DE2317352C2

DE2317352C2 - Perlförmige Zusammensetzung und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2317352C2
Application number: DE2317352A
Authority: DE
Inventors: Haldor Ingemar Johansson; Marius Klaus Uppsala Joustra; Helga Katarina Lundgren
Original assignee: Pharmacia Fine Chemicals AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1972-04-07
Filing date: 1973-04-06
Publication date: 1982-09-16
Also published as: US3914183A; DE2317352A1; JPS4910246A; SE361046B; FR2179247A1; JPS5721529B2; FR2179247B1; GB1404507A

Description

Gegenstand der Erfindung ist die in den Patentansprüchen beschriebene perlförmige Zusammensetzung und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Aus der SE-PS 3 37 223 ist eine durch Cyanbromid aktivierte Agarose bekannt. Es ist auch bekannt, verschiedene biologische Substanzen, wie z. B. Glucosoxidase. an die so aktivierte Agarose zu kuppeln. Die Umsetzung wird in zwei Stufen durchgeführt, wobei in der ersten Stufe eine Aktivierung der Agarose mit dem Cyanbromid und in der zweiten Stufe eine Kupplung der Glucosoxidase an die durch das Cyanbromid aktivierte Agarose durchgeführt wird. Es besteht jedoch heute Bedarf an einer durch Cyanbromid aktivierten Agarose. die nicht sofort dem Kupplungsverfahren mit der daran anzubringenden Substanz unterworfen werden muß. sondern während einer angemessenen Zeit gelagert und dann verwendet werden kann, ohne daß ih'e Aktivität in einem übermäßigen Ausmaß vermindert worden und/ oder ihre Quellbarkeit in Wasser verloren gegangen ist

Die erfindungsgemäße perlförmige Zusammensetzung besteht aus durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierter Agarose. Agarosederivat. Cellulose oder Cellulosederivat als wasserunlöslichen Polysacchariden, die als Matrize zur Kupplung aminogruppenhaltiger Substanzen geeignet sind,, einer zur Verringerung des pH'Wertes ihrer wäßrigen Lösung auf unterhalb 5 fähigen, wasserlöslichen Säure, mindestens einem wasserlöslichen PolysacGharid oder einem niedermolekularen Saccharid, die Dextran, ein ungeladenes Dextranderivat oder ein ungeladenes Cellulosederivat bzw. ein Mono- oder Disaccharid sind, und 0 bis 4% Wasser. In dieser Zusammensetzung ist die durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierte Agarose, Agarosederivat, Cellulose oder Cellulosederivat gegen eine Verminderung ihrer Reaktionsfähigkeit und gegen einen Verlust ihrer Quellbarkeit bei der Lagerung stabilisiert

Wenn die Zusammensetzung für Kupplungszwecke

ίο eingesetzt wird, sollte man sie in einer wäßrigen Flüssigkeit zum Quellen bringen, wobei die in der Gelstruktur des durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierten, wasserunlöslichen Polysaccharids aufgenommenen Substanzen herausgelöst werden, wonach

lä die Kupplung stattfinden kann.

Nach der Erfindung kann das durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierte, wasserunlösliche Polysaccharid eine durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierte Agarose oder ein durch Cyanchlorid ode, .Cyanbromid aktiviertes Agarosederivat sein. Ein Beispiel für ein derartiges Derivat ist eine vernetzte Agarose, wobei als Vernetzungsmittel Epichlorhydrin eingesetzt wurde.

Nach der Erfindung kann das durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierte, wasserunlösliche Polysaccharid auch eine durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierte Cellulose oder ein durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktiviertes Cellulosederivat sein.

Nach der Erfindung kann das wasserlösliche Polysaccharid Dextran oder ein ungeladenes Dextranderivat sein.

Nach der Erfindung kann die Zusammensetzung als niedermolekulares Saccharid ein Monosaccharid oder ein DisacL arid enthalten. Lactose und Glucose sind Beispiele für geeignete Saccharide.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der perlförmigen Zusammensetzung wird ein Gemisch aus gequollenen Perlen von durch Cyanchlorid oder Cyjnbromid aktivierter Agarose. Agarosedenvat. Cellulose oder Cellulosederivat als wasserunlöslichen PoIy-

■"> saccharides die als Matrize /ur Kupplung aminogruppenhaltiger Substanzen geeignet sind, mit mindestens einem wasserlöslichen Polysaccharid oder niedermolekularen Saccharid, die Dextran, ein ungeladenes Dextranderivat oder ein ungeladenes Cellulosederivat bzw. ein Mono- oder Disaccharid sind, und der zur Verringerung des pH Wertes auf unterhalb 5 fähigen, wasserlöslichen Säure bildet und dieses Gemisch auf ein-.-n Wassergehalt im Bereich von 0 bis 4 Gewicht sproze; ' lyophihsiert.

Gegebenenfalls kann das niedermolekulare Saccharid. wie z. B. Lactose oder Glucose, or der Lyophilisierung in das Gemisch eingearbeitet werden.

Die Erfindung ist von großer Bedeutung, da sie es ermöglicht, eine mit Cyanchlorid oder Cyanbromid.

vorzugsweise Cyanbromid. aktivierte Matrize in den Handel zu bringen, die sowohl ihre Struktur als auch ihre reaktiven Gruppen für lange Zeiten beibehält. Die Tatsache, daß die vorstehende Lösung die bisherigen Schwierigkeiten in einfacher Weise löst, ist sehr

^M überraschend, wenn berücksichtigt wird, was bisher bekannt war. Nach der bisherigen Literatur über dieses besondere Gebiet ist es erforderlich, die reaktiven Gruppen innerhalb einer sehr kurzen Zeit einzusetzen. DäS erfindungsgemäße Produkt behält die Reaktivität

⁶^ der aktiven Gruppen in einer wäßrigen Lösung so lange bei, daß das Produkt aufgearbeitet werden und das Wasser daraus entfernt werden kann- Das Produkt behält dann seine Wirksamkeit in einem hohen Ausmaß

während einer beträchtlich langen Dauer bei. Ein bedeutendes Merkmal der Erfindung besteht darin, daß die Zusammensetzung eine Säure enthalten muß und daß der pH-Wert der durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierten Matrize nach der Aktivierung schnell verringert wird.

Das durch die Aktivierung mit reaktiven Gruppen versehene, wasserunlösliche Agarosederivat kann, wie bereits bemerkt, eine vernetzte Agarose sein. Ein Cellulosederivat kann erhalten werden, indem man eine Substitution mit bestimmten Gruppen, z. B. Hydroxypropylgruppen, durchführt und z. B. Hydroxypropylcellulose erhält.

Die Säuren in der Zusammensetzung sind solche Substanzen, die in der Lage sind, den pH-Wert der Zusammensetzung in wäßriger Lösung auf unterhalb etwa 5, vorzugsweise unterhalb etwa 4, zu verringern, Säuren und organische Säuren, wie z. B. Mineralsäuren und wasserlösliche organische Säuren, wie niedere Fettsäuren. Zitronensäure und Milschsäure. Die Säure und die Menge, in der sie zugesetzt wird, werden zweckmäßig so ausgewählt, daß der pH-Wert in verdünnter wäßriger Lösung zwischen etwa 2 und etwa 4 liegt

Der Wassergehalt der Zusammensetzung ist von Bedeutung, da ein übermäßiger Wassergehalt zu einem unbeständigen Produkt führt. Die Grenze, bei der als Ergebnis der Gegenwart von Wassc r Unbeständigkeit der Zusammensetzung auftritt, kann bei etwa 4% angesetzt werden. Der Wassergehalt sollte jedoch zweckmäßig mindestens etwas unterhalb dieser Grenze, d. h. unterhalb etwa 3% liegen. Übliche Werte, die eine gute Beständigkeit der Zusammensetzung ergeben, liegen zwischen 1 und 2%.

Eine bevorzugte Zusammensetzung nach der Erfindung kann die folgenden Bestandteile η den folgenden Mengen enthalten:

mit Cyanchlorid oder Cyanbromid
aktivierte Agarose, Agarosederivat.
Cellulose oder Cellulosederivat 5-80%

wasserlösliches Polysaccharid 25 — 95%

niedermolekulares Saccharid.

falls vorhanden 25-95%

wasserlösliche Säure in genügender
Menge, um den pH-Wert der Zusammensetzung nach Quellung in Wasser auf
unterhalb 5 zu verringern
Wasser 0- 4%

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel I

Ein 500 ml Reaktionsgefäß wurde mit einem Rührer, einem Thermometer und einer mit einem pH-Meter verbundenen Glas-Kalomel-Elektrode ausgestattet. Die Apparatur wurde in einen Abzug gestellt. 3,Jg Cyanbromid wurden unter Rühren in 300 ml destilliertem Wasser in dem Reaktionsgefäß gelöst. 150 g gefällte Agarose wurde ausgewogen und auf einer Nutsche mit etwa 21 destilliertem Wasser gewaschen.

Die Agarose wurde dann in das Reaktionsgefäß eingebracht, Und 2 η Natriumhydroxidiösung wurde langsam zugesetzt, bis der pH-Wert auf 11 angestiegen war, worauf die Reaktion einsetzte. In der Reaktion, die bei etwa Raumtemperatur stattfand, wurde Natriumhydroxid verbraucht. Das Verbrauchte Natriumhydroxid wurde ersetzt, indem man 2 η Natriumhydroxidlösung zusetzte und auf diese V/'cise den pH-Wert konstant auf 11 hielt. Der Zusatz von Natriumhydroxid in dem Reaktionsgefäß wurde nach 6 Minuten eingestellt. Das Reaklionsgemisch wurde dann auf eine Nutsche übergeführt und mit etwa 21 kaltem, destilliertem Wasser gewaschen. Die Lösung wurde schließlich mit etwa 21 0,005 m Zitronensäure gewaschen. Vorher wurde eine Lösung mit einem Gehalt von 24 g Dextran

ίο mit einem durchschnittlichen Molekulargewich' von 40 000 in 120 ml 0,005 m Zitronensäure hergestellt. Die mit Zitronensäure gewaschene, aktivierte Agarose wurde dann unter Rühren mit der Dextranlösung gemischt und insgesamt eine Stunde lang gerührt. Das Gemisch wurde dann auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 1 bis 2% gefriergetrocknet Einschließlich der zugesetzter. Substanzen betrug die Ausbeute etwa 28 g. Die Reaktivität des Endproduktes gegenüber Protein wurde durch Kupplung von a-Chymotrypsinogen getestet. Auf diese Weise wurden 270 mg ix-Chymotrypsinogen pro g der trockenen Matrize gekuppelt Die Lagerungsfähigkeit des aktivierten Produktes wurde getestet, indem man es 4 Wochen lang bei 40"¹C lagerie. Nach dieser Zeit wurde festgestellt, daß die Kupplungsfähigkeit der Substanz an Protein um 19% verringert worden war.

Seispiel 2

Dieser Versuch wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit der Abweichung durchgeführt, daß e'nz Lösung mit einem Gehalt von 16.2 g Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 40 000 und 16,2 g Lactose in 0,005 m Zitronensäure anstelle der Lösung, die nur Dextran enthielt, eingesetzt wurde.

Die Ausbeute betrug etwa 34 g. 350 mg *-Chymo· trypsinogen würden pro g der trockenen Matrize durch Kupplung an die Matrize gebunden. Nach bwöchiger Lagerung bei 40°C hatte sich die Kupplungsfähigkeit gegenüber dem Protein um 15% verringert.

Beispiel 3

Dieser Versuch wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel I beschrieben, jedoch mit der Abweichung durchgeführt, daß 0.001 m Salzsäure anstelle der Zitronensäure eingesetzt wurde. Die Ausbeute betrug etwa 32 g.

304 mg ^-Chymotrypsinogen wurden pro g der trockenen Matrize durch Kupplung an die Matrize gebunden. Nach 4wöchiger Lagerung bei 40 C hatte sich die Kupplungsfähigkeit gegenüber dem Protein um 14% verringert.

Beispiel 4

Dieser Versuch wurde in der gleichen Weise wie der in Beispiel 1 beschriebene, jedoch .nit der Abweichung durchgeführt, daß 0,005 m Milchsäure anstelle der Zitronensäure eingesetzt wurde, Die Ausbeute betrug etwa 33 g<

287 nig «^Chymötrypsinogen würden pro g der

trockenen Matrize durch Kupplung an die Matrize gebunden. Nach 4wöchiger Lagerung bei 40⁰C hatte

sich die Kupplungsfähigkeit gegenüber dem Protein um 10% verringert.

Beispiel 5

Dieser Versuch wurde in der gleichen Weise wie der in Beispiel 1 beschriebene, jedoch mit der Abweichung durchgeführt, daß eine Lösung mit einem Gehalt von 16,2 g Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 40 000 und 16,2 g Glucose anstelle der Lösung, die nur das Dextran enthielt, eingesetzt wurde. Die Ausbeute betrug etwa 34 g.

224 mg α-Chymotrypsinogen wurde durch Kupplung an die Matrize gebunden, berechnet pro g der trockenen Matrize. Nach 4wöchiger Lagerung bei 40° C hatte sich die Kupplungsfähigkeit gegenüber dem Protein um 21 % verringert

Beispiel 6

Dieser Versuch wurde in der gleichen Weise wie der in Beispiel 2 beschriebene, jedoch niit der Abweichung durchgeführt, daß 150 g gefällte Perlen von durch Epichlorhydrin vernetzter Agarose mit einem Trockengehalt von 4% als das durch ein Cyanhalogenid aktivierte, wasserunlösliche Kohlehydratderivat eingesetzt wurde. Die Ausbeute betrug etwa 32 g.

83 mg α-Chymotrypsinogen wurden durch Kupplung an die Matrize gebunden, wobei die Berechnung auf die trockene Matrize erfolgte. Nach 4wöchiger Lagerung bei 40° C hatte sich die Kupplungsfähigkeit um 24% verringert

Claims

Patentansprüche:

1. Perlförmige Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie besteht aus durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierter Agarose, Agarosederivat, Cellulose oder Cellulosederivat als wasserunlösliches Polysacchariden, die als Matrize zur Kupplung aminogruppenhaltiger Substanzen geeignet sind, einer zur Verringerung des pH-Wertes ihrer wäßrigen Lösung auf unterhalb 5 fähigen, wasserlöslichen Säure, mindestens einem wasserlöslichen Polysaccharid oder einem niedermolekularen Saccharid, die Dextran, ein ungeladenes Dextranderivat oder ein ungeladenes Cellulosederivat bzw. ein Mono- oder Disaccharid sind, und 0 bis 4% Wasser.

Z Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als niedermolekulares Saccharid Lactose enthält

3. Verfahren zur Herstellung einer perlförmigen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder Z dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus gequollenen Perlen von durch Cyanchlorid oder Cyanbromid aktivierter Agarose, Agarosederivat, Cellulose oder Cellulosederivat als wasserunlöslichen Polysacchariden, die als Matrize zur Kupplung aminogruppenhaltiger Substanzen geeignet sind, mit mindestens einem wasserlöslichen Polysaccharid oder niedermolekularen Saccharid, die Dextran, ein ungeladenes Dextranderivat oder ein ungeladenes Cellulosederivat bzw. ein Mono-ι ier Disaccharid sind, und der zur Verringerung des pH-Wertes auf unterhalb 5 fähigen, wasserlöslichen Säure bildet und dieses Gemisch auf einen Wassergehalt im Bereich von 0 bis 4 Gewichtsprozent lyophilisien.