DE2620649A1

DE2620649A1 - Immunstimulierendes agens

Info

Publication number: DE2620649A1
Application number: DE19762620649
Authority: DE
Inventors: Juergen Dr Knop; Hans-Harald Dr Sedlacek; Friedrich Robert Seiler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1976-05-11
Publication date: 1977-11-17
Also published as: LU77295A1; IL52048A; IT1075545B; BE854512A; AU2503377A; CH630807A5; JPS52136914A; GB1569003A; IL52048A0; JPS624371B2; FR2350847B1; DE2620649B2; CA1077841A; AU512240B2; ATA332577A; IE45145L; NZ184039A; DK204277A; IE45145B1; US4510129A

Description

BEIIKirilGVJERKE AKTIENGESELLSCHAFT

Aktenzeichen: Ma 262

Datura: HOE 76/?? 01.3 Dr.LI/jk

IMMUNSTIMULIERENDES AGENS

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Stimmulierung der immunologischen Reaktivität, insbesondere der durch Antigene induzierbaren Antikörperbildung.

Es ist lange bekannt, daß die immunologische Antwort von Organismen, die? durch die Applikation von Antigenen provoziert wird, durch Zusatz bestimmter Stoffe beeinflußt werden kann. Bei einem fördernden Einfluß derartiger unterstützender Bestandteile von immunologisch v/irksamen Substanzen werden diese als Adjuvantien bezeichnet. Adjuvantien sind sehr verschiedenen Stoffklassen zuzuordnen. Über deren Wirkungsmechanismus bestehen nur Vermutungen. Ihre Güte ist demnach nur durch vergleichende Experimente zu beurteilen, so daß eine Voraussage über die Adjuvanswirkung einer noch nicht erprobten Substanz nur bedingt möglich ist.

Wegen der großen wirtschaftlichen Bedeutung von immunisierenden Agentien in der Prophylaxe wie in der Therapie einer Reihe von Erkrankungen ist die Auffindung einer Adjuvanswirkung einer Substanz von großem wirtschaftlichen Interesse.

Es werde nun überraschend gefunden, daß das Enzym Neuraminidase (Glycoprotein-ü-AcGtylneuraminyl-Hydrolase, klassifiziert unter EC. 3.2.1.18) ein wertvolles immunstimulierendes Agens, ein s. g. Adjuvans, darstellt.

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Es ist bekannt, daß die Immunogenität von Glycoproteinen durch die Entfernung der N-Acetylneuraminsäure mit Hilfe des Enzyms Neuraminidacc signifikant yesteigert werden kann. Die Steigerung der Immunogenität ist jedoch in diesen Fällen eindeutig durch die Wirksamkeit der Neuraminidase auf das Antigen zu erklären, die durch den encymatischen Angriff auf den Glycosid-Anteil des Glycoproteins neue antigene Determinanten freisetzt. Nach der Abspaltung der N-Acetyl-neuraminsäure-Reste kann das Desialo-Glycoprotein von der Neuraminidase getrennt zur Immunisierung eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß die Neuraminidase als unterstützender Bestandteil von Antigenen deren Wirkung in Immunsystemen fördert. Gegenstand der Erfindung ist demnach in erster Linie ein Mittel zur Stimmulierung der immunologischen Reaktivität, bestehend aus einem Gemisch von Antigen und Neuraminidase.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur Stimmulierung der immunologischen Reaktivität in einemWirt und zur Herstellung eines Antiserums durch geeignete Verabreichung dieses Mittels.

Die Neuraminidase in diesen Mitteln wird zweckmäßig in einer Menge von 0,01 - 150, vorzugsweise 0,5 - 50, in vielen Fällen auch 5-50 Einheiten pro immunisierender Dosis, eingesetzt.

Unter der Bezeichnung Neuraminidase wird eine Reihe von bekannten Enzymen zusammengefaßt, die aus neuraminsäurehaltigen Glvcoproteinen jdie Neuramineäure abzuspalten vermögen Ihre Gewinnung und Reinigung ist aus der Literatur bekannt. Die im Sinne der Erfindung als Adjuvans verwendbaren Neuraminidasen sind gekennzeichnet durch ihre Aktivität, die wC-ketosidische Bindung zwischen der Neuraminsäure und einem Zuckerpartner zu hydrolysieren. Vorzugsweise werden diejenigen Neurarainidasen verwendet, welche die Bindungen 2~;O, 2-^4, 2-^6

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und 2·-> 8 hydrolysieren. Besonders wirksam ist demzufolge die aus Vibrio Cholerae erhaltene Neuraminidase, von der bekannt ist, daß sie alle vier Bindungstypen zu hydrolysieren vermag. Kine ähnliche Aktivität zeigt die Neuraminidase von Clostridium perfringens. Es sind jedoch auch virale Neuraminidasen im Sinne der Erfindung wirksam, auch wenn sie nicht die breite Spezifität der bakteriellen Enzyme besitzen. Neben den von Mikroorganismen zu gewinnenden Neuraminidasen können auch aus dem Plasma oder Organen von Wirbeltieren erhältliche NeurarnJnidasen im Sinne der Erfindung verwendet werden.

Zweckmäßig werden solche Neuraminidasepräparate als Adjuvans verwendet, Vielehe mit der Sorgfalt üblicher pharmazeutischer Zubereitung hergestellt wurden.

Die pro-Dosis eines Antigens zuzusetzende Menge des Adjuvans Neuraminidase wird zweckmäßig in Einheiten der Aktivität des Enzyms ausgedrückt. Eine Neuraminidase-Einheit ist die Menge des Enzyms, die benötigt wird, um 1 Mikrogramm N-Acetylneuraminsäure aus huruanemßC,-Glycoprotein (Orosomucoid) in 0,05 molarem Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 5,5 mit dem Zusatz von 9 rag/ml Kochsalz und 1 mg/ml Calciumchlorid in 15 Minuten bei 37⁰C freizusetzen (E. Mohr und G. Schramm, Z. Naturf. 15b, Seite 568, 1960).

Wegen der Möglichkeit, daß Neuraminidase auf neuraminsäurehaltige Antigene eine antigenändernde Wirksamkeit ausüben kann, sind bei den im Rahmen der Erfindung durchgeführten Versuchen zumeist neuraminsäurefreie Antigene verwendet worden. Dies kann jedoch den Erfindungsgegenstand nicht auf derartige Verbindungen einengen, umsomehr, als Neuraminidase bislang nicht gemeinsam mit neuraminsäuretragenden Antigenen zur Immunisierung verwendet wurden. In der Regel wurden die mit Neuraminidase inkubierten Glycoprotein-Äntigene nach der Inkubation mehrfach gewaschen und auf diese Weise die

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die Neuraminidase entfernt.

Die Entfernung (Waschen) einer zunächst zu dem Antigen zugegebenen Menge Ncurarsiriidase führt zu keiner- nennenswerten Stimulierung der Immunantwort gegen das Antigen. Eine Keimsuspension von neuraminsäurefreien Escherichia Coli-;".einem verursacht bei Mäusen in Anwesenheit von Neuraminidafe einerseits eine frühere Antikörper-Raktion, andererseits höhere Antikörper-Spiegel im Serum als eine nsuraminidasefreie Keimsuspension.

Das zeigt der folgende Versuch:

Mäuse wurden mit 2 x10 Keinem von abgetöteten E. Coli/Maus zusammen mit verschiedenen Mengen Vibrio Cholerae Neuraminidase intraperitonial immunisiert. Bei einem Teil der Mäuse wurde die Neuraminidase zunächst zu den abgetöteten E. CoIi-Keimen zugesetzt, danach jedoch wurde die Neuraminidass durch Zentrifugation der Keime von den Keimen entfernt, diese in geeignetem Puffermedium resuspendiert und diese Maßnahme 3x wiederholt.Ein anderer Teil der Mäuse erhielt die E. Coli-Keime zusammen mit Vibrio Cholerae Neuraninidase.

Die Tabelle 1 zeigt die Antikörper-Titer im Blut der verschiedenen Mäusegruppen am 5. und 20. Tag nach erfolgter Immunisierung.

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TABELLE 1 : Immunisierung von Mäusen mit neuraminsäurefreien E. Coli-Keimen

Antigen E. CoIi + 2 χ ίΟ⁸/Maus	Ädjuvans Vibrio Cholerae	Mittlerer Antikörperti- ter + Standardabwei chung am Tag	20
		5	160 + 120
ja	kein	10 +_ 10	640 _+ 240
ja	0,5 E	60 4- 40	130 +_ 60
ja	0,5 E gewaschen	10 +_ 10	320 +_ 140
ja	0,05 E	10 +_ 10	640 +_ 320
ja	5 E	160 ^120	160 +_ 100
ja	5 E gewaschen	10 +_ 10	320 +_ 160
ja	50 E	80 + 40	160 +_ 80
ja	50 E gewaschen	10 +_ 10

Die Stimulierung der immunologischen Antwort wird unabhängig von der Art der Verabreichung des Antigens gemeinsam mit der Keuraminidase v/irksam, z. B. bei intraperitonealer, subcutaner oder intramuskulärer Gabe. Die angegebenen Antikörper sind im Bakterizidietest gemessen.

Vergleichbare Ergebnisse werden in einem Immunisierungsversuch mit Vibrio Cholerae erhalten. In der indirekten Härnagglutinationstestung mit Hilfe des Vibrio Cholerae

Lipopolysaccharids findet man zu der Tabelle 1 analoge Resultate.

Die Adjuvanswirkung von Neuraminidase kann darüber hinaus auch für Virusantigene, z. B. das Röteln-Virus, nachgewiesen v.-erden (s. Tabelle 2).

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TABELLE 2: Immunisierung von Mäusen mit Röteln-Virus

Antigen

+ Adjuvans

(Vibrio Cholerae Neurann nidase)

0,0

0,5 E pro Maus 5 E pro Maus 50 E pro Maus 5 E pro Maus

Mittlerer Hämagglutinations

Hennuings-Titer

_+ Standard-Abweichung

82 ± 98 105 ± 83 461 +_ 246

89 +. 47 8

Mit dem gleichen System kann demonstriert werden, daß eine Zweit-Immunisierung (Boosterung) mit sehr gutem Erfolg durchführbar ist, v/obei ebenfalls die mit Neuraminidase versetzten Virussuspensionen eine erhöhte Immunantwort bewirken.

Statt mit partikulärem Antigenmaterial, wie dies beispielhaft an der Keimsuspension von Escherichia CoIi, Vibrio Cholerae und von Röteln-Virus gezeigt worden ist, kann die Adjuvanswirkung auch mit löslichen Antigenen nachgewiesen werden.

Wird beispielsweise eine Immunisierung von Mäusen mit Rinderserum-Albumin vorgenommen, so findet man ebenfalls in den mit Neuraminidase versetzten Antigenpräparationen eine Steigerung der immunologischen Antwort. Sie ist mit Hilfe der indirekten Hämagglutination von mit Rinderserum- Albumin beladenen Hammelerythrozythen nachweisbar.

Neuraminidase ist zudem geeignet, eine immunologische Toleranz zu durchbrechen. Hierfür haben sich Neuraminidaserr.eiigen pro Dosis von etwa 0,5-5 Einheiten als wirksam erwiesen, wohingegen deutlich höhere Dosen zu weniger ausgeprägten Reaktionen führten. 709848/046Q

Mit Neuraminidase als Adjuvans läßt sich ferner experimentell eine Antikörper-Antwort gegen Schaferythrozyten steigern. Dies kann mit der als Jerne-Technik bekannten Methode des Nachweises der "plaque forming cells" aus den Milzen der immunisierten Tiere nachgewiesen werden. Auch mit diesem Versuchsansatz ist belegbar, daß ein nachfolgendes Waschen der mit Neuraminidase inkubierten Erythrozyten die immunologische Antwort nicht zu stimulieren vermag.

Über die vorhergehend demonstrierten Versuche zur Steigerung der Antikörperbildung mit Hilfe des Enzyms Neuraminidase hinaus, führt das erfindungsgemäße Adjuvans zu einer verbesserten Infektionsabwehr.

Die Tabelle 3 zeigt das Ergebnis eines Versuchs, in welchem Mäuse mit S.typhimurium mit und ohne Adjuvanszugabe immunisiert wurden. Dazu erhielten die Mäuse am 1. und 14. Tag jeweils 4x10 abgetötete Keime von S. typhimurium. Am 28. Tage nach der ersten Injektion wurden die Tiere mit 2 χ 10 virulenten S. typhimurium intravenös infiziert. Zur Feststellung des Immunisierungserfolges wurden am 1., 3. und 8. Tag nach der Infektion einige Tiere aus den einzelnen Gruppen getötet, die Leber und die Milz entnommen und die darin enthaltenen Lebendkeime bestimmt. Ih der folgenden Tabelle sind die Lebendkeimzahlen aufgeführt. Die restlichen Tiere der einzelnen Gruppen wurden bis zum 28. Tag beobachtet und die Anzahl der überlebenden Tiere festgestellt. Die prozentuale Überlebensrate der Tiere ist ebenfalls in der Tabelle 3 angegeben.

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TABELLE 3:

Antigen Adjuvans

-Sf-

Lebendkeirie in Leber und Milz am Tag + Standard-Abweichung

Überlebende

kein

8 χ 10°
+ 1 χ 10~

6 χ 10 + 2 χ 10⁴

4 χ 10'

+3x10'

30 %

S.typhi. kein

S.typhi. Neuraminidase 5 E
pro Dosis

8 χ 10^J

+ 3 χ 10^:

2,5 χ 10" + 1 χ 10^E

1,5 x 10⁴ 2,5 χ 10⁴ +0,2 χ 10⁴

6 x 10
+ 3 x 10^£

2,4 χ

+ 2,2 χ 10⁴ + 2,3 χ 10⁴

45 %

70 %

Das Neuraminidase enthaltende Antigen S. typhimurium führt zu einer deutlich verringerten Lebendkeimzahl in den Organen und einer verbesserten Überlebensrate der Tiere.

Wie in den Versuchsbeispielen gezeigt, ist die Neuraminidase als Adjuvans für verschiedenste Antxgenpraparatxonen brauchbar. Es liegt demnach im Sinne der Erfindung, die Neuraminidase sowohl löslichen wie partikulären, lebenden wie toten, von Mikroorganismen und von höheren Tieren gewinnbaren Antigenen einzusetzen. Erfindungswesentlich ist, daß die Neuraminidase gleichzeitig mit dem Antigen appliziert wird, gegen das eine spezifisch gesteigerte immunologische Antwort des behandelten Wirtes erreicht werden soll. Seine besondere praktische Bedeutung hat das Adjuvans unter anderem bei der Infektionsabwehr, aber auch in der Erhöhung der immunologischen Antwort bei der Verabreichung von Gewebezellen, beispielsweise aus Tumorgewebe. Mit Vorteil wird Neuraminidase als Adjuvans bei der Herstellung von Antiseren gegen definierte Antigene eingesetzt, da hierbei mit der gleichen Menge des erforderlichen" Antigens eine bedeutende Erhöhung der Ausbeute des zu gewinnenden Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere erreicht werden kann.

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Claims

S hoe ι(-,'λ ολζ

1. Mittel zur Stimulierung der immunologischen Reaktivität, bestehend aus einen? Gemisch von Antigen und Neuramixiidase.

2. Mittel nach Anspruch 1, enthaltend 0,01 bis 150 Einheiten Neuraminidase pro Antigendosis.

3. Verfahren zur Stimulierung der immunologischen Reciktivität in einem Wirt., dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 verabreicht.

4. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 einem Tier verabreicht, nach der Bildung von Antikörpern im Blut dieses entnimmt und in üblicher Weise das Serum gewinnt.

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BAD ORIGINAL