DE2228588A1 - Verfahren zur herstellung von oligoribonucleotiden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von oligoribonucleotiden

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

PATENTANWALT DR.-ING. LOTTERHOS ANNASTRASSE 19
FERNSPRECHER! (0611) 555061 TELEQRAMMEi LOMOSAPATENT LANOESZENTRALBANK 50007H9 POSTSCHECK-KONTO FFM. 1667
HI/K FRANKFÜRT (MAIN)1 8. Juni 1972
YEDA Besearch and Development Co.
Rehovot, Israel
Verfahren zur Herstellung von Oligoribonucleotiden
Die Erfindung betrifft Oligoribonucleotide, die eine definierte und vorausbestimmte Sequenz und die in der Natur vorkommende*! 3' -5' -Int ernucleotid-Bindungen auf weis en. Mit dem Verfahren der Erfindung kann man kurze Oligoribonucleotide mit gewünschter und vorausbesiimmter Sequenz herstellen, indem man ausgeht von natürlichen Riboöligonucleotiden mit 2 bis 4 oder mehr Einheiten und schrittweise vorbestimmte Einheiten anfügt, bis das gewünschte Produkt entstanden ist.
Es sind sowohl chemische als auch enzymatische Verfahren bekannt (Lohrmann et al., JlXJS 88, 819 (1966), Thach et al., 142, 131o> 148, 632 (1965). Diese waren jedoch beschränkt auf die Herstellung von ziemlich kurzen Oligonucleotiden mit nicht mehr als 4 bis 5 Monomereneinheiten in der Kette. Das Verfahren der Erfindung verschafft die Möglichkeit eines schrittweisen Aufbaus von Ketten mit vorausbestimmter Se-'quenz und grosserer Länge.
Im allgemeinen führt die Polymerisation von Ribonucleosiddiphosphat mittels E. coli - PolynucleotidphosphorjLase (EO 2.7.7.8) zur Bildung von langkettigen Polymeren zufälliger Zusammensetzung. Erfindungsgemäss kann diese Polymerisation so modifiziert werden, dass in gesteuerter Reaktion
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mit jedem Schritt eine einzelne Einheit eines "bestimmten Nucleotid-monophosphats an die "bestehende Kette angefügt wird. Diese gesteuerte Additionsreaktion kommt dadurch zustande, dass an den Riboseteil des Ribonucleosid-diphosphat-Substrats eine geeignete Blockierungsgruppe angefügt wird. Das blockierte Ribonucleosid-diphosphat, das der auf die Anfügung einer einzelnen Nucleotideinheit beschränkten Additionsreaktion unterworfen wird, wird im folgenden als "Monofunktionelles Substrat" der Polynucleotidphosphorylase bezeichnet. Die monofunktionellen Substrate werden für die schrittweise Synthese von Oligoribonucleotiden mit vorausbestimmter Sequenz verwendet. Die gesteuerte Addition und der schrittweise durchgeführte Aufbau des gewünschten Produktes wird folgendermassen vollzogen:
Ein bestimmtes Oligonucleotid wird mit dem ausgewählten monofunktionellen Substrat in Gegenwart eines zweckmässigen Enzyms, z.B. Polynucleotidphosphorylase (in löslicher oder in polymergebundener, wasserunlöslicher Form) zur Reaktion gebracht. Hierdurch erhält man ein Produkt, das um eine Monomereneinheit länger ist als das Ausgangsoligonucleotid, Dieses Prodiafct wird aus dem Reaktionsgemisch isoliert, und die Blockierungsgruppe wird durch eine milde Behandlung, z.B. durch schwaches Alkali, entfernt. Das erhaltene Oligonucleotid wird dann für einen weiteren Verlängerungsschritt eingesetzt, bei dem es als Initiator dient und wie oben besdirieben mit einem anderen monofunktioneilen Substrat umgesetzt wird. Die Sequenz mit schrittweiser Addition wird fortgesetzt, bis man die gewünschte Kettenlänge erreicht hat.
iiir die schrittweise Synthese von Oligonucleotiden mit definierter, vorausbestimmbarer Saquenz muss das monofunktionelle Substrat folgende Bedingungen erfüllen:
a) Bei Jedem Schritt führt die Reaktion zur Addition eines einzelnen Nucleotidteils.
b) Die Blockierungsgruppe ist so geartet, dass sie unter den Bedingungen der Additionsreaktion beständig ist, jedoch durch
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eine milde Behandlung, welche die Oligonucleotidkette nicht schädigt, entfernt -werden kann.
Viele 2'(31)-0-Acylnucleosid-diphosphate erfüllen diese Bedingungen. Diese Derivate sind leicht und schnell aus gut zugänglichen, handelsüblichen Garbonsäuren herstellbar. Sie sind bei neutralem pH verhältnis_mässig beständig und können durch schwaches Alkali hydrolysiert werden.
Verschiedene 2-' (31 )-0-Acylnucleosid-diphosphate wurden hergestellt und auf ihre Brauchbarkeit für das erfindungsgemässe Verfahren geprüft. Beispielsweise erzielt man mit 21(3')-O-Acylestern von ADP, GDP, UDP, GDP, IDP und XDP, und zwar den Propionyl-, Butyryl-, Valeryl-, Isobutyryl-, Isbvaleryl- und ■ Orthomethoxibenzoylestern sehr gute Ergebnisse. Die Benzoyl- und Phenylacetylester waren zufriedenstellend. Es ist klar, dass auch noch andere 21(31)-O-Acylester von Nucleosid-diphosphaten in Betracht kommen.
Nachstehend wird lediglich beispielsweise die Herstellung eines typischen 2'(3')-0-Acylnucleosid-diphosphats und die Anwendung selcher Derivate für' die schrittweise Herstellung von Oligoribonucleotiden von gewünschter und vorausbestimmter Sequenz beschrieben. Als Ausgangsmaterial kann je nach Wunsch irgendein natürliches Eibooligonucleotid mit beispielsweise 2 bis 4- Einhei ten verwendet werden, an das in aufeinanderfolgenden Additionen die gewünschten Einheiten in der gewünschten Sequenz eingefügt werden.
Synthese eines monofunktionellen Substrats
1o2 mg (ImM) Isovaleriansäure in o,2 ml Dimethylformamid wurden bei 250G mit 162 mg (1 mW) N,N'-Carbonyldiimidazol (K and K Laborcitories Inc.) umgesetzt. Nach 1o Minuten wurden o,4- ml einer o,25 in. wüiiBrigen Lösung von Na^ADP zugegeben und die Inkubation für 3 bin b Stunden fortgesetzt. Nach beendeter Inkubation wurde dins lie?)kr/ion;H':fiiaisch dreimal mit 2 ml Diäthylather extrahiert.
2 U 9 B Ü 1 / 0 7 'i 8
Die wässrige Phasewurde mit ο,5 ml 5o%iger Essigsäure verdünnt und als schmales Band auf ein 5ox5o cm Chromatograph!er-' papier (Schleicher und Schüll Grünband Nr. 589) aufgebracht und während 6 bis 8 Stunden mit n-Butanol / · Essigsäure/ Wasser im Verhältnis 5:2:3 chromatographiert. Das Chromatogramm wurde getrocknet undfonter einer UV-Lampe geprüft. Das 2'(31)-0-Isovaleryl-ADP (R„ = o,48) wurde mit Wasser aus dem Papier eluiert, bis zur Trockene lyophilisiert, dann in 1o ml Wassergelöst und durch eine Säule Dowex 5ox8 H+-Form (Bio-Rad) 1x1o cm durchgeleitet. Die Säule wurde mit 1o ml Wasser gewaschen,und die Ausflüsse wurden vereinigt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 η NaOH auf 6,ο eingestellt. Dann wurde die Lösung durch Gefriertrocknung auf o,o1 bis o,o5 m konzentriert und gefroren gehalten. Die Ausbeute betrug 6o %.
Das 2'(3')-0-Isovaleryl-ADP erhält man auch auf folgendem Wege:
2 μΐ Isovaleriananhydrid wurden zu o,5 nil einer o,2 m Lösung von Na7JlDF in 2 m wässrigem Imidazol zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37'C gerührt. Nach beendeter Inkubation wurde das Gemisch unmittelbar auf Ghromatogaphierpapier gebracht. Die chromatographische Trennung und Aufarbeitung erfolgte wie oben beschrieben. Man erhielt eine Ausbeute von 5o bis 6o %.
2'(31)-0-Isovalerylderivate von GDP, UDP und GDP erhält man ebenfalls mit den beiden beschriebenen Methoden. Die Ausbeuten bei diesen Derivaten liegen zwischen 3o und 5o %.
Beispiel für eine Monoadditionsreaktion, katalysiert durch E.coli-Polynucleotidphosphorylase
Herstellung_von_2^3^)-0-lsovalervl-ApApApA_aus_ApApA und
Das Eeaktionsgemisch (o,1 ml) enthielt 2o mM 2'(3')-0-lsovaleryl-ADP, 2 mM ApApA, 1oo mM Tris-HCl (pH 8,5), 2 mM und 4 Einheiten von gereinigter E.coli-Polynucleotidphospho-
2 ü 9 8 8 Ί / O 7 3 θ
rylase. Nach Inkubation bei 370G folgte auf die Bildung höherer Oligonucleotide eine Papierelektrophorese bei pH 1,9. Als Ergebnis der Reaktion war ApApA vorwiegend in ein neues Oligonucleotid umgewandelt, das wie ApApApA in Papier wanderte und als 2'(31)-0-Isovaleryl-ApApApA identifiziert wurde. Die Isolierung dieses Stoffes erfolgte mittels Papierelektrophorese des Reaktionsgemisches auf Grünband-Ghromatographierpapier Nr. 589 von Schleicher und Schüll während 6ο Minuten bei 5o Vollem und bei pH 1,9· Das Elektrogramm wurde getrocknet und unter . einer UV-Lampe untersucht. Das 2'(31)-0-Isovaleryl-ApApApA wanderte in gleicher Weise wie ApApApA, markiert mit R^vA-pÄ von o,o8. Das Produkt wurde mit 2 ml Wasser aus dem Papier eluiert und durch Gefriertrocknung konzentriert. Die Ausbeute . betrug 7o %. Die 2'(3')-0-Isovaleryl-Blockxerungsgruppe wurde quantitativ entfernt durch eine zweistündige Inkubation in 5o%igem wässrigen Methanol, das mit Ammoniak gesättigt war. In gleicher Weise wurde (Ap)^C, (Ap)-,G und (Ap)7JJ aus (Ap)p und 2'(3')-0-Isovalerylderivaten von CDP, GDP und UDP synthetisiert.
Beispiel für die schrittweise Synthese kurzer Oligoribonucleotide durch drei aufeinanderfolgende Monoadditionen
a) Herstellung; von UpUpUpG
Das Oligonucleotid wurde hergestellt durhh Tl Ribonuclease— ν Digestion^ von PoIy-UG (3:1) und anßchliessende saure Hydrolyse des 3'-endständigen cyclischen Phosphats und darauffolgende Entfernung des 3'-endständigen Phosphats mittels E.coli-alkalischer Phosphatase. Das (Up)nG-Gemisch wurde getrennt in einer DEAE-Zellulosesäule mit einem linearen Gradienten von Triäthylammoniumbicarbonatpuffer (pH 7,6). Von 6ooo A26Q-Einheiten des Polymeren erhielt man eine Ausbeute von 6oo Ap6 -Einheiten des Oligonucleotids.
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b) Herstellung; von UpUpUpGpA
UpUpUpG wurde mit 2' (3' )-0-Isovaleryl-ADP in Gegenwart von Polynucleotidphosphorylase umgesetzt. Die molare Konzentration der Reaktionsteilnehmer und die Inkubationsbedingungen waren die gleichen wie bei der vorstehend beschriebenen Synthese von 2'(3')-0-Isovaleryl-ApApApA. Nach beendeter Inkubation wurde das Reaktionsgemisch 2 Stunden gekocht, gekühlt, mit 5o ml Wasser verdünnt und 3 Stunden mit E.coli-alkalischer Phosphatase (ο,1 Einheiten pro μΜ Nucleosid-diphosphat) inkubiert. Die Lösung wurde mit 15 ml Chloroform/Isoamylalkohol im Verhältnis 24:1 extrahiert, um die alkalische Phosphatase zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde lyophilisiert, und der Rückstand wurde in 5 ml einer 5o%igen, mit Ammoniak gesättigten wässrigen Methanollösung gelöst. Nach 2 Stunden bei 250C wurde die Lösung im Vakuum bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand wurde in I00 ml o,oo5 m Triäthylammoniumbicarbonat (pH 7,6) gelöst und auf eine DEAE-Ce^lulosesäule (o,73 meq/g) 1x3o cm aufgegeben und eluiert mit einem linearen Gradienten von Triäthylammoniumbicarbonat (pH 7?6) bestehend aus je 1 1 von o,oo5 m und o,5 m Lösung. Das UpUpUpGpA wurde bei einer Pufferkonzentration zwischen o,21 und o,24 m eluiert. Aus 7,5 μΜ UpUpUpG erhielt man 2 μΜ UpUpUpGpA. Die entstandene UpUpUpGpA-Losung wurde wiederholt lyophilisiert und in Wasser gelöst, um den flüchtigen Puffer zu entfernen.
c) Herstellung von UpUpUpGApA
(Up)νGpA wurde in gegenwart von Polynucleotidphosphorylase mit 2'(31)-0-Isovaleryl-ADP umgesetzt, ebenso wie bei der Synthese von UpUpUpGpA. Das (Up)^GpApA wurde aus der DEAE-Cellulosesäule bei Pufferkonzentrationen zwischen o,28 und o,3o m eluiert. Aus 1 μΜ (Up),,GpA erhielt man 0,6 μΜ (Up)^GpApA.
d) Herstellung von (Up)7GpApApG
0,6 μΜ (Up) GpApA wurden mit 12 μΜ 2'(3')-0-Isovaleryl (G14) GDP in Gegenwart von Polynucleotidphosphorylase umgesetzt, wie bei der Synthese von UpUpUpGpA beschrieben. Nach einer Inkubation von 3o Minuten bei 370G wurde das Reaktionsgemisch wie in den Abschnitten a) und b) beschrieben behandelt mit der
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Abweichung, dass die Trennung durch Elektrophorese auf DEAE-Papier mittels 7%iger Ameisensäure während 8 Stunden "bei 3o Volt/cm erfolgte. Unter diesen Bedingungen wanderte das UpUpUpGpApApG 8 cm. Es wurde aus dem Elektrogramm mit 2 m Triäthylammoniumbicarbonatpuffer (pH 9,5) eluiert und durch wiederholte Coevaporation mit Wasser entsalzt. Aus o,6 μΜ UpUpUpGpApA erhielt man o,25 μΜ UpUpUpGpApAp(J.
Schrittweise Synthese von Oligoribonucleotiden unter Verwendung unlöslicher Derivate der PolynucleotidphosphorJase
Die oben beschriebene Methode für die schrittweise Synthese von Oligoribonucleotiden von vorbestimmter Grundsequenz kann modifiziert werden, so dass man wasserunlösliche Polynucleotidphosphorylase anstelle des löslichen Enzyms verwenden kann.
Die wasserunlöslichen Derivate der Polynucleotidphosphorylase erhält man durch chemische Fixierung des Enzyms an cyanhalogenid-aktivierte Polysaccharidträger (Eur.J.Biochem. 18, 351 (1971)).
Im folgenden wird beispielsweise nur die Herstellung eines wasserunlöslichen Polynucleotidphosphorylasederivats und seine Verwendung für die Addition einer einzelnen Nucleotid-Monophosphat-Einheit an eine bereits bestehende Nucleotidkette beschrieben.
Chemische Bindung von Nucleotidphosphorylase an Sepharose 4B Sepharose 4B (Pharmacia) wurde als Aufschlämmung auf einem gesinterten Büchner-Trichter mittels Durchsaugen von Wasser gewaschen und dann in 5 ml Wasser suspendiert. Mit 5 η NaOH wurde die Suspension auf pH 12 eingestellt. 0,5 g kristallines BrCN wurde in einem Mörser zerstossen und in 2 ml Wasser suspendiert. Die Bromcyanidsuspension wurde zur Sepharose-Suspension gegeben, und das Gemisch wurde kräftig gerührt. Der pH-Wert wurde durch tropfenweise -Zugabe von 5n NaOH auf gehaltieii. Wach 1o Minuten wurde die Suspension auf einen Büchner-Trichter mit einem Glasfrittenboden gebracht und mit 1oo mJ Wfjünop und dann mit 1oo ml o,1 m Natriumbicarbonat-
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-βίο sung, deren pH-Wert mit 5 η HCl auf 7>6 eingestellt war, gewaschen. Die Aufschlämmung (o,7 g) wurde suspendiert in 2 ml einer gereinigten Lösung von E.coli-Phosphorylase (Kimhi und Littauer, J.Biol.Chem. 243, 231 (1968))1,' die vorher gegen o,1 m Natriumbicarbonatpuffer (pH 7,6) dialysiert worden war (25o Phosphorolyseeinheiten, 52 Einheiten/mg Protein). Die Suspension wurde 16 Stunden bei 40C gerührt, dann auf einen Büchner-Trichter mit Glasfrittenboden gebracht und mit loo ml o,o2 m Tris-Puffer (pH 8,0) gewaschen. Nach erneuter Suspendierung in 1o ml des gleichen Puffers wurde in eine Pasteur-Pipette als 6xo,3-Säule eingebracht.
Synthese von 2'(3')-Q-Isovaleryl-(Ap)7G aus ApApA
2'(3')-0-Isovalerjl-GDP_unter_Verwendung_einer Säule aus unlösliche^Polvnucleotidghosghor^lase
Aus 2 mM ApApA, 2o mM Isovaleryl-GDP, 2 mM MnCl2 und 2oo mM Tris-HGl-Puffer (pH $,5) wurden 5>o ml Reaktionsgemisch zusammengestellt und auf 0«C gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein enges Rohr auf die oben beschriebene Polynucleotidphosphorylase-Säule gebracht. Die durch die Säule laufende Flüssigkeit wurde in einem eisgekühlten Reagensglas aufgefangen. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug o,1 ml/min. Nach Durchfluss des Reaktionsgemisches wurde die Säule mit 2 ml o,o2 m TriS-HCl-Puffer (pH 8,0) gewaschen und die Waschflüssigkeit mit der vorher aufgefangenen Flüssigkeit vereinigt. Die Produktlösung war dann aus der Säule entfernt, und letztere wurde unter o,o2 m Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend o,o2 % NaN^, gesetzt. Bei Aufbewahrung bei 40C kann die Säule für zahlreiche weitere Synthesen während vieler Monate wiederverwendet werden.
Die Produktlösung wurde duida Papierelektrophorese bei pH 1,9 analysiert. Unter den beschriebenen Bedingungen war ApApA quantitativ in 2'(31)-0-Isovaleryl-ApApApG übergeführt worden.
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Claims (6)

Pat ent ansprüche
1) Verfahren zur Herstellung von Oligoribonucleotiden von definierter und vorausbestimmter Seuuenz, enthaltend die natürliche 3', 5'-Internucleotidfeindung,
dadurch gekennzeichnet, dass man ein Oligonucleotid mit einen monofunktionellen Substrat in Form eines blockierten Eibonucleosid-diphosphats in Gegenwart einer Polynucleotidphpshorylase zu einem Produkt, dessen Kette um eine Monomereneinheit länger ist als das Ausgangsoligenucleotid, umsetzt, dieses Produkt aus dem fieaktionsgemisch isoliert, die Blockierungsgruppe entfernt und - sofern ein weiterer Aufbau gewünscht ist dieses Verfahren so oft wiederholt, bis durch schrittweises Anfügen je einer Monomereneinheit die verlangte Kettenlänge erreicht ist.
2) Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von Polynucleotidphosphorylase in wasserlöslicher Form.
3) Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von Polynucleotidphosphorylase in trägergebundener, wasserunlöslicher Form.
4) Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass als monofunktioneles Substrat 2'(3')-0-Acylnucleosid-diphosphat verwendet wird.
5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als 2'(3')-0-Acylnucleosid-diphosphat ein 2'(3')-O-Acylester von ADP, GDP, UDP, ODP, IDP oder XDP verwendet wird.
6) Verfahren nach Anspruch 1-5» dadurch gekennzeichnet, dass die Blockierungsgruppe am Eibonucleosid-diphosphat eine Propionyl-, Butyryl-, Valeryl-, Isobutyryl-, Isovaleryl- oder Methoxibenzoylgruppe ist.
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