DE2321784C2

DE2321784C2 - Verfahren zur Herstellung von vernetzten Gelose- oder Agarose-Gelen sowie deren Verwendung

Info

Publication number: DE2321784C2
Application number: DE2321784A
Authority: DE
Inventors: René Paris Tixier
Original assignee: GENERALE DE RECHERCHES ET D'APPLICATIONS SCIENTIFIQUES "SOGERAS" PARIS FR Ste
Current assignee: GENERALE DE RECHERCHES ET D'APPLICATIONS SCIENTIFIQUES "SOGERAS" PARIS FR Ste
Priority date: 1972-05-01
Filing date: 1973-04-30
Publication date: 1983-09-15
Also published as: JPS5176444A; DE2321784A1; JPS5337417B2; US3956272A; FR2183009B1; FR2183009A1; GB1435508A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von vernetzten Gelose- oder Agarose-Gelen sowie deren Verwendung in der Chromatographie und in der Elektrophorese.

Gelose (cK*er Agar-Agar) und Agarose (ein neutrales, aus Gelose isoliertes Polysaccharid) werden häufig entweder in Form von Platten aus dem hydratisierten Gel in Immunodiffusions-, Elektrophorese- und Immunoelektrophoreseverfahren oder in Form von Körnchen zur Abtrennung von natürlichen Substanzen durch Molekülausschlußchromatograyhie verwendet In der granulären Form werden sie auch als Träger zum chemischen Fixieren von Enzymen, verschiedenen Substanzen (selektive Chromatographie) oder ionisierten Gruppen (Ionenaustauscherchromatographie) verwendet

Diese Gele müssen .^:n ihrer verschiedenen Anwendungsformen bei Temperaturen unterhalb 50° C und im hydratisierten Zustand verwenr'rt werden, wodurch ihre Verwendbarkeit begrenzt und ihre Kommerzialisierung schwierig gemacht wird. Die Bildung eines Gels in Wasser geht nämlich im Prinzip auf die Anwesenheit von Wasserstoffbrücken zurück, weiche die Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk miteinander verbinden. Diese Bindungen sind sehr schwach und infolgedessen durch physikalische oder chemische Agenden leicht aufspaltbar. Deshalb bildet Gelose oder Agarose bei extremen (sauren oder basischen) pH-Werten, bei einer Temperatur oberhalb etwa 5O⁰C und in Gegenwart bestimmter chemischer Substanzen, wie Harnstoff, kein Gel. Diese natürliche Zerbrechlichkeit der Gele begrenzt ihre Verwendbarkeit sowohl in der Elektrophorese als auch in der Chromatographie und damit auch als Träger für die Enzyme.

In der Chromatographie können die Körnchen oder Perlen nicht durch Wärme sterilisiert werden, was einen schwerwiegenden Nachteil bei der Abtrennung von Viren oder biologischen Substanzen darstellt, die aseptisch gehandhabt werden müssen. Wenn die Körnchen als Träger für die Enzyme dienen, ist es außerdem nicht möglich, sie zu verwenden, wenn die Temperatur des Reaktionsmediums 40⁰C übersteigt.

In der Elektrophorese werden Gelose- oder Agaroselösungen in geringen Konzentrationen (im allgemeinen unterhalb 2%) verwendet, so daß die durch Abkühlen erhaltenen Gele weich und demzufolge sehr zerbrechlich (instabil) sind. Die Lösungen müssen deshalb auf Glasplatten gegossen werden und anschließend müssen bei der Handhabung der Gele und beim Konservieren der Elektrophoretogramme umfangreiche Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden. Letztere liefern nach dem Trocknen besonders bröckelige Filme.

Es ist zwar aus der DE-OS 2131 139 bekannt, daß mit Epichlorhydrin oder Epibromhydrin vernetzte Agar-Fraktionen zur Chromatographie besser geeignet als unvernetzte sind. Aus der US-PS 28 05 220 ist ferner bekannt, andere Polysaccharide wie Stärke, mit Cyanurchlorid unlöslich zu :aiachen. Die Vernetzung mit Epihalogenhydrinen erfordert jedoch ein alkalisches Milieu. Deshalb sind Agaroüe und Gelose mit diesen wie auch mit anderen Epoxiden nicht vernetzbar. Mit

ίο wasserunlöslicher Stärke sind aber chromatographische Trennungen, wie sie erfindungsgemäß verbessert werden sollen, nicht in vergleichbarer Weise durchzuführen.

Es wurde nun gefunden, daß es doch möglich ist,

r5 Gelose- oder Agarose-Gele herzustellen, die den Vorteil haben, daß sie gegen Agenden, welche die Wasserstoffbindungen schwächen, beständig sind, ohne daß sie dabei ihre physikalisch-chemischen Haupteigenschaften verlieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von vernetzten Gelose- oder Agarose-Gelen ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Gele mit 2,4,6-TrichIor-l,3.5-triazin als Vernetzungsmittel behandelt und die bei der Behandlung gebildete Salzsäure neutralisiert

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verhalten sich die unlöslich gemachten Gel-Perlen nach der Behandlung in gleicher Weise wie die üblichen Perlen, weiche die gleiche Konzentration an Agarose enthalten, d.h. daß insbesondere das Auflösungsvermögen gegenüber den untersuchten Substanzen unverändert bleibt So können beispielsweise die mit erfindungsgemäß behandelten Peilen, die 2,4 und 6% Agarose enthalten, erhaltenen Kurven der Molekül- Selektivität auf die jeweiligen Kurven gelegt werden, die mit üblichen Perlen erhalten werden, welche jeweils die gleichen Mengenanteile an Agarose enthalten. Die Sterilisation bei 120⁰C über einen Zeitraum von 15 Minuten in einem Autoklaven führt zu keiner Verände rung der chromatographischen Eigenschaften der so behandelten Gele.

Die erfindungsgemäß behandelten Gele behalten auch ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften bei, auf Grund deren sie in Elektrophorese-, Immunodiffu sions- und Immunoelektrophoreseverfahren verwendet werden, darüber hinaus weisen sie aber nach der Behandlung neue physikalische Eigenschaften auf: sie sind gleichzeitig weich und beständig und können deshalb ohne Verwendung eines starren Trägers leicht gehandhabt werden; sie können bei 120°C in einem Autoklaven sterilisiert werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

200 ml eines Gels mit 2% Agarose oder Gelose wurden in einer Lösung von 5 g Trichlortriazin in einem Gemisch aus 75 ml Aceton und 25 ml Wasser, das vorher auf 50⁰C erwärmt worden war, suspendiert.

Anschließend wurde 90 Minuten lang gerührt, dann wurde mit In NaOH die während der Umsetzung gebildete Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Danach wurde das Gel mit entsalztem Wasser gewaschen, um das Aceton und die Nebenprodukte der Umsetzung sowie den Überschuß von Trichlortriazin zu entfernen. Das Ge! wurde erneut in 100 ml In NaOH suspendiert. Nach der Zugabe von 0,500 g Natriumborhydrid wurde die Suspension eine Stunde lang bei einer

Temperatur in der Nähe von 90⁰C gehalten. Das so behandelte Gel wurde mit warmem Wasser gewaschen, dann in kaltem Wasser wieder suspendiert, bis zu einem pH-Wert von 4 mit In Essigsäure versetzt, 15 Minuten lang gerührt, dann erneut mit entsalztem Wasser gewaschen und schließlich unter Vakuum abgesaugt Die Mengen an verwendetem Trichlortriazin betrugen 8 g auf 200 ml eines 4%igen Gels und 12 g auf die gleiche Menge eines 6°/oigen Gels.

Die nach diesem Verfahren erhaltenen Gele verhielten sich ebenso wie die gewöhnlichen Gele mit der gleichen Konzentration an Agarose oder Gelose. Dies geht aus Ausschlußchromatographie-Vergleichsversuchen hervor, die mit einem 4%igen Agarose-Gel in Form von Perlen mit einem Durchmesser von 100 bis 160 μπι vor und nach der Behandlung mit Trichlortriazin sowie nach 30minütiger Sterilisation bei 120⁰C durchgeführt wurden. Durch mit dem Gel gefüllte Säulen, die einen Durchmesser von 20 mm und eine Höhe von 400 mm aufwiesen, ließ man eine Lösung von »Blue-Dextran 2000« (vgl. AnaL Biochem. 39, [1971], S. 2Ö2-2Ö7) in dem Puffer iris-(Hydroxymethyi)-aminomethan - HCl (03 m bei pH 7,4) laufen. Die aufzeichneten Elutionskurven waren für die drei verschiedenen Gelformen identisch, was anzeigt daß das Auflösungsvermögen des Gels mit 4% Agarose weder durch die Behandlung mit Trichlortriazin noch anschließend durch die Sterilisierung des behandelten Gels verändert wurde.

Die F i g. 1 zeigt 3 Elutionskurven, die unter Verwendung von »Blue-Dextran 2000« durch Gelfiltration über ein polymerisiertes,4°/oiges Agarosegel

a) vor der Polymerisation (durchgezogene Kurve)

b) nach der Polymerisation (gestrichelte Kurve) bzw.

c) nach der Sterilisation (strichpunktierte Kurve)

erhalten wurden. Die Verhältnisse der Elutionsvolumina (in ml) des zweiten Maximums (v₂) zum ersten Maximum (v\) der jeweiligen Kurven betrugen:

a) V₂M = X »3

b) V₂M-1,84 bzw.

c) V₂A-, = 1,82.

Beispiel 2

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Es wurden 200 ml eines Gels mit 2% Agarose oder Gelose in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert. Dann wurden 6 g Trichlortriazin in 100 ml Dioxan gelöst und diese Lösung wurde langsam unter Rühren bei Umgebungstemperatur in die Gelsuspension gegossen. Nach etwa lOminütigem Rühren wurde die Suspension mit In NaOH neutralisiert. Das Rühren und Neutralisieren wurde fortgesetzt, bis der pH-Wert sich bei etwa 7 stabilisierte.

Es wurde eine Stunde lang auf 60 bis 65° C erwärmt, wobei die sich bei der Umsetzung von TrichlortriazL·! mit Agarose bildende Säure neutralisiert wurde. Man ließ abkühlen und das Gel wurde bis zur Eliminierung der Chloride gewaschen. Nach dem erneuten Suspendieren in 100 ml In NaOH wurde das Gel nach dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren mit Natriumborhydrid behandelt Auf 200 ml 4%iges Gel mußten 8 g Trichlortriazin verwendet werden, während auf 200 ml 6%iges Gel 12 g Trichlortriazin verwendet werden mußten.

Die mit »Blue-Dextran 2000« erhaltenen Elutionskurven zeigen, daß die 4%igen Agarose-Perlen nach der Behandlung in dem Dioxanmilieu und nach der Sterilisation das gleiche Auflösungsvermögen aufwiesen wie die nicht-behandelten Perlen.

Beispiel 3

200 ml *:ines Gels mit 2% Agarose oder Gelose wurden in 1000 ml entsalztem V**sser suspendiert Außerdem wurden 6 g Triehlortriaziü ir 150 ml Aceton gelöst und diese Lösung wurde zu der Gelsuspension zugegeben. Die Mischung wurde langsam auf eine Temperatur in der Nähe von 60⁰C gebracht und dann wurden 90 ml In NaOH und 1 Natriumborhydrid Natriumbohrhydrid zugegeben. Das Rühren wurde 1 Stunde lang bei 6O⁰C fortgesetzt Nach dem Abkühlen wurde das Gel bis zur Eliminierung der Chloride gewaschen und dann unter Vakuum abgesaugt Die verwendeten Mengen an Trichlortriazin betrugen 8 g auf 200 ml des 4°/oigen Gels und 12 g auf die gleiche Menge des 6%igen Gels.

Beispiel 4

150 mg Trichlortriazin wurden in 23 ml Aceton gelöst Außerdem wurde eine 13% ige Lösung (100 ml) von Agarose oder Gelose in 0,1 m Trinatriumcitrat hergestellt. Die Trichlortriazinlösung wuide «n die Agaroselösung (oder die Geloselösung), die vorher auf 50⁰C erwärmt worden war, gegossen. Unter ständigem Ruh. en wurde die Temperatur auf 70°C gebracht dann wurde eine In NaOH-Lösung (25 ml), die vorher auf 70⁰C erwärmt worden war, zugegeben. Die Mischung wurde zur Herstellung einer Gelschicht einer Dicke von 2 mm in Kunststoffkasten (4 8,2 mm ■ 133 mm große Kasten für 100 ml Gel) gegossen. Die Polymerisation war bei Umgebungstemperatur nach etwa 15 Stunden beendet. Die Platten wurden anschließend mit warmem Wasser (von etwa 70⁰C) bis zur Neutralität gewaschen.

In der Figur bedeuten:

Ve das Elutionsvolumen in ml (Milliliter)
T d^;: Transmission des Eluats in %, gemessen bei 282 nm (Nanometer)

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von vernetzten Gelose- oder Agarose-Gelen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gele mit 2,4,6-Trichlor-134-triazin als Vernetzungsmittel behandelt und die bei der Behandlung gebildete Salzsäure neutralisiert.

2. Verwendung von mach Anspruch 1 erhaltenen vernetzten Gelose- oder Agarose-Gelen für chromatographische Zwecke: