DE1792256C3 - Oral applizierbare, polyvalente Impfstoffe gegen lokale Darminfektionen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft oral applizierbare, polyvalente Impfstoffe gegen lokale Darminfektionen.

Bei den Infektionen des Darmes unterscheidet man grundsätzlich zwei verschiedene klinische Verlaufs- -" formen, die zyklischen und die lokalen Erkrankungen. Die zyklischen Darminfektionen (Typhus und Paratyphus), die durch einen Phasenablauf mit normierter Inkubationszeit, Generalisationsstadium und Stadium der Organmanifestation gekennzeichnet sind, führen -> zu einer langdauernden Immunität, die eine Zweiterkrankung verhindert. Die Lokalinfektionen des Darmes (Ruhr, Cholera, Salmonellen-Enteritis, Dyspepsiecoli-Infektionen u. a.) besitzen keinen Phasenablauf und führen nur zu einer schwachen, antito- w xischen Immunität; deshalb ist den verschiedenen iiijckiionsirnpiveriahren gegen diese Infektionskrankheiten, die eine zyklische Infektion nachahmen, si;·? ein mangelhafter Erfolg beschieden gewesen.

In allen Ländern mit hoher Zivilisation nehmen seit r> etwa 20 Jahren die Erkrankungen an Typhus und Paratyphus stetig ab, während andere Darminfektionen wie die bakterielle Ruhr und, in subtropischen und tropischen Landern, die Cholera mit einem etwa gleichhohen Trend unverändert endemisch vorkom- w men oder wie die Enteritis infectiosa salmonellosa. die Dyspepsie-Coli-Erkrankungen und die Infektionen mit einigen Enteroviren (Coxsackie- und ECHO-Viren) ständig zunehmen. Beim Nut/vieh steigt in letzter Zeit die Zahl der Samoncllcn-Infek- 4» tionen erheblich an; das ist vor allem in volkswirtschaftlicher Hinsicht von Bedeutung. Gegen alle diese Krankheitserreger gibt es bisher noch keine wirksame Immunprophylaxe, allein die Cholera-Injektionsimpfung ist /u nennen, die die Cholera-Erkrankung /war > <> leichter verlaufen laßt, sie aber nicht verhindern kann.

Eine Immunprophylaxe gegen Enteritis-erregende Krankheitserreger ist in Epidemie- und Katastrophergebieten und bei Reisen in Ländern mit erfahrungsgemäß niedrigem Hygienestandard angezeigt v> und dringend erwünscht. Da in den meisten Fallen der Enteritiserreger, der den Menschen gefährden wird, unbekannt bleibt, muß gegen alle möglichen Keime immunisiert werden Ähnliches gilt fur eine Immunprophylaxe heim Nut/vieh; hier sind es vor allern verschiedene Salmonellen, die durch importierte Futtermittel eingeschleppt werden, und bestimmte Typen von kölibakterieri, die Verschiedene Und schwere Aüfzuchtseüchen verursachen. Beim Nutz* Vieh ist demnach eine laufende Immunprophylaxe an* gezeigt.

Nun gibt es aber über 500 Salmoncllentypen, die für Mensch und Tief fakultativ krankheitserregend sind, 22 Typen von Ruhrbakterien, die allein beim Menschen pathogen sind, und eine große, noch unbekannte Zahl von Kolibakterien (mindestens 120 Typen), die teils für den Menschen, teils für das junge Tier gefährlich sind. Ein Kombinationsimpfstoff gegen alle möglichen Enteritiden müßte also die Antigene von etwa 700 Erregertypen enthalten; dabei ist noch zusätzlich zu berücksichtigen, daß jeden Tag neue Typen entdeckt werden. Aus zwei Gründen ist es unmöglich, einen solchen Impfstoff für Injektionen herzustellen: In der größtmöglichen Injektionsmenge (1-2 ml) läßt sich eine derartig große Zahl von Antigenen zu einer wirksamen Konzentration nicht unterbringen, zum anderen ist der Körper gar nicht in der Lage, nach Injektion von so vielen Antigenen gleichzeitig entsprechende spezifische Antikörper zu bilden. Mit der Injektionsmethode ist also eine breite Immunprophylaxe gegen Enteritiden nich; .nöglich.

Die orale Immunisierungsmethode hat demgegenüber eine Reihe von entscheidenden Vorteilen:

Die Antigene erscheinen, wenn sie geschluckt werden, schon nach Stunden im Blutkreislauf, denn sie werden erfahrungsgemäß von der Darmschleimhaut leicht resorbiert. In der Darmschleimhaut aktivieren sie lokal nachweislich immunkompetente Zellen. Ins Blut und damit in das retikuloendotheliale System (RES) gelangt, bringen die oral aufgenommenen Antigene eine allgemeine Abwehrreaktion des Körpers in Gang. Nach oraler Impfung entsteht deshalb sowohl eine gute, belastbare, vorwiegend zellulare Immunität des Darmes als auch eine immunologische Reaktion des ganzen Korpers; diese Aussage ist sowohl irr¹, Tierversuch als auch in umfangreichen Versuchen am Menschen erhärtet worden. Bei geeignetem Mengenverhältnis können zahlreiche Antigene kombiniert werden, ohne daß sie sich gegenseitig stören. Kombinationen von Antigenen erwiesen sich bei oraler Anwendung als sehr gut verträglich. Da die Dosis für oral angewendete Impfstoffe praktisch unbegrenzt ist. können beliebig viele Antigene in genügend hoher Konzentration kombiniert werden. Eine orale Impfung kann ohne technische Schwierigkeiten wiederholt werden; der Körper ist demnach nicht wie bei der parenteralen Impfung gezwungen, plötzlich auf eine einmalige Antigenzufuhr hoher Konzentration /u reagieren. Weiter wird die Gefahr von allergischen Reaktionen, die bei Injektionsimpfstoffen noch sehr groß ist, bei oraler Antigengabc weitgehend vermieden. Schließlich hat diese orale Methode einen entscheidenden seuchenprophylaktisf'".en Vorteil. Erfahrungsgemäß ist die freiwillige Impfbeteiligung bei oraler Anwendung des Impfstoffes viel größer als bei der Spritzeninpfung. Ein bestimmter, hoher Durchimpfungsgrad der Bevölkerung ist aber erforderlich, um die Ausbreitung einer Infektionskrankheit zu verhindern

Bei der oralen Impfung können /war wesentlich höhere Antigenmengen angewendet werden, so daß es wohl möglich ist. etwa 700 Antigene im Impfstoff unterzubringen, aber praktisch ist die Zusammenfassung so vieler Bakterienstämme sehr schwierig. Hier zeigt sich nun ein weiterer entscheidender Vorteil der oralen Immuriisiertingsmethöde* Im Gegensatz zu der parenteralen Antigengabe mit lediglich erregefspezl· fischer Wirkung bei nachfolgender Infektion (US^PS 3 139382) ist bei der oralen Antigen-Applikation und nachfolgender Infektion die Wirkung erregerunspezifisch. Neben dem infektionsschutz gegenüber dem

homologen Bakterienstamm wird auch gegen verwandte Stämme signifikant geschützt, wenn auch nicht ganz so gut wie durch die stammspezifische Impfung. So schützt z. B. eine orale Impfung mit S. typhi murium-Bakterien gegenüber einer oralen Infektion mit S. enteritidis und umgekehrt (ZbI. f. Bakt. I. Orig. 197 [1965], 368). Es würde also genügen, wenn von jeder Erregergruppe nur einige Erregertypen in dem Impfstoff vereinigt werden. Doch diese müßten gleichmäßig hoch dosiert werden, was eine unverträglich und unrationell große Gesamtantigenmenge im Impfstoff erfordern würde.

Entgegen dieser Annahme wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich synergistisch (potenzierend) wirkende, oral applizierbare, polyvalente, gegen lokale Darminfektionen schützende Impfstoffe erhalten lassen, wenn sie hitzeinaktivierte Bakterienstämme der Art (Spezies) Dyspepsiecoli und hitzeinaktivierte Bakterienstämme der Gattungen (Genera) Salmonella und Shigella enthalten.

Bei der Durchführung von Experimenten mit verschiedene Bakterienstämme enthaltenden Impfstoffen offenbarte sich nämlich ein zusätzlicher, nicht voraussehbarer, überraschender Vorteil des erfindungsgemäßen Impfstoffes. Man fand, daß nach der oralen Applikation mehrerer Antigene die unspezifischen Komponenten der Antigen-Mischung die spezifische Wirkung im Sinne eines Adjuvans-Effektes erhöhten; es trat überraschenderweise eine beachtliche synergistische Wirkung ein, die nicht erwartet werden konnte. So konnte beispielsweise nachgewiesen werden, daß ein 5Γη^ρ h-Iniⁿisioff, der fünf verschiedene Antigene zu gleichen Teilen in eip-r solchen Gesamtmenge enthielt, '.vie sie üblicherweise in einem Einfach-lmpfstoff vorhanden ist, den '■'eichen Immunisierungsschutz bot wie ein entsprechender Einfachimpfstoff, der demnach die 5fachc Menge des homologen Antigens enthielt.

Entsprechende Ergebnisse wurden mit einem Zwölffachimpfstoff erhalten, der zwölf verschiedene Antigene zu gleichen Teilen enthielt und dessen Wirksamkeitswerte wesentlich höher lagen, als wenn die Tiere mit einem monovalenten Impfstoff gleicher Gesamtkeimzahl immunisiert worden waren.

Überraschend war schließlich auch, daß die orale Gabe von inaktivierten Impfstoffen eine gute, belastbare Immunität des Darmes gegenüber den Lokalinfektionen erzeugt. So wurde im Verlauf der der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Arbeiten gefunden, daß Mäuse sogar noch 257 Tage nach der oralen Antigen-Zufuhr in der Lage waren, spezifische Antikörper zu bilden.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Impfstoffe und die Art der Antigene und ihre Kombination in solchen Oralimpfstoffen richtet sich nach der jeweiligen epidemiologischen Lage und dem angestrebten Ziel oer Immunprophylaxe. In Katastrophengebieten (Erdbeben, Überschwemmungen u ä.) wird man möglichst alle die Antigene derjenigen Krankheitserreger in den Kombinationsimpfstoff einbeziehen, die in dem betreffenden Gebiet zu erwarten sind, vorzugsweise Salrrionellen, Shigellen und DyspepsiecoIi-Bakterien, in endemischen Choleragebieten Wird man auch Antigene der Vibrionen in den Impfstoff aufnehmen, Reisende Mitteleuropas in subtropische und tropische Gebiete wird man ebenfalls mit einer Kombination von inaktivierten Salmonellen, Shigellen und Dyspepsiecolibakterien impfen.

Die Herstellung des kombinierten Impfstoffes richtet sich nach der Anwendung, In der Regel werden die nach an sich bekannten Verfahren inaktivierten Mikroorganismen in gefriergetrockneter Form gemischt und in den pharmazeutisch üblichen Applikationsformen wie zum Beispiel Dragees, Tabletten, Pillen, Pastillen, Säften oder Kapseln verabfolgt, doch können die Antigene auch ohne vorangegangene Gefriertrocknung in Flüssigkeit aufgeschwemmt werden.

Säuglingen, Kleinkindern und Jungvieh wird man zweckmäßigerweise das gefriergetrocknete Mischantigen mit der Nahrung vermischt verabreichen. Für eine prophylaktische Immunisierung erwachsener Menschen hat sich eine an fünf aufeinanderfolgenden

υ Tagen erfolgte orale Applikation von jeweils 50 mg eines Iyophilisierten Mischantigens als zweckmäßig erwiesen, doch kann die tägliche Dosis auch unbedenklich erhöht werden.

Herstellung der Impfstoffe

Die wirksamen Bestandteile der erfindungsgemäßen impfstoffe werden beispielsweise folgendermaßen hergestellt:

Der zur Impfstoffherstellung benutzte Bakterien-

-'' Stamm (Bakterien aus der Gruppe der Enterobacteriaceen) wird in üblicher Weise im Laboratorium gehalten. Von der Sammlungskultur wird eine Vorzucht in flüssigem Niedium beimpft und ca. 8 Stunden bei 37° C bebrütet. Mit dieser Vorkultur wird dann die

J» Oberfläche eines üblichen festen Bakterien-Nährbodens beimpft, der sirii in Gefäßen mit großer Oberfläche hefinriet. Nach 24stündiger Bebrütung der Kulturen auf dem festen Medium werden die Bakterien mit physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt. Die

i> Bakteriensuspension wird zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit verworfen, das Bakterienmaterial in frischer physiologischer Kochsalzlösung wieder aufgenommen, die Suspension wird zentrifugiert und die Waschflüssigkeit verworfen. Der Waschvorgang

4Ii wird in der Regel noch einmal wiederholt. Nach dem letzten Waschen wird der Bakterienrückstand erneut mit physiologischer Kochsalzlösung oder mit destilliertem Wasser aufgenommen und ca. 20 Minuten auf 100° C erhitzt (Inaktivierung der lebenden Keime).

4Ί Die derart inaktivierten Bakterien werden von der flüssigen Phase durch Zentrifugieren, wie oben für den Waschprozeß angegeben, abgetrennt und nach bekanntem Verfahren lyophilisiert.

Bei Durchfuhrung dieses Herstellungsverfahrens

V) entsprechen 5 x l()^v Keime etwa 1 mg Trockengewicht.

Die synergistische Wirkungdererfindungsgemäßen Impfstoffe wird durch nachfolgende Versuche nachgewiesen:

Versuch 1

100 weiße Mäuse wurden zehnmal an aufeinanderfolgenden Tagen täglich mit einem hitzeinaktivierten Dyspepsiecolistamm (Nr. 2380) oral geimpft, die ver-

bo abfolgte Gesamtkeimzahl betrug 7,5 10" Keime Maus.

100 Weitere Mäuse wurden mit einem Dreifachimpfstoff, der dieselbe Gesamtkeimzahl enthielt und zu einem Drittel aus demselben CöÜstamm, einem

b5 Salmonella typhi mürium-Stamm Und einem Shigella fiexneri 2a-Stamm bestand, oral geimpft, und weitere 100 Mäuse Wurden nicht geimpft, Am 10, Tag nach der letzten Impfung wurden die 300 Mäuse gleich-

zeitig mit dem lebenden Colistamm 2380 infiziert. Von den nichtgeimpften Kontrolltieren starben 63 %, von den beiden Impfgruppen nur je 29%. Der Dreifach-Impfstoff hatte ebenso gut wie der Einfachimpfstoff gewirkt, obwohl er nur ein Drittel des homologen Antigens enthielt. Wenn die spezifische Komponente des Einfach-Impfstoffes mit einer indifferenten Substanz auf V₃ verdünnt worden wäre, so hätte nach den experimentellen Erfahrungen die Mortalität etwa 51% betragen.

Versuch 2

123 Mäuse wurden wie im Versuch I mit dem hitzeinaktivierten Dyspepsiecolistamm Nr. 2380 ora! geimpft, 247 Mäuse erhielten einen Fünffach-Impfstoff derselben Gesamtkeimzahl, der neben dem Colistamm noch inaktivierte S. typhi murium-, S. schwarzengrund-, S. blockley- und Sh. flexneri 2a-Bakterien zu gleichen Teilen enthielt. Am 10. Tag nach der letzten Impfung wurden alle Tiere und 142 Kontrolltiere mit dem lebenden Colistamm Nr. 2380 infiziert. Von den nichtgeimpften Mäusen starben 61,3%, von den nur mit dem Colistamm geimpften T'eren starben 17,1% und von den mit Fünffach-Impfstoff geimpften 20,2%. Wenn die spezifische Komponente des Einfach-Impfstoffes mit einer indifferenten Substanz auf V₅ verdünnt worden wäre, so hätte nach den experimentellen Erfahrungen die Mortalität etwa 53% betragen.

Versuch 3 (nachgereicht)

99 weiße Mäuse wurden wie im Versuch 1 beschrieben mit inaktivierten S. schwarzengrund-Bakterien oral geimpft, die verabfolgte Gesamtkeimzahl betrug 3 · 10⁷ Keime/Maus. 96 weitere Mäuse wurden mit einem Sechzehnfachimpfstoff, der dieselbe Gesamtkeimzahl enthielt und zu V₁₆ aus inaktivierten S. schwarzengrund-Bakterien und zu ¹V₁₆ aus Antigenen anderer Enterobakteriazeen (⁹Z₁₆ Salmonelien-, ⁴/₁₆ Shigella flexneri- und ²/_I6 Dyspepsiecoli-Stämmen) bestand oral geimpft. Ferner wurden 99 Mäuse mit einem Impfstoff geimpft, bei dem der monovalente Anteil S. schwarzengrund von V₁₆ mit 15 Teilen physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt wurde. Am 10. Tag nach der letzten Impfung wurden alle geimpften Tiere und 98 Kontrolltiere mit lebenden S. schwarzengrund-Bakterien infiziert. ^von den nicht geimpften Mäusen starben 50%, von den nur mit S. schwarzengrund geimpften Tieren starben 22% und von den mit dem Sechzehnfach-Impfstoff geimpften Tieren starben 18,8% Bei der Verdünnung der spezifischen Komponente des Sechzehnfach-Impfstoffs mit NaCI-Lösung betrug die Mortalität 30,3%.

Verschiedene galenische Zubereitungen der erfindungsgemäßen Impfstoffe worden durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben:

ι Beispiel 1

Gelatinekapseln mit 50 mg Iyophilisiertem Impfstoff Je 10 g gemäß Herstellungsbeispiel inaktivierter,

Iyophilisierter Keime von E. CoIi Nr. 2380, S. typhi murium und Sh. flexneri 2a werden homogen vermischt und in Mengen von je 50 mg in Hartgelatine-Steckkapseln abgefüllt.

Beispiel 2
Tabletten mit 50 mg Iyophilisiertem Impfstoff

>"' Zusammensetzung für eine Tablette.

Je 16²/₃ mg gemäß Herstellungsbeispiel inaktivierter, Iyophilisierter, homogen vermischter Keime von E. CoIi Nr. 2380, S. typhi muTium und Sh. flexneri 2a.

-⁷o 25,00 mg Maisstärke (USP XVI)
20,00 mg Milchzucker (DAB 6)
3.00 mg Talkum (DAB o>
1,45 mg Gelatine," weiß (DAß 6)
0,52 mg Natriumlaurylsulfat (USP XVI)
2ϊ 0,02 mg p-Oxybenzoesäuremthy3ester

(DAB 6, 3. Nachtrag)
0,01 mg p-Oxybenzoesäurepropylester

(DAB 6, 3. Nachtrag)

100,00 mg

Beispiel 3

Immunisierende Milch mit einem Impfstoffgehalt
von 50 mg/100 ml Flüssigkeit

Man suspendiert in 30 I pasteurisierter Milch je 5 g si inaktivierte Keime von E. CoIi Nr. 2380, S. typhi murium und Sh. flexneri 2a und füllt in Flaschen zu je 100 ml ab.

Beispiel 4

Pastillen zur buccalen Applikation

mit 15 mg Iyophilisiertem Impfstoff

Zusammensetzung für 1 Pastille.

5,00 mg inaktivierte, lyophilisierte Keime von

E. CoIi 2380
5,00 mg inaktivierte, Iyophilisierfe Keime von

S. typhi murium
5,00 mg inaktivierte, lyophilisierte Keime von

Sh. flexneri 2a
300,00 mg Puderzucker
->o 130,00 mg Süßholzsaft

25,00 mg Süßholzpuder
30,00 mg Gummi arabicum
500,00 mg

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Synergistisch (potenzierend) wirkende, oral applizierbare, polyvalente, gegen lokale Darminfektionen schützende Impfstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß sie hitzeinaktivierte Bakterienstämme der Axt (Spezies) Dyspepsiecoli und hitzeinaktivierte Bakterienstämme der Gattungen (Genera) Salmonella und Shigella enthalten.