NO300421B1

NO300421B1 - Kompleks egnet for rensing av pre-S-hepatitt-B-virus overflateantigen

Info

Publication number: NO300421B1
Application number: NO904085A
Authority: NO
Inventors: Johann Eibl; Friedrich Dorner; Artur Mitterer
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1989-09-20
Filing date: 1990-09-19
Publication date: 1997-05-26
Also published as: FI904412A0; EP0419446B1; EP0419446A1; NO904085L; ATE121417T1; NO904085D0; FI101625B; FI101625B1; DE59008927D1; JP2721033B2; CA2025263A1; DK0419446T3; ATA219889A; AT392417B; ES2074558T3; JPH03120300A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et kompleks som er særpreget ved at det består av en uløselig, polymer bærer især på agarose- eller dekstrosebasis til hvilken humanalbumin er kovalent bundet, og et pre-S-hepatitis-B-virus-overflate-antigen (pre-S-HBsAg), som over sin pre-S(2)-del og/eller pre-S(l)-del er bundet til det monomere humanalbumin i eluerbar form, samt anvendelse derav ved rensning av pre-S-hepatitt-/3-virus-overflateantigen og fremstilling av diagnostika og vaksiner.

Fra EP-A2-0 243 103 er det kjent en fremgangsmåte ved rensing av pre-S-HBsAg, hvilken fremgangsmåte består i at gjærceller som uttrykker rekombinant pre-S-HBsAg, sprenges, og fra celleinneholdet separeres pre-S-HBsAg affinitetskromatografi sk . Som adsorbens for pre-S-HBsAg fungerer polymerisert humant serumalbumin (polyalbumin) som er bundet kovalent til en matrise. Dette polyalbumin er et med tverrfornetter, f.eks. glutaraldehyd, i høymolekylær form kunstig fremstilt produkt. Pre-S-HBsAg adsorberes over sin pre-S-(2)-del på polyalbumin og elueres fra matrisen etter at forstyrrende substanser er vasket ut, og underkastes et ytterligere rensingstrinn.

Det ble påvist at i pre-S-delen av HBsAg fins det en virksom reseptor for polyalbumin som består av et polypep-tid med 55 aminosyrer, og som kodes med et avsnitt av hepatitis-virus-DNA som umiddelbart forlagres i S-området ("pre-S2") (Valenzuela et al., Bio/Technology 3: 317-320, 1985) . Det ble videre påvist at både dette umiddelbart forlagrede område (pre-S2) og også det totale pre-S-område i forbindelse med S-området (pre-Sl) koder overflateprotei-ner som utgjør reseptorer for hepatitis-B-virus (HBV) for binding til cellemembranen hos leverceller.

HBsAgsom inneholder en pre-S-del, ble første gang utvunnet i 1979 av infisert menneskelig plasma (Neurath og Strick, Arch. Virol. 60: 79-81, 1979) og ble senere fremstilt også på genteknologisk måte av Valenzuela et al. (Bio/Technology 3: 317, 1985, og Nature 311: 67, 1984) og Paoletti et al.

(PNAS 81: 193, 1984).

Senere ble det foreslått forskjellige rekombinant uttrykte pre-S-holdige overflateantigener som vaksine for å indusere antistoffdannelse mot HBV. Disse antistoffer retter seg mot virusets reseptor og forhindrer således at det bindes til levercellen, og dermed forhindres infeksjon.

Den affinitetkromatografiske rensing av antigenene over polyalbumin har den ulempe at ved anvendelse av tverrfornetter ved fremstilling av polymerisasjonsjonsprodukter kan det bringes inn toksiske substanser, såsom glutaraldehyd, i eluatet.

Foreliggende oppfinnelse har som mål å eliminere denne vanskelighet og fremskaffe et kompleks som i tillegg til muligheten for en rask og virkningsfull affinitetskromatografisk rensing av pre-S-HBsAg, åpner bruksmuligheter for terapeutiske og diagnostiske formål.

Komplekset ifølge oppfinnelsen består av en uløselig, polymer bærer, især på agarose eller dekstranbasis, til hvilken bærer monomert humanalbumin er kovalent bundet, og et pre-S-hepatitis-B-virus-overflateantigen som er bundet i eluerbar form over sin pre-S(2)- og/eller pre-S(l)-del til det monomere humanalbumin.

Ifølge oppfinnelsen ble det fastslått at pre-S-HBsAg danner kompleks med det monomere humanalbumin i tilstrekkelig styrke for affinitetskromatografisk rensing bare når dette er bundet kovalent til bæreren. Bindes albuminet bare adsorptivt, kan pre-S-HBsAg ikke - hhv. bare i liten grad - danne kompleks med albuminet, slik at en affinitetkromato-graf isk rensing ikke er mulig. En ytterligere fordel med komplekset ifølge oppfinnelsen består i at pre-S-HBsAg er lett eluerbart, hvorved proteinet kan utvinnes mer skånende og i høyere utbytte.

For dannelse av komplekset ifølge oppfinnelsen er det nødvendig med en uløselig bærer til hvilken det monomere humanalbumin er kovalent bundet. For fremstilling av den uløselige, polymere bærer kan enhver polymer anvendes som etter tilsvarende aktivering er istand til å binde proteiner kovalent. Aktuelle bærermaterialer er

organiske polymerer, såsom polyamider og vinylpoly-merer (polyakrylamid, polystyren og polyvinylalkoholer

og deres derivater), videre

naturlige polymerer, såsom cellulose, dekstraner,

agarose, kitin og polyaminosyrer, og

uorganiske polymerer, såsom kiselgel, glass og metall-hydroksyder.

Disse bærermaterialer anvendes i form av partikler, f.eks. molekylsikt, i form av membraner eller plater, f.eks. mikrotiterplater.

Fortrinnsvis er den uløselig, polymere bærer oppbygget på agarose- eller dekstrosebasis.

Komplekset ifølge oppfinnelsen kan lagres over lengre tid, således både i vandig fase hvor bæreren foreligger i oppsvulmet tilstand (f.eks. som affinitetsharpiks) og også i lyofilisert tilstand (f.eks. som membran eller mikrotiterplate). En lyofilisering utføres fortrinnsvis fra en flyktig buffer som inneholder glycin eller glukose.

Av komplekset ifølge oppfinnelsen kan pre-S-HBsAg isoleres med høy renhet. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av komplekset for fremstilling av diagnostika eller vaksine. Vaksinene kan anvendes både for aktiv immunisering mot hepatitis B og for utvinnelse av spesifikt immunglobulin fra givere som er blitt immunisert med slik vaksine, men en slik vaksine utgjør i seg selv ikke en del av foreliggende oppfinnelse.

Bæreren ifølge oppfinnelsen kan lades på enkel måte med S-hepatitis-B-virus-overflateantigen ved å bringe en vandig løsning av hepatits-B-virus-overflateantigen i kontakt med bæreren, hvorved de pre-S-holdige deler av hepatitis-overflateantigenet adsorberes på albuminmolekylene.

Anvendelsen av komplekset ifølge oppfinnelsen ved rensing av pre-S-hepatitis-B-virus-overflateantigen omfatter at komplekset vaskes med bufferløsning for å fjerne

eventuelt foreliggende forurensninger, og pre-S-hepatitis-B-virus-overflateantigenet som er selektivt adsorbert på det monomere humanalbumin, avspaltes og utvinnes ved at komplekset enten behandles med et elueringsmiddel som inneholder kaotrope substanser, såsom urinstoff, guanidinhydroklorid, tiocyanat, kaliumklorid, magnesiumklorid eller kalium-jodid; eller

komplekset behandles med detergenter; eller komplekset behandles med et pH-endrende middel, hvoretter det eventuelt foretas en ytterligere rensing .

En foretrukken anvendelse av komplekset ifølge oppfinnelsen er hvor det som detergenter anvendes ioniske detergenter, især natriumdeoksykolat og taurodeoksykolsyre, eller zwitterioniske detergenter, især 3[(3-kolamidopropyl)-dimetylammonio]-1-propansulfonat og 3[(3-kolamidopropyl)-dimetylammonio]-2-hydroksy-1-propansulfonat, eller ikke-ioniske detergenter, især oktyl-glukopyranosider.

Det har vist seg at ved anvendelse av disse detergenter forringes ikke kvartærstrukturen for eluert pre-S-HBsAg.

Fortrinnsvis består den videre rensing etter elueringen av gelf iltrering, ul trasentrif unger ing, hydrofob kromatograf i, lektin-af f initetskromatograf i eller ionebytterkromatograf i. Hvert enkelt av disse rengjøringsskritt fører til en renhet for pre-S-HBsAg på over 90 %.

I det følgende beskrives oppfinnelsen nærmere: Pre-S-HBsAg kan uttrykkes fra rekombinant Vaccinia-virus som inneholder den genetiske informasjon for pre-S-HBsAg. Denne teknikk er beskrevet i litteraturen (Moss et al.,Nature 311: 67 (1984). Først fremstilles en høytitrisk virus-standardløsning, idet Vero-celler infiseres med 1 pfu/celle. Etter 2 til 3 dagers inkubering overføres de infiserte celler til mediet og pelleteres ved 20 minutters sentrifugering ved 5.000 g. Væsken helles vekk og lagres ved 4°C. Cellene vaskes tre ganger med PBS, hvoretter det tilsettes en trypsinløsning til cellesuspensjonen inntil det oppnås en sluttkonsentrasjon av trypsin på 0,025 vekt%. Suspensjonen omrøres deretter lett i 30 min ved 37°C, slås sammen med supernatanten, fordeles i alikvote ampuller og dypfryses ved -80°C. Ved denne fremgangsmåte høynes virustiteren til ca det tidobbelte av hva som ellers oppnås i cellemediet.

Vero-celle-startkulturen beredes ved at cellene dyrkes i Roux-flasker og i Roller-flasker (Nunc) av kunststoff for å produsere tilstrekkelig mange celler for å kunne innpodes i en 6 liters fermenteringsbeholder som deretter på sin side tjener som startkultur for en 40 liters sats. For dette formål opptines først en enkelt ampulle med Vero-celler av et bestemt generasjonstall og dyrkes videre for å ferdigstille tolv tettvokste Roller-flasker.

Cellene trypsiniseres, resuspenderes i medium 199 med 5 vekt% føtalt kalveserum, blandes med en suspensjon av mikrobærere (Cytodex 3, Pharmacia) og pumpes inn i fermenteringsbeholderen, hvorved det oppnås en sluttkonsentrasjon på 2xl0<8> celler og 5 g mikrobærer pr. liter. På dette stadium tilsettes ytterliger medium i en mengde av en tredjedel av sluttvolumet.

I løpet av tre timer gis cellene mulighet til å binde seg til mikrobæreren, hvorved suspensjonen samtidig langsomt omrøres. Deretter tilsettes ytterligere medium (DMEM som inneholder 5 vekt% føtalt kalveserum) for å oppnå sluttvolumet. Så snart det er fremvokst en celletetthet på 6 til 8xl0<8>/liter, startes en kontinuerlig perfusjon med DMEM (som inneholder 5 vekt% føkalt kalveserum). Etterat en celletetthet på ca 5xl0<9>/liter er oppnådd, trypsiniseres mikrobærerne, og cellene samt mikrobærerne pumpes inn i 50 liters fermenteringsbeholderen som inneholder ytterligere 5g mikrobærer pr. liter. Etter adsorpsjonen fylles beholderen opp til 40 liter, og kultiveringen fortsettes som beskrevet ovenfor.

Når celletettheten er 5xl0<9>/liter, pumpes mediet vekk etterat mikrobærerne har satt seg. Fem liter av mediet som inneholder den rekombinante mikroorganisme, pumpes inn i f ermenteringsbeholderen for å gi en m.o.i.-verdi på 2 pfu pr. rekombinant celle. Etter adsorpsjon av viruset fylles fermenteringsbeholderen opp til 4 0 liter med medium 19 9 (som inneholder 5 vekt% føtalt kalveserum) og perfunderes med 4 0 liter av det samme medium i 4 0 timer. Etter dette tidsrom har ca 80 % av cellene løst seg fra mikrobærerne og pumpes vekk med mediet.

De resterende celler som fremdeles sitter fast på mikrobærerne, løses ved vasking med medium under hurtig omrøring og slås sammen med den første del. Mikrobærerne fjernes ved hjelp av en 70 fim sikt. Ved sentrifugering i en Beckmann JFC-Z-gjennomflytningsrotor pelleteres cellene ved 16.000 g. Mediet konsentreres ved ultrafiltrering i Pellikon-system (Millipore-Waters). Til det konsentrerte medium tilsettes urinstoff til det oppnås en 8M løsning. Denne løsning.dialyseres.

Den konsentrerte Vero-celle-supernatant overføres til en søyle som fylles med et uløselig, polymert bærermateriale som humant serumalbumin er kovalent bundet til. Koblings-metoden retter seg som kjent etter bærerens kjemiske natur. Ved anvendelse av "Sepharose" aktivert med f.eks. CNBr, kobles det monomere, humane serumalbumin til "Sepharose".

Etterat søylen var vasket med buffer 1 som besto av 0,2 M natriumacetat (pH 4,0) og 0,5 M NaCl, med buffer 2 som besto av 0,1 M Tris (pH 8,0) og 0,5 M NaCl, med løsning 3 som besto av 8 M urinstoff, og tilslutt med buffer 3 som besto av 0,02 M Tris (pH 7,4), overføres Vero-celle-supernatanten til søylen. Straks supernatanten er opptatt av søylen, vaskes de ikke-adsorberte proteiner med buffer 4 som består av 0,02 M Tris (pH 7,4) og 0,5 M NaCl, fra søylen. Det adsorberte pre-S-(2)-HBsAg elueres med natriumtiocyanat i buffer 4 (1 til 4 M, fortrinnsvis 3 M) ved en pH-verdi på 6 til ca 8, fortrinnsvis ved pH 7 (buffer 5) eller med urinstoff i buffer 4, fortrinnsvis med 4 M urinstoff (buffer 6). Denne separasjon ifølge oppfinnelsen med monomert humanalbumin fører til en 145-foldig anrikning av pre-S-HBsAg. Dets identitet kan påvises med immunoblot-teknikk (Burnette, Anal. Biochem., 112, 195, 1981), hvorved renheten beløper seg til 80 %.

Pre-S(2)-HBsAg kan videre renses ved gelfiltrering på "Sepharose" (Pharmacia). For dette formål dialyseres den ovenfor erholdte fraksjon i en buffer som består av 0,02 M Tris (pH 7), og påføres "Sepharose"-søylen som er aktivert med 0,02 M Tris (pH 7). Med teknikken "Silverstaining" og "Immunoblotting" kan det påvises en renhet på mer enn 90 % hos pre-S-HBsAg.

I de følgende utførelseseksempler beskrives utførelsen av

fremgangsmåten mer utførlig:

Eksempel 1

Affinitetskromatografisk rensing av pre-S(2)-HBsAg ved hjelp av monomert humanalbumin

Det rekombinante Vaccinia-virus med den genetiske informasjon for pre-S(2)-HBsAg ble oppnådd ved hjelp av de teknik-ker som er beskrevet av Moss et al. (Nature 311: 67, 1984). Den høytitriske standardløsning av det rekombinante Vaccinia-virus ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Vero-cellene for infeksjon med det rekombinante virus ble dyrket under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. Det konsentrerte, dialyserte medium med pre-S(2)-HBsAg ble også fremstilt som tidligere beskrevet.

Monomert humanalbumin ble kovalent bundet til CNBr-aktivert "Sepharos 4B" (Pharmacia) ifølge produsentens instruk-sjoner. Deretter ble en søyle med et volum på 50 ml fylt og vasket med 500 ml av bufferløsning 1, 500 ml av løsning 3 og til slutt med 500 ml av bufferløsning 4.

Den klare verocelle-supernatant inneholdt 8500 mg protein og 95 mg pre-S(2)-HBsAg og ble pumpet inn i den preparerte søyle med en gj ennomf lytningshastighet på 100 ml/time. Etter at hele mengden var overført til søylen, ble de ikke-adsorberte proteiner vasket ut av søylen med bufferløsning 4. Pre-S(2)-HBsAg ble eluert med 3 M natriumtiocyanat, pH 7 (bufferløsning 5) . Identifiseringen og renhetsundersøke1-sen skjedde med "silver-staining"-metoden og immunoblotting etter en polyakrylamidgel-elektroforese.

De fra søylen eluerte fraksjoner ble delt i to og inkubert i 15 minutter ved 100°C i en buffer som besto av 2 vekt% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,125 M Tris-HCl (pH 6,8) og 100 mM ditiotreitol. Prøvene ble separert elektroforetisk over 12,5 vekt% polyakrylamid-separasjonsgel i 2,5 timer vd 65 mA/gel (Laemmli, Nature 227: 680, 1971). Den ene del av gelprøvene ble farvet med sølvnitrat for å gjøre polypep-tidene synlige. Den andre del av prøvene ble undersøkt ved hjelp av immunoblotting-teknikken, hvorved det ble anvendt kanin-antiserum.

De eluerte fraksjoner inneholdt 42 mg protein og 68 mg pre-S(2)-HBsAg. Med dette ble det oppnådd en 145-foldig anrikning av pre-S(2)-HBsAg.

De følgende eksempler 2 og 3 beskriver den videre rensing av den fraksjon som ble oppnådd i eksempel 1.

Eksempel 2

En ifølge eksempel 1 erholdt pre-S(2)-HBsAg-holdig løsning ble videre renset ved hjelp av søylekromatografi på "Sepharose 4B" (Pharmacia). For dette ble søylen først preparert og vasket med 500 ml 0,02 M Tris (pH 7,0) ved en gjennom-strømningshastighet på 30 ml/t. Den pre-S(2)-HBsAg-hoIdige løsning ble dialysert mot denne buffer, og det dialyserte antigen som forelå i en konsentrasjon på 10 mg/12 ml ved siden av 6,2 mg protein/12 ml, ble overført til søylen. Søylen ble aktivert med 0,02 M Tris (pH 7,0), og den eluerte pre-S(2)-HBsAg-holdige fraksjon inneholdt 4,8 mg protein og 8,2 mg pre-S(2)-HBsAg. "Silver-staining" og immunoblotting av polyakrylamidgelene som ble utført som beskrevet i eksempel 1, ga en renhet for pre-S(2)-HBsAg på mer enn 90%.

Eksempel 3

En ifølge eksempel 1 erholdt pre-S(2)-HBsAg-holdig løsning ble renset ytterligere ved hjelp av søylekromatografi på "Lentil-Lectin-Sepharose 4B" (Pharmacia). For dette ble søylen først preparert og vasket med 100 ml 0,02 M Tris (pH 7,0) ved en gjennomstrømningshastighet på 50 ml/t. Den

pre-S(2)-HBsAg-holdige løsning ble dialysert mot denne

buffer, og det dialyserte antigen som forelå i en konsentrasjon på 21 mg/25 ml ved siden av 13 mg protein/25 ml, ble overført til søylen med en gjennomstrømningshastighet på 25 ml/t. Deretter ble det ikke-adsorberte materiale vasket med Tris-bufferløsning, og pre-S(2)-HBsAg ble eluert med Tris-bufferløsning, som inneholdt 5 vekt% alfa-metyl-mannosid. Eluatet inneholdt 9,1 mg protein og 15,6 mg pre-S(2)-HBsAg. "Silver-staining" og immunoblotting av polyakrylamidgelene ble utført som beskrevet i eksempel 1, og ga en renhet for pre-S(2)-HBsAg på mer enn 90%.

Rensingen av hepatitis-B-overflateantigener som i stedet for pre-S(2)-delen bærer pre-S(1)-delen, henholdsvis pre-S(2)- og pre-S(1)-delene, skjer analogt med de beskrevne utførelseseksempeler. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til rensing av ethvert protein som bærer en pre-S(2)-del av HBsAg.

Følgende eksempler 4 og 6 beskriver anvendelsen av forskjellige bærermaterialer og -former samt koblingsmetoder som tilsvarer det ønskede anvendelsesformål.

Eksempel 4

Kobling av monomert humanalbumin til silikatbærere

Som bærere kommer derved enten kiselgeler eller mikroglass-kuler (Controlled Pre Glass = CPG) på tale. 10 g av en aminert glassbærer (aminopropyl-CPG, Pierce) rystes med 100 ml av en 2,5 % vandig glutaraldehydløsning i 4 timer ved romtemperatur. Etter aktiveringen vaskes bæreren grundig med avionisert vann til den er aldehydfri. Den således aktiverte bærer inkuberes med 2 00 mg humant serum albumin i 0,1 M fosfatbuffer (pH 8,0) i en time. Etter blokkering med 1 M etanolamin og grundig vasking med fosfatbuffer er bæreren ferdig til bruk.

200 ml av en pre-S(2)-HBsAg-holdig cellekultursupernatant (11 mg pre-S(2)-HBsAg, 950 mg protein) inkuberes med 10 ml av affinitetsbæreren i 2 timer ved 14°C. Ubundet protein fjernes ved vasking med buffer på et sinterfilter, og det spesifikt bundne pre-S(2)-HBsAg elueres ved inkubering av den ladede bærer i 10 ml 8 M urinstoffløsning. Dette forsøk ga 6,8 mg høyrenset pre-S(2)-HBsAg med en samlet protein-mengde på 5,4 mg (bestemmelse ifølge Bradford).

Eksempel 5

Kobling av monomert humanalbumin til membraner

Aktuelle som bærere er membraner av f.eks. nylon, poly-vinylidendifluorid eller cellulose-polyakrylamidblandings-polymerisater. Nylonmembran (f.eks. Zetabind, CUNO) hydro-lyseres partielt ved inkubering i HC1/H20. De derved frisatte aminogrupper omsettes med 1 M oksaldialdehyd i nærvær av 0,1 M natriumcyanoborhydrid ved pH = 7 i to timer. Etter vasking med avionisert vann kobles til denne med reaktive aldehydgrupper aktiverte membran humant serumalbumin (10 mg/ml i 0,1 M fosfatbuffer pH = • 7) i nærvær av 0,1 M natriumcyanoborhydrid. Overflødige reaktive grupper blokkeres ved tilsetning av 1 M etanolamin. Etter vasking med fosfatbuffer (0,1 M; pH = 8) kan membranen anvendes for selektiv binding av pre-S(2)-holdige proteiner .

Bindingkapasiteten av en således fremstilt membran er 5 til 10 ^g pre-S(2)-HBsAg/cm2 .

Eksempel 6

Kobling av monomert humanalbumin til mikrotiterplater

Til dette kan det anvendes funksjonaliserte polystyrol-plater, såsom f.eks. en amino-plate (med primære amino-gruper) eller en karboplate (med karboksylgrupper) (Nissho Iwai, Tokyo) eller lignende materialer.

100 jxl av en løsning av N-etoksykarbonyl-2-etoksy-l,2-dihydro-kinolin (40 mM i 50% vandig etanol) pipetteres i hvert hull av en mikrotiterplate med 96 hull og inkuberes i 2 timer ved 4 0°C. Etter grundig vasking med etanol og avionisert vann, pipetteres 200 /xl av en 1% vandig løsning av humant serumalbumin i hvert hull og inkuberes over natten ved +4°C. Etter blokkering med henholdsvis 1 M etanolamin og 1 M acetatbuffer pH = 4 og derpå følgende vasking, er platen ferdig for bruk.

100 [ il av en pre-S (2)-HBsAg-holdig cellekultursupernatant pipetteres med stigende fortynninger inn i den preparerte mikrotiterplate og inkuberes i 2 timer ved +4°C. Etter vasking med buffer og inkubering med enzymmerket anti-pre-S(2)-HBsAg (monoklonale antistoffer) ifølge den kjente ELISA-teknikk, bestemmes ved substrattilsetning den bundne mengde av pre-S (2) -protein absorpsjonsspektrometrisk ifølge kjente metoder.

Lades mikrotiterplaten med SH-denaturert pre-S(2)-HBsAG eller syntetisk pre-S(2)-peptid, kan en således behandlet plate anvendes for bestemmelse av anti-pre-S (2)-antistoffer (f.eks. av pasientserum). 10 mg pre-S (2)-HBsAg i 10 ml fosfatbuffer (0,1 M; pH = 7,0) inkuberes med 100 jul merkaptoetanol 9 10% natriumdodecylsulfat (SDS) i 5 min ved 100°C. Derved ødelegges det immu-nologisk aktive S-antigen av HBsAg (Milich D.R. et al.,

"Enhanced immunogenicity of the Pre-S region of hepatitis B surface antigen", Science 227: 1195-1199 (1985)). Etter blokkering av SH-gruppene med 500 jodacetamid i en time fjernes overflødige reaksjonsprodukter ved dialyse, og

pre-S(2)-antigenet fortynnes med fosfatbuffer pH = 7,4 til 100 /xg protein/ml.

En preparert HSA-mikrotiterplate besjiktes med denne pre-S(2)-løsning og vaskes deretter. Således preparerte

plater kan også lagres i tørr form.

100 fil av et anti-pre-S (2)-holdig kaninserum pipetteres med stigende fortynninger inn i hullene. Etter inkubering ved +4°C over natten, bestemmes bundet pre-S(2)-antistoff absorpsjonsspektrometrisk ved inkubering med enzymmarkert anti-kaninserum og påfølgende substrattilsetning.

Eksempel 7

Bindingskapasitet og utbytte av pre-S(2)-HBsAg ved anvendelse av forskjellige albumin-bærer-komplekser.

Henholdsvis humant serumalbumin (HSA) og polymerisert humant serumalbumin (poly-HSA) ble bundet, henholdsvis kovalent og adsorptivt i sammenlignbar mengde, til forskjellige bærermaterialer. Bindingskapasiteten og utbyttet av pre-S(2)-HBsAg etter eluering ble bestemt ved hjelp av en HBsAg-spesifikk ELISA-metode og er sammenfattet i følgende tabell.

Av tabellen kan det ses at i foreliggende utførelseseksem-pel oppnås det høyere utbytter av pre-S(2)-HBsAg med oppfinnelsens uløselige, polymere bærer, hvor det monomere humanalbumin er kovalent bundet til Sepharose, enn med Sepharose som polyalbumin er kovalent bundet til.

Disse tydelig høyere utbytter kan føres tilbake til de mer skånsomme elueringsbetingelser som er mulig ved anvendelse av bæreren i oppfinnelsen. Videre kan det ses at nettopp den kovalente binding av HSA til bæreren gir oppfinnelsens egenskap med pre-S(2)-affinitet, og en molekylsikt som albuminet bare er adsorptivt bundet til, er ikke egnet for

Claims

1. Kompleks, karakterisert ved at det består av en uløselig, polymer bærer, især på agarose-eller dekstrosebasis, som monomert humanalbumin er kovalent bundet til, og et pre-S-hepatitis-B-virus-overflateantigen, som over sin pre-S(2)-del og/eller pre-S(1)-del er bundet til det monomere humanalbumin i eluerbar form.

2. Anvendelse av kompleks ifølge krav 1 ved rensing av pre - S-hepat it is-/3-virus-overf lateantigen.

3. Anvendelse ifølge krav 2 under samtidig benyttelse av en detergent.

4. Anvendelse ifølge krav 2 eller 3, hvor rensingen omfatter gelfiltrering, ultrasentrifugering, hydrofob kromatografi, lektin-affinitetskromatografi eller ionebyt-tekromatogreafi.

5. Anvendelse av et kompleks ifølge krav 1 ved fremstilling av diagnostika og vaksiner.