DE1815332B2 - Verfahren zur Bindung von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden oder Derivaten derselben an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Hydroxyl- oder primären oder sekundären Aminogruppen - Google Patents

Verfahren zur Bindung von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden oder Derivaten derselben an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Hydroxyl- oder primären oder sekundären Aminogruppen

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Description

Vorliegende Erfindung betrifft den in den Patentan-Sprüchen definierten Gegenstand.
Proteine, Polypeptide, Peptide oder Derivate derselben mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -YH, wobei -YH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe ist, deren Bindung an Polymere von 4> speziellem Interesse ist, sind beispielsweise Enzyme, Antikörper, Protein- und/oder Peptid-Hormone, Antigen-Proteine, Allergene sowie Haptene. Ein wichtiges Beispiel sind die Antikörper, die zur analytischen Bestimmung auf diese Weise an Polymere gebunden « werden können.
Beispiele für Polymere mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -XH, wobei -XH eine Hydroxyl- oder eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, sind Polysaccharide wie Dextran, Cellulose, Stärke, Dextrin und Agar-Agar, Copolymere von Dextran mit Epichlorhydrin oder Derivate dieser Verbindungen wie Hydroxyäthylcellulose und 2-Hydroxy-3-(4-amino-phenoxy)-propyl-substituierte Copolymere von Dextran mit Epichlorhydrin. Auch Polyamino- to styrol ist ein geeignetes Polymer.
Zur Herstellung eines reaktionsfähigen Derivats eines derartigen Polymeren bislang bekannte Verbindungen waren Mittel zur Einführung von Azidgruppen, Isocyanatgruppen und Diazoniumgruppen. Die Herstellung derartiger reaktionsfähiger Derivate war häufig kompliziert und die Ergebnisse nur schwer reproduzierbar. Es war ferner bekannt, reaktionsfähige Gruppen in ein Polymeres einzuführen, das eine oder mehrere Gruppen der Formel -XH aufweist, und zwar durch Behandeln des Polymers mit Bromcyan. Diese Verbindung ist jedoch sehr toxisch und daher zum Arbeiten in technischem Maßstab ungeeignet. Während Bromcyan ein reaktionsfähiges Derivat ergibt, das unter verschiedenen Gesichtspunkten außerordentlich gute Eigenschaften zeigt, besteht ein gravierender Nachteil dieser Verbindung darin, daß die Reaktionsfähigkeit des so erhaltenen Derivates kaum variiert bzw. dem jeweiligen Fall angepaßt werden kann. Demgegenüber wird erfindungsgemäß zur Bildung des reaktionsfähigen Derivats des Polymeren eine Verbindung eingesetzt, die eine oder mehrere Cyanatgruppen aufweist
Aus Annual Review of Biochemistry, Bd. 35, S. 873 ff. (1966) ist bekannt, verschiedene arninogruppenhaltige Enzyme durch kovalente Bindungen an polymere Träger zu kuppeln, welche durch Einführung von Azid-, Bromacetyl- oder Diazoniumgruppen aktiviert wurden.
Die Verwendung von Cyanatverbindungen als »Bindungsvermittler« zwischen z. B. Enzymen oder Antikörpern mit einer oder mehreren primären oder sekundären Aminogruppen einerseits und andererseits polymeren Trägern, wie z. B. einem Polysaccharid, wurde jedoch durch den Stand der Technik nicht nahegelegt, und es ist als im hohen Maße überraschend anzusehen, daß z. B. Enzyme und Antikörper nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise Antikörper — auch sehr empfindliche — unter Verwendung dieser speziellen Bindungsvermittler an polymere Träger unter sehr schonenden Bedingungen gebunden werden können, ohne daß hierbei deren Fähigkeit, ihr Antigen zu binden, verlorengeht.
Ein beträchtlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darüber hinaus in der Möglichkeit, dieses an die jeweiligen speziellen zu bindenden organischen Verbindungen, wie z. B. Proteine, hinsichtlich Reaktivität und Reaktionsgeschwindigkeit anzupassen, indem man eine unter dem jeweiligen dominierenden Gesichtspunkt optimale Cyanatverbindung auswählt, was mit keinem der bislang bekannten Bindungsvermittler möglich war.
Bevorzugte, eine oder mehrere Cyanatgruppen aufweisende, als Bindungsvermittler verwendbare Verbindungen besitzen die allgemeine Formel
R(OCN)1
in der R beispielsweise eine Halogenalkylgruppe, eine substituierte aromatische Gruppe, ein heterocyclisches Ringsystem oder eine cycloaliphatische Gruppe und χ die Zahl 1 oder 2 bedeuten. Substituenten der aromatischen Gruppe sind beispielsweise Nitrogruppen, Halogen, wie z. B. Chlor, Alkylreste, wie z. B. der Methyl- oder tert.-Butylrest, und Alkoxygruppen, wie z. B. die Methoxygruppe.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Verbindungen mit mindestens einer Cyanatgruppe können sehr verschiedener Natur sein. Es kann sich beispielsweise um substituierte oder unsubstituierte organische Verbindungen, wie z. B. substituierte oder unsubstituierte aliphatische, alicyclisch-aromatische oder heterocyclische Cyanatverbindungen handeln, oder um an anorganische Cyanate, wie z. B. Natriumoder Kaliumcyanat. Als Beispiele für derartige Verbindungen seien genannt.
/J./J./J-Trichloräthylcyanat,
1-Adamantylcyanat, Phenylcyanat,
o-Nitrophenylcyanat, p-Nitrophenylcyanat,
m-ChlorphenylcyanaUp-Methoxyphenylcyanat,
o-terL-Qutyiphenylcyanat,
22- Dimethylpheny Icyana t,
2,4,6-Tri-tert-butylphenylcyanat,
2-Naphthylcyanat und j
1,4- DicyanatobenzoL
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus zwei Stufen. In der ersten Stufe wird das reaktionsfähige Derivat des Polymeren hergestellt, indem man das eine oder mehrere Gruppen der Formel -XH enthaltende ic Polymere mit dem betreffenden Cyanat in Berührung bringt Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in wäßriger Lösung oder Suspension, wobei sowohl saure wie auch basische Bedingungen möglich sind. Die pH-Werte liegen jedoch im allgemeinen zwischen 7 und 13. Die t5 Reaktion kann ferner in von Wasser verschiedenen Lösungsmitteln, beispielsweise mit Walser mischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton oder Dioxan, erfolgen. Zur Einstellung des zweckmäßigen pH-Werts oder pH-Bereichs geeignete Verbindungen sind Natriumhydroxyd, Calciumhydroxyd, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat und Triäthylamin. Der geeignete pH-Wert oder pH-Bereich, der unter anderem von der Reaktionstemperatur und -zeit abhängt, kann leicht ermittelt werden. Die Umsetzung kann bei verschiedenen Temperaturen, beispielsweise 0 bis 50° C, durchgeführt werden, und die Reaktionszeit kann in einem breiten Bereich schwanken und beispielsweise bis zu mehreren Stunden betragen. Das reaktionsfähige Derivat des Polymeren wird vor der Bindung an die organische Verbindung, wie z. B. das Protein, zweckmäßigerweise gereinigt, beispielsweise durch Waschen mit geeigneten Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser oder Aceton.
In der zweiten Verfahrensstufe, d. h. bei der Bindung des reaktionsfähigen Derivats des Polymeren an die organische Verbindung, wie z. B. das Protein, die eine oder mehrere Gruppen der Formel — YH aufweist, wird in einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung bei einer Temperatur von im allgemeinen 0 bis 50°C, bcispiels- 4(1 weise bei Raumtemperatur, gearbeitet.
Ein wesentlicher Vorteil bei der Verwendung von Cyanatverbindungen als Mittel zur Einführung der reaktionsfähigen Gruppen in das Polymere besteht darin, daß man auch sehr empfindliche organische Verbindungen, wie z. B. Proteine, an Polymere binden kann, ohne daß erstere einer nicht erwünschten Veränderung unterliegen. Durch Umsetzung des die Gruppen der Formel -XH enthaltenden Polymeren mit verschiedenen Cyanatverbindungen erhält man sehr 5c reaktionsfähige Zwischenprodukte, die schematisch wie folgt dargestellt werden können:
P-X-CO R1
NH
55
worin X die weiter oben genannte Bedeutung besitzt, Ri den Rest des Cyanats und P uas Polymere darstellen. Diese Zwischenprodukte reagieren leicht unter milden bo Reaktionsbedingungen mit einer Aminogruppe der betreffenden organischen Verbindung, wie z. B. des Proteins. Beispielsweise kann man einen Antikörper auf diese Weise an das Polymere binden, ohne daß die Fähigkeit des Antikörpers zur Bindung seines Antigens verlorengeht.
Ein Beispiel für ein in Wasser unlösliches Polymeres ist ein Copolymeres aus Dextran und Epichlorhydrin (»Sephadex«). Dieses Polymer zeichnet sich durch verschiedene Wasseraufnahme und variierende Teilchengrößen aus. Zur Bindung beispielsweise von Antikörpern an das Dextran-Copolymere kann man eine aus kleinen Körnchen, vorzugsweise von 1 —10 μπι bestehende Form derselben verwenden.
Aus nachstehendem Beispiel ist ersichtlich, daß die Art des Substituenten in der organischen Cyanatverbindung variiert werden kann. Der Substituent kann fähig sein. Elektronen abzugeben oder aufzunehmen, ferner kann er eine gewisse sterische Hinderung verursachen; die Stellung des Substituenten zur Cyanatgruppe ist nicht wesentlich. Die Aktivierung des Polymeren kann bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen erfolgen, wobei für jede einzelne Cyanatverbindung die besten Bedingungen leicht feststellbar sind.
Beispiel 1
A) Die Herstellung des
reaktionsfähigen Derivats des Polymeren
Allgemeines Verfahren
1 g des Polymeren (z. B. vernetztes Dextran, Agar-gel von Agar-Agar, Cellulose) wird in 40 ml destilliertem Wasser 3 Minuten lang gerührt, dann werden 2 g der mindestens eine Cyanatgruppe aufweisenden Verbindung zugesetzt. Der pH-Wert wird auf 10,7 eingestellt und durch automatische Zugabe einer wäßrigen 2molaren Lösung von Natriumhydroxid auf diesem Wert gehalten. Die Reaktion wird 6 Minuten lang forlgesetzt, dann wird das Reaktionsprodukt abfiltriert und sorgfältig mit Wasser, Aceton und Wasser und schließlich Aceton gewaschen und getrocknet.
Die Herstellung des reaktionsfähigen Derivats kann auch bei anderen pH-Werten und unter Verwendung anderer Reaktionszeiten (Tabelle 5) erfolgen.
B) Bindung von organischen Verbindungen,
die eine oder mehrere Gruppen der Formel — YH
enthalten, an das
reaktionsfähige Derivat des Polymeren
I.Bindung von Insulin-Antikörpern an Teilchen
aus vernetztem Dextran, Agar-Agar und Cellulose
100 mg des reaktionsfähigen Derivats werden in 400 μΙ eines Natriumcarbonat-Natriumcarbonat-Puffers (pH-Wert 9,2) 10 Minuten lang gequollen. 100 μΙ der Lösung des Antikörpers in der gleichen Pufferlösung werden dem reaktionsfähigen Derivat zugegeben, dann wird bei +4°C 2 bis 3 Tage lang geschüttelt. Danach gibt man wenige ml einer 0,1 molaren Natriumbicarbonatlösung zu, worauf zentrifugiert und die klare Lösung abgesaugt wird. Der feste Rückstand wird mit 0,1 molarer Natriumbicarbonatlösung, 0,5molarem Essigsäurepuffer (pH-Wert 4,5) und schließlich mit dem Puffer, der später für die auszuführende Analyse der 125g-lnsulin-Adsorbtion verwendet wird (vgl. Tabelle 1 —4), gewaschen.
2. Bindung von Glycylleucin und
Glycyltyrosin an das reaktionsfähige Derivat
von vernetztem Dextran
0,20 g des reaktionsfähigen Derivats von vernetztem Dextran und 0,08 g Glycylleucin oder Glycyltyrosin werden in 1 ml einer Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 9,2) 2 Tage lang bei 4°C gerührt. Das Produkt wird abfiltriert und mit 0,5molarer
5 Phenylcyanat
Natriumbicarbonatlösung und 0,01 molarer Salzsaure Tabelle
und und 1 molarem NaCI und schließlich mit Wasser
gewaschen. Das gewaschene Produkt wird mit Aceton Cyanat geschrumpft und getrocknet.
Analyse:
1) Die an das vernetzte Dextran gebundene Menge Glycylleucin beträgt 13%.
2) Die an das vernetzte Dextran gebundene Menge Glycyltyrosin beträgt 12%.
3) In den folgenden Tabelle werden die Eigenschaften verschiedener Arten von vernetzten! Dextran, die durch verschiedene organische Cyanate aktiviert sind, miteinander verglichen.
Die Ergebnisse der jeweiligen Tabellen sind nicht untereinander vergleichbar. Unter cpm wird die Anzahl von Ausschlägen pro Minute angegeben, die mit 125 J-Insulin, absorbiert durch 0,1 mg eines Komplexes zwischen Antikörpern und aktiviertem vernetzten Dextran, erhalten wird.
Tabelle 1
Polymer
cpm
im Handel erhältliches,
mit Epichlorhydrin
vernetztes Dextran 9200
(Handelprodukt
Sephadex«)
Cellulose 9000
Agar-Agar
(Handelsprodukt
Sepharos®)
9100
15 Tabelle
Cyanat Polymer
cpm
Natriumcyanat
Polyvinylalkohol
vernetztes Dextran 1000
(vgl. Tab. 6)
dito 700
Cyanat
cpm
Phenylcyanat
p-Nitrophenylcyanat
o- N i trophenylcyanat
m-Chlorphenylcyanat
Tabelle 2
9200 9300 4600 1400
25
30
Cyanat
cpm
3. Bindung von Insulin-Antikörpern an Teilchen aus vernetztem Dextran
Es wurde nach obigem Verfahren, B) Kap. 1, gearbeitet, jedoch mit folgenden Abweichungen:
Die Lösung des Antikörpers wurde dem reaktionsfähigen Derivat zugesetzt und bei +23°C 1,2,4,6 bzw. 24 Stunden lang geschüttelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.
Tabelle
Phenylcyanat
p-Methoxyphenylcyanat
2,4-Dichlorphenylcyanat
2-tert.-Butylphenylcyanat
1 -Adamantylcyanat
2,6-Dimethylphenylcyanat
Tabelle 3
2600 2240
540 2040
5S0 1100
Cyanat
cpm
jS.jS./S-Trichloräthylcyanat
2,4,6-Tri-tert.-butyIphenylcyanat
Tabelle 4
34 18
Cyanat
cpm
1-Naphthylcyanat
1,4-Phenylendicyanat
Phenylcyanat
Tabelle 5
1200
600
1250
Cyanat
pH
Aktivisrungszeit
Min.
cpm
Phenylcyanat 10,7 1,5 112 000
Phenylcyanat 10,7 6 93 000
Phenylcyanat 8 6 44 000
Phenylcyanat 7 6 4 000
Phenylcyanat 4 6 7 000
45
50
55
60
65
Cyanat
Reaktionszeit
cpm
Phenybyanat
Phenylcyanat
Phenylcyanat
Phenylcyanat
Phenylcyanat
1
2
4
6
24
4500 4700 4800 4800 4800
Mit Ausnahme von 1-Adamantyicyanat und o-Nitrophenylcyanat waren alle getesteten Cyanat-Verbiiidung aus der Literatur bekannt (vgl. Angew. Chem., Bd. 79, S. 219 [1967]). Das 1-Adamantylcyanat wurde nach einem an sich bekannten Verfahren wie folgt hergestellt (vgl. J. Am. Chem. Soc, Bd. 86, S. 4732, [1964]), ebenso das o-Nitrophenylcyanat (vgl. Chem. Ber. Bd. 97, S. 1018 [1964]).
1 -Adamantylcyanat
Eine 50%ige Suspension von 5 g Natriumhydrid in Öl wurde zweimal mit trockenem Benzol gewaschen, das dann abdekantiert wurde. Das Natriumhydrid wurde sodann in 75 ml trockenem Benzol dispergiert, danach wurden 15,3 g 1-Adamantanol zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rühren 4 Stunden unter Rückfluß erwärmt, dann wurde auf Raumtemperatur abgekühlt.
Sodann wurden 10,5 g Bromcyan, in 25 ml trockenem Benzol gelöst, im Verlauf von etwa 15 Minuten zugetropft. Nach weiterem lOminütigem Rühren wurde der Niederschlag abfiltriert und mit trockenem Benzol gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft. 10 g des Rückstands wurden in 25 ml siedendem Benzol gelöst, und die Lösung wurde über Nacht bei — 200C stehengelassen.
Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde als Aktivierungsmittel verwendet.
o-Nitrophenylcyanat
13,9 g o-Nitrophenol und 11,1 g Bromcyan wurden in ml Aceton gelöst. Dann wurden 10,1 g Triethylamin unter Eiskühlung mit solcher Geschwindigkeit zugetropft, daß die Temperatur nicht über 10°C anstieg. Nach beendeter Zugabe wurde noch 5 Minuten lang gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde in Eiswasser gegossen. Das Produkt wurde abfiltriert und in einem Exsiccator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhielt 14,2 g Produkt (87% Ausbeute). Dieses Rohprodukt wurde als Aktivierungsmittei verwendet.
Beispiel 2
15 Bindung von Antikörpern
gegen Immunglobulin-lgE an ein mit aromatischen
Aminogruppen substituiertes
Polyacrylamidpolymer und an Keratin
(A) Aktivierung des Polymeren
durch Umsetzung mit Phenylcyanat
1) Als Polymeres wurde ein mit p-Aminophenylgruppen substituiertes, vernetztes Polyacrylamid verwendet, dessen Struktur-Hauptmerkmale aus der nachfolgenden Formel ersichtlich sind (Handelsprodukt Enzacryl® der Firma United Kingdom Company, Koch-Light Laboratories, Ltd, CaImbrook, Buckinghamshire)
-CH — CH2-CH — CH2-CONH2
CH2-CH — CH2-CH — CH2-CH — CH2-CONH2 CONH2
NH- CO
CH2
NH-CO
-CH — CH2-CH — CH2-CH — CONH2
CH2-CH — CH2-CH — CH2-CONH2 CONH2
Zur Aktivierung des Polyarylamidpolymeren wurden 50 g desselben in 10 ml destilliertem Wasser 3 Minuten bewegt, wonach 100 mg Phenylcyanat zugegeben wurden. Die Aktivierung wurde bei einem pH-Wort von 10,7 durch automatische Zugabe eine: wäßrigen 2-m Natronlauge während 6 Minuten bei Raumtemperatur bewirkt. Das aktivierte Gel wurde auf einem Glasfilter unter Absaugen zuerst mit Wasser, dann mit Aceton und abermals mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde in Aceton geschrumpft und im Vakuum bei 20'C getrocknet.
2) In 40 ml destilliertem Wasser wurde 1 g entfettete Schafwolle (Keratin) während 3 Minuten bewegt, wonach 1 g Phenylcyanat zugegeben wurde. Der pH-Wert wurde auf 10,7 eingestellt und durch automatische Zugabe einer wäßrigen 2-m Natronlauge bei diesem Wert gehalten. Die Umsetzung wurde 6 Minuten fortschreiten gelassen, wonach das Reaktionsprodukt abfiltriert und sorgfältig mit Wasser und Aceton gewaschen, sodann mit Aceton geschrumpft und im Vakuum bei 200C getrocknet wurde.
(B) Bindung von Antikörpern
gegen Immunglobulin-lgE (Anti-IgE) an den
polymeren Träger
1) 25 mg des aktivierten Polyacrylamidpolymeren in 4 ml einer 0,1 -m Natriumbicarbonatlösung wurde mit 50 μΐ einer Lösung von Anti-IgE, welche 10 mg pro ml enthielt, versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Teilchen wurden
zunächst zweimal während 30 Minuten mit einer 0,5-m Natriumbicarbonatlösung gewaschen und sodann 3 Stunden mit 0,5-m Ethanolamin in 0,1 molarer Natriumbicarbonatlösung umgesetzt.
Die Teilchen wurden zweimal mit 0,5-m NaHCO3-Lösung, sodann 2 Minuten mit einer 0,1 -m Natriumacetatlösung und sodann 30 Minuten mit einer 0,1 -m Natriumacetatlösung gewaschen. Die Teilchen wurden in einem Puffer suspendiert, welcher 0,05-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 4, 0,9% NaCl, 0,3% Humanserumalbumin, 0,05% des Handelsproduktes Tween 20 und 0,01 % NaN3 (als Inkubationspuffer) enthielt.
0,5 ml der zuvor beschriebenen Suspension mit einem Gehalt an 0,5 mg Teilchen pro ml wurden mit 50 ml einer IgE-Lösung mit einem Gehalt an 400 Einheiten (British Research Standard 68/341) IgE pro ml vermischt und 3 Stunden bewegt Die Probe wurde mit dem Inkubationspuffer gewasehen, und eine Lösung von 100 μΐ von 125 J Anti-IgE mit einem Gehalt an 3 ng pro 100 μΐ wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Probe wurde mit 03% NaCl und 0,05% Tween 20 gewaschen; die gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines y-Zählers bestimmt
2) 0,5 g der aktivierten Schafwolle (Keratin) wurden mit 0,1 ml einer Lösung von Anti-IgE mit einem
Gehalt von 10 mg/ml in 40 ml einer 0,1-m Natriumbicarbonatlösung vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Teilchen wurden zunächst zweimal mit eitler 0,5-m Natriumbicarbonatlösung während 30 Minuten gewaschen und sodann mit 0,5-m Ethanolamin in einer 0,1-m Natriumbicarbonatlösung während 3 Stunden umgesetzt. Die Teilchen wurden zweimal mit einer 0,5-m Natriumbicarbonatlösung und sodann mit einer 0,1-m Natriumacetatlösung während 2 Minuten und schließlich mit einer 0,1-m Natriumacetatlösung während 30 Minuten gewaschen. Die Teilchen wurden in einem Puffer suspendiert, welcher 0,05-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 4, 0,9% NaCI% Humanserumalbumin, 0,05% Tween 20 und 0,01 NaN3 (inkubationspuffer) enthielt.
0,5 ml der zuvor beschriebenen Suspension mit einem Gehalt an 1 mg Teilchen pro 100 μΐ wurden mit 50 μΙ einer IgE-Lösung mit einem Gehalt an 400 Einheiten (British. Research Standard 68/341) IgE pro ml vermischit, wonach 3 Stunden bewegt wurde. Die Probe wurde mit dem Inkubationspuffer
gewaschen, wonach eine Lösung von 100μ1 125 J Anti-IgE zugegeben wurde, welche 3 ng pro 100 μΐ enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Probe wurde mit 0,9% NaCI und 0,05% Tween 20 gewaschen; die gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines y-Zählers bestimmt.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Unter »cpm« wird die Anzahl von Ausschlägen pro Minute angegeben, die mit 125 J Anti-IgE erhalten wurde, das immunochemisch an 250 mg des Polyacrylamidkonjugats oder an 1 mg des Keratinkonjugats gebunden war.
Tabelle
Polymeres
Aktivierungsmittel
cpm
Polyacrylamid
(Handelsprodukt
Enzacryl®)
Keratin
Phenylcyanat
Phenylcyanat
31 000
13 000

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bindung von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden oder Derivaten derselben mit einer oder mehreren Gruppen -YH, wobei -YH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -XH, die eine Hydroxylgruppe oder eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, durch kovalente Bindungen, wobei das die Gruppe(n) der Formel -XH enthaltende Polymer mit einer Verbindung umgesetzt wird, die ein reaktionsfähiges Derivat des Polymers zu bilden vermag, worauf das Derivat mit dem Protein, Poypeptid, Peptid bzw. Derivat derselben umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als zur Bildung des reaktionsfähigen Derivates des Polymers befähigte Verbindung eine Verbindung mit einer oder mehreren Cyanatgruppen verwendet, wobei die Umsetzung in Lösung mit Wasser oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel oder wäßriger Suspension durchgeführt wird, und daß das Umsetzungsprodukt, gegebenenfalls nach Reinigung, mit dem Protein, Polypeptid, Peptid bzw. Derivat derselben in einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung bei einer Temperatur von im allgemeinen 0 bis 500C umgesetzt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn- jo zeichnet, daß man bei der Umsetzung des Polymers mit der Verbindung mit einer oder mehreren Cyanatgruppen in wäßriger Lösung oder in wäßriger Suspension bei einem pH-Wert zwischen 7 und 13 arbeitet. r>
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