JPH03120300A - プレ―ｓ ｂ型肝炎表面抗原の精製法に好適なコンプレックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトアルブミンが共有結合している不溶性ポ
リマー担体、およびプレ−ＳＢ型肝炎表面抗原（プレ−
Ｓ−ＨＢｓＡｇ）からなるコンプレックス、並びにプレ
−Ｓ−ＨＢｓＡｇの精製方法に関するものである。

ヨーロッパ特許出願公開Ａ２−０２４３１０３から、組
換プレ−Ｓ　　ＨＢｓＡｇを発現している酵母細胞を破
壊し、細胞内容物からアフィニティークロマトグラフィ
ーによってプレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇを分離することからな
る、プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇの精製方法は知られている。

マトリックスに共有結合しているポリマー化ヒト血清ア
ルブミン（ポリアルブミン）は、プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇ
のための吸着剤として働（。このポリアルブミンは、交
差結合剤、例えばグルタルアルデヒドによって高分子形
態で合成される生成物である。プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇは
、そのプレ−５（２）−領域によってポリアルブミンに
吸着され、妨害物質を洗い流した後、マトリックスから
溶離され、第２の精製工程に付される。

効果的なポリアルブミン受容体はＨＢｓＡｇのプレ−Ｓ
領域に存在し、それは５５アミノ酸を含有するポリペプ
チドからなり、Ｓ−領域のすぐ前の肝炎ウィルスＤＮＡ
の断片によってコードされている（“プレ−８２”）こ
とが明らかにされた（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　ｅｔ　ａ
ｌ、＋　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、３：
３１７−３２０゜１９８５）。更に、Ｓ−領域について
は、このすぐ前の領域（プレ−３２）と全プレ−Ｓ−領
域（ブレーｌ）の両者が、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ
）が肝細胞の細胞膜に結合するためのレセプターである
表面タンパクをフードしていることが証明された。

プレ−Ｓ領域を含有しているＨＢｓＡｇは、１９７９年
に、感染したヒトの血漿から初めて得られ（Ｎｅｕｒａ
ｔｈ　ａｎｄ　５ｔｉｃｋ、　ＡｒｃｈＪｉｒｏｌ、、
　６０ニア９−８１．１９７９）、後にバレンズエラ等
（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：３１７．１９８５
およびＮａｔｕｒｅ　３１１：６７．１９８４）および
パオレッティ等（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌｌ、　
ＰＮＡＳ　８１：１９３．１９８４）により、遺伝子工
学によっても製造された。

次いで、種々の組換発現プレ−Ｓ−含有表面抗原が、抗
ＨＢＶ抗体の産生を誘導するワクチンとして提示された
。これらの抗体はウィルスのレセプターに対して導かれ
、肝細胞に対するその結合およびそれに随伴する感染を
妨げる。

ポリアルブミンを介するアフィニティークロマトグラフ
ィーによる抗原の精製は、重合産物の製造において交差
結合剤を使用するために、グルタルアルデヒドの様な不
純物、更には毒性物質さえも、溶出液に導入されるとい
う欠点を有している。

この難点を排除し、プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇのアフィニテ
ィークロマトグラフィー精製を迅速かつ効果的に行い得
るだけでなく、治療および診断目的への新規な適用を呈
示するコンプレックスを提供することが、本発明の目的
である。

本発明のコンプレックスは、モノマーヒトアルブミンが
共有結合している、とりわけアガロースまたはデキスト
ランをベースとする不溶性ポリマー担体、およびそのプ
レ−５（２）−および／またハプレ−５（１）−領域に
よってモノマーヒトアルフミンに溶離可能な形態で結合
しているプレ−ＳＢ型肝炎表面抗原を含有してなる。

本発明によって、プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇは、モノマーヒ
トアルブミンが担体に共有結合している場合のみ、アフ
ィニティークロマトグラフィー精製に十分な程度にモノ
マーヒトアルブミンとコンプレックス形成するというこ
とが見いだされた。アルブミンが単に吸着によって結合
する場合、プレ−−ＨＢｓＡｇは、全くまたは非常にわ
ずかしかアルブミンとコンプレックス形成し得ないので
、アフィニティークロマトグラフィー精製は可能ではな
いであろう。本発明のコンプレックスのその他の利点は
、プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇは容易に溶離することができ、
従ってタンパクをより穏やかな方法およびより高収率で
回収することができるという点にある。

モノマーヒトアルブミンが共有結合している不溶性ポリ
マー担体は、本発明のコンプレックスの製造に必要であ
る。従って、この不溶性ポリマー担体も、本発明の範囲
に包含される。本発明の不溶性ポリマー担体を製造する
ためには、タンパクと共有結合し得るいずれのポリマー
も、適当に活性化させて、使用することができる。以下
の担体物質を使用することができるニ ーポリアミドおよびビニルポリマーの様な有機ポリマー
類（ポリアクリルアミド、ポリスチレンおヨヒポリビニ
ルアルコール類およびそれらの誘導体）、および 一セルロース、デキストラン、アガロース、キチンおよ
びポリアミノ酸の様な天然のポリマー類、および 一シリカゲル、ガラスおよび水酸化金属の様な無機ポリ
マー類。

これらの担体物質は、例えばモレ牛ニラーシーブとして
粒子形態で、または膜形節で、または例えばマイクロタ
イタープレ−トとしてプレ−トの形態で使用することが
できる。

不溶性ポリマー担体は、アガロースまたはデキストラン
をベースとするのが好ましい。

本発明のコンプレックスは、担体が膨潤状態で（例えば
アフィニティー樹脂として）存在する水相、および凍結
乾燥状態（例えば膜またはマイクロタイタープレ−トと
して）の両者で長期間貯蔵可能である。凍結乾燥は、グ
リシンまたはグルコースを含有している揮発性緩衝液中
で行われるのが好ましい。

７’Ｌ／−Ｓ−ＨＢｓＡｇは、本発明によって、コンプ
レックスから高純度で単離することができる。

本発明はまた、診断薬、およびＢ型肝炎に対する能動免
疫のためおよびこの様なワクチンで免疫したドナーの特
異的免疫グロブリンを得るための両者に適用可能なワク
チンの製造のための、本発明のコンプレックスの用途に
関するものである。

本発明の担体は、Ｂ型肝炎表面抗原の水溶液を担体と接
触させることにより、簡単な方法でプレ−Ｓ　　Ｂ型肝
炎表面抗原を負荷することができ、肝炎表面抗原のプレ
−Ｓ−含有画分はアルブミン分子に選択的に吸着される
。

本発明のコンプレックスを使用することによるプレ−Ｓ
Ｂ型肝炎表面抗原の精製方法は、コンプレックスを緩衝
液で洗浄して、存在し得る不純物を除去し、 モノマーヒトアルブミンに選択的に吸着されているプレ
−ＳＢ型肝炎表面抗原をカオトロピソり物質、例えば尿
素、塩酸グアニジン、チオシアネート、塩化カリウム、
塩化マグネシウムまたはヨウ化カリウムを含有している
溶離剤でコンプレックスを処理するか、または界面活性
剤でコンプレックスを処理するか、またはｐＨ調節剤で
コンプレックスを処理することによって解離させて回収
し、必要に応じ、第２の精製工程を行うことをベースと
する。

本発明方法の好ましい実施態様は、イオン性界面活性剤
、とりわけデスオキシコール酸ナトリウムおよびタウロ
デスオキシコール酸、または両性イオン性界面活性剤、
とりわけ３［（３−コールアミドプロピル）−ジメチル
−アンモニオ］−１−プロパンスルホネートおよび３［
（３−コールアミドプロピル）−ジメチルーアンモニｔ
］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、また
は非イオン性界面活性剤、とりわけオクチルグルコピラ
ノシド類を、界面活性剤として使用することができる。

これらの界面活性剤を使用する時、溶離されたプレ−Ｓ
−ＨＢｓＡｇの４次構造は影響されないということがわ
かった。

溶離後の第２の精製工程は、ゲル濾過、超遠心、疎水ク
ロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグ
ラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含むの
が好ましい。これらのいずれの精製工程も、９０％以上
の純度でプレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇを与える。

以下に、本発明をより詳細°に説明する：プレ−Ｓ−Ｈ
ＢｓＡｇは、プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇの遺伝情報を有する
組換ワクシニアウィルスから発現させることができる。

この方法は、文献に記載されている（モス等（Ｍｏｓｓ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１１：６７（１９
８４））。

先ず、ｖｅｒｏ細胞をＩＰＦＵ／細胞で感染させること
によって、組換ワクシニアウィルスの高力価ウィルスス
トックを調製した。３７°Ｃで２〜３日間インキュベー
トした後、感染細胞を培地に振り入れ、５．　ＯＯＯ９
で２０分間遠心することによってペレット化する。上清
を除去し、４°Ｃで貯蔵する。細胞をＰＢＳで３回洗浄
し、その後、トリプシンの終濃度が０．０２５重量％に
達するまで、細胞懸濁液にトリプシン溶液を加える。そ
の後、懸濁液を３７℃で３０分分間中かに撹拌し、上清
とともにプールし、アンプルに分注し、−８０℃で凍結
させる。この方法によって、ウィルス力価は、細胞培地
で通常得られる力価と比較して約１０倍上昇する。

６−リットルの発酵槽に接種し得る十分量の細胞を調製
するために、プラスチック製うウクス・アンド−ｏ−ラ
ー（Ｒｏｕｘ　ａｎｄ　Ｒｏｌｌｅｒ）びん（Ｎｕｎｃ
）中で細胞を継代接種することによりｖｅｒｏ細胞接種
物を調製し、次いで、これを４０−リットル容器用接種
物として使用する。このために、まず、定の継代数のＶ
ｅｒＯ細胞のアンプル１本を解凍し、継代して、全面成
長したローラーびん１２本を得る。

細胞をトリプシン処理し、５重量％のウシ胎児血清を加
えた１９９倍地定置懸濁し、マイクロキャリヤー（Ｃｙ
ｔｏｄｅｘ　３．　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の懸濁液と混
合し、発酵槽に入れて、１リツトル当たり２Ｘ１０’個
細胞および５ｇマイクロキャリヤーの終濃度を得る。こ
の段階で、更に培地を最終発酵容量の３分のｌ量加える
。

懸濁液を穏やかに撹拌しながら、細胞を３時間マイクロ
キャリヤーに付着させる。この後、最終発酵容量を得る
ために、更に培地（５重量％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ
）を加える。８Ｘ１０Ｉｌ／ＩＪツトルの細胞密度に達
したらすぐに、ＤＭＥＭ（５重量％ウシ胎児血清含有）
の連続注入を開始する。

約５Ｘ１０”／リットルの細胞密度に達したら、マイク
ロキャリヤーをトリプシン処理し、細胞およびマイクロ
キャリヤーを、１リツトル当たり更に５ｇのマイクロキ
ャリヤーを含有する４０−リットル発酵槽に入れる。吸
着したら、発酵槽を４０リツトル容量まで満たし、前記
と同様にして培養を続ける。

５Ｘ１０”／リットルの細胞密度に達したら、マイクロ
キャリヤーが沈澱した後、培地を除去する。組換微生物
を含有している培地５リツトルを発酵槽に入れ、組換細
胞１個当たり約２ＰＦｕｌ１７）ｔｏ、　ｏ、　ｉ、−
値を得る。ウィルスの吸着後、発酵槽に、４０リツトル
容量まで１９９培地（５重量％ウシ胎児血清含有）を満
たし、同一培地４０リツトルを４０時聞かん流させる。

この後、約８０％の細胞をマイクロキャリヤーから剥離
させ、培地と共に取り出す。

まだマイクロキャリヤーに付着している残存細胞を、急
速撹拌下、培地で洗浄することによってそれから剥離さ
せて取り出し、最初の画分と一緒にプールする。マイク
ロキャリヤーを７０＋＋＋ｙ＋ａふるいによって除去す
る。Ｂｅｃｋｍａｎｎ　ＪＦＣ−Ｚ連続流ローターで遠
心することによって、１６．０００９で細胞をベレット
化する。ペリコン・システム（Ｐｅ１１ｉｋｏｎ　ｓｙ
ｓｔｅｍ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅｒｓ）で限
外濾過することによって、培地を濃縮する。この濃縮培
地に、８Ｍ溶液に調節されるまで尿素を加える。この溶
液を透析する。

濃縮されたｖｅｒｏ細胞上清を、ヒト血清アルブミンが
共有結合している不溶性ポリマー担体物質を充填したカ
ラムに加える。カップリング法は、担体の化学的特性に
依存することが知られている。

セフ１０−スを使用する場合、ＣＮＢｒで活性化し、例
えば、その後、モノマーヒト血清アルブミンをこの活性
化セファロースとカップリングさせる。

カラムを、０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）およ
び０．５ＭＮａＣＮからなる緩衝液１，０．１Ｍトリス
（ｐＨ８，０）および０．５Ｍ　ＮａＣｌ２からなる緩
衝液２．８Ｍ尿素からなる溶液３、最後に０゜０２Ｍト
リス（ｐＨ７，４）からなる緩衝液３で洗浄した後、カ
ラムにｖｅｒｏ細胞上清を負荷する。上清がカラムに吸
着されたらすぐに、０．０２Ｍ１−リス（ｐＨ７，４）
および０．５ＭＮａＣＱからなる緩衝液４で洗浄し、吸
着されなかったタンパクをカラムから除去する。吸着さ
れたプレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇを、ｐＨ６〜約８の緩
衝液４（ｌ〜約４Ｍ、好ましくは３Ｍ）中チオシアン酸
ナトリウム、好ましくはｐＨ７（緩衝液５）中のチオシ
アン酸ナトリウム、または緩衝液４中８Ｍ尿素、好まし
くは４Ｍ尿素（緩衝液６）で溶離させる。本発明のこの
分離法とモノマーヒトアルブミンによって、プレ−Ｓ−
ＨＢｓＡｇは１４５−倍濃縮される。その同一性を、イ
ムノブロッティング法（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ａｎａｌ
。

Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、＋　ＩＩＬ　１９Ｌ　１９８１）お
よび銀染色したポリアクリルアミドゲル（銀染色法：　
Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、、
　　１１７．３０７．　１９８１）によって調べると、
純度は少な（とも８０％に達する。

プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇは、例えばセファロース（
ファルマシア）でゲル濾過することによって、更に精製
することができる。上で得た画分を、０゜０２Ｍトリス
（ｐＨ７）からなる緩衝液に対して透析し、０．０２Ｍ
）リス（ｐＨ７）で活性化したセファロースカラムに負
荷する。プレ−Ｓ−ＨＢｓＡｇの純度は、銀染色法およ
びイムノブロッティング法によって、９０％以上である
と示される。

以下の例示態様によって、本発明の方法の実施を更に説
明する。

実施例１　モノマーヒトアルブミンアフィニティークロ
マトグラフィーによるプレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇの精
製 モス等（Ｍｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３
１１：６７．１９８４）によって記載された方法を使用
し、プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇのための遺伝情報を有
する組換ワクシニアウィルスを得た。前記と同様にして
、組換ワクシニアウィルスの高力価ストックを調製した
。

組換ウィルスで感染させるためのｖｅｒｏ細胞を、前記
と同一条件下で増殖させた。プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡ
ｇを有する濃縮および透析した培地を前記の方法で得た
。

製造業者の指示に従ってＣＮＢｒ−活性化したセファロ
ース４Ｂ（ファルマシア）に、モノマーヒトアルブミン
を共有結合させた。その後、カラムに５０ＲＱ容量のマ
トリックスを充填し、緩衝液１（５００１１１２）、緩
衝液２（５００ｘｆｆ）、緩衝液３（５００１１の、最
後に緩衝液４　（５００ｘので洗浄した。

不純物を除去したｖｅｒｏ細胞上清は、タンパク８５０
０ｍｇおよびプレ−Ｓ（２）−ＨＢａＡｇ９５ｍｇを含
有しており、調製したカラムに１００　ｘＱ／時の流速
で注入した。総量をカラムに入れた時点で、緩衝液４を
用い、吸着されなかったタンパクラカラムから洗い流し
た。プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇを３Ｍチオシアン酸カ
トリウム、ｐＨ７（Ｉ衝液５）で溶離させた。ポリアク
リルアミドゲル電気泳動後、銀染色法およびイムノブロ
ッティング法によって同定および純度の分析を行った。

カラムから溶出した画分の２回分を、２重量％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｏ，１２５Ｍトリス−ＨＣ
ｌ２（ｐＨ６，８）および１００＋ｎＭジチオスレイト
ールからなる緩衝液中、１００℃で１５分間インキュベ
ートした。この試料を、１２．５重量％ポリアクリルア
ミド分離用ゲルにて、６５ｍＡ／ゲルで２．５時間電気
泳動したくラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ
　２２７：　６ｇ０．１９７１））。１組のゲル試料を
硝酸銀で染色し、ポリペプチドを可視化した。他の組の
試料を、ウサギ抗血清を使用し、イムノブロッティング
することによって検定した。

溶出画分は、タンパク４２ａｙｇおよびプレ−Ｓ（２）
−ＨＢｓＡｇ６８ｘｇを含有しり。従ッテ、フレーＳ（
２）−ＨＢｓＡｇの１４５−倍濃縮が達成された。

以下の実施例２および３によって、実施例１で得た画分
の２次精製を説明する。

実施例２ 実施例１に従って得たプレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇ−含
有溶１（Ｊｔヲ、セファロース４Ｂ（ファルマシア）カ
ラムクロマトグラフィーによって更に精製した。

まず、カラムを調製し、０．０２Ｍ１−リス（ｐＨ７。

０）５００ｍｆｆにて３０肩＆／時の流速で洗浄した。

プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇ−含有溶液をこの緩衝液に
対して透析し、６．２ｊｙｇタンパク／１２ｚｇ以外に
ｌ　Ｏｘｇ／　１２ｘＱの濃度で存在している透析した
抗原をカラムに加えた。・カラムを０．０２Ｍ１−リス
（ｐＨ７，０）で活性化すると、溶出したプレ−５（２
）　−ＨＢｓＡｇ−含有画分はタンパク４．８ｍｇおよ
びプレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇ８．２ｍｇを含有した。

実施例１に記載の方法で行ったポリアクリルアミドゲル
の銀染色およびイムノブロッティングから、プレ−５（
２）　　ＨＢｓＡｇの純度は９０％より大きいことがわ
かった。

実施例３ 実施例１に従って得たプレ−５（２）　　ＨＢｓＡｇ−
含有溶液ヲ、レンチル−レクチンセファロース４Ｂ（フ
ァルマシア）カラムクロマトグラフィーによって更に精
製した。まず、カラムを調製し、０．０２Ｍト’Ｊス（
ｐＨ７，０）ｌｏＯｘｆｆｉ：Ｔ５０ｘＣ／時の流速で
洗浄した。プレ−Ｓ（２）ＨＢｓＡｇ−含有溶液をこの
緩衝液に対して透析し、１３ａｖｇタンハク／２５Ｊ！
１２以外１：２１１℃ｇ／２５ｍｆｆの濃度で存在して
いる透析した抗原を２５ａＱ／時の流速でカラムに負荷
した。この後、吸着されなかった物質をトリス緩衝液で
洗い流し、プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇを、５重量％ア
ルファーメチルマンノシド含有トリス緩衝液で溶離した
。溶出液は、タンパク９．１ｍｇおよびプレ−Ｓ（２）
−ＨＢｓＡｇｌ　５．６ｍｇを含有した。実施例１の記
載と同様にしてポリアクリルアミドゲルの銀染色および
イムノブロッティングを行い、プレ−５（２）　　ＨＢ
ｓＡｇの純度は９０％より大きいことがわかった。

プレ−５（２）−領域、またはプレ−５（２）−おヨヒ
プレ−５（１）−領域の代わりにプレ−５（１）〜領域
を有するＢ型肝炎表面抗原の精製は、前記′実施態様と
同様にして行われる。本発明の方法は事実上、ＨＢｓＡ
ｇのプレ−５（１）−および／またハフレー５（２）−
領域を担持しているいずれのタンパクを精製するために
も使用することができる。

以下の実施例４〜６によって、種々の担体物質および形
態の使用、および要求される使用目的にかなうカップリ
ング法を説明する。

実施例４　ケイ酸塩担体へのモノマーヒトアルブミンの
カップリング 使用し得る担体は、シリカゲルまたはガラスマイクロビ
ーズ（制御された孔を有するガラスピーズ＝ＣＰＧ）で
ある。

アミノ化ガラス担体（アミノプロピルＣＰＧ、Ｐｉｅｒ
ｃｅ）　ｌ　Ｏｇを、２．５％グルタルアルデヒド水溶
液１００村と一緒に室温で４時間振盪する。活性化した
ら、担体を脱イオン水で十分洗浄し、アルデヒドを除去
する。この様にして活性化した担体を、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ８，０）中のヒト血清アルブミン２００ｍ
ｇと共に１時間インキュベートスル。１Ｍエタノールア
ミンでブロックしてリン酸緩衝液で十分洗浄した後、担
体はいつでも使用することができる。

プレ−５（２）　　ＨＢｓＡｇ−含有細胞培養上清２０
０叶（プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇｌ　１＋ｇ、タンパ
ク９５０　ｘｇ）をアフィニティー担体１０ｍσと共に
１４°Ｃで２時間インキュベートする。焼結吸引フィル
ター上、緩衝液で洗浄することによって、結合しなかっ
たタンパクを除去し、特異的に結合したプレ−Ｓ（２）
ＨＢｓＡｇを、８Ｍ尿素溶液ＩＱｘｇ中で、充填された
担体をインキュベートすることによって溶離させる。こ
の検定によって、高純度のプレ−５（２）　−ＨＢｓＡ
ｇ６．８ｍｇを、全タンパクＭ５．４ｍ９で得た（Ｂｒ
ａｄ「ｏｒｄによる試験法）。

実施例５　　膜へのモノマーヒトアルブミンのカップリ
ング 例えばナイロン、ポリビニリデンジフルオライドまたは
セルロースポリアクリルアミド混合ポリマーの様な膜は
、使用し得る担体である。ナイロン膜（例えば、Ｚｅｔ
ａｂｉｎｄ、　ＣｌｌＮ０）を、Ｉ（Ｃｆ！／Ｈ，０中
でインキュベートすることによって、部分加水分解する
。解放されたアミ７基を、Ｏ，，１Ｍシアノホウ水素化
ナトリウムの存在下、ｐ）１７で、１Ｍオキサルジアル
デヒドと２時間反応させる。脱イオン水で洗浄後、ヒト
血清アルブミン（１０ｍｇ／Ｉ（０，１Ｍリン酸緩衝液
、ｐｉ（７）を、Ｏ，１Ｍシアノホウ水素化ナトリウム
の存在下、反応性アルデヒド基で活性化したこの膜にカ
ップリングさせる。１Ｍエタノールアミンの添加によっ
て、過剰の反応性基をブロックする。リン酸緩衝液（Ｏ
ＩＭ；ｐＨ８）で洗浄後、プレ−５（２）−含有タンパ
クと選択的に結合させるためにこの膜を使用することが
できる。

この様にして調製した膜の結合力は、５〜１０ｍｙｇプ
レ−Ｓ（２）−１−ＩＢｓＡｇ／ｃｍ”である。

実施例６　マイクロタイタープレ−トへのモノマーヒト
アルブミンのカップリング この目的のために、例えばアミノ−プレ−ト（Ａｍｉｎ
ｏ−Ｐｌａｔｅ、　１級アミ７基を含有する）またはカ
ルボ−プレ−ト（Ｃａｒｂｏ−Ｐｌａｔｅ、カルボキシ
ル基を含有するＸＮ１５ｓｈｏ　Ｉｗａｉ　Ｃｏｒｐ、
、　ＴＯＫＹＯ）の様な機能化されたポリスチレンプレ
−トまたは同様の物質を使用することができる。

Ｎ−エト牛ジカルボニルー２−エトキシ−１゜２−ジヒ
ドロ−キノリンの溶液（５０％エタノール水溶液中４０
　ｍＭ）２００　ｍｙｌを、９６−ウェルマイクロタイ
タープレ−トの各ウェルにピペツトで入れ、２時間４０
℃でインキュベートする。エタノールおよび脱イオン水
で注意深く洗浄した後、ヒト血清アルブミンの１％水溶
液２００ｍｙｌを各々ウェルにピペット注入し、＋４°
Ｃで一夜インキユベートする。】Ｍエタノールアミンま
たはＩＭＤ酸緩衝液ｐＨ４でブロックし、次いで洗浄し
た後、プレ−トはいつでも使用することがてきる。

プレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇ−含有細胞培養上清１００
ｍｙｌを、調製したマイクロタイタープレ−トに漸増希
釈率でピペット注入し、＋４°Ｃで２時間インキュベー
トする。緩ｉ！ｉ　ｉ（ｌで洗浄後、既知のＥＬＩＳＡ
法に従い、酵素ｆ顕職した抗−プレ−５（２）　−）ｉ
　Ｂ　ｓＡ　ｇ（モノクローナル抗体）と共にインキュ
ベートし、基質を添加して、既知の吸収スペクトル法に
より、プレ−５（２）−タンパクの結合割合を調べる。

マイクロタイタープレ−トに、ＳＨ−変性させたプレ−
Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇまたは合成プレ−５（２）−ペプ
チドを負荷した場合は、抗−プレ−５（２）−抗体（例
えば患者の血清由来）を検定するために、この様にして
処理したプレ−トを使用することができる。

リン酸緩衝液（０，１Ｍ；ｐＨ７，０）ｌ　ＯｍＱ中の
ブＬ、＝Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇｌ　Ｏｉｇを、１０％ド
デンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中のメルカプトエタノ
ール１００ｍｙｌと共に５分間、ｌＯＯｏＣでインキュ
ベートする。この間に、ＨＢ　ｓへｇの免疫学的に活性
なＳ−抗原は破壊される（ミリノチ等（Ｍｉｌｉｃｈ　
Ｄ。

Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　１ｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｐｒｅ−Ｓ−Ｒｅｇｉ
ｏｎ　ｏｆ’　ｌ１ｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆａ
ｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１
１９５−１１９９　（１９８５））。ヨウドアセトアミ
ド５００ｍｇで１時間、ＳＲ−基をプロ、７りした後、
過Ｉ！ＩＩ量の反応生成物を透析によって除去し、プレ
−５（２）−抗原をリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で１０
０１１１ｙｇタンパク／πＱに希釈する。

調製したＨＳＡマイクロタイタープレ−トをこのプレ−
５（２）溶液で岐覆し、次いで洗浄する。

この様にして調製したプレ−トは、乾燥状態でも貯蔵す
ることができる。

抗−プレ−５（２）−含有ウサギ血清１００ｍｙｌを漸
増希釈率で各々ウェルにピペット注入する。

＋４°Ｃで一夜インキコベートした後、結合したプレ−
５（２）−抗体を、酵素標識した抗ウサギ血清と共にイ
ンキュベートし、次いで基質を加えることにより、吸収
スペクトルによって検定する。

実施例７　種々のアルブミン担体コンプレックスを使用
した時のプレ−Ｓ（２）−ＨＢｓＡｇの結合能力および
収率 ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）およびポリマー化ヒト血
清アルブミン（ポリ−Ｈ３Ａ）を共有結合的に、または
吸着結合的に、比較するのに適当な量で種々の担体物質
に結合させた。溶離後、プレ−（２）−ＨＢｓＡｇの結
合能力および収率を、ＨＢｓＡｇ−特異的ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ法によって調べた。結果を以下の表に示す。

（以下余白）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、モノマーヒトアルブミンが共有結合している不溶性
   ポリマー担体、およびプレ−Ｓ（２）−領域およびプレ
   −Ｓ（１）−領域を有し、該プレ−Ｓ（２）−領域およ
   び該プレ−Ｓ（１）−領域の少なくとも一方によって溶
   離可能な形態で該モノマーヒトアルブミンに結合してい
   るプレ−ＳＢ型肝炎表面抗原からなるコンプレックス。 ２、該不溶性ポリマー担体が、アガロースおよびデキス
   トランからなる群から選択される物質をベースとする請
   求項１に記載のコンプレックス。 ３、モノマーヒトアルブミンが共有結合している不溶性
   ポリマー担体。 ４、アガロースおよびデキストランからなる群から選択
   される物質をベースとする請求項３に記載の不溶性ポリ
   マー担体。 ５、モノマーヒトアルブミンが共有結合している不溶性
   ポリマー担体、およびプレ−Ｓ（２）−領域およびプレ
   −Ｓ（１）−領域を有し、該プレ−Ｓ（２）−領域およ
   び該プレ−Ｓ（１）−領域の少なくとも一方によって溶
   離可能な形態で該モノマーヒトアルブミンに結合してい
   るプレ−ＳＢ型肝炎表面抗原からなるコンプレックスを
   使用することによるプレ−ＳＢ型肝炎表面抗原の精製方
   法であって、 該コンプレックスを緩衝液で洗浄して、存在し得る不純
   物を除去し、 該コンプレックスを解離させて、該プレ−ＳＢ型肝炎表
   面抗原を回収することからなる精製方法。 ６、該コンプレックスをカオトロピック物質含有溶離剤
   で処理することによって該プレ−ＳＢ型肝炎表面抗原を
   回収する請求項５に記載の方法。 ７、該カオトロピック物質が尿素、塩酸グアニジン、チ
   オシアネート、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび
   ヨウ化カリウムからなる群から選択される請求項６に記
   載の方法。８、該コンプレックスを界面活性剤で処理す
   ることによって該プレ−ＳＢ型肝炎表面抗原を回収する
   請求項５に記載の方法。 ９、該コンプレックスをｐＨ調節剤で処理することによ
   って該プレ−ＳＢ型肝炎表面抗原を回収する請求項５に
   記載の方法。 １０、更に第２の精製工程を含む請求項５に記載の方法
   。 １１、該界面活性剤がイオン性界面活性剤、両性イオン
   性界面活性剤および非イオン性界面活性剤からなる群か
   ら選択される請求項８に記載の方法。 １２、該イオン性界面活性剤がデスオキシコール酸ナト
   リウムおよびタウロデスオキシコール酸からなる群から
   選択される請求項１１に記載の方法。 １３、該両性イオン性界面活性剤が３［（３−コールア
   ミドプロピル）−ジメチル−アンモニオ］−１−プロパ
   ンスルホネートおよび３［（３−コールアミドプロピル
   ）−ジメチル−アンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プ
   ロパンスルホネートからなる群から選択される請求項１
   １に記載の方法。 １４、該非イオン性界面活性剤がオクチルグルコピラノ
   シドである請求項１１に記載の方法。 １５、該第２の精製工程が、ゲル濾過、超遠心、疎水ク
   ロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグ
   ラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーからなる
   群から選択される工程を含む請求項１０に記載の方法。 １６、診断薬、およびＢ型肝炎に対する能動免疫に適し
   たワクチンであって、該ワクチンで免疫したドナーの特
   異的免疫グロブリンを得るのに適したワクチンの製造の
   ための、請求項１に記載のコンプレックスの用途。