DE1925230B2

DE1925230B2 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums streptozotocin

Info

Publication number: DE1925230B2
Application number: DE19691925230
Authority: DE
Inventors: Edward James Kalamazoo Mich. Hessler (V.St.A.)
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1968-05-23
Filing date: 1969-05-17
Publication date: 1978-01-12
Also published as: DE1925230C3; DE1925230A1; US3577406A; CH518278A; NL6907323A; FR2068449A1; FR2068449B1; GB1191808A; NL152862B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung >o des Antibiotikums Streptozotocin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (1.) D-Glucosamin bei etwa -5 bis etwa 25°C mit N-Methylisocyanat zu N-(Methyicarbamoyl)-D-glucosamin umsetzt und (2.) das erhaltene N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin mit einer wäßrigen Lösung von salpetriger Säure nitrosiert.

Streptozotocin ist in der US-PS 30 27 300 beschrieben und stellt in der Veterinärmedizin ein wichtiges Mittel dar, da es gegen Pasteurella niultocida und Salmonella pullorum wirksam ist. jo

Ursprünglich wurde das wichtige Antibiotikum Streptozotocin durch Fermentation unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces achromogenes hergestellt. Das Fermentationsverfahren sowie auch die Isolierung zur Herstellung von Streptozotocin sind in ü den Beispielen 1 bis 4 der US-PS 30 27 300 beschrieben. Anschließend wurde von R. R. H e r r, H. K. J a h η k e und A. D. A r g ο u d e I i s in J. Am. Chem. Soc, Bd. 89 (1967), S. 4808 die Struktur von Streptozotocin sowie auch dessen chemische Totalsynthese beschrieben. Bei dieser chemischen Synthese von Streptozotocin wurde Tetra-O-acetylglucosamin-hydrochlorid mit Methylisocyanat zu einer Verbindung der Formel CIbHj₄NiOi₁I umgesetzt, die einen Schmelzpunkt von 142 bis 144°C sowie [ίφ'->- 18° (cO,9, 95% Äthanol) aufwies. Durch Behandlung dieser Verbindung mit Nitrosylchlorid in Pyridin erhielt man Tetraacetylstreptozotocin, und die Ammonolyse dieser Verbindung ergab Streptozotocin. Dieses bekannte Verfahren war also ziemlich umständlich, und die Gesamtausbeute an Streptozotocin betrug nur 4%. Wegen der geringen Ausbeute an Streptozotocin und der vielen erforderlichen Verfahrensstufen war das bekannte chemische Verfahren im Vergleich zum Fermentationsverfahren zur Herstellung von Streptozotocin wirtschaftlich ungeeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine verbesserte chemische Synthese zur Herstellung von Streptozotocin und stellt augenblicklich das bevorzugte Verfahren zur Streptozotocin-Herstellung dar. Zur Durchführung dieses Verfahrens benötigt man zwei chemische Stufen, und die Streptozotocinausbeute beträgt etwa 55 bis 70%, bezogen auf D-Glucosamin.

Die erste Stufe der Herstellung von Streptozotocin umfaßt die Umsetzung von D-Glucosamin mit N-Methylisocyanat, wobei N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin entsteht. Die zweite Stufe umfaßt die Umsetzung von N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosa;:nin mit einer wäßrigen Lösung von salpetriger Säure zur Herstellung von Streptozotocin. Das Verfahren kann folgendermaßen erläutert werden:

HO

CH,

N-N=O

O=C

NH

OH

HO

(I)

(H) CH₂OH

(111)

Durch Umsetzung von D-Glucosamin der Formel I mit N-Methylisocyanat bei etwa —5°C während 30 Minuten erhält man N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin der Formel II. Die Reaktion kann auch länger als 30 Minuten ausgeführt werden, ohne das gewünschte Produkt zu beeinträchtigen. Durch Verlängerung der bo Reaktionsdauer auf langer als 30 Minuten werden jedoch keine Vorteile erzielt.

Eine vorteilhafte Reaktionstemperatur liegt in den Grenzen von etwa -5 bis etwa 25^CC. Bei einer Reaktionstemperatur unterhalb -7°C kann das Reak- ei tionsgemisch gefrieren, und dadurch wäre die Reaktion weniger wirksam. Mit steigender Reaktionstemperatur von -5 bis +25⁰C nimmt die Reaktionsdauer ab. Um die Beendigung der Reaktion sicherzustellen, sollte die Reaktionsdauer bei +25⁰C wie bei -5°C etwa 30 Minuten betragen.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren kann ein beliebiges D-Glucosaminsalz, z. B. D-Glucosamin-hydrochlorid, verwendet werden. Dieses Salz muß jedoch zuerst in die freie D-Glucosaminbase umgewandelt werden. Man kann diese Umwandlung nach der Methode von R. B r e u e r, Chem. Ber., Bd. 31 (1898), S. 2193 ausführen, oder auch dadurch, daß man eine wäßrige Lösung von D-Glucosamin-hydrochlorid durch ein anionisches Austauscherharz in der Hydroxylform laufen läßt.

Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens

besteht in der Umsetzung von N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin der Formel Il mit einer wäßrigen Lösung von salpetriger Säure zu Streptozotocin der Formel III. Beispielsweise wird diese Stufe ausgeführt, indem man N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin der Formel Il etwa 30 Minuten lang bei -5°C mit Natriumnitrit und verdünnter Schwefelsäure umsetzt, wobei Streptozotocin (III) erhalten wird.

Streptozotocin der Formel III kann aus dem vorstehenden Reaktionsgemisch, in dem die salpetrige 1« Säure in situ gebildet wurde, isoliert werden, indem man zuerst Methanol hinzufügt, um Natriumsulfat auszufällen, das Natriumsulfat durch Filtration entfernt, die zurückbleibende Lösung zu einem trockenen Rückstand konzentriert und dann den trockenen Rückstand mit Methanol behandelt, um Kristalle von Streptozotocin (III) zu bilden.

Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch ausgeführt werden, indem man N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin (II) mit einer wäßrigen Lösung von salpetriger Säure umsetzt, die z. B. hergestellt wurde, indem man in Wasser bei 0°C 10 Minuten lang Distickstofflrioxid einleitet. Diese Nitrosierungsmethode ist insbesondere vorteilhaft für die Ausführung der Reaktion in großtechnischem Maßstab, da die Isolierung von Streptozotocin (III) aus dem Reaktionsgemisch in diesem Fall verhältnismäßig leicht ausgeführt werden kann. Zur Isolierung wird das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und anschließend der trockene Rückstand mit Methanol jo behandelt, um Kristalle von Streptozotocin (III) zu bilden.

Die Reaktionstemperatur und die Rcaklionsdauer der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens können in gleicher Weise wie die Reaktionstemperatur y, und die Reaktionsdauer der ersten Stufe des Verfahrens geändert werden. Die Reaktionstemperatur kann also etwa —5 bis etwa 25⁰C betragen, wobei die Reaktionsdauer mit steigender Reaktionstemperatur geringer wird.

Um die Reaktionsdauer für die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens festzustellen, wurde der folgende Vorversuch durchgeführt: Eine Lösung von 179 mg D-Glucosamin (1,0 mMol) in 0,80 ml Wasser und 0,50 ml Diäthyläther wurde auf -5°C abgekühlt, 60 mg frisch destilliertes N-Methylisocyanat (62A, 1,05 mMol) wurden schnell hinzugefügt, während die Lösung bei — 5°C gerührt wurde. Aliquote Mengen von je 100 λ wurden nach 15, 30 und 45 Minuten entfernt und lyophilisiert. Nach 60 Minuten Reaktionsdauer wurde der Rest des Reaktionsgemisches lyophilisiert. Durch Gaschromatographie der aliquoten Mengen nach üblicher Silylierung (wobei 10 mg der Testprobe, 1,0 ml trockenes Pyridin, 0,2 ml Hexamethyldisilazan und 0,1 ml Trimethylsilylchlorid 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur geschüttelt wurden — vgl. C. C. S w e e 1 e y, R. B e η 11 e y, M. M a k i t a und W. W. W e 11 s, J. Am. Chem. Soc, Bd. 85 (1963), S. 2497 - wurde festgestellt, daß D-Glucosamin nach 30 Minuten vollständig aufgebraucht war und der Umsetzungsgrad zu der w) Verbindung der Formel Il 93% betrug.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Synthese von Streptozotocin (111)

Eine Lösung von 3,58 g D-Glucosamin (20 mMol) in 16,0 ml Wasser und 8,0 ml Diäthyläther wurde auf -5°C abgekühlt. Man gab 1,24 ml frisch destilliertes N-Methylisocyanat (1,20 g 21 mMol) hinzu und rührte das Gemisch 30 Minuten lang bei — 5°C. Dann wurden 1,36 g Natriumnitrit (19,8 mMol) hinzugefügt und das Gemisch so lange gerührt, bis sich das Salz aufgelöst hatte. Diese Lösung wurde tropfenweise mit 9,80 ml, 2,0 η-Schwefelsäure versetzt und etwa 30 Minuten lang bei —5°C gerührt. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wurden 160 ml kaltes Methanol zugegeben, wodurch Natriumsulfat ausgefällt wurde. Das Natriumsulfat wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtrat bei Zimmertemperatur zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit 10 ml Methanol aufgeschlämmt, wobei gelbe Streptozotocinkristalle in einer Menge von 3,565 g (68% bezogen auf D-Glucosamin) erhallen wurden. Das zurückbleibende Filtrat wurde zur Trockene eingedampft und mit 15 ml Äthanol aufgeschlämmt, wobei nochmals 6£0 mg (12,8% bezogen auf D-Glucosamin) gelbe Kristalle von weniger reinem Streptozotocin erhalten wurden.

Für die reine Fraktion der Streptozotocinkristalle wurden die folgenden Eigenschaften ermittelt:

Der Schmelzpunkt ließt sich nicht genau ermitteln; die Kristalle zersetzten sich unter Gasbildung bei etwa 115⁰C, wobei eine klare Lösung bei 125°C entstand.

Elementaranalyse:

C 36,2; H 5,7; N 15,8; 0 42,3%
Empirische Formel:

C₈H₁₅N₃O₇
Molekulargewicht:

265
UV-Spektrum (in Äthanol):

228 nm a = 24

380 nm a = 0,37

394 η m a = 0,48

412 nm a= 0,40
IR-Absorptionsspcktrum (in Mincralölmull):

starke Banden bei

3440-3180, 1718, 1705,1548, 1535,1505,

1497,1483,11 70,1137,1115 - 1083,1065,

1035,1020,985,968,818 und 793 cm '.

Die als Ausgangsmaterial eingesetzte freie Base von D-Glucosamin (I) wurde wie folgt erhalten:

200 g D-Glucosamin-hydrochlorid wurden 20 Stunden lang mit 140 ml Diethylamin und 2 1 absolutem Äthanol aufgeschlämmt. Man isolierte den Feststoff durch Filtrieren und spülte mit 100 ml absolutem Äthanol. Dann gab man den Feststoff zu 1 Liter absolutem Äthanol und 70 ml Diäthylamin und schlämmte nochmals 20 Stunden lang auf. Nach Filtrieren, Waschen und Trocknen wurden 158 g (95%) der reinen D-Glucosaminbase erhalten, die einen negativen Chloridionentest ergab. Das Material wurde bei — 10⁰C aufbewahrt und war während mehrerer Monate beständig.

Beispiel 2
Synthese von Streptozotocin (III)

Eine Lösung von 1,79 g D-Glucosamin (10,0 mMol) in 8,0 ml Wasser und 4,0 ml Diäthyläther wurde auf - 5^GC abgekühlt. Man gab 0,62 ml frisch destilliertes N-Methylisocyanat (0,60 g, 10,5 mMol) hinzu und rührte das Gemisch 30 Minuten lang bei —5°C, um eine Lösung herzustellen, die N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin (II) enthielt.

Lickstofftrioxid wurde 10 Minuten lang in 50 ml :r bei 0⁰C eingeleitet. Man untersuchte 1 ml dieser g auf den Gehalt an salpetriger Säure. Die Lösung Ipetrigen Säure wies etwa einen Gehalt von 18,1 3 mg salpetrige Säure/ml auf.
vorstehend hergestellte Lösung von N-(Methylnoyl)-D-glucosamin (II) wurde tropfenweise im if von 30 Minuten zu 26,1 ml der vorstehend !teilten Lösung der salpetrigen Säure (26,1 χ 18/47 = 10,OmMoI HNO₂) bsi 0°C gegeben. Die erhaltene Lösung wurde weitere 30 Minuten lang bei O⁰C gerührt und dann bei Zimmertemperatur zur Trockene eingedampft. Der Rest wurde mit 15 ml Methanol etwa 2 Stunden lang aufgeschlämmt, wobei gelbe Kristalle von Streptozotocin (III) in einer Menge von 1,46 g (55% bezogen auf D-Glucosamin) erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren die gleichen wie die in Beispiel I aufgeführten.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Slreptozotocin, dadurch gekennzeichnet, daß man (1.) DGlucosamin bei etwa —5 bis etwa 25°C mit N-Methylisocyanat umsetzt und (2.) das erhaltene N-(Methylcarbamoyl)-D-glucosamin min einer wäßrigein Lösung von salpetriger Säure nitrosiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nitrosierung mit einer wäßrigen Lösung von salpetriger Säure durchführt, die durch Einleiten von NiOj in Wasser erhalten wurde.