DE1909915A1

DE1909915A1 - Verfahren zur Herstellung gereinigter 6-Aminopenicillansaeure und Penicilline

Info

Publication number: DE1909915A1
Application number: DE19691909915
Authority: DE
Inventors: Michael Sela; Shmuel Shaltiel
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1968-02-29
Filing date: 1969-02-25
Publication date: 1969-09-25
Also published as: BE729183A; ES364195A1; AT294310B; IL31703A0; GB1224181A; NL6903217A; BR6906649D0; IL31703A; DK126208B; FR2022088B1; FR2022088A1; US3770584A

Description

Dft. EIiSAuSTH 7ÜNQ

DS VC :■ , γ -·■ - ng DIPL-U;. . ' . ~-_{

•München i^S.cnasstr 26 Telefon: 3450 61

5. FB. 1S

UoZ.-s E 1Σ1 (Vn/kä)

BEECHAM GROOP LIMITED
Brentford,, Middlesex; England

" Verfahren zur Herstellung gereinigter 6-Aminopenicillansäure und Penicilline"

Priorität: 29« Februar 1968, Grosebritannien, Hr. 09 77&

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der Antigenwirkung von 6-Aminopenicillansäure und Penicillinen sowie deren Derivaten, die auf fermentativem V/ege erhalten worden sind»

6-Aminopenicillansäure und Penicilline und deren Derivate, die auf fermentativem Wege erhalten wurden und nach herkömmlichen Verfahren isoliert werden, enthalten Verunreinigungen mit starker Antigenwirkung. Diese Verunreinigungen sind äusserst unerwünscht, da Penicilline, die aus 6-Aminopenicillansäure hergestellt worden sind, z,B. einen anaphylaotischen Schock bei Patienten hervorrufen können. Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Abbau dieser Verunreinigungen mit Antigenwirkung zu schaffen, damit die Immunogenität des Produktes und seine

Reaktionsfähigkeit mit spezifischen Antikörpern wesentlich ver-

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rlngert istr Diese Aufgabe wird duroh die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung let ©emit ein Verfahren zur Her«teilung gereinigter ö-Amiaopeniclllanaäure und Penicilline sowie ihrer

Derivate, die auf fermentativem Wege erhalten wurden, da· da-

LOsuns

durch gekennzeichnet iet, dass man eine wäesrlge/von o-Aminopenicillansäure oder eines Penicillins oder dessen Derivats nit mindestens einem wasserunlöslichen Derivat von mindestens einem proteolytischen Jinzym behandelt«

Das Verfahren der Erfindung kann angewandt werden auf

1) Penicilline, die durch unmittelbare Fermentation in öegenwart von Seitenkettenvorläufern hergestellt wurden;

2) auf 6-Arainopenicillansäure, die duroh unmittelbare Fermentation in einem synthetischen Nähruedium hergestellt wurde;

3) 6-Aminopenloillansäure, die duroh enzynatisohe Hydrolyse eines Penicillins hergestellt wurde;

4) auf 6-Aminopenicillansäure oder ein·· Beters dieser Verbindung, die durch ohemisohe Abspaltung der Seitenkette eines Penicillins erhalten wurde; oder

5) ant Penicilline oder deren Derivate, dl· aus 6-Aminopenioillansäure hergestellt wurden, velohe vorher keinem Verfahren sun Abbau der antigen wirkenden Stoff· unterworfen wurde·

Die Penicilline können duroh unmittelbare Acylierung von 6-Aminopenicillansäure und ansohlieeeende Reinigung oder Umwandlung in Derivate, s.B· das Reak ti one produkt von 6-Aainobensylpenicillin mit Aceton^hergestellt werden. Auen dies· Derivat· können den erflndungsgenäesen Verfahren unterworfen werden.

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BAD

Die waeserunlösliciieu Enzymderivate werden nach herkömmlichem Verfahren hergestellt, z.B. naoh den in der britischen Patentschrift 916 931 und X 062 596 beschriebenen Verfahren· Das la Verfahren der &rfindun£ bevorzugt verwendete prottolytisohe Bnzym ist Pronase, die aus Streptoajoee griseus isoliert wird und eine breite spezifische »irkung entfaltet. Bas Enzym kann z.B. mit BromacetyloelluloBe umgesetzt oder mit CM-Sephadex in Gegenwart eines geeigneten Amldbinuune«n bildenden Reagens» z.B. einem Carbodilmid, behandelt werden. Die wasserunlöslichen Derivate behalten die Aktivität des Auagangsensyms, sie bleiben in der wasserunlösliohen form und können damit in kontinuierlichen Yerfahren in Säulen oder anderen Vorrichtungen verwendet warden· Zur Erhöhung des Aktivitätebereiohes kann di· Behandlung «it mehr ale einem Ünzym in der wasserunlöslichen form durchgeführt werden. Auf diese Weise lassen eich die proteinartigen Antigene In Auegangematerial stärker abbauen.·

Bei Verwendung von wasserunlöslicher fronase wird daa Verfahren der Erfindung zur Erzielung beeter Srgebnisse vorsugaweiee bei P_K 7 bis 8 durchgeführt. Der Abbau des proteinartigen Materials erfolgt ziemlich raeoh, im allgemeinen innerhalb 1 bis 3 Stunden.

Sie Wirksamkeit von Pronase zum Abbau der in 6-Aminopenioillansäure enthaltenden proteinartigen Verunreinigungen mit Antigenwirkung wurde durch Versuche bewiesen, dl· mit einer isolierten Antlgenfraktlon durohgefUhrt wurden, die mit Pronase behandelt wurde. Die behandelte Fraktion wurde der Elektrophorese und Chromatographie unterworfen. Ba zeigte eich» daee sie sich wie •in AminoaäurengeBieoh verhielt« Bei der Dialyse der behandelten

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BAD ORIGINAL

Fraktion hinterblieb nur ein &etontat von Pronaee» während die Anfangsfraktion In einem Kontroll versuch nicht dialyeierb&r war. Aufgrund dee PCA-Testβ zeigte sieh» daao kein« Antikörper in Tieren erzeugt wurden» denen die beende!te fraktion wurde, Die Wirkeamkeit der Pronase wurde aicht weun die Antigenfraktion ©it einem grosses übersshuss von 6-AiBiaopeniciIlaiieäure vermischt nmwäQ, ua die Situation von technischer ß-Asinopenielllanaäure süs

hinsichtlich der Wirkeamkeit eher Derivate von Proaase wurden bei Tersuohea odt Aneätsexi von G-Ai&lnopenioiil&ns&ure und Penioi llirsn, vie und ·<- Amino benzylpenicillin,

Die Beispiele erläutern die Erfiadung» Beispiel 1 Die Fraktionen mit antigenen Verunreinigungen, did vorher

teohnieoher 6-Aainopenioillaneäure nit Hilf» «in«« el«be isoliert wurden, wurden foleenderm*.fetea

Sine Fortion von 1,5 ag der Traktion wurde ia 5t 7 a-Salseäure

gelöst und 16 Stunden bei 105 ± I⁰C l^drolysiert« U*@> Produkt wurde nlt eine» JLainoiäuren-Asalj**tor uatereuoht·

Bine andere Fortion von 1,5 ag der Jteaktioa «ardt in 0,5 ■! 0,05 aolaren Aaaoniuebicarbonmtpuffer· P₀ 7,9 geltet und ait 10/* einer LOeung von 1,5 ag I>roaA«e/ni ia glelonea Fuffer eetet· Dae Qeaisoh wird 16 Stunden bei 37⁰C inkubiert und *asohlieeeend «ur Trockene eingedaapft. Au ob dieeee Produkt vurde mit dem Aalnoeäuren-Analyeator untereuoht.

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-Sr

8ei.de Produkte enthielten eine gjo3ae Anzahl von Aminosäuren βο-wie einige kleine Peptide, veriautlicb Dipeptide· Die ^vereuoh« aeigten, d"aae die Pronase unspezifiech war und die proteinartigen Stoffe 201 Aminosäuren und Kleinen Ptptiticn auf dlo gleiche Weise abbaute, vie es bei tier Behandlung mit Säure der Fall war.

Beispiel 2

2 mg der Traktion mit antigenen Verunreinigungen, die vorher aus technischer 6-Aminopenicillansäure mit Hilfe eines Molekularsiebe Isoliert wurde_# in 1 ml eines 0,05 molaren Ammoniuabicarbonatpuffers p_fl 8,3 wurde mit 0,C2 ag handeleüblicher, waaeerlöelioher Pronaee Tersetat und 22 Stunden bei 37⁰C iakubiert.

Das Produkt beaaee eine wesentlich geringere Fähigkeit zur Bildung Ton Antikörpern, wie eich aus PCA-Teβte an Meerschweinchen ergab· für Kontrollverauohe wurden

(1) die unbehandelte fraktion mit antigenen Terunrei&lgungen in Puffer» frieoh hergestellt Tor der Injektion, sowie

(2) 2 ng der Fraktion mit antigenen Verunreinigungen, auf die ▼oretehend geschilderte Weise behandelt, jedoch ohne Zusats ▼on Pronaee, verwendet.

Sie £rgebnieee sind In Tabelle I susauengesttllt·

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BAD ORIGINAL

	Gruppe	Zahl der positiven I¹I ere pro Genast zahl άβΐ geprüften Tiere	Durchnesaer deε fleok», u
Zeit, Tage	A B C	0/4 0/4 0/10	ooo
10	A B C	2/4 1/3 0/9	10 10 0
18	A C	2/3 0/9	25 25 0
24	A B C	%	30 30 23
54	A B C	2/7	26 28 18
90	A B C	%	27 28 20
134

A « unbehandelte Traktion ait antigener Verunreinigung B - fraktion ohne Pronase inkubiert C ■ fraktion mit Fronase inkubiert

Bei diesem Versuch wurden 3 Gruppen von Keereohweinchen ύ·τ*9λ-det· FUr die Gruppen A und B wurden jeweils 4 Heerschweinohen und für die Gruppe C wurden 10 Keersohwtinohtn verwendet·

Die Siere aue der Gruppe A wurden mit 0,25 al dee inkubierten ββ-mieche β aus der Fraktion alt antigenen Verunreinigungen und Prona.ee, Termischt mit 0,25 ml Freund's kompletten Adjuvants immunisiert*. Die Tiere aus den Gruppen B und C wurden in ähnlicher Heise mit Lösungen inuaunisiert, die für die vorstehend

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BAD OHIQiNAL

beschriebauen Kontrollversuche hergestellt wurden.

Bei den angegebenen Zeitabetäzuien wurden J&utent&ahjMn dusoiige· führt, und dl« Seren wurden bie aur Verwendung gefröre«· Imaalv· cutane Anaphylaiie-Teat* (PCi-5eete) wurden an Alblno-fteex*· achweinohen »it einen Gewicht von 25C bia JIOO g durongefttbrt« Den Tieren vurde 0,1 nl intieerua intraderaal lnjisiert, und 1Θ Stunden β Jäter wurden die ^i ere rait 1 al einer fj&eeh feerg·- stellten löfcuug der unbehandelten fraktion mit antigen ft r Verunreinigung (1 mg/ml in physiologischer Koeheal&löeung;), renaleoht ait 1 al einer 1 j^-igisn lösung von Bran-i ¹BSAu beüitndelt· Di· Durchaeswr der Fleöke wurden nach 10 Minuten

Beiaple/ 3

Die v/iifeing von Pron&se auf die AntigenKirloQi^ eine* freuet ion mit antigenen Verunreinigungen, die vorher »U· teohnliöütr 6->»liopenicillar.eäur9 mit Hilfe eines Kolekularaiebe Isoliert würfle, wurde an Hautvereuchen beetlnsit· Die Ergtbnl&ee eind in Tabelle Ii zuecramengeetellts

Tabelle II

Meng· an injiziertem Antigen,	Sureh.iohnittliolier Dwrcheaeaez des E«aktlonefleokt_f mi nach _r 24 Stunden	alt Pronaee Traktion
50 10 5 2,5 1 0,5 0,05	onbefcAndelte Fraktion	9 5 2 0 0 0 α
20 17 15 11 10

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BAD ORIGINAL

8 Meerschweinchen wurden mit der ttnbehand alten Fraktion Beispiel 2 itcinunieiert. i/ach 20 Tagen hatten die Tiere einen glelohneaeigen Antikörpereple&el in Serum erreicht, woe eich au· PCA-Teete ergab· zu dieser Zeit wurde Jedes Tier de« HautvereucJi mit 0,05 bie 50/* der verunreinigten Fraktion in 0,1 al phyeiologieober KoohealsUsung oder einer Äquivalenten Hea&e der Praktion behandelt, die vorher ait Pronaee, gelöst in 0,0$ «olarea Ammoniumbicarbonatpuffer, behandelt Kit Pronaee und 22 Stunden bei 37⁰C inkubiert, wie in Beiepiel 2 beeohrieben, untereuoht. Die Reaktionefleeke werden 24 Stunden naeh der Behandlung gerneeeen.

Beiepiel 4

Ähnliche Vereuohe vie in Beispiel 2 wurden alt (ieeiechen tob (Λ) 6-lainopenioillaneaure und 1 % der Traktion alt antigene« Verunreinigungen eovie (B) 6-JLmlnopenioineneMirre, 1 f der Fraktion mit anti^enen Verunreinigungen and Pronaae (2 Jt* belögen auf den Protein^ehalt der verunreinigten. Fraktion) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III soMuaaeageatellt·

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BAD ORiGiNAL

Tabelle Π ί

ZeLt₉ rage	e-ruppe ι I	Zahl der positive« !Piere· pro üeanrntzahl der behandelten Tiere	DurchBiesaer dec Flocke, cub
ι ^: ίο ;	I Λ Β	0/4 0/4	0 O
PJ	Α ■ ^B J	2/4 0/4	10 O
24 ι ι	A B	3/4 0/4	25 0
38 ί	A β	4/4 1/4	25 20
85	A B	4/4 1/4	22 16
150	A B	4/4 1/4	26 20

Die lEununogenieitut wurde gemäes Beispiel 2 durch PCA-Teate be~

8tlQClt.

Bei8Piel 5

Die Wirkung von Pronaee auf die Titration von Antleeren gegen eine Fraktion mit antigener Verunreinigung aus teonnleoner 6-Aminopenicillaneäure wurde beetiamt. Die ürgebnlee® sind In tabelle IV zusanuaengeeteilt.

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•id

Tabelle IV

Ser iimve rdünnung	i	jjurenechnittliciiex' iforohaeeeer des PleoJcs, we	ait Pronaa· b·- han4ilt
ί ■ ■,. j	? l;25O	unbobandelt	21
1:5	1:500	26	17
■ - Ii10	IiIOCO	25	14
1ϊ20		21	12
j 1:50	11200C	19	10
ΙϊΙΟΟ	Kontrollvereucii- » !»onaalee Hearschweinchfcneerua, 1;5 veraünnt	17	Endpunkt
	0
13	O
10	0
7
Bkidpunfct	0
4	0
0

Ein Ansatz γοη poeitiyen lntieeren gegen die Ytranrelnl^te fraktion wurde mit physiologischer KGchstlsltteung ^eaäea ^&b«ll· IT ▼erdüjint. Ein Volumen von 0,1 ml der verdünnten Lösung wurde
zwei Gruppen von jeveJle 4 Heersonwdinchen intradennal iujislert« BIe eine Gruppe wurde 18 ätunden später ait 1 ml einer Löeun«
gereiüt, die 0,1 mg der Fraktion alt den Verunreinigungen eowie 1 al Ev&ns blau in phyßiologiecher Kochgalslöeung enthielt. Di« andere Gruppe wurde mit einer äquivalenten Menge der Fraktion
ait Verunreinigungen gereizt, die mit Waeeer ualöalioher Pronaso (erhalten durgfa Umeetauiiß von Pronae· uit
ββ) benandelt worden war· -■■" _ ·.·■■:· ·..,; ;:. /-:

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Beispiel β

Proben too technische» BenBylpenloillln und Anplolllin wurden

o.uf dl· Yerrlngerung der lonunogenloität xuloa der Behandlung alt

Wasser nßlöallcther Frontee (Hergestellt aue BroeeootylotUuloft

und Fronase) untersucht. Die iSrgelmleee sind in !«belle T «u— oaxamengeetellt·

Tabelle T

	ler-icillin G	Zeit, Sage	Gruppe	Kahl der poeltlren Vier· pro Oeeasit- sahl der iaMuni- eierten Uberleben-	Burob- eohnitt« lioher Oaroiuwft> m 20 0
■	It	14	A C		24 25
M	21	A C	2/5 0/5	26 25
Ampicillin	28	A C	5/5 1/5	53 0
η	14	A C	4/5 1/5	29 0
η	21	A C	2/2 0/5	50 0
28	A C	2/2 0/5
2/2 0/5

Gruppen ταη 5 Kaninchen wurden mit 50 ag der cu untersuchenden Penlclllinverbindune luninieiert» l>ie Gruppe A erhielt unbehendelte Pro bei. dee Penicilline, während die Gruppe C die Penicilline nach -voznerl^er Inkubation mit einer gleichen GewiciitSBenge unlöslicher Pronaoe (bei 37°C während 22 Stunden in einen PuXfer tos P₀ 8,3) erhielt, He Injektionen wurden eubcu-

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tan in Freund⁽s kompletter» Adjuvants (\t\) verabfolgt. Afc B. und 15» Tag wurden Injektionen von 50 mg Antigen. In Freunu's fcoaplet ten Adjuvants verabfolgt. Ab L₁ 7., 14., 21. nod 28» fag wurde den Kaninchen Blut entnonaen, und die Seren wurden bsi -2D⁰C aufbewahrt. PCA-Seete wurden en den Antleeren unter Verwendung von Penlcllloyl BGG ale Antigen durchgeführt.

Beleplel 7

300 ag Pronaae in Qitrat-Phoephat-Puffer P₈ 5#1 warden η 10 g Broaaoetjleellulose (Imeegewloht) gegeben· Die Suspension wird 30 Stunden bei 22⁰C gelinae gerünrt und ait eine» tropfen einee Antieohaunnittel· versetzt. Hierauf wird die Suspension 10 Hinuten bei 10 000 0 sentrifugiert, das Preoipitat wurde in 30 si O₉I aolarea fiicarbonatpuffer Pg 8_#9 resuspendiert «ad die &ispen~ si on S4 Stunden bei 4⁰O etehenselaesen. AneohJit essend wurde die Suspension 10 Minuten bei 10 000 Q seatrifugUvt» Der Oberstand wurde snr Bestianuie der optischen Diente aufbewahrt. Das sediment wurde in O₉05 solarer Lüftung von Z-Aalnoätbeziol la 0,1 ·ο-larea Bloarbonatpuffer bei Pg 8»9 suspendiert. Das Präparat wurde sohlleeslleli noohemls sentrifufiert und in 0,15 siolarer la« trluaohloridlOeung gewaeohen, bis der Oberetand keine optleone Dichte bei 280 au mehr aufwies.

Die ensysMtisohe Aktivität der gebundenen Pronaee wurde alt Tyroeyltyroftin, fryptophyltyrosin oder Leuoylglyoln als substrat bestiaat· Die Aktivität gegenüber dieoen Substraten wurde ohronatographieoh als funktion der Zelt, best laut. Zur Kontrolle wurde lOsllohe Pronase verwendet.

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1,5 ng einer Verunreinigungen enthaltenden Fraktion aus einer Probe ron technischer 6™Am:Lnopenioillaneäure wurde in 0,5 «1 einet 0,05 aolaren AmaöniumbicßrbOBatpiiffera bei p_H 7,9 gelöst und zu 10^(0,01 ml) einer Lösung gegeben« die 1,5 mg Pronaae/ ml (als v/asserunlösliches Material) lsi gleichen Puffer entbleit. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei 37⁰C unter gelinden Vermischen inkubiert und anschliessend zur !trockene eingedampft.

Bei diesem Verauch, wurde festgestellt, dass das wasserunlösliche Pronaeematerial wiederholt ohne nennenswerten Aktivitätsverlust verwendet werden konnte. So wurde 8oB„ Material« d·· bei der umsetzung mit Brociacetyleelluloee erhalten wurde, 5 RaI während 10 Monaten rerwendet. Jedesmal nach der Verwendung wurde da· Material im Puffer und aneohlieesend In phyeiologiecher Kooiiealzlöaung gewaschen und hierauf in Gegenwart von Caloiuaionen sur Stabilisierung des Enzyms bei 4⁰C aufbewahrt·

Bei diesen Versuchen waren die wasserunlöslichen Produkte, die aus Pronase und Carboxymethylcellulose sowie Carboxyaethylsephadex erhalten wurden, weniger wirksam, als das Produkt» das bei der Umsetzung mit Bromaoetylcelluloee erhalten wurde.

Belajylel 9

Eine 2 g Pro^e yon technischer 6-Ajainopenioillanaäure wurde in Wäöser unter Züeata von 3n Natronlauge bis zu p_H 8,6 gelöet, anschiieeQend auf 20 ml verdünnte UIe Lösung wurde in zwei gleiche Teile unterteilt. Beide Lösungen wurden 20 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die eine Lösung enthielt 500 mg des wasserunibaliohen

Umsatzung8produkteB von Pronaee mit Broioacetylcellulose. Die das

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BAD ORIGINAL

-H-

Pronaseinaterial enthaltende Lösung wurde zentrifugiert. An-

sohlieaeend wurden die beiden Lösungen Bit 3 η SaI»säure auf 4,3 eingestellt und 24 Stunden bei O⁰O stehengelassen· Aue Je-Lb* sung wurde feste 6-Aminopeniolllaneaurt wiedergewonnen und

zur Immunisierung von Kaninchen gem&ss folgendes Sohena verwendet. Ee wurde die AiitikBrperreaÜction gemessen*

Tag 1 - 50 mg der 6~Aminopenicillansäure in Freund'· kompletten Adjuvant (2 mg/ml M. butyrloua) + 6 ag der 6-Aminopenioillaueäure in wäeeriger Lösung (bei 6 χ 0,1 al einer Löeung VAn 10 mg/ml); suboutan verabreicht·

Tag 7 - 40 ml dar 6-Aminopenicillanoäure subcutan verabreicht In Freund's kompletten Adjuvance. Die Ergebnisen sind in Tabelle TX aueamoengesteiltι Tabelle YI

Ausgangs- Kaninchen material	Haematglutinati one-Tlter · Heoiprd gegen mit Benayl- penlcilloln behandelte Kanlnohen- erythrcoyten. fase	7	14	21	28
iKontrollveröUOh 1 ,6-Amiiiopenicillan- « Ian3äure . 3	O	2049 256 64	16400 ,. 512 1024	512 200 100	128 256 128
mit Pronase be~ 4 hanüölte e 6—Aminopenioll- !ansäure. "6	O 0 0	6 4 0	128	32 8 r,--«!-4>i--	64 8 ^28
0 Ό 0

Aus der Tabelle ('st ersichtlich, dass die Immunogenicität der technischen 6-Aminopenicillansäure nach der Behandlung mit unlöslicher Pronasi starJc verringert ist, ,

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Claims

Petentan a ρ τ U ο h

1· Verfahren *ur Herstellung uertinlgttr 6~Aa4&openlolHftn~ säur·· lteaiellllm und deren Derivaten, dadurch f · · kesiielohaet, da·· «an «ine vlUeri*· LBstm* von 6~A*lnopenioillansäure oder eine« Penicilline oder dessen Derivate «it mindestens einen waseerunlöeliehen Derivat von «indestens einem proteclytischen Knzyra behandelt»
2. Verfahren nach Anspruch 1, 6 a d u Γ ο B t *kl HB^ eeichnet, dass «an al· proteolytl»ell·· Jtosva Procaee verwandet» '
3o Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch β** kennreichnetp dass «an ein waeeerunieeliohee Derivat einos proteolytischen Enzyms verwendet« das durch Behandlung des Enzyms mit Broiaacetylcei.luXcpe erhalten worden let,
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder ?, dadurch ge» kennzeichnet, dass man ein wasserunlösliches Derivat eines proteolytischen Enzyms vorwendet, das durch Behandlung des Enzyms mit CM-Sephadex oder Carboxymethylcellulose er- μ halten worden ist«

5· Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadur oh gekennzeichnet, dass man die Behandlung der wässrige» Lösung alt de« Derivat des wasserunlöslichen Proteine bei p_g Die 8 durchführt.

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