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Verfahren zur Gewinnung von Antikörper enthaltender Milch und. daraus hergestellten Präparaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Antikörper enthaltender Milch und daraus hergestellten Präparaten durch Immunisierung von trächtigen Kühen, Schafen oder Ziegen mit Antigenen, das darin besteht, dass man den Tieren, zweckmässig zwei bis acht Wochen vor dem Werfen, eine Lösung oder Suspension der Antigene durch den Strichkanal in das Euter einbringt, die Behandlung in regelmässigen Abständen, vorzugsweise von zwei Tagen bis zwei Wochen, in steigenden Dosen ein-bis achtmal wiederholt und danach die Antikörper enthaltende Milch und Kolostralmilch in an sich bekannter Weise zu Wirkstoffkonzentraten verarbeitet.
Es konnte festgestellt werden, dass die nach der erfindungsgemässen Infusion des Antigens in das Euter einer Kuh gewonnenen Produkte einen höheren Antikörpertiter aufweisen als die nach bekannten Verfahren zur Immunisierung von Milchtieren durch intramus- kuläre Injektion bisher erhaltenen Produkte.
Die Bedeutung des Colostrums der Kühe als Antikörperquelle für die neugeborenen Kälber ist seit vielen Jahren bekannt und sehr eifrig studiert worden. Bei früheren Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Bildung der Antikörper im Euter der Horntiere, u. zw. in interstitiellen Plasmazellen, erfolgt und sich die Anzahl dieser Zellen entsprechend der Antikörperproduktion verändert. Ferner wurde entdeckt, dass die Tiere spezifische Antikörper bilden, wenn man in das Euter die entsprechenden Antigene in Form von lebenden oder abgetöteten Mikroorganismen bzw. von Eiweisslösungen oder Suspension von normalem oder pathologischem Gewebe einspritzt, wobei der Gehalt von spezifischen Immunkörpern in der Milch durch wiederholte lokale Verabreichung der Antigene systematisch erhöht werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht eine einfache und praktische Anwendung der auf diese Weise gewonnenen Immunkörper zur Verhütung und Behandlung von Krankheiten bei Mensch und Tier, da sowohl bei oraler als auch rektaler Verabreichung der Antikörper enthaltenden Milch eine Resorption der Immunkörper erfolgt, u. zw. nicht nur bei älteren Tieren, sondern auch bei neugeborenen Tieren, sowie auch andern Tierarten als der des Spenders. Entsprechende Zubereitungen aus der erfindungsgemäss gewonnene Antikörper enthaltenden Milch können parenteral an Tiere der gleichen Art wie der des Spenders, und auch andere Tierarten, ohne Nebenwirkung verabreicht werden.
Der die Antikörper enthaltende Anteil der Milch kann durch Zentrifugieren bei einem pH-Wert von ungefähr 4,6 abgetrennt werden. Die erfindungsgemäss gewonnene, Antikörper enthaltende Milch kann durch Pasteurisieren oder durch Trocknung konserviert werden.
Bei der erfindungsgemässen Immunisierung der trächtigen Tiere sind Volumen und Konzentration der Antigendosen nicht von entscheidender Bedeutung und können daher den jeweiligen Erfordernissen angepasst werden. Es hat sich gezeigt, dass die Erhöhung oder die Verminderung des Volumens der Antigeninfusion keine Veränderung des Antikörpergehaltes der Milch bewirkt. Das Antigen kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt während der Trächtigkeit infundiert werden, aber im Falle einer nicht milchenden Kuh ist es zweckmässig, das Antigen erst gegen Ende der Schwangerschaft einzuführen. So sollen die ersten Infusionen vorzugsweise etwa zwei bis acht Wochen vor der Geburt erfolgen.
Zur Steigerung der Antikörperproduktion können neben den erfindungsgemässen Massnahmen noch andere subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektionen des gleichen Antigens verabreicht werden.
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Sofern solche zusätzliche Injektionen verabfolgt werden, müssen diese gleichfalls nach dem Ermes sen des Behandelnden über einen angemessenen Zeitraum verteilt werden, wobei die Injektionen in ge. nügend kurzen Zeitabständen erfolgen müssen, damit keine anaphylaktische Reaktion eintritt. Bei de Mehrzahl der in Betracht kommenden Tierarten beläuft sich die Gesamtdauer auf weniger als etwa zeh, bis vierzehn Tage. Um örtliche Reizung und Verstopfung zu vermeiden, muss man in der Regel daran achten, dass die zusätzlichen Injektionen nicht häufiger als einmal täglich gegeben werden. Die Anti.
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gens in das System der Euterkanäle zu erhalten.
Wenn die Antigeninfusionen bei einer trockengestellten Kuh erfolgen, dann sind in der ersten Mild bereits Antikörper enthalten. Um eine hohe Antikörperproduktion aufrechtzuerhalten, kann man das Anti gen zusätzlich intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreichen.
Bei der erfindungsgemässenverabreichung vonAntigen an milchende Kühe sind Antikörper etwa zwe Tage bis zwei Wochen nach der ersten Infusion nachweisbar, wobei geringe Schwankungen je nach den dabei verwendeten Antigen auftreten, z. B. findet man Antikörper gegen Streptococcus agalactie in de Milch einer milchenden Kuh am zehnten Tage nach der ersten Verabreichung.
Antigene Substanzen, welche bei Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, an Immunstoffe zu erzeugen, sind Bakterien, z. B. Salmonella pullorum, Salmonella typhi, Salmonelle paratyphi, Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, Staphylococcus pyogenes, Pneumococcen Streptococcen ; Viren, z. B. der Influenza Typ A, Windpocken, Blattern, Herpessimplex ; Pilze, z. B Schimmelpilze ; Proteinsubstanzen, z. B. Eiereiweiss, Zellgewebe von Mäusen, Htihnerembryonen, Blu und Sperma ; Pollen und ähnliche antigene Substanzen. Unter dem Begriff"antigene Substanz"sollei auch solche Substanzen verstanden werden, die zwar an sich keine Antigene sind, sich aber in der Ge. genwart von Adjuvantien wie Antigene verhalten.
Beispiel 1: Einer Jersey-Kuh wurde fünf Wochen vor-dem Abkalben eine Suspension einer abge. töteten Kultur von Salmonella pullorum in den Zitzenkanal infundiert, u. zw. 1 ml Antigen mit einen Gehalt von ungefähr 5 Milliarden Keimen je Viertel. Die nächste Antigeninfusion erfolgte eine Woch : später mit 1 ml Antigensuspension, etwa 10 Milliarden Keime enthaltend, je Viertel. Die folgenden In- fusionen in Abständen von einer Woche von 1 ml je Viertel erfolgten mit Antigensuspensionen von stei gender Konzentration, nämlich ungefähr 20,30 und 40 Milliarden abgetöteter Keime. Nach der Gebm agglutinierte die Milch das Antigen bei mehr als 100 000tacher Verdünnung.
Der Antikörpergehalt der Milch nahm nach dem Abkalben rasch ab, u. zw. von einer Agglutination bei mehr als 100 000facher Verdünnung unmittelbar nach der Geburt bis zu einer Agglutination bei nu 1000facher Verdünnung in vier Wochen. Der Antikörperspiegel kann durch weitere parenterale Verabfolgung von Antigen in regelmässigen Abständen erhöht und gehalten werden. Nach dem Abkalben kann die Verabreichung des Antigens nicht in die Zitzenkanäle, sondern nur parenteral erfolgen, da sonst allergi sehe Reaktionen auftreten können.
Beispiel 2 : Die Immunisierung gemäss Beispiel l wurde bei einer ändern Kuh wiederholt mit den einzigen Unterschied, dass die Konzentration des Antigens sowohl bei den Infusionen wie auch bei de : folgenden Injektionen nur ein Zehntel derjenigen von Beispiel 1 betrug. Trotzdem war der Antikörperge. halt ebenso gross wie in der nach Beispiel 1 gewonnenen Milch.
Beispiel 3 : Einer milchenden Kuh wurden 5 ml einer Suspension einer abgetöteten Kultur voi Streptococcus agalactiae mit einem Gehalt von etwa 1 Milliarde Keimen in ein Viertel infundiert. Di Milch dieser Kuh zeigte vor der ersten Verabfolgung des Antigens eine negative Reaktion. Antikörpe waren in der Milch am zehnten Tag nachzuweisen und nach Verlauf von fünfzehn Tagen zeigte die Mild einen hohen Antikörpergehalt, der durch Agglutination festgestellt wurde. Eine weitere Infusion de Antigens in das gleiche Viertel am sechzehnten Tag verursachte eine starke allergische Reaktion.
Beispiel 4: Bei der Infusion von 5 ml einer Kultur von Aerobacter aerogenes mit einem Gehal von etwa 2 Milliarden Keimen in ein Viertel betrug der Agglutinationstiter der Milch 1 : 20, sechzeh : Tage später 1 : 5120.
Beispiel 5 : Eine Kultur von Escherichia coli wurde einer milchenden Kuh in ein Viertel de Euters infundiert, u. zw. erstmalig 5 ml mit einem Gehalt von etwa 200 Millionen Keimen. Die Milci zeigte 14 Tage später einen Agglutinationstiter von 1 : 20.
Beispiel 6 : Einer milchenden Kuh wurde eine Kultur von Staphylococcus aureus in das Euter in- fundiert. Die Kuh wurde einen Tag lang nicht gemolken und dann das Melken in regelmässigen AbstäE-
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den wieder aufgenommen. Zehn Tage nach der Injektion zeigte die Milch einen Agglutinationstiter von 1 : 10.
Beispiel 7 : Zur Untersuchung der Antikörperreaktion gegen eine spezifische Kombination bakterieller Antigene wurde ein Gemisch von etwa gleichen Teilen der Kultursuspensionen von Pneumococcus Typ 1, Pneumococcus Typ 2, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi und Staphylococcus albus in das Euter einer Kuh zwei Wochen vor dem Abkalben infundiert und die Verabreichung eine Woche wiederholt. Die Milch zeigte nach dem Kalben eine starke Antikörperreaktion gegen alle der infundierten Mikroorganismen.
Beispiel 8 : 2 ml Eiereiweiss wurden in ein Euterviertel einer milchenden Kuh infundiert. Die erste Verabfolgung verlief reaktionslos und die Präzipitationsreaktion war negativ. Zwölf Tage später zeigte die Milch eine starke Präzipitationsreaktion. Am folgenden Tag verursachte die Infusion einer zusätzlichen Menge von 2 ml Eiereiweiss in das gleiche Viertel eine heftige allergische Reaktion.
Beispiel 9 : Die Gewinnung von Antikörper gegen Salmonella pullorum enthaltender Milch bei Ziegen erfolgte, indem man täglich Infusionen von je 1 ml einer Suspension von Salmonella pullorum durch die Zitzenkanäle einer trächtigen Ziege verabreichte. Die täglichen Infusionen erfolgten während eines Zeitraumes von mehr als vier Monaten vor dem Werfen.
Beispiel 10 : In Vermehrung befindliche Viren einer Zellkultur können dem Euter in zwei Phasen einverleibt werden. Die erste Infusion erfolgt auf die übliche Weise mit einer Suspension der Zellkultur. Die nach der ersten Infusion erhaltene Milch wird einem andern Tier infundiert, wobei die begleitenden Gewebsantigene infolge der Verdünnung wirkungslos werden. Bei der Durchführung dieser Methode verabreichte man einer milchenden Kuh eine Infusion in die Zitzenkanäle mit einer Suspension der Kultur des Virus der Herpes simplex in Hirnsubstanz von Mäusen. Die Kuh wurde anschliessend regelmässig gemolken. Am folgenden Tag zeigte die Kuh einen positiven Whitesidetest. Am zweiten Tag nach der Infusion wurde die Milch in das Euter einer nicht milchenden Kuh durch die Zitzenkanäle infundiert.
Auf diese Weise gelang es, das Virus, jedoch ohne die Antigene der Mäuse-Hirnsubstanz, zu übertragen.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Produkte sind von Bedeutung für die Immunisierung und Behandlung von Mensch und Tier, da die Antikörper enthaltende Milch bzw. die mit Antikörpern angereicherten Fraktionen peroral, rektal, parenteral oder lokal verabfolgt werden können.
Antikörper enthaltende Milch kann unter geeigneten Bedingungen pasteurisiert, kondensiert oder in Trockenmilch übergeführt werden. Beim Pasteurisieren müssen die vorgeschriebenen Temperaturen sorgfältig eingehalten werden. Dauerpasteurisieren (d. h. bei 600C auf die Dauer von 30 Minuten) hat keine nachteilige Wirkung auf die Antikörper. Man muss nur dafür Sorge tragen, dass die Temperatur während einer merklichen Zeit nicht darüber hinausgeht. So z. B. hat man beim Pasteurisieren bei rund 6SoC festgestellt, dass der Antikörpergehalt der Milch auf die Hälfte sinkt. Das Abkühlen der pasteurisierten Milch muss rasch erfolgen, um die Antikörper zu konservieren. Das Pasteurisieren kann in bekannter Weise durch Kurz-oder Dauererhitzung erfolgen.
Die Antikörper enthaltende Milch kann unter sorgfältiger Einhaltung niedriger Temperaturen kondensiert werden. Antikörper enthaltende Trockenmilch wird vorzugsweise aus nicht kondensierter Milch hergestellt, obwohl auch Kondensmilch verwendbar ist, wenn sie bei so niedrigen Temperaturen sorgfältig kondensiert wurde, dass keine Zerstörung von Antikörpern erfolgte. Das Trocknen kann durch Zerstäubungstrocknung oder mit beheizten Walzen unter schonenden Bedingungen erfolgen. Kurzzeitige Einwirkung hoher Temperaturen sind an sich für die Antikörper nicht nachteilig, es sei denn, dass sie etwa mehrere Minuten lang aufrechterhalten werden. So kann man die Milch auch in Trockenanlagen trocknen, in welchen Temperaturen von rund 149 bis 2040C erreicht werden, wenn die Milch diesen Temperaturen nur einen Augenblick ausgesetzt wird.
Zahlreiche Versuche an Menschen, Kälbern und Schweinen zeigten, dass bei fortgesetzter Einnahme der Antikörper gegen Salmonella pullorum enthaltenden Milch der Antikörperspiegel im Blut ständig ansteigt. Ebenso zeigten Versuche an Menschen und Kälbern, dass die Antikörper auch vom Rektum aus, jedoch in geringerem Masse als bei oraler Verabreichung, resorbiert werden. Man kann sich jedoch der rektalen Resorption bedienen, wenn eine perorale Verabfolgung contraindiziert ist. Bei der Behandlung örtlicher allergischer Entzündung kann das die Antikörper enthaltende Produkt auch örtlich, etwa in Form von Salben, zur Anwendung gelangen.
Bei den erwähnten Versuchen wurde aus praktischen Gründen Salmonella pullorum als Antigen verwendet, denn dieser Stamm ist für das Versuchstier verhältnismässig unschädlich, leicht verfügbar, leicht zu identifizieren und seine Resorption kann durch Agglutination leicht verfolgt werden. Es ist indessen zu beachten, dass dieses besondere bakterielle Antigen hier lediglich als Beispiel genommen wurde, ohne damit den Erfindungsbereich einschränken zu wollen.
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Besonders wirksam ist die y-Globulinfraktion der erfindungsgemäss gewonnenen Milch, allerdings wirkt das von einer Tierart gebildete y-Globulin unter gewissen Umständen für andere Arten als Antigen. Beispielsweise ist das y-Globulin der Kuhmilch ein Antigen für von den Rindern verschiedenetierarten und wird daher vorzugsweise zur Behandlung von Tieren der gleichen Art, z. B. von Kälbern, verwendet.
Wenn nötig, kann jedoch auch ein y-Globulin, welches aus einer Antikörper gegen die Schweinepest enthaltenden Kuhmilch gewonnen wurde, Schweinen und Ferkeln parenteral verabfolgt werden.
Zur Gewinnung der y-Globulinfraktion wird die Antikörper enthaltende Milch zunächst in einer Milchschleuder üblicher Bauart abgerahmt, um das Fett zu entfernen. Der pH-Wert der Milch wird auf
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dem Ansäuern verdünnt werden. Das Kasein wird durch Abstehen, Filtrieren oder Ausschleudern entfernt.
Aus der Molke erfolgt die Abscheidung von y-Globulin in an sich bekannter Weise.
Das Filtrat wird auf eine Ionenstärke von ungefähr 0,40 bis 0,45 eingestellt, auf ungefähr -5oC gekühlt und ein Viertel des Volumens an Äthylalkohol hinzugesetzt. Das ausgefällte y-Globulin wird durch Ausschleudern, Dekantieren oder Filtrieren bei etwa -5oC abgetrennt.
Das so erhaltene rohe y-Globulin kann zur weiteren Reinigung in einer wässerigen Lösung eines Salzes dispergiert und neuerdings mit Alkohol bei-5 C ausgefällt werden. Im folgenden Beispiel wird diese Arbeitsweise näher erläutert.
Beispiel 11 : Eine trächtige Kuh wurde in der im Beispiel l beschriebenen Weise gegen Salmonella pullorum immunisiert. Das Colostrum hatte einen Agglutinationstiter von 1 : 10 000. Ungefähr 7, 57 1 dieser Milch wurden entrahmt, auf das vierfache Volumen verdünnt, und der pH-Wert auf 4,5 mit n-Salzsäure eingestellt. Das ausgefällte Kasein wurde entfernt, das Filtrat mit n-Natronlauge auf einen PH-Wert von 6, 8 eingestellt und 2 Stunden im KUhlschrank bei-5 C gehalten. Hierauf fügte man gleichfalls bei-5 C ein Viertel des Volumens an absolutem Äthylalkohol zu und zentrifugierte die Fällung bei - 5 C nach 8 Stunden langem Absetzen ab.
Die so erhaltene y-Globulinfraktion wurde in einem kleinen Volumen einer Salzlösung bei -50C gelöst und durchGefriertrocknung bei-79 C innerhalb von 8 Stunden. in ein trockenes weisses Pulver übergeführt.
Ausser bakteriellen Antigenen können beim erfindungsgemässen Verfahren auch zahlreiche andere Antigene zur Gewinnung therapeutisch wirksamer Produkte verwendet werden. So erhält man bei der erfindungsgemässen Behandlung von Tieren mit Pollen von Senecio jacobaea eine Immunmilch, die bei Verabreichung an Personen, die an Heuschnupfen leiden, einen Schutz gegen diese Erkrankung bewirkt.
Aus dem Schrifttum ist zu entnehmen, dass gewisse Tumoren durch Antigene verursacht werden können. Wenn nun ein solches Antigen isoliert und in das Euter einer Kuh infundiert wird, kann ein spezifischer Antikörper gegen dieses Antigen gebildet werden. Trinkt man nun Milch, die solche spezifische Antikörper enthält, oder wird dieselbe in anderer Weise verabfolgt, dann kann das Wachstum einer solchen Geschwulst verhindert bzw. verzögert werden, oder es kann sogar die völlige Rückbildung eines solchen Tumors erfolgen.
Trockenmilch, die spezifische Antikörper bzw. ein entsprechendes y -Globulin enthält, kann zur lokalen Behandlung von allergischen Hautreaktionen in Form von Kataplasmen verabreicht werden. So kann man beispielsweise eine Milch gewinnen, welche die Antikörper gegen die Toxine von. Rhus toxicodendron (Giftsumach) enthält, und diese auf die mit dem Antigen in Berührung gekommen, entzündet Haut auftragen.
Eine wichtige Anwendung der erfindungsgemäss erhaltenen Schutzstoffe liegt in der Gewinnung eines Schutzcolostrums zur Behandlung von Kälbern. Man schätzt, dass gegenwärtig etwa 20% der lebend geborenen Kälber in den ersten Wochen ihres Lebens, infolge von Infektionskrankheiten, eingehen. Zur Behandlung dieser Erkrankungen kann man Gemische der in Betracht kommenden bakteriellen Antigene nach dem erfindungsgemässen Verfahren in das Euter von trockengestellten Kuchen infundieren und das sämtliche spezifische Antikörper enthaltende Colostrum zwecks Konservierung trocknen und verpacken.
Man erhält so ein jederzeit verfügbares Produkt zum Verfüttern an Kälber unmittelbar nach deren Geburt, welches den nötigen Antikörper-Blutspiegel sichert und die Tiere während der kritischen Periode ihres Lebens vor Infektionen schützt.
Die Verabfolgung der erfindungsgemäss herstellbaren Produkte an Menschen erfolgt zweckmässig in Form von pasteurisierter Milch oder von sonstigen Molkereiprodukten. Da der Agglutinationstiter bei 1 : 100000 liegt. kann die erfindungsgemäss gewonnene Milch stark mit normaler Milch verdünnt und getrunken werden. Der Verdünnungsgrad hängt vom Antikörpertiter der Milch und ebenso von der erforlichen Höhe des damit erzielbaren Antikörper-Blutspiegels ab. Man kann die Antikörper enthaltende Milch mit gleichem Erfolg auch andern Milchprodukten beimischen, so z. B. Milchgetränken, Eiscreme, Milchpunsch, Käsesorten usw.