat, die Suspension rührt, das Kieselsäureaerogel abtrennt, zur Elution mit einer wäßrigen Salz- oder Pufferlösung behandelt, das choleragenhaltige Eluat von dem Kieselsäureaerogel abtrennt und gegebenenfalls durch Ionenaustausch-Chromatographie und/oder Molekularsieb-Techniken weiterreinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Choleragen-haitige Lösung ein Kulturfiltrat eines Choleragen-bildenden Vibrio