JPH01503548A - ヘパリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　ヘパリン誘導体 発明の分野 本発明は以下に説明する金属イオン、詳しくは、ヘパリン、硫酸ヘパラン、低分 子ヘパリン、低分子量硫酸ヘパラン、ヘパリン断片、硫酸ヘパラン断片及び前述 した金属イオンに結合するヘパリン又は硫酸ヘパランから誘導したオリゴ糖類の ような画分又はその画分の塩を有する銅イオンの複合体と、前述した金属結合画 分及び金属複合体を得るための方法と、前述した複合体を治療に、利用する用途 に関するものである。適切なアンギオスタティック剤、特にステロイドの存在に おいて生体内での本発明の複合体の血管形成に対する抑制特性が、金属イオンに 結合されなかった画分又は非分画生成物に関して著しく強められたことが予期し ない発見であった。

発明の背景 ヘパリンの化合物又は適切なステロイドと共の六糖類は哺乳類における血管形成 の抑制の原因となること及び哺乳類における腫瘍塊が退縮を来たし転位が妨げら れることが判明している（フオルクマン氏等著、サイエンス、１９８３年、第７ １９頁乃至第７２・５頁）、この結合はネズミの受精プロセスに依存する他の血 管形成を有効に抑制していたことも示している（フォルクマン氏等名義の新血管 疾管の治療にも効果的である。また、乾痕と関節炎において起こる血管形成のた め、この化合物がこれらの疾病の治療に有用になることが期待されている。

血管形成を抑制するこの化合物のステロイド部分に関する一層の研究開発は強力 且つ特殊なステロイド（フルム氏等著、サイエンス、１９８５年、第２３０号第 １３７頁乃至第１３７８頁）を産出し、ヘパリンステロイド組成物のヘパリン成 分に関しては前述のような進展はなかった。合成高硫酸化非凝血性活性六糖類は その高非凝血性活性類似体（３−〇−硫酸化類似体）と同程度のステロイドの存 在において血管形成に抑制作用を有することが最近わかった（チョアイ氏等によ る欧洲特許出願第ＥＰ−０１４０７８１号）、、これはヘパリンとヘパリン断片 の抗凝血性（抗Ｘａ）特性がヘパリン及びヘパリン断片にとってはステロイドの 存在において血管形成に対する抑制的である必要がないという発見を裏書きする （フォルクマン氏等著のサイエンス、１９８３年、第２２１号、第７１９頁乃至 第７２５頁及びフルム氏等著のサイエンス、１９８５年、第２３０号、第１３７ ５頁乃至第１３７８頁）。

ヘパリンはウロン酸とＤ−グルコサミンのグリコシド連鎖高硫酸化共重合体であ る。ウロン酸はＬ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸であり、前者は通常硫酸化 され後者は通常硫酸化されていない。グルコサミンはＮ−硫酸化又はＮ−アセチ ル化のいずれかにされているか、更に６−０−硫酸化されている。少量の他の構 造的変異体もまた発生する。ヘパリンの正確な構造とその作用の抗トロンビン機 構の明確な性質はそれがほぼ５０年間広く使用されてきたにもかかわらず説明さ れなかった。ヘパリンは所定連鎖の中で多数の構造的変異体を備え、分子量範囲 が３０００乃至３００００の多分散系である。

ヘパリンの正確な組成物はその源泉により変化し、その源泉は通常豚の腸粘膜、 牛の肺臓、牛の腸粘膜又は羊の腸粘膜であり、更にそれらの源泉の調製と精製法 によっても変化する。低分子量ヘパリン（分子量範囲２０００乃至１００００） を標準ヘパリンの分画により少量に分離した。分子量範囲５００乃至１００００ のヘパリン断片を化学方法または酵素方法によるヘパリンの部分解重合により調 製した。科学的解重合を多数の異った方法、しばしば低ｐＨの亜硝酸によるか、 ウロン酸を通常エステル化した後、アルカリβ除却によるか、過酸化物又は過ヨ ウソ酸塩を通常用いる酸化法によっている。亜硝酸を用いる解重合後、ヘパリン 断片の縮小端において新しく形成された無水マンノースと、このような断片から 誘導されたオリゴ糖類を生成物の安定度増大のため通常無水マンニトールに還元 するか又は酸化して無水マノニン酸にする。酵素解重合とアルカリβ−除却はヘ パリン断片の非縮小端における同一４，５不飽和と、これらの断片から誘導され たオリゴ糖類になる。安定度の増大には、前述不飽和基をその後、標準手順たと えば接触水素添加により還元できるか、あるいは全４，５不飽和単糖類を例えば 緩酸処理によるか、又は金属含有試薬例えば水銀塩を塗布することにより除却で きる。後者の場合、ヘパリン断片、ヘパラン硫酸断片および不同数のサツカリド 成分を含む上記の断片から誘導されたオリゴ糖類が得られる。ヘパラン硫酸はＮ −硫酸化グルコサミンも含むヘパリンのそれ以外の唯一のグリコサミノグリカン である。

しかし大抵のヘパラン硫酸はＮ−硫酸化グルコサミンよりも大量のＮ−アセチル 化グルコサミンを含み、ヘパリンの場合は逆である。

ヘパリンに用いられる分画と解重合の同一方法もまたヘパラン硫酸に適応できる 。ヘパラン硫酸に用いられる酵素は通常ヘパリンに最も一般に使用されるヘパリ ン結合の代りのへバルテイテイナーゼ（ヘバラナーゼ）である。少量のヘパラン 硫酸は通常標準ヘパリンに見出される。ヘパラン硫酸もまた、牛の肺臓を特に形 成するヘパリン副生物の大部分から成っている。

ヘパリンそれ自体（ステロイドなしに）は、体内での腫瘍誘導因子により誘導さ れた血管形成の強さを増大させるが、腫瘍細胞、腫瘍抽出物または腫瘍誘導因子 の不在においては、ヘパリンを放出するヘパリンまたはマスト細胞のいずれも血 管形成を誘発することはない（ティラー及びフオルクマン著によるネーチャー、 １９８２年、第２９７号、第３０７頁乃至第３１２頁）。

通常細胞及び組織からのいくらかの血管生成因子、たとえばいわゆるヘパリン結 合成長因子もまた血管生成を誘発し、毛細管内皮細胞の増殖を刺激することがで きる。

いくつかの成長因子を用いて、毛細管内細胞増殖のこの刺激をヘパリンにより増 強する。

ヘパリンはその高陰電荷によって腸イオンに対する強親和力を有し、その場合、 ｐＨ依存性が通常観察されているので結合は大体においてイオンを含むものであ る。　゛臨床的に用いられる標準ヘパリンはヘパリン酸のナトリウム塩又はカル シウム塩のいずれかである。カルシウムヘパリンは通常的ｌ１ｗ／ｗ％のカルシ ウム含量を有し、これは約２．　８　ｕｍｏ　ｉ　ｅ　Ｃａ”’／ｍｇのヘパリ ンに相当する。銅イオン（Ｃｕ”つにとってヘパリンへの結合はｐＨ依存になる ように示され、典型的ヘパリン（分子量１３１００、抗凝血活量１４６　Ｉ　Ｕ ／ｍ　ｇ）にとって銅結合は中性ｐＨで０，６０６μｍｏｌｅ　Ｃｕ”／ｍｇの ヘパリンであった（ステイバラ氏著によるアメリカ連邦学会、連邦会報、生物実 験、１９７７年第３６号、第８３頁乃至第８８頁）。従って、銅イオンのヘパリ ンへの結合は中性ｐＨでのカルシウムイオンよりもすくなく、銅イオンに対して はカルシウムイオンのそれの結合の約２０％であった。ヘパリンの２０μｇ当り の銅の１μｇを含むヘパリン（これは０，７８７ＩＬｍｏｌｅ　Ｃａ″′″／ｍ ｇのヘパリン又は約１０μｍｏ　１　ｅ　Ｃａ”／μｍｏｌｅのヘパリンに相当 する）が体内での血管形成なかった（ジー　アレサントリ、ケー　ラジュ及びビ ーエム　グリノ氏著による［微小循環、内被及びリンパ組織Ｊ　１９８４年、第 １号、第３２９頁乃至第３４６頁）。

リガンド交換クロマトグラフィーとも固定化金属イオン吸着クロマトグラフィー とも称する金属キレート親和性クロマトグラフィーを種々の金属イオンたとえば 、Ｃｕ”、Ｚｎ”、Ｎ　ｉ　２　”、Ｃ０２゛、Ｍ　ｎ　”　”、（：ｔ　ａ” 、Ｆ　ｅ”−１及びＦｅ３″を固体マトリックス、たとえば陽イオン交換樹脂又 は特殊金属イオンキレート化剤たとえばキレ−ティングセファローズ　６Ｂフア ーマシヤ　アンドチニレックス（商標）、１００バイオ−ラッドを結合（キレー ト）することによって実施し、その後複合混合物の分画により遂行する。

発明の説明 本発明によって、一定の金属イオン、特にヘパリン、硫酸ヘパラン、低分子量ヘ パリン、低分子量硫酸ヘパラン、ヘパリン断片、硫酸ヘパラン断片及びヘパリン 又は硫酸ヘパランから誘導したオリゴ糖類のような画分を有するか又はその画分 が特に金属イオンに結合する画分の塩を有する銅イオン、カルシウムイオン、マ ンガンイオン、鉄イオン及び亜鉛イオンの複合体はアンギオスタテイツク（ａｎ ｇｉｏｓｔａｔｉｃ）成分、特に上述したステロイドと共に使用・する時に抗血 管形成特性を著しく増大させることを示した。従って本発明はヘパリン、ヘパラ ン硫酸、低分子量ヘパラン、低分子量ヘパラン硫酸、ヘパリン断片、ヘパラン硫 酸断片及びヘパリン又は金属イオンに結合するヘパラン硫酸から誘導されたオリ ゴ糖類に画分を有する銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン 及び亜鉛イオンの複合体と、 該複合体を製造するための方法と、 特にアンギオスタティックステロイド成分と呼ばれるアンギオスタティック成分 に関して本発明の複合体を治療に利用する用途と、 特にアンギオスタティックステロイド成分と呼ばれるアンギオスタテイック成分 に関して本発明の複合体を血管形成の減少が所望されている病気の治療に利用す るための用途と、 ヘパリン、硫酸ヘパラン、低分子量ヘパリン、低分子量硫酸ヘパラン、ヘパリン 断片、硫酸ヘパラン断片及びヘパリン又は硫酸ヘパランから誘導されたオリゴ糖 類と、その塩類の金属結合画分と、 特にアンギオスタティックステロイドと呼ばれるアンギオスタテイック成分に関 連して本発明の複合体を治療上有効な量で投与することにより血管形成の減少が 所望されている病気を治療する方法と、 血管形成の減少が所望されている病気を治療するための薬剤を調製するのに本発 明の複合体を用いる用途と、特にアンギオスタテイックステロイドと呼ばれるア ンギオスタテイック成分に関連して本発明の複合体を任意に含有する薬剤組成物 とに関するものである。

以下は主として銅イオン（Ｃｕ”、Ｃｕ”）の複合体について説明するが、それ はカルシウム（Ｃｕ”）、マンガン（Ｍｎ”）、鉄（Ｆｅ”−Ｆｅ”）および亜 鉛（ｚｎ２４）イオンとの複合体をも含むものである。

本発明の画分はヘパリン又は（および）硫酸ヘパランの成分を含んでいる。それ らは牛、豚、羊又はその他の有機物のヘパラン及び硫酸ヘパランと、低分子量ヘ パリン又は硫酸ヘパランと、ヘパリン及び硫酸ヘパランの断片と、これらの生成 物のいずれかからのオリゴ糖類と、大きさが均一であり且つヘパリン又はヘパラ ン硫酸成分、例えばヘパリン生成物からの副生物を含む他の画分からのオリゴ糖 類とから単離したものである。本発明の画分は５００乃至約３５０００の分子量 に相当する２乃至約１２０糖分を含む。ヘパリン断片の塩類はナトリウム、カル シウム又はアンモニア塩のような生理的基準に合った塩類を意味する。ナトリウ ム塩及びカルシウム塩、特にナトリウム塩は好ましい塩類である。通常、本発明 のヘパリン複合体はその塩の形態で使用される。

本発明の画分は、固体マトリックスにキレートされた銅イオンで保持されており 、ｐＨ勾配又は競合リガンド又は他のキレート剤により銅イオン含有固体マトリ ックスから肌着できることを特徴とするものである。それらは上述した出発原料 からこの方法で生産できる。

銅イオンの含有量はヘパリン／硫酸ヘパラン成分のμｍｏｌｅ当り５乃至１００ ０１０００ｎの範囲である。

好ましい間隔はヘパリン／硫酸ヘパラン成分のμｍｏ］。

ｅ当り１０乃至１０００１０００ｎである。ヘパリン１硫酸ヘパラン成分の銅結 合画分中において、５００乃至１００００又は５００乃至８０００の分子量を有 する低分子量ヘパリン又は低分子量硫酸ヘパランを用いること及びヘパリン又は 硫酸ヘパランから誘導した低分子量オリゴ糖類、特に四糖類、四糖類、四糖類、 十糖類、十三糖類、十四糖類及び土水糖類を用いることが好ましい。

血管形成、即ち、新しい毛細血管の生成は胚の成長、黄体及び傷癒着の形成のよ うな通常行程において重要である。それはまた慢性炎症、ある種の免疫応答及び 新生組織形成のような病理学的行程における構成要素である。

血管形成は非常に硬い腫瘍の特性でもあり、その生成に必要である。

血管形成の低下が所望されている医療適応症を例示すれば次のものである。

一腫瘍、特に固い腫瘍 一腫瘍細胞転位の予防 一眼の新血管新生疾患、例えばの血水晶体繊維増殖症、糖尿病性網膜症及び新血 管緑内症 一骨多孔症 一乾癖 一関節炎 本発明の複合体は、アンギオスタテイック成分、特に、高抗血管形成効果と低糖 質コルチコイド及び鉱質コルチコイド効果を有するステロイドであるいわゆるア ンギオスタティックステロイド（フルム氏等著のサイエンス、第２３０巻、第１ ３７７頁）に関連して使用することを意図したものである。このようなステロイ ドの例はフルム氏の文献に述べられており次のものが含まれる。

−＝ルチジン ーヒドロコルチゾン ーヒドロコルチゾンの１１α−異性体 −６０−フル万ロー１７．２１−ジヒドロキシ−１６β−メチル−プレグナ−４ ，９（１１）ジエン−３゜２Ｑ−ジオン −１７０−ヒドロキシ−プロゲステロン−５β−プレグナン−３α、１フα、２ １−トリオ−ルー２０−オン（テトラヒドロ−８） 一テトラヒドロコルチゾル又はその３α−グルクロニド 臨床実地において、本発明の複合体の投与は本質的には標準ヘパリン及び低分子 量ヘパリンについて規定されているように行うものである。従って、局所的且つ 非経口投与、すなわち皮下、筋肉内投与が考えられる。たとえは眼の中に又は腫 瘍に局所的に投与することが望ましい。そのほか、本発明の複合体は経口投与も できる。

ステロイド成分はステロイド投与の通例の方法、例えば経口又は非経口で投与さ れる。

本発明の新奇複合体とアギオスタテイック成分とを投与する前に混合してもよい し、別個に投与することもできる。

本発明の複合体とアギオスタテイック成分との投与量は各患者の個々の要求に応 じて調製する必要がある。

本発明の複合体の調製をするには、ヘパリン、硫酸ヘパラン、低分子量ヘパリン 、低分子量硫酸ヘパラン、ヘパリン断片、硫酸ヘパラン断片又はヘパリン硫酸ヘ パランから誘導されたオリゴ糖類、又はその塩を銅、カルシウム、マンガン、鉄 および亜鉛イオンから選択した金属イオンに反応させ、その後、このように形成 された複合体を単離する。

反応はイオン交換樹脂、特にイミノジアセチル酸基を含む樹脂またはその溶液を 用いて行うことができる。反応体は銅イオンの場合に得られた複合体にヘパリン ／硫酸ヘパラン成分のμｍｏｌｅ当り５乃至１１０００ｎ。

１ｅの銅を含むように適合されている。本発明の別の金属の複合体にも同様の量 が好ましい。

本発明の画分を調製し且つ単離するためには、金属イオン（チェレックス（商１ ））１００．　ビオ−ラッド又はキレ−ティングセファロース（商標）６Ｂフア ーマシアを結合（キレート）させるためにイミノジアセチル酸基を含む固体マト リックスを用いて金属キレート親和性クロマトグラフィを行った。塩化銅（ｎ） （ＣｕＣＬ）の溶液を銅イオンの供給源として使用することにより、キレート化 した銅イオンは主としてｉ　（ＩＩ）イオン（Ｃｕ２゛）になる。しかし、銅イ オンのいくつかは、Ｈ（Ｉ）イオン（Ｃｕ”）として存在することがある。銅イ オンを充填したカラムに分画すべき試料を蒸留水、緩衝液、塩溶液又は緩衝塩溶 液に溶解して加えた。その後、カラムを試料の溶解に使用した同一溶剤で洗浄し た。銅チェレックスカラムに結合しなかったか又は結合してもごくわずかであっ た材料をこの画分で収集した。カラムに結合（カラムにより保持）された付加生 成物の脱着に次の３つの一般方法が用いられた。

１）ｐＨ勾配による肌着。ヘパリン銅の相互作用がｐＨに左右されることが示さ れたので、これが効果的な代案である。

２）増加勾配によるか、又はイミダゾール、ヒスタミン、グリシン、アンモニア 水、好ましくは塩化アンモニウム、あるいはマトリックスに結合した同種の金属 イオンを含む溶液のような拮抗的リガンドによる平等的な脱着、リガンドの溶液 は好ましくは洗浄に用いた塩又は（および）緩衝液を含む。

３）ゲルから金属イオンを取り除き、吸着物質すべての溶離を生じさせるＥＤＴ ＡまたはＥ　Ｇ　Ｔ　Ａのようなキレート化剤による肌着。

銅イオンを用いるリガンド交換クロマトグラフィーを蛋白質、アミノ酸およびヌ クレオチドに適用したが、へバリン又は硫酸ヘパラン又はそれらから誘導した生 成物のような複合炭水化物に対しては適用しなかった。ヘパリン、硫酸ヘパラン 又はそれらの断片、低分子量生成物、又はそれらの生成物から誘導された大きさ の均一なオリゴ糖類、或いはヘパリン製造から副生物が銅キレート親和性クロマ トグラフィーで分画される時に、これらの生成物の少部分がマトリックス上の銅 イオンに結合するようになった。これら確実に結合した画分の脱着後、フォルク マン氏等著のエイエンス、１９８３年、第２２１号、第７１９頁乃至第７２５頁 及びフルム氏等著のザイニンス、１９８５年、第２３０号、第１３７５頁乃至第 １３７８頁により規定されたヒドロコルチゾン又は別のアンギオスタティックス テロイドと併用してそれらの血管形成の抑制を分析した。その時わかったことは マトリックス上のイオンにより保持（銅イオンに結合）されていたそれらの画分 がアンギオスタテイックステロイドの存在において、血管形成に銅イオン含有マ トリックスにより保持（マトリックスに結合）されなかったこれら生成物の画分 よりも高い抑制効果をもたらすことを示した。

（第１表） 銅チェレックスカラムに保持された画分もアンギオスタティックステロイド（例 えばヒドロコルチゾン）の存在において、血管形成に、分画に用いられたそれぞ れの出発生成物よりも高い抑制効果をもたらすことを示した。

米国薬局方及び英国薬局方により臨床的に用いられた標準ヘパリンは３０ｐｐｍ 以上の重金属を含有してはならない。原子吸収分析によりわかったことは、ヘパ リン、ヘパラン硫酸及び低分子量材料、断片、画分とヘパリン及び硫酸ヘパラン から調製されたオリゴ糖類中において、これら重金属の約１０ｐｐｍまでは銅で あった。しかし、この銅のＯ乃至１０ｐｐｍの範囲では、銅の含量とステロイド の存在において血管形成の抑制度との相関関係は明白ではない。

銅チェレックスカラムから溶離された画分がナトリウムイオンを含むチェレック スで処理された時、わかったことは水、塩溶液、緩衝液又は緩衝塩溶液で溶離さ れた最初の画分が原子吸光分光により測定されたように２０ｐｐｍ以下の銅を常 に含有していたことであった。しかし、上述のように脱着された結合画分は、ナ トリウムイオンを含むチェレックスで処理された後は常にそれ以上の銅が含まれ ていた（第２表参照）。銅のこの残存量の除去は非常に困難で、たとえば大量の ＥＤＴＡの溶液に対する透析による以外にない（実施例９参照）。そこで思いが けなくわかったことは銅チェレックスカラムに結合（カラムによって保持）され ていた画分中の銅イオンのこの残留量はこれらの画分により示された血管形成の 抑制に必要であった。銅イオンのこの残留量の除去にあたり、抗血管形成活動度 が失われた（第２表参照）。銅イオンを、銅イオンを奪われたこれら結合画分に 添加するとそれらの抗血管形成活動度を回復させた（第２表参照）。

銅イオンが同一分離からの結合画分中に効果的である量で保持されない両分に付 加される時に、抗血管活動度の増加どころか減少が観察された（第２表参照）。

ヘパリン、硫酸ヘパランの画分とそれらから誘導された生成物の画分は以下の点 を特徴とする：−アンギオスタティックスステロイドの存在においてそれらは血 管形成に強い抑制を示す。

−一定量の銅イオンを強力に結合する能力を有する。

−一定量の銅イオンを強力に結合する能力を有することに加えて、血管形成の強 化抑制を示すためこの能力に合うだけの量の銅イオンを含む必要がある。

アンギオスタテイツクスステロイドの存在において、血管形成の強化抑制は卵分 析に示されている（第１表）。

銅イオンの強力結合はこれらの画分、たとえば水溶液、ＮａＣ１の０．５Ｍ乃至 ２Ｍまたは３Ｍ溶液に相当する高濃度塩溶液、あるいは中性またはほぼ中性緩衝 溶液によって溶離されていないこれらの画分の高親和性によって示されている。

強力な銅結合はこれらの画分がいったん銅イオンに結合するとこれら画分からの 銅イオン除去が困難になる、たとえばナトリウムの形でのチェレックスカラムの ような銅キレート化剤による処理が強力に結合した銅イオンを除去しなかったこ とで示されている。

これらは強金属キレート化剤ＥＤＴＡでの極めて大規模な処理によってのみ除去 された。血管形成の強化抑制を示す新しい画分に必要な銅イオンの量は、血管形 成の強化抑制を起こすこれらの画分の中の構造的因子の量により測定される。こ の量を超える銅イオン（たとえば小さい構造体に結合する銅イオン）はこれらの 画分の血管形成の抑制にもたらす増大効果はないが、むしろ銅イオンのやや高い 毒性のため劣化効果がある。実施例１により調製されたヘパリン画分にとって、 銅イオンの最適量は結合μｍｏ　ｌ　ｅ当り１０画分乃至５００ｎｍｏｌｅであ ヘパリン、ヘパリン断片及びヒドロコルチゾンの存在においてヘパリン断片から のオリゴ糖類による血管形成の抑制 御）詳細は実験部分参照 ２）ヒドロコルチゾンなしに １）詳細は実験部分参照 第２表 ヒドロコルチゾンの存在において本発明によるヘパリン及びヘパリン断片の画分 による血管形成の抑制 １）ＨＦ−３ＡはＨＦ−３（実施例９の実験部参照）からの強力に結合した銅イ オンを除去して得られた。ＨＦ−３Ｂ、ＨＦ−３Ｃ，ＨＦ−３Ｄ及びＨＦ−３Ｅ は様々な量の塩化銅（ＩＩ）　（Ｃｕ”）をＨＦ−３Ａに添加して得られた。Ｈ Ｆ−２Ａは適当な量の塩化銅（ｎ）　（Ｃｕ２＋）をＨＦ−２に添加して得られ た。ＨＦ−３ＡはＨ−３からの強力に結合した銅イオンを除去して得られた。

Ｈ−３８とＨ−３Ｃは塩化銅（ＩＩ）　（Ｃｕ”）をＨ−３Ａに添加して得られ た。Ｈ−２Ａは適量の塩化銅（Ｃｕ”）をＨ−２に添加して得られた。

２）非結合画分 実施例１．　アルカリβ除去で得られたヘパリン断片からの銅結合ヘパリン断片 豚の腸粘膜（４０ｇ）からのヘパリンナトリウムを水（２００ｍΩ）で溶解して 、ハイアミン（商標）１６２２〔ジイソブチルフェノキシエトキシエチル〕−塩 化ジエチルベンジルアンモニウム（２００ｇ）を水（１０００ｍΩ）との溶液に 撹拌しながら滴下添加した。混合物をさらに１時間撹拌し、その後、冷却機で夜 通し冷却した。上滑を分離し、沈殿物を水（８００ｍΩ）で洗浄し３０分間遠心 分離した。沈殿物を真空で夜通し６０℃の温度で乾燥した。得られた粘着性ガム をジクロロメタン（７５０ｍΩ）で溶解してα−プロモトルニン（８５ｍΩ）を 添加した。この溶液を７２時間２３℃の温度で撹拌した。形成されたベンジルエ ステルをその後、メタノール（１５ｗ／ｖ、１０００ｍΩ）に溶解した酢酸ナト リウムを添加して沈殿させた。その沈殿物を３０分間遠心分離し、メタノール（ ５００ｍΩ）で洗浄し、再度遠心分離した。得られた沈殿物を水（ＬｏｏｍΩ） とメタノール（２５乃至ＬｏｏｍΩ）に溶解した。酢酸ナトリウム（１５ｇ）を その後添加した。３０分間撹拌後、混合物をセライトによって濾過し、メタノー ル（１０００ｍΩ）を濾液に添加した。沈殿物を最後にメタノールで洗浄し、遠 心分離して真空で夜通し乾燥した。ヘパリンベンジルエステルの収量は２６ｇで あった。

ヘパリンベンジルエステル（１，０ｇ）を水（５ｍΩ）に溶解して、６０℃の温 度に加熱した。水酸化ナトリウム（０，４０Ｍ、５ｍΩ）を添加して、その溶液 １時間３０分の間６０℃の温度で撹拌した。混合物を室温に冷却後、陽イオン交 換樹脂（ドウエックス　５０Ｗ−Ｘ８Ｈ）を添加して塩基性溶液を中和した。濾 過して樹脂を除去し、水（ｉｎｎ）で洗浄した。混合溶液（濾過水と洗液）のｐ Ｈを、希薄水酸化ナトリウムを添加してｐＨ７調整した後、凍結乾燥した。収量 は１．０ｇであった。

このヘパリン画分（ＨＦ−１）の平均分子量は、参考として既知重合度のヘパリ ン画分を用いてセファデックスＧ−７５のゲル濾過により測定された通り、５ｏ ｏｏであった。抗凝血性活動度はアンダーソン氏等著の抗トロンビン、第１５号 、第５３１頁による色素生産性基質Ｓ−２２２２（スウェーデン国、ストックホ ルム所在のカム　ダイアグナスティ力）を利用して抗Ｘａ検査により測定した。

このヘパリン画分（ＨＦ−１）の抗Ｘａ活動度は９０ｕ／ｍΩであった。

銅キレート親和性クロマトグラフィーコラムは次の方法で準備した。ナトリウム 形態のチェレックス１００（ビオ−ラッド）５０ｍｎを塩化銅（ＩＩ）（Ｃｕ” ）（５００ｍΩ、０．５Ｍ）の溶液に添加した。この混合物を２４時間放置しそ の後濾過した。親和性ゲルを蒸留水（３ＸｉＯＯｍΩ）で洗浄した。親和性ゲル を蒸留水に注入し脱泡した。ナトリウムイオン（５ｍΩ）を含むチェレックス１ ００をクロマトグラフィー〇カラム（２５Ｘ１，６ａｍ）に注入し、またこのゲ ルの上に銅チェレックスゲルを注入してカラムを用意した。前記分離管をアンモ ニア（ｌｏｏｍｆｉ、０．５Ｍ）と水（２５゜ｍΩ）で洗浄した。上述のアルカ リβ除去で得られたヘパリン断片（ＨＦ−１）（５ｇ）を水（２０ｍｆｉ）で溶 解して、銅チェレックスカラムの上部に加えた。水を１゜２（２）／ｈの速度で 溶離剤として用い、２４０ｎｍに固定したＵＶ−モニターで検出してそれ以上の ヘパリン断片がない時、溶離剤をアンモニア水（２Ｍ）に入れ換えた。

溶剤を水で溶離した画分と、アンモニアで溶離した画分とから真空で蒸発させた 。それらをその後蒸留水で溶解し、ナトリウムイオンを含むチェレックス１００ で処理し、濾過して凍結乾燥した。水溶液からは最初のヘパリン断片の画分（３ ，２ｇ）が得られた。ヘパリン断片ＨＦ−２と呼ばれるこの画分は、銅チェレッ クスカラムにとって非常に低い、換言すれば親和性が全くなかった。

アンモニア水で溶離した画分を蒸留水で溶解し、アミコン８０５０限外濾過セル のシアフロ（Ｄｉａｆｌｏ）膜５ＹＣＯ５での限外濾過にかけた後、その残留物 を凍結乾燥した。凍結乾燥生成物を塩化ナトリウム（２Ｍ）に溶解して、再度同 一濾過器で限外濾過し、塩素イオンがなくなるまで水で完全に洗浄した後、凍結 乾燥して銅チェレックスカラムで０．２ｇ保持されていた最初のヘパリン断片の 画分を得た。ヘパリン断片ＨＦ−１のこの画分をヘパリン断片ＨＦ−３と称する 。この保持された両分ＨＦ−３は、セファデックスＧ−７５のゲル濾過で測定さ れて平均分子量が６０００であった。元素分析ではＮが２．４％、硫黄が９．５ ％モしてＣｕが２５５ｐｐｍであった。ウロン酸はビッタ−及びミュア氏による １９６２年の生化学分析、第４号、第３３０頁によるカルベゾール硫酸法に上り 測定したところ３Ｑｗ／ｗ％であった。

このヘパリン断片（ＨＦ−３）の抗Ｘａの活動度は１６ｕ／ｍｇであった。両分 ＨＦ−３はアミノ酸分析による測定ではグルコサミンのみでガラクトサミンは含 有しなかった。Ｄ　、　Ｏ／　Ｎ　ａ　ＯＤにおける’ＨＮＭＲ分先は２．７ｐ ｐｍではなんの兆候も示さなかった。それはグルコサミンのＨ−２がその位置で 遊離アミノ酸を有しているからである。

実施例２．　ヘパリンナトリウムのアルカリβ−除去解重合により生成されたヘ パリン断片から得られたオリゴ糖類から得られた銅結合オリゴ糖類 豚の腸粘膜（４０ｇ）からのヘパリンナトリウムを水（２００ｍｇ）に溶解して 、ハイアミン（商標）１６２２［（ジイソブチルフェノキシエトキシエチル）− 塩化ジエチルベンジルアンモニウム］（２００ｇ）を水（１０００ｍΩ）との溶 液に撹拌しながら滴下添加した。混合物をさらに１時間撹拌した後、遠心分離し た。上滑を分離し、沈殿物を水（８００ｍｇ）で洗浄し３０分間遠心分離した。

この沈殿物を真空で夜通し６０℃の温度で乾燥した。得られた粘着性ガムをジク ロロメタン（７５０ｍ℃）に溶解して、ヨウ化メチル（４５ｍ℃）を添加した。

この溶液を７２時間２３℃の温度で撹拌した。形成されたメチルエステルをその 後、メタノール（１５％ｗ／ｗ、ｌｏｏＯｍΩ）に溶解した酢酸ナトリウムを添 加して沈殿させた。得られた沈殿を水（１００ｍｇ）とメタノール（２５乃至１ ００ｍｇ）に溶解した。その後、酢酸ナトリウム（１５ｇ）を添加した。３０分 間の撹拌後、混合物をセライトによって濾過し、メタノール（１０００ｍΩ）を その濾過液に添加した、沈殿物を遠心分離し、上滑を他に注いだ。沈殿物が得ら れるまでこの手順を反復したが、その沈殿物は完全に水溶性であった。この沈殿 物を最後にメタノールで洗浄し、遠心分離して真空で夜通し乾燥した。ヘパリン メチルエステルの収量は２３ｇであった。

ヘパリンメチルエステル（１，Ｏｇ）を水（５ｍ　Ｑ　）に溶解して６０℃の温 度に加熱した。水酸化ナトリウム（０，４０Ｍ、５ｍｇ）を添加し、その溶液を １時間３０分の間５０℃の温度で撹拌した。この混合物を室温に冷却後、陽イオ ン交換樹脂（ドウエックス　５０Ｗ−ｘ８Ｈ）を添加して塩基性溶液を中和させ た。樹脂を濾過除去し、水（１ｍｇ）で洗浄した。希薄水酸化ナトリウムを添加 して混合溶液のｐＨを調整してｐＨ７にした後、凍結乾燥した。収量０．９８゜ このヘパリン断片の平均分子量は３５００であった。

このヘパリン断片（ＭＷ３５００）（Ｉｇ）を塩化ナトリウム（０，２５Ｍ、５ ｍｇ）に溶解して、ゲル濾過カラム（５Ｘ１８０ａｎ　Ｐ−６，バイオ−ラッド ）に加えた。２１４ｎｍのｔＪＶ検波を用い、５．８ａｎ／ｈの速度で塩化ナト リウム（０，２５Ｍ）によって前記カラムを溶離した。画分を収集し、水を３． ６ａｎ／ｈの速度で溶離剤としてまた、屈折率測定による検出とを用いてセファ デックスＧ−１０で脱塩した。凍結乾燥後、下記の画分を得た。

三糖類　５　ｍ　ｇ 四糖類　３６ｍｇ 六糖類　６５ｍｇ へ糖類　８９ｍｇ 十糖類　１１８ｍｇ 十三糖類　９５ｍｇ 十四糖類　７１ｍｇ 千木糖類　８３ｍｇ 十六糖類以上の糖類　３０５ｍｇ を水（５ｍ　Ｑ　）に溶解して、実施例１に説明の通りに用意した銅チニレック スカラムに加えた。溶離剤としての水を１．２ａｎ／ｈの速度で用いて溶離を実 施し、２４０ｎｍのＧＶ検波でモニターした。保持されない（非結合）三糖類が 溶離されていない時に、溶離剤をカラムにより保持（分離管に結合）されていな かった四糖類の画分を産してアンモニア水（２Ｍ）に入れ替えた。これら２画分 を蒸発させた。結合画分を反復蒸発させた。溶剤蒸発後、画分を蒸留水に溶解し て、ナトリウムイオンを含むチェレックスで処理、濾過し、上の四糖類単位のと ころで説明の通り、セファデックスＧＩＯのクロマトグラフィーで精製した。凍 結乾燥後、四糖類画分が水での溶離から得られたが、それは極めて少量、換言す れば前記銅チェレックスカラムでは全然保持されなかった。収量は４３５ｍｇ　 （ＴＳ−２）、アンモニアとの溶離で別の両分ができた。この画分は銅チェレッ クスカラムによって保持（カラムに結合）された四糖類を含んでいた。収量は６ ．５ｍｇ　（ＴＳ−３）。

同一方法で、上述の通すヘパリンのアルカリβ除去により得られるヘパリン断片 から得られた四糖類（ＨＳ−１，５５０ｍｇ）を上述のように銅チェレックスカ ラムで分画して、非常に少量、換言すれば全然保持されなかった四糖類画分がで きた。ここでも四糖類画分が得られ、収量は８．９ｍｇ　（ＭＳ−３）であった が、それは銅チェレックスカラムに保持されていたものであった。保持四糖類（ ＴＳ−３）も、保持水糖類（ＨＳ−３）のいずれもり、Ｏ／Ｎａ０Ｄにおける’ ＨＮＭＲ分先は２．７ｐｐｍではなんの兆候も示さなかった。それはゲルコサ大 オリゴ糖類の各１つば脱塩を限外濾過膜シアフロ５ＹＣＯ５（アミコン社）で遂 行する以外は四糖類及び六゛糖類に対するのと同一方法で分画された。銅チェレ ックスカラムに保持された画分の収量は０．　３乃至３％であった。

実施例３．　亜硝酸によるヘパリンナトリウムの部分解重合により得られたヘパ リン断片からの銅結合ヘパリン断片 脂の島粘膜からのヘパリンナトリウムを亜硝酸ナトリウム（５％ｗ　／　ｗ　） の溶液添加により現場で形成された亜硝酸によりｐＨ１，５で部分解重合した。

その後、無水マンノース基を３℃の温度で過剰ホウ化水素ナトリウムで還元した 。過剰ホウ化水素を酢酸で分解し、稀釈水酸化ナトリウムを添加して溶液を中和 した後、その溶液の一部は水を溶離剤として、セファデックスＧ−１５のゲル透 過クロマトグラフィーにかけられた。ＨｐＬＣゲル透過クロマトグラフィーによ る主成分として十四乃至土水糖類を含むヘパリン断片（ヘパリン断片ＨＦ−４） を収集した。ＨｐＬＣゲル透過クロマトグラフィーを、おのおのが６０ｏＩＩＩ ！［ｌ×７．５１ｎＩ１１内径の２基のＴＳＫＧ３０００　ＳＷカラムを直列接 続して行った。１基のＴＳＫ　ＳＷＰカラム（７５順Ｘ７．５ｍｍ内径）をガー ドカラムとして使用した。移動相は０．２Ｍ酢酸ナトリウムであった。流量は０ ．５ｍＱ／ｍｉｎであった。ピークは参考としての既知大きさのヘパリンオリゴ 糖類を用いて屈折率測定によって検知された。

銅キレート親和性クロマトグラフィーカラムを次のように用意した。：ナトリウ ムイオンを含むチェレックス１００　（バイオ−ラッド、５０ｍｆｉ、１００乃 至２００メツシユ）を水で洗浄してカラム（２，６ｘ３０ａｎ）に充填した。チ ェレックスゲルを塩化ｇ（ＩＩ）（Ｃｕ”’）（０，０Ｍ：　５００　ｒｎ　Ｑ 　）の溶液をカラムに３，８ａｎ／ｈの速度で通してポンピングすることにより 銅イオンで飽和させた。過剰の塩化銅（ＩＩ）を蒸留水で洗浄除去した。カラム をその後、燐酸ナトリウム（０，０２Ｍ）を含む塩化ナトリウム（０，５Ｍ）で 平衡させた。銅チェレックスカラムのうしろに、ナトリウムイオンをもつチェレ ックスを含むカラムを配列した。この２基カラム系に、上述のように得られ、塩 化ナトリウム、燐酸ナトリウム（０，５Ｍ、０．０２Ｍ）に溶解したヘパリン断 片ＨＦ−４を加えた。極めて少ない、換言すれば銅チェレックスカラムに全然保 持されないヘパリン断片を塩化ナトリウム、燐酸ナトリウム（０，５Ｍ、０．０ ２Ｍ）で溶離した。溶離は、もはや断片が２１４ｎｍの′ＵＶで検波できなくな るまで継続された。

二のヘパリン断片ＨＦ−４の画分をヘパリン断片ＨＦ−５と称す。セファデック スＧ−１５で脱塩して凍結乾燥後の収量は３９５ｍｇであった。ＨＰＬＣのこの 画分の主ピークは十四乃至土水糖類であった。銅チェレックスカラムによって保 持（分離管に結合）されたヘパリン断片の別の画分を塩化ナトリウム（０，５Ｍ ）を含む塩化アンモニウム（２Ｍ）により溶離した。セファデックスＧ−１５で のクロマトグラフィーの後、０．７ｍｇの収量が得られた。このヘパリン断片の 画分をヘパリン断片ＨＦ−６と称する。ＨＰＬＣによれば、それは主として十乃 至十四糖類から成っていた。

実施例４．　標準ヘパリンナトリウムからの銅結合ヘパリン画分 ゲルを含む銅イオンの約５００ｍΩを含む銅チェレックスカラム（５ｘ２５ａｎ ）を実施例３に従って用意した。

そのカラムのうしろに、１基のナトリウムチェレックスカラムを配列した。この ２基カラムに、塩化ナトリウム（０，５Ｍ）に溶解した標準ヘパリンナトリウム ＵＳＰ（２０ｇ、抗−Ｘａ　１３８ｕ／ｍｇ、Ｈ−１）を添加した。極めて少量 、換言すればゲル上銅イオンには全然保持されないヘパリンを塩化ナトリウム（ ０，５Ｍ、１゜８Ｑ）で溶離した。安定基線（２１４ｎＩＩｌのＵＶ検波）を得 た時、塩化ナトリウム（０，５Ｍ）を含むアンモニアリウムイオンを含むチェレ ックスで処理の後、凍結乾燥（ヘパリン画分Ｈ−２）Ｌ／た。保持ヘパリン画分 を蒸発させ、セファデックスＧ−１５で脱塩、凍結乾燥して、ナトリウムイオン を含むチェレックスで処理し、その後、蒸留水を用いてセファデックスＧ−１５ で脱塩した。凍結乾燥後、ヘパリン画分（ヘパリン画分Ｈ−３）が得られたが、 それは銅チェレックスカラムで保持されていたものであった（８８ｍｇ）、抗Ｘ ａ活動度は１１９ｕ／ｍｇ。元素分析では、Ｎは２．１％、Ｓは１０．７％、Ｎ ａは１０．３％、またＣｕは２２０ｐｐｍであった。

アミノ酸分析によるこの画分中の唯一のアミノ糖はグルコサミンであった。ビッ タ−氏及びミュア氏による１９６２年版、生化学、第４号、第３３０頁によるカ ルバゾール硫酸法により測定された通り２８＋３％ｗ　／　ｖ＋ｙであった。出 発材料として用いられた標準ヘパリンナトリウムのウコン酸含量は３０±３％ｗ 　／　ｗであった。

実施例５．　亜硝酸によるヘパリンナトリウムの部分解重合によって得られたヘ パリン断片からの銅結合四糖類画分の調製 実施例３からの解重合ヘパリンを８容量のメタノールを添加して沈殿させた。こ のように得られた生成物の５ｇを１２ｍｇの水に溶解し、バイオゲル（Ｂｉｏｇ ｅｌ）Ｐ−６ゲルのゲル透過クロマトグラフィーに、３．７０／ｈの速度で溶離 剤として０．２５Ｍ塩化ナトリウムを用いてかけた。クロマトグラフィーを屈折 率検知器によってモニターし、画分をプールして大きさ均一オリゴ糖類を得た。

それぞれの画分を濃縮した。水を３．６ａｎ／ｈの速度で溶離剤として用いて小 画分を、セファデックスＧ−１０カラム（８５Ｘ５ａｎ）のクロマトグラフィー で脱塩した。金属含有炭水化物の検出は屈折率検波器によって実施された。大型 オリゴ糖類（≧１０単糖類単位）をＹＣＯ５濾層を備えるアミコン８４００セル による限外濾過で脱塩した。収量は次の通りである。

四糖類　０．５１ｇ 八潮類　０，７１ｇ 八潮類　０．３５ｇ 十糖類　０．５１ｇ 十三糖類　０，１７ｇ 十四糖類　０．３１ｇ 土木糖類　０．１５ｇ 十六糖類　０．１４ｇ 二十以上の糖類　０．４３ｇ 四糖類画分（６，０ｇ’）（ＴＳ−４）を水（１０ｍｌに溶解して、銅チェレッ クス１００カラム（２５Ｘ１゜６ａｎ）に加えた。速度１．２ａｎ／ｈの水を溶 離剤として用いて、銅には親和性の低い画分を得た。紫外線ＵＶ２１４検波器を 用いて検出を行った。最初の画分の溶離した時、溶離剤をアンモニア（１０００ ｍΩ、２　Ｍ　）に変えて、次の画分を収集した。それぞれの画分を濃縮した後 、ナトリウム型式のチェレックス１００で処理した。

最後に、両国分を速度３．６ａｎ／ｈの水を溶離剤として用いてセファデックス ＧＩＯでクロマトグラフィーして、非結合画分（５，８ｇ）（Ｔ５−５）と結合 画分（８４ｍｇ）を生ずる。

前証結合画分を０．２５Ｍ塩化ナトリウムに溶解してバイオゲル（Ｂｉ　ｏｇｅ 　１）ＰＰ−６ゲル、１８０Ｘ５印ガラムのゲル透過クロマトグラフィーに加え 、上述のように０．２５Ｍ塩化ナトリウムで溶離した。四糖類画分を収集して水 を溶離剤として用いセファデックスＧ−１０で脱塩し、凍結乾燥後、銅含量が３ ９００ｐｐｍ（ＴＳ−６）の７０　ｍ　ｇ生成物を生じた。結合画分（１８ｍｇ ）を水（５ｍＱ）と塩化ナトリウム（２０ｍｇ）に溶解してチェレックス１００ を添加した。混合物を２時間放置した後、濾過した９濃縮後、残量を上述のよう にＧ−１０カラムで脱塩した。四糖類は収集し凍結乾燥して、銅含量が２９００ ｐｐｍ　（ＴＳ−７）の９．５ｍｇを生じた。ＴＳ−７の四糖類の性質は実施例 ３によるＨＰＬＣゲル透過クロマトグラフィーにより確認された。

寒嵐輿且・ 実施例５により調製された八潮類画分（ＨＳ　−４）（１，１５ｇ）を０．５Ｍ 塩化ナトリウムに溶解して、１基の銅チェレックスカラムに続くナトリウムチェ レックスカラムとから成る２基カラムに加えた。この両力ラムを塩化アンモニウ ムの段階増加濃縮により溶離した。

各画分をセファデックスＧ−１５の反復クロマトグラフィーによる脱塩後、相当 量の過剰塩化ナトリウムで処理し、再度脱塩して下記の画分を生じた。画分Ｈ５ −５及びＨ５−９をナトリウムチェレックスでの処理によりさらに精製した。

画分Ｈ５−９をＨＰＬＣゲル透過クロマトグラフィーで八潮類であることを確認 した。ＡＩＨ−ＮＭＲ分光を第１図に示す。

実施例７゜ キレート化セファロース６Ｂ　（ファーマシア：１１０ｍΩ）をビーカーに入れ た。硫酸銅塩化銅（ＩＩ）　（Ｃｕ（１（１）で完全に洗浄した。その後それを 燐酸ナトリウム（０，ＬＭ；ｐＨ７，５）（緩衝剤Ａ）を含む塩化ナトリウム溶 液（ＬＭ、３００ｍΩ）を添加した。ゲルを脱泡して、クロマトグラフィーカラ ム（４０Ｘ２．６ｇｍ）に移動させ、緩衝剤Ａ（１００ｍΩ）で洗浄した。

実施例５（５ｇ）によって得られた十糖類（ＤＳ−１）を緩衝剤Ａ（１５ｍΩ） に溶解して銅イオン含有カラムの上部に配置した。６．８ｃｒｒｌ／ｈの速度で 緩衝剤Ａを用いて溶離を実施した。溶離剤を固定波長ＵＶ検波器（ＵＶ−２１４ ，ファーマシア）でモニターして、画分を収集した（２０ｍｉｎ／管）。３０分 後、非結合物質が現れた。非結合物質を含む画分をプールして濃縮、脱塩および 凍結乾燥して、十糖類ＤＳ−２を生じさせた。銅カラムはその後６．８ａｎ／ｈ の速度で７時間の間に燐酸ナトリウム（０，１Ｍ、ｐＨ７，５）緩衝剤Ｂを含有 する塩化ナトリウム（３Ｍ）で洗浄された。この期間、クロマトグラムになんら のピークも現れなかった。その後、溶離剤を塩化アンモニウム（２Ｍ）に切り換 え、ピークが現れるまでクロマトグラフィーを継続した。このピークに相当する 画分を収集プールして、アミコン５ｏｏｏ限濾過セルで、ＹＣＯ５膜を用いて濃 縮、脱塩した。その保持物質は塩化ナトリウム（ＩＭ、２ｘ３００ｍＱ）で洗浄 され、その復水で塩化物イオンがなくなるまで水で洗浄された。その保持物質は 凍結乾燥されて１４ｍｇ、Ｃｕ含量が６４０ｐｐｍの結合画分（ＤＣ−３）を生 じた。２Ｍの塩化アンモニウムを夜通し用いて連続クロマトグラフィーにはそれ 以上のピークは現れなかった。

生物学的試験 ヘパリン、硫酸ヘパラン又はヘパリン及び硫酸ヘパラン成分を含む生成物に対す る漿尿膜（ＣＡＭ）の血管形成反応が受精卵で調査された。スウェーデン国、リ ンコビンに所在のリンコピンス　コントロールホンセリから入手した非温ｆｆ１ （０日）受精卵を照卵器（アンダーランアンドボンデＴＲＹ４０）に入れて３７ ℃の温度で温償できるようになるまで低温誘卵器に貯蔵した。温償（３７℃）卵 を温償（３日）の第３日目に割って、全内容物をベトリ皿に流し込んだ。卵黄の こわれていない卵を、上昇相対湿度をつけて３７℃の温度で３％Ｃｏ、組織培養 温償器に入れて後続培養に使用した。ＣＯ□雰囲気中で３日間の培養（６日）後 、以下に説明の通りに用意されたメチルセルロース皿を用いて植え付ける。メチ ルセルロースを二環蒸留水に０．５％の濃度で添加し、その後、無菌の１３８ｋ ｐａの圧力と１２０℃の温度で３ｏ分間オートクレーブで処理した。この混合物 はゲル化メチルセルロースのボールを含んでいる。その後、５℃の温度で２乃至 ３日間弱撹拌すると、溶液が間違いなく完全に溶解する。そこで溶液を直ぐ使え るようになるまで冷蔵庫に保存しておく。試験材料をメチルセルロース中に室温 で採取的には５乃至５０μｇ／１０１ＬΩの濃度に懸濁する。試験試料を含む１ ０μΩメチルセルロースのアリコートをテフロン棒（３ｍｍ径）の端に置く。

メチルセルロース試験材料円板を乾燥（３０乃至４０分）させて、それをテフロ ン棒から２本の細いビンセットで取り外し、非成長容器がないようにするため、 ６日ＣＡＭの周辺部に配列する。８日目の日に、透明円板の下および廻りの生成 容器を解剖顕微Ｍ（Ｘ２６乃至Ｘ４０倍）にかけて検査した。容器成長の抑制が 容器成長の無抑制としてか又は容器成長の抑制としてかのいずれかで記録する。

各化合物を最小１５卵で試験紙、その記録を試験物質の性質と濃度に関し一様で ある２人の専門家によって行われる。

結果は抑制を示す百分比卵として示されている。

実施例９．　本発明のヘパリン断片の画分の銅含量（第２表） ヘパリン画分ＨＦ−１、ＨＦ−２およびＨＦ−３を原子吸収分光分析法により銅 に対して分析した。それらは９ｐｐｍ、５ｐｐｍ及び２５５ｐｐｍをそれぞれ含 有していることがわかった。

ナトリウムイオンを含むチェレックス１００で蒸留水にヘパリン断片ＨＦ−３を 溶解した溶液をさらに処理しても銅含量になんらの減少も生じなかった。銅含量 を１０ｐｐｍ以下に減少させるため、次の行程を採用した。

すべての行程を実行するため、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）８０５０限外濾過セル にシアフロ（Ｄｉａｆｌｏ）膜５ＹＣＯ５を用いた。

ヘパリン断片（ＨＦ−３）を塩化ナトリウム（２Ｍ。

５０ｍΩ）に溶解し、追加の塩化ナトリウム（２Ｍ。

２５０ｍＭ）で、その後蒸留水（２００ｍＱ）で洗浄し、その後、凍結乾燥した 。この凍結乾燥断片をその後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＴＤＡ；　Ｏ，ＩＭ ：　ｐＨ７゜０；５０ｍΩ）に溶解して、同一溶液の追加２５０ｍΩで洗浄した 。その後、それを塩化ナトリウム（］、Ｍ。

２５０ｍΩ）、蒸留水（２５０ｍｆｉ）で逐次洗浄し、その後凍結乾燥した。こ の凍結乾燥断片を同一方法で倍の洗浄量を用いてもう一度処理した後凍結乾燥し た。ＨＦ−３Ａと称するヘパリン断片は５ｐｐｍの銅含量を有することになった 。上記の凍結中間体の全部を銅に対し、て分析したが、全部の行程の後に初めて 、銅含量が１０ｐｐｍ以下となった。

銅イオンをヘパリン断片Ｉ−（Ｆ　−３Ａに添加のため、塩化銅（ＩＩ）　（Ｃ ｕ”）の原液を次のように調製した。塩化銅（ＩＩ）　（Ｃｕ”）　Ｘ　２　Ｈ ｚ　Ｏ（２７、ｌ　ｒｎ　ｇ　）をメスフラスコに入れて計量し、二環蒸留水を １０ｍΩの標線まで添加した。この溶液から、１ｍＱを２番目のメスフラスコに 入れ、二環蒸留水を１０００ｍΩの標線にまで添加した。この溶液は１．０１μ ｇ　Ｃｕ　／　ｍΩＨ２０を含んでいた。銅の５ｐｐｍを含むヘパリン断片の５ ゜２ｍｇを二環蒸留水（２、０ｍ　Ｊ２　）に溶解した。原液の原子吸収分析に よる銅含量は１１００ｐｐであった。

ヘパリン断片ＨＦ−３Ａ　（５，９ｍｇ）を二環蒸留水（２，０ｍΩ）に溶解し 、原液の３．８０ｍΩを添加し、混合物を室温で４時間放置し、その後、凍結乾 燥してヘパリン断片ＨＦ−３Ｃを生じた。原子吸収分析による銅含量は６４５ｐ ｐｍであった。

ヘパリン断片ＨＦ−３Ａ　（４，６ｍｇ）を二環蒸留水の２．ＯｒｎΩに溶解し 、原液の６．９０ｍΩを添加して混合物を４時間室温で放置し、その後、凍結乾 燥してヘパリン断片ＨＦ−３Ｄを生じた。原子吸収分析による銅含量は１５００ ｐｐｍであった。

ＨＦ−３Ｃ（３，６ｍｇ）及びＨＦ−３Ｄ　（４，１ｍｇ）を水（１０ｍΩ）に 溶解した。溶液をその後凍結乾燥して原子吸収により測定された通り１１０ｌ１ ００ｐｐを含むヘパリン断片ＨＦ−３Ｅ（７，６ｍｇ）を生じた。

銅イオンをヘパリン断片ＨＦ−２に添加のため１４Ｆ−２の２０．０ｍｇを２． 　ＯｒｎΩの二環蒸留水に溶解し、原液の３．１７ｍΩを添加して、混合物を室 温で４時間放置しその後、凍結乾燥してヘパリン断片ＨＦ−２Ａを生じた９原子 吸収分光分析法による銅含量は１６０ｐｐｍであった。

ヘパリンＨ−３Ａ、Ｈ−３Ｂ、Ｈ−３Ｃ及びＨ−２Ａを生じるため、ヘパリンの 分画をヘパリン断片の画分と同一方法で処理した。

第２表でわかることは抗血管形成効果は銅含量が減少する時、はとんど全く失わ れている。たとえば、百分比抑制は断片ＨＦ−３の５７と比較して断片ＨＦ−３ Ａの８である。銅イオンの添加は活動度を回復させた。たとえば断片ＨＦ−３Ｂ 、ＨＦ−３Ｄ及びＨＦ−３Ｅにみられるように、それぞれ３７．７０及び５３％ 抑制を示した。ヘパリン断片にとって同様の効果がＨ−３Ａ及びＨ−３Ｂを第２ 表のＨ−３と比較するヘパリンにも見られる。

国際調査報告 ｌｐｌｅＭｊｂｅＭＩＩ　Ａ＊＠１．．１ｂｌｌｌＩＮ１１．　ＰＣＴ／ＳＥ８ １３１００２２２＋　吻ｍｍ＋ｌＩｍＡ＊＠’ｃ＃Ｉ−Ｎ＠、ＰＣＴ／５ＥＢａ ／ＤＯ２Ｅ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン及び亜鉛イ オンから選択した金属イオンと、 （ｂ）ヘパリン、硫酸ヘパラン、低分子量ヘパリン、低分子量硫酸ヘパラン、ヘ パリン断片、硫酸ヘパラン断片及びヘパリン又は硫酸ヘパランから誘導したオリ ゴ糖類の画分、又は金属イオンに結合する面分の堤と から成り、成分（ｂ）のμｍｏｌｅあたり５乃至１０００ｎｍｏｌｅの金属を含 むことを特徴とする複合体。 ２）成分（ａ）は銅イオンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の 複合体。 ３）銅の量は成分（ｂ）のμｍｏｌｅ当り１０乃至１０００ｎｍｏｌｅであるこ とを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の複合体。 ４）成分（ｂ）はヘパリン又は低分子量ヘパリン又はヘパリン断片又はヘパリン から誘導したオリゴ糖類であることを特徴とする特許請求の範囲第２項又は第３ 項記載の複合体。 ５）オリゴ糖類は四糖類、六糖類、八糖類、十糖類、十二糖類、十四糖類又は十 六糖類であることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の複合体。 ６）成分（ｂ）は硫酸ヘパラン又は低分子量硫酸ヘパラン又は硫酸ヘパラン断片 又は硫酸ヘパランから誘導したオリゴ糖類であることを特徴とする特許請求の範 囲第２項又は第３項記載の複合体。 ６７）オリゴ糖は四糖類、六糖類、八糖類、十糖類、十二糖類、十四糖類又は十 六糖類であることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の複合体。 ８）特許請求の範囲第１項の成分（ｂ）は塩の形態としたことを特徴とする特許 請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか１項記載の複合体。 ９）ナトリウム又はカルシウム塩であることを特徴とする特許請求の範囲第８項 記載の複合体。 １０）塩はナトリウム塩であることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の複 合体。 １１）（ａ）銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン及び亜鉛 イオンから選択した金属イオンを、 （ｂ）ヘパリン、硫酸ヘパラン、低分子量ヘパリン、低分子硫酸ヘパラン、ヘパ リン断片、硫酸ヘパラン断片、又はヘパリン又は硫酸ヘパランから誘導したオリ ゴ糖、又はその塩で 反応させ、その後このように形成された複合体を単離する特許請求の範囲第１項 乃至第１０項に記載した複合体の製造法。 １２）ヘパリン、硫酸ヘパラン、低分子量ヘパリン、低分子量硫酸ヘパラン、ヘ パリン断片、硫酸ヘパラン断片、ヘパリン又は硫酸ヘパランから誘導したオリゴ 糖類を銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン及び亜鉛イオン から選択した金属イオンを含有する固体マトリックスに添加し、該マトリックス 上のイオンに結合しない添加材料の画分を分離し、マトリックス上の金属イオン に結合した画分を単離することを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第１０項 に記載した複合体の製造法。 １３）金属イオン成分（ａ）は銅イオンであり、複合体の単離をイミノニ酢酸基 を含有するイオン交換マトリックスを用いて行うことを特徴とする特許請求の範 囲第１項又は第１２項記載の複合体の製造法。 １４）アンギオスタティック成分、特にいわゆるアンギオスタティックステロイ ド成分と共に治療に使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第１０ 項に記載した複合体の用途。 １５）血管形成の減少の所望されている病気の治療にアンギオスタティック成分 、特にいわゆるアンギオスタテイックステロイド成分と共に使用することを特徴 とする特許請求の範囲第１項乃至第１０項に記載した複合体の用途。 １６）血管形成の減少が所望されている病気の治療の薬剤を製造するために使用 することを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第１０項に記載した複合体の用 途。 １７）アンギオスタティック成分、特にいわゆるアンギオスタティックステロイ ド成分と共に特許請求の範囲第１項乃至第１０項に記載した複合体を治療上有効 量だけ投与するこのような治療を必要とする動物または人間における血管形成を 低下させる方法。 １８）活性成分として特許請求の範囲第１項乃至第１０項に記載した複合体から 成る薬剤組成物。 １９）銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン及び亜鉛イオン から選択した金属イオンのμｍｏｌｅ当り５乃至１０００ｎｍｏｌｅの結合容量 を有するヘパリン、硫酸ヘパラン、低分子量ヘパリン、低分子量硫酸ヘパラン、 ヘパリン断片、硫酸ヘパラン断片或いはヘパリン又は硫酸ヘパランから誘導した オリゴ糖類の画分又はその画分の塩。