DE69713514T2 - Festphasenträgeroberfläche die toxin-bindende oligosaccharide enthalten - Google Patents
Festphasenträgeroberfläche die toxin-bindende oligosaccharide enthaltenInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
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Description
- Die Erfindung betrifft neue feste Trägermatrices mit einem Oligosaccharid, das Toxine von krankheitsverursachenden Mikroorganismen bindet. Die Matrixaspekte der Erfindung betreffen insbesondere neue feste Trägermatrices, wobei ein toxinbindendes Oligosaccharid an einen festen Träger über einen Verbindungsarm kovalent gebunden ist, der mindestens 8 Atome umfasst und das Oligosaccharid vom festen Träger beabstandet.
- Die Bindung von Toxinen krankheitsverursachender Mikroorganismen lässt sich in vitro und in vivo erreichen. Erzielt man die Bindung in vivo, dann werden die hier beschriebenen Matrices vorzugsweise über eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht. Somit betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine hier beschriebene feste Trägermatrix umfassen.
- Die nachfolgenden Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden in der Anmeldung in Form hochgestellter Zahlen zitiert:
- 1 Bartlett, J. G., et al., "Antibiotic-Associated Pseudomembranous Colitis Due to Toxin-Producing Clostridia", N. Engl. J. Med. 298: 531-534 (1978).
- 2 Lyerly, D. M., "Epidemiology of Clostridium difficile Disease", Clin. Microbial. News 15: 49-53 (1993).
- 3 Heerze, L. D., et al., "Oligosaccharide Sequences Attached to an Inert Support (SYNSORB) as Potential Therapy for Antibiotic-Associated Diarrhea and Pseudomembranous Colitis", J. Infect. Dis. 169: 1291-1296 (1994).
- 4 Heerze, L. D., et al., U.S.-Patent 5 484 773, für "Treatment of Antibiotic Associated Diarrhea", eingereicht 16. Januar 1996.
- 5 Spangler, B. D., "Structure and Function of Cholera Toxin and Related Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin", Microbiological Reviews 56(4): 622-647 (1992).
- 6 Edelman, R., et al., "Summary of the International Symposium and Workshop on Infections Due to Verocytotoxin (Shiga-like Toxin)-Producing Escherichia coli", J. Infect. Dis. 157: 1102-1104 (1988).
- 7 Armstrong, G. D., et al., "Investigation of Shiga-like Toxin Binding to Chemically Synthesized Oligosaccharide Sequences", J. Infect. Dis. 164: 1160-1167 (1991).
- 8 Armstrong, G. D., et al., " A Phase I Study of Chemically Synthesized Verotoxin (Shiga-like Toxin) Pk- Trisaccharide Receptors Attached to Chromosorb For Preventing Hemolytic-Uremic Syndrome", J. Infect. Dis. 171: 1042-1045 (1995).
- 9 Rafter et al., U.S.-Patentanmeldung laufende Nr. 08/669 004, für "Treatment of Bacterial Dysentery", eingereicht 21. Juni 1996.
- 10 Karlsson, K.-A., "Animal Gylcosphingolipids as Membrane Attachment Sites for Bacteria", Ann. Rev. Biochem. 58: 309-350 (1989).
- 11 Fishman, P. H., "Gangliosides as Receptors for Bacterial Enterotoxins", Adv. Lipid Res. 25: 165-187 (1993).
- 12 Blomberg, L., U.S.-Patent 4 923 980 für "Process for the Manufacture of a Gel Product", eingereicht 8. Mai 1990.
- 13 Blomberg, L., et al., "Immobilization of Reducing Oligosaccharides to Matrices by a Glycosylamide Linkage", J. Carbohydr. Chem. 12: 265-276 (1993).
- 14 Hutchins, S. M., et al., "A Strategy for Urea Linked Diamine Libraries", Tetrahedron Letters 36: 2583-2586 (1995)
- 15 Ratcliffe et al., U.S.-Patent 5 079 353
- 16 Weetal et al., "Porous Glass for Affinity Chromatography Applications" in Methods in Enzymology, Bd. XXXIV, (Jacoby et al., Hrsg.), Academic Press, New York (1974) S. 59-72.
- 17 Dubois et al., "Colorimetric Methods for Determination of Sugars and Related Substances", Anal. Chem. 28: 350-356 (1956)
- 18 Blanken und vän de Eijnden, "Biosynthesis of Terminal Ga1α1-3Ga1βJ1-4GlcNAc Oligosaccharide Sequences an Glycoconjugates, J. Biol. Chem. 260: 12927-12934 (1985)
- 19 Palcic et al., "The Use of Hydrophobic Synthetic Glycosides as Acceptors in Glycosyltransferase Assays, Glycconj. J. 5: 49-63 {1988)
- Alle obigen Veröffentlichungen, Patente und Patenanmeldungen sind hier durch Bezugsnahme in ihrer Gänze aufgenommen, als sei für jede einzelne Veröffentlichung, jedes einzelne Patent oder jede einzelne Patentanmeldung speziell und einzeln angegeben, dass sie/es durch Bezugnahme in ihrer Gänze aufgenommen ist.
- Bekanntlich verursachen von Bakterien und anderen Organismen produzierte Toxine eine Reihe Erkrankungen des Menschen, einschließlich vieler Diarrhöerkrankungen. So ist zum Beispiel das von dem anaeroben Organismus Clostridium difficile gebildete Toxin A die Hauptursache einer mit Antibiotika einhergehenden Diarrhö ("C. difficileassoziierte Diarrhö" oder "CDAD") und von pseudomembranöser Colitis ("PMC")¹&supmin;&sup4;. Ebenso hat man das hitzelabile Enterotoxin ("LT"), das von bestimmten enterotoxigenen Escherichia coli-Stämmen sezerniert wird, als Ursache der bakterieninduzierten Reisediarrhö identifiziert&sup5;. Zudem sind bekanntlich die von enterohämorrhagischen E. coli gebildeten Shiga-ähnlichen Toxine ("SLT") für hämorrhagische Colitis und das hämolytisch-urämische Syndrom verantwortlich&sup6;&supmin;&sup8;. Shiga-ähnliche Toxine gehen zudem mit einer bakterienverursachten Dysenterie einher&sup9;. Von besonderer Bedeutung ist das von Vibrio cholerae gebildete Choleratoxin ("CT"), das als Ursache der schwerwiegenden Diarrhöerkrankung Cholera identifiziert wurde&sup5;.
- Bekanntlich binden viele Toxine krankheitsverursachender Mikroorganismen beim Anfangsschritt der pathologischen Entwicklung des mit ihnen einhergehenden Leidens an Oligosaccharidrezeptoren auf Wirtszellen10,11. Ein in der Literatur beschriebener Ansatz zur Diagnose und Behandlung der toxinvermittelten Erkrankungen ist daher die Adsorption des Toxins aus einer toxinhaltigen Probe oder aus dem Darm, beispielsweise unter Verwendung eines Oligosaccharidrezeptors-Analogons, welches das Toxin bindet und an einem inerten festen Träger immobilisiert ist.
- Heerze et al. haben zum Beispiel beschrieben, dass Toxin A von Clostridium difficile an bestimmte synthetische Oligosaccharidsequenzen bindet, die an einen inerten festen Träger über einen Verbindungsarm mit mindestens einem Kohlenstoffatom kovalent gebunden sind, wobei der Verbindungsarm -O(CH&sub2;)&sub8;C(O)- als spezielles Beispiel genannt wird³. Es wird beschrieben, dass die oligosaccharidhaltigen festen Träger die Toxin-A-Aktivität in Stuhlproben von Patienten mit C. difficile-assoziierter Diarrhö effizient neutralisieren.
- Zudem haben Heerze et al. pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart mit einer Oligosaccharidsequenz, die an einen pharmazeutisch verträglichen, festen, inerten Träger über einen verträglichen Nicht-Peptidyl-Verbindungsarm gebunden sind, wobei die Oligosaccharidsequenz an Toxin A bindet&sup4;. Es werden zudem Verfahren zur Behandlung von Toxin-A-vermittelter Diarrhö unter Verwendung der Zusammensetzungen offenbart.
- Ebenso beschreiben Armstrong et al., dass Shigaähnliche Toxine, z. B. SLT-I und SLT-II/IIc, an bestimmte synthetische αGal(1-4)βGa1-Sequenzen binden, die an einen inerten festen Träger über einen Verbindungsarm -O(CH&sub2;)&sub8;C(O)- kovalent gebunden sind7,8.
- Im Fachgebiet sind zwar verschiedene oligosaccharidhaltige feste Trägermatrices bekannt, aber die üblichen Verfahren zur Herstellung dieser Matrices beinhalten die arbeitsaufwändige chemische Synthese eines komplexen Oligosaccharids mit einem funktionalisierten Verbindungsarm, über den es an einen festen Träger gekuppelt werden kann (z. B. einen Verbindungsarm -O(CH&sub2;)&sub8;C(O)-). Die Synthese dieser Oligosaccharide erfordert gewöhnlich den selektiven Schutz sowie die Entfernung der Schutzgruppen von verschiedenen funktionellen Gruppen am Oligosaccharid (z. B. von Hydroxylgruppen), damit die gewünschte Zuckerstruktur synthetisiert und in geeigneter Weise an den festen Träger gebunden werden kann. Diese komplexen Syntheseverfahren sind recht aufwändig bei insgesamt niedrigen Ausbeuten aufgrund der recht hohen Zahl an einzelnen Reaktionsschritten. Offensichtlich verhindert die Kombination von komplexer Chemie und niedrigen Gesamtausbeuten eine allgemeine kommerzielle Entwicklung und Verwendung dieser Matrices.
- Dagegen haben Blomberg et al. ein Verfahren zur Matrixherstellung offenbart, welches ein reduzierendes Oligosaccharid an die Amingruppe eines Abstandshalter-Armes kuppelt, der an einen festen Träger gebunden ist, unter Bildung einer Glycosylamid-Bindung12,13. Die von Blomberg et al. beschriebenen Verfahren erfordern keinen Schutz und keine Entfernung von Schutzgruppen von Hydroxylgruppen am reduzierenden Oligosaccharid. Nach der Bindung wird die erhaltene Glycosylamin-Bindung acyliert, wobei eine Gycosylamid-Bindung gebildet wird. Blomberg et al. offenbaren zudem, dass die Länge des bei diesen Materialien eingesetzten Abstandshalter-Armes nicht entscheidend ist, dass aber Abstandshalter-Arme mit weniger als 25 Atomen bevorzugt sind.
- Die Erfindung betrifft teilweise die Entdeckung, dass bestimmte neue feste Trägermatrices, worin ein toxinbindendes Oligosaccharid über einen Glycosylamid- Verbindungsarm mit mindestens 8 Atomen kovalent an einen festen Träger gebunden ist, überraschende und unerwartete Ergebnisse bei der Neutralisierung verschiedener Toxine von krankheitsverursachenden Mikroorganismen erbringen, insbesondere bei Toxin A, hitzlabilem Enterotoxin und Choleratoxin, wenn man sie mit ähnlichen Matrices vergleicht, die einen Verbindungsarm mit weniger als 8 Atomen haben.
- Blomberg et al. beschreiben zwar, dass ein Harz mit Globotriöse (d. h. Ga1α1-4Ga1β1-4G1c), die über einen kurzen Abstandshalter-Arm mit 5 Atomen über eine Glycosylamid-Bindung kovalent an eine Fractogel-Matrix gebunden ist, Shiga-Toxin direkt aus einem rohen, zellfreien Gemisch von Shigella dysenteriae bindet¹³. Es gibt jedoch keine Offenbarung in Blomberg et al., dass die Matrices eine erheblich bessere Bindung für ein Spektrum von Toxinen zusätzlich zu Shiga-Toxin ergeben, wenn sie längere Abstandshalter-Arme enthalten.
- Die Erfindung stellt neue feste Trägermatrices bereit, die sich zur Diagnose oder Neutralisierung verschiedener Toxine von krankheitsverursachenden Mikroorganismen eignen. Unter einem ihrer Zusammensetzungsaspekte betrifft somit die Erfindung eine feste Trägermatrix der Formel:
- worin ist:
- SS ein fester Träger;
- R¹ ausgewählt aus der Gruppe kovalente Bindung und divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen;
- R² eine divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen;
- X' jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe -O- und > NR&sup4;, wobei R&sup4; jeweils unabhängig ausgewählt ist aus Wasserstoff, -R²NH&sub2; oder -R²NR³Z, wobei R² wie oben definiert ist;
- R³ ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff und -C(O)R&sup5;, wobei R&sup5; Hydrocarbyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist;
- W ausgewählt aus Sauerstoff oder Schwefel;
- X ausgewählt aus der Gruppe -NH-, -O- und -S-;
- Y ausgewählt aus der Gruppe -NH-, -O- und -S-;
- Z ein toxinbindendes Oligosaccharid;
- p eine ganze Zahl von 0 bis 50 oder mehr und
- n eine ganze Zahl, dass die Matrix einen Beladungsgrad mit toxinbindendem Oligosaccharid von etwa 0,001 bis etwa 2000 Mikromol pro Gramm fester Träger besitzt, wobei die Zahl der Atome zwischen dem festen Träger
- und dem toxinbindenden Oligosaccharid insgesamt mindestens 8 ist.
- Bei besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Matrices sind X und Y NH, W ist Sauerstoff, p ist 0 und R² ist eine Alkylengruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen. Diese bevorzugten Matrices werden dargestellt durch die Formel:
- worin SS, R¹, R³, Z und n wie oben definiert sind und R&sup6; eine Alkylengruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.
- Unter einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die sich zur Behandlung in vivo einer toxinvermittelten Krankheit bei einem Säuger eignet, wobei die Zusammensetzung eine oben beschriebene feste Trägermatrix und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, der sich zur oralen Verabreichung eignet und wobei die Matrix aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann.
- Die Erfindung beruht u. a. auf der überraschenden und unerwarteten Entdeckung, dass der Verbindungsarm, der in den neuen, erfindungsgemäßen festen Trägermatrices das toxinbindende Oligosaccharid mit dem festen Träger kovalent verbindet, mindestens 8 Atome enthalten muss, die den festen Träger vom Oligosaccharid trennen, damit das Oligosaccharid effizient an Toxin in der toxinhaltigen Probe bindet.
- Es zeigt/zeigen:
- Fig. 1-10 die chemischen Strukturen verschiedener Oligosaccharide, die an in Tabelle 1 beschriebene feste Trägermatrices gebunden sind;
- Fig. 11-13 die chemische Struktur von SYNSORB 16, SYNSORB 89 bzw. SYNSORB Cd;
- Fig. 14 die Neutralisierung der Hämagglutinierungswirkung von gereinigtem Toxin A unter Verwendung fester oligosaccharidhaltiger Trägermatrices.
- Wie oben beschrieben, betrifft die Erfindung teilweise neue feste Trägermatrices, an die über einen Verbindungsarm ein Oligosaccharid kovalent gebunden ist, das Toxine von krankheitsverursachenden Mikroorganismen bindet. Bevor die Erfindung eingehender erläutert wird, werden zunächst die folgenden Begriffe definiert.
- Die folgenden, hier verwendeten Begriffe haben, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben, die folgenden Bedeutungen.
- Der Begriff "ein toxinbindendes reduzierendes Oligosaccharid" betrifft Oligosaccharidstrukturen, die von Bakterien exprimierte Toxine binden, wobei sich die Oligosaccharide in ihrer reduzierten Form befinden. D. h. das anomere Kohlenstoffatom des reduzierenden Zuckers liegt in ungeschützter Form als -OH vor. Beispiele für toxinbindende Oligosaccharide sind im Fachgebiet bekannt und beispielsweise von Heerze et al.3,4 und Armstrong et al.7,8 offenbart.
- Der Begriff "Hydrocarbyl" betrifft einwertige Reste, die nur Kohlenstoff und Wasserstoff umfassen, und beinhaltet zum Beispiel Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl und dgl.
- Der Begriff "Alkyl" betrifft gerad- oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit mindestens 1 Kohlenstoffatom und vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Übliche Alkylgrupen sind u. a. beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, sek.-Butyl, n-Decyl und dgl.
- Der Begriff "Alkenyl" betrifft gerad- oder verzweigtkettige Alkenylgruppen mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, und an mindestens 1 Stelle einer ungesättigten Doppelbindung. Übliche Alkenylgrupen sind u. a. beispielsweise Ethenyl (- CH=CH&sub2;), 1-Propenyl (-CH=CHCH&sub3;), 2-Propenyl (-CH&sub2;CH=CH&sub2;), 2-Butenyl (-CH&sub2;CH=CHCH&sub3;) und dgl. Selbstverständlich umfasst diese Definition sämtliche Isomere, z. B. cis- und trans-Isomere.
- Der Begriff "Alkinyl" betrifft gerad- oder verzweigtkettige Alkinylgruppen mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, und an mindestens 1 Stelle einer ungesättigten Dreifachbindung. Übliche Alkinylgrupen sind u. a. beispielsweise Ethinyl (- CH=CH), Propargyl (-CH&sub2;OEOH) und dgl.
- Der Begriff "Aryl" betrifft ungesättigte aromatische carbozyklische Gruppen mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen und einem einzelnen Ring oder mehreren kondensierten Ringen, der/die gegebenenfalls mit 1 bis 3 Substituenten aus Halogen, Nitro, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Trihalogenmethyl und dgl. substituiert ist/sind. Beispiele für Arylgruppen sind u. a. Phenyl, p-Nitrophenyl, Naphthyl und dgl.
- Der Begriff "Hydrocarbylen" betrifft zweiwertige Reste, die nur Kohlenstoff und Wasserstoff umfassen und zu denen beispielsweise Alkylen-, Alkenylen-, Alkinylen-, Arylengruppen und dgl. gehören.
- Wenn es die spezifische Definition einer Alkylengruppe nicht anders erfordert, betrifft der Begriff "Alkylen" gerad- oder verzweigtkettige Alkylengruppen mit mindestens 1 Kohlenstoffatom und vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Übliche Alkylengrupen sind u. a. beispielsweise Methylen (-CH&sub2;-), Ethylen (-CH&sub2;OH&sub2;-), Propylen (-CH&sub2;OH&sub2;OH&sub2;-), iso-Propylen (-CH (CH&sub3;) CH&sub2;-), n-Butylen (-CH&sub2;OH&sub2;OH&sub2;OH&sub2;-), sek. -Butylen (-CH (CH&sub2;CH&sub3;) CH&sub2;-) und dgl.
- Der Begriff "Alkenylen" betrifft gerad- oder verzweigtkettige Alkenylengruppen mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, und an mindestens 1 Stelle einer ungesättigten Doppelbindung. Übliche Alkenylengrupen sind u. a. beispielsweise Ethenylen (-CH=CH-), 1-Pröpenylen (-CH=CHCH&sub2;-), 2-Propenylen (-CH&sub2;CH=CH-), 2-Butenylen (-CH&sub2;CH=CHCH&sub2;--) und dgl. Selbstverständlich umfasst diese Definition sämtliche Isomere, z. B. cis- und trans-Isomere.
- Der Begriff "Alkinylen" betrifft gerad- oder verzweigtkettige Alkinylengruppen mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, und an mindestens 1 Stelle einer ungesättigten Dreifachbindung. Übliche Alkinylengrupen sind u. a. beispielsweise Ethinylen (-C C-), Propargylen (-CH&sub2;C C-) und dgl.
- Der Begriff "Arylen" betrifft ungesättigte aromatische carbozyklische Gruppen mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen und einem einzelnen Ring oder mehreren kondensierten Ringen sowie zwei Bindungsstellen, die gegebenenfalls mit 1 bis 2 Substituenten aus Halogen, Nitro, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Trihalogenmethyl und dgl. substituiert sind. Beispiele für Arylengruppen sind u. a. 1,4-Phenylen (z. B.
- )
- und dgl. Selbstverständlich umfasst der Begriff Arylen sämtlich möglichen Bindungsstellen (z. B. 1,4-Phenylen, 1,3-Phenylen und dgl.).
- Der Begriff "Verbindungsarm" oder "Abstandhalter-Arm" betrifft die chemische Gruppe, die das Oligosaccharid kovalent an den festen Träger bindet. Die Anzahl Atome im Verbindungsarm, der das Oligosaccharid vom festen Träger trennt, wird durch Addieren aller linearen Atome in der Gruppe
- bestimmt. D. h. die linearen Atome umfassen die Summe der Atome in R¹, X, X', Y, R² plus 2 (d. h. das Kohlenstoffatom und das Stickstoffatom in der linearen Kette).
- Der Begriff "Oxyalkyleneinheit" betrifft eine Ethereinheit mit der allgemeinen Formel -RbO-, wobei Rb eine Alkylengruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
- Der Begriff "Poly(alkylenamin)" betrifft ein Polymer oder Oligomer der allgemeinen Formel -(RaNH)c-, wobei Ra eine Alkylengruppe ist, vorzugsweise mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, und c eine ganze Zahl über 1 und vorzugsweise etwa 12 oder weniger ist. Wird auf die Anzahl Alkylenamineinheiten in einer bestimmten Poly(alkylenamin)- Verbindung verwiesen, betrifft diese Zahl selbstverständlich die durchschnittliche Anzahl Alkylenamineinheiten in diesen Verbindungen, wenn nicht anders angegeben. Eine Mono(alkylenamin)-Gruppe enthält 1 Alkylenamineinheit. Beispiele für Poly(alkylenamine) sind u. a. beispielsweise -(CH&sub2;CH&sub2;NH)z-, wobei z eine ganze Zahl von 2 bis 12 ist.
- Der Begriff "Pöly(oxyalkylen)" betrifft ein Polymer oder Oligomer der allgemeinen Formel - (RbO) d-, wobei Rb eine Alkylengruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und d eine ganze Zahl über 1 und gewöhnlich etwa 50 oder weniger ist. Wird auf die Anzahl Oxyalkyleneinheiten in einer bestimmten Poly(oxyalkylen)-Verbindung verwiesen, betrifft diese Zahl selbstverständlich die durchschnittliche Anzahl Oxyalkyleneinheiten in diesen Verbindungen, wenn nicht anders angegeben. Eine Mono(oxyalkylen)-Gruppe enthält 1 Oxyalkyleneinheit.
- Der Begriff "fester Träger" betrifft ein inertes festes Material, an das ein Oligosaccharid über einen Verbindungsarm gebunden werden kann. Bei Verwendung in vivo ist der feste Träger biologisch und pharmazeutisch verträglich. Geeignete Träger sind u. a. Silica einschließlich synthetischer Silikate, wie poröses Glas; biogene Silikate, wie Diatomeenerde; silikathaltige Mineralien, wie Kaolinit; synthetische Polymere, wie Polystyrol, Polypropylen usw.; Polysaccharide, wie Dextrane, Cellulosen (CMC), Alginate, Chitine und Chitosane, und dgl.
- Erfindungsgemäß bevorzugt verwendete feste Trägermaterialien sind Silica-Träger, die mit ω-Aminoalkyltrialkoxysilan unter Verwendung herkömmlicher Verfahren silylaminiert worden sind. Geeignete ω-Aminoalkyltrialkoxysilane sind u. a. beispielsweise 3-Aminopropyltriethoxysilan, 4-Aminobutyltriethoxysilan und dgl. Ein bei den Silylaminierungsumsetzungen besonders bevorzugt eingesetztes Silica wird unter dem Handelsnamen Chromosorb PTM von Manville Corp., Denver, Colorado, kommerziell vertrieben.
- Der Begriff "mit Antibiotika einhergehende bakterielle Diarrhö" betrifft den Zustand, bei dem eine Antibiotikatherapie das Gleichgewicht der Mikrobenflora im Darm stört, sodass sich pathogene Organismen wie Clostridium difficile vermehren können. Diese Organismen verursachen Diarrhö. Eine mit Antibiotika einhergehende bakterielle Diarrhö umfasst zum Beispiel Störungen wie C. difficileassoziierte Diarrhö (CDAD) und pseudomembranöse Colitis (PMC).
- Der Begriff "biologisch verträglich" betrifft chemisch inertes Verhalten gegenüber menschlichen Geweben oder Körperflüssigkeiten. Biologisch verträgliche Materialien sind nicht sensibilisierend.
- Der Begriff "Cholera" betrifft eine akute epidemische Infektionskrankheit, die von Vibrio cholerae verursacht wird. Das von Vibrio im Darmtrakt gebildete lösliche Toxin verändert die Durchlässigkeit der Schleimhaut und verursacht eine ausgiebige wässrige Diarrhö, extremen Flüssigkeits- und Elektrolytverlust, Entwässerung und Kollaps, aber keine große morphologische Veränderung in der Darmschleimhaut.
- Der Begriff "Choleratoxin" betrifft ein Enterotoxin von V. cholerae, das Cholera und verwandte Leiden verursacht. Das Toxin hat eine lectinähnliche Wirkung.
- Der Begriff "hitzelabiles Toxin" oder "LT" betrifft ein Enterotoxin aus enterotoxigenen E. coli, welches Reisediarrhö und verwandte Leiden hervorruft. Das Toxin hat eine lectinähnliche Wirkung.
- Der Begriff "pseudomembranöse Colitis" (PMC), auch pseudomembranöse Enterocolitis oder Enteritis, betrifft die Entzündung der Schleimhaut von Dünn- und Dickdarm unter Bildung und Einleitung von pseudomembranösem Material (aus Fibrin, Schleim, nekrotischen Epithelzellen und Leukozyten) in den Stuhl.
- Der Begriff "Toxin A" betrifft ein Enterotoxin von Clostridium difficile, welches CDAD und verwandte Leiden verursacht. Das Toxin hat eine lectinähnliche Wirkung.
- Der Begriff "Reisediarrhö" betrifft eine plötzlich auftretende Diarrhö, die oft mit Unterleibskrämpfen, Erbrechen und Fieber einhergeht und bei Reisenden in der Regel in der ersten Reisewoche sporadisch auftritt. Diese Diarrhö wird meist von enterotoxigenen E. coli verursacht.
- Für die Zwecke dieser Anmeldung sind alle Zucker unter Verwendung der üblichen Dreibuchstabennomenklatur angegeben. Wenn nicht anders angegeben, haben alle Zucker die D-Form, ausgenommen Fucose, die in der L-Form vorliegt. Zudem haben alle Zucker Pyranoseform.
- Die erfindungsgemäßen oligosaccharidhaltigen festen Trägermatrices lassen sich mit den folgenden allgemeinen Verfahren herstellen. Sind übliche oder bevorzugte Verfahrensbedingungen angegeben (z. B. Reaktionstemperaturen, Zeiten, Molverhältnisse der Teaktanten, Lösungsmittel, Drücke usw.), können offensichtlich auch andere Verfahrensbedingungen verwendet werden, wenn nicht anders angegeben. Optimale Reaktionsbedingungen variieren je nach den verwendeten Reaktanten oder Lösungsmitteln. Der Fachmann kann diese Bedingungen durch routinemäßige Optimierungsverfahren ermitteln.
- Erfindungsgemäße oligosaccharidhaltige feste Trägermatrices lassen sich herstellen durch Zusammenbringen funktionalisierter fester Trägermaterialien der Formel:
- mit einem Verbindungsreagenz der Formel HY-(R²X')pR²NH&sub2; unter solchen Bedingungen, dass ein aminofunktionalisiertes festes Trägermaterial hergestellt wird der Formel:
- worin SS, W, X, X', Y, R¹, R² und p wie oben definiert sind und T aus der Gruppe Halogen und -OR&sup7; ausgewählt ist, wobei R Alkyl, Halogenalkyl oder Aryl ist; n' eine ganze Zahl ist, dass die Matrix einen Beladungsgrad mit der funktionellen Gruppe R¹XC(= W)T oder R¹-N=C=W von etwa 0,001 bis etwa 2000 umol pro Gramm Matrix besitzt; und n" eine ganze Zahl ist, dass das aminofunktionalisierte feste Trägermaterial eine Beladung mit Aminogruppen von etwa 0,001 bis etwa 2000 umol pro Gramm besitzt.
- Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise unter Verwendung eines Überschusses Verbindungsreagenz, bezogen auf die funktionellen Gruppen R¹XC(=W)T oder R¹-N=C=W, sodass Vernetzung des festen Trägers minimiert oder verhindert wird. Stärker bevorzugt werden etwa 2 bis etwa 50 Moläquivalente Verbindungsreagenz bei der Umsetzung eingesetzt, bezogen auf die funktionellen Gruppen R¹XC(=W)T oder R¹-N=C=W. Ist T eine Halogengruppe, erfolgt die Umsetzung vorzugsweise in Anwesenheit von mindestens einem Moläquivalent, bezogen auf das Verbindungsreagenz, eines geeigneten tertiären Amins, wie Diisopropylethylamin, Triethylamin, Pyridin und dgl., sodass die bei der Umsetzung gebildete Säure abgefangen wird.
- Die Umsetzung erfolgt gewöhnlich bei einer Temperatur von etwa -70ºC bis etwa 70ºC in einem im Wesentlichen wasserfreien inerten Verdünnungsmittel, wie Dimethylformamid, etwa 1 bis etwa 24 Stunden lang. Nach Beendigung der Umsetzung wird das aminofunktionalisierte feste Trägermaterial mit herkömmlichen Verfahren gewonnen, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation und dgl.. Das gewonnene Material wird gegebenenfalls ein- oder mehrmals mit einem im Wesentlichen wasserfreien inerten Verdünnungsmittel gewaschen, wie Dimethylformamid und dgl., wobei nicht umgesetztes, überschüssiges Verbindungsreagenz und andere lösliche Materialien entfernt werden.
- Die erfindungsgemäß eingesetzten funktionalisierten festen Trägermaterialien sind im Fachgebiet bekannt und lassen sich mit herkömmlichen Verfahren herstellen. Zum Beispiel lässt sich dieses Material aus einem festen Träger herstellen, der eine funktionelle Amino-, Hydroxyl- oder Thiolgruppe enthält, indem der feste Träger mit einem bifunktionellen Reagenz der Formel L-C(=W)T umgesetzt wird, wobei T und W wie oben definiert sind und L eine geeignete Abgangsgruppe ist, wie ein Halogen oder -ORa, wobei R&sup8; Alkyl, Halogenalkyl, Aryl oder substituiertes Aryl ist. Geeignete Bedingungen zur Herstellung eines funktionalisierten festen Trägers unter Verwendung von p- Nitrophenylchlorformiat sind zum Beispiel von S. M. Hutchins et al. in Tetrahedron Letters¹&sup4; beschrieben.
- Beispielhafte bifunktionelle Reagenzien, die sich zur Herstellung funktionalisierter fester Trägermaterialien eignen, sind z. B. Alkylhalogenformiate, wie Methylchlorformiat, Methylbromformiat, Ethylchlorformiat, n- Propylchlorformiat und dgl.; Halogenalkylhalogenformiate, wie Trichlormethylchlorformiat (Diphosgen); Arylhalogenformiate, wie Phenylchlorformiat, p-Chlorphenylchlorformiat, p-Nitrophenylchlorformiat und dgl.; Phosgen; Thiophosgen und andere geeignete Phosgen- und Thiophosgenäquivalente. Diese bifunktionellen Reagenzien sind im Fachgebiet bekannt und in der Regel kommerziell erhältlich.
- Die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungsreagenzien sind entweder bekannte Verbindungen oder lassen sich durch übliche Verfahren aus bekannten Verbindungen herstellen. Das Verbindungsreagenz enthält gewöhnlich eine funktionelle Hydroxyl-, Thiol- oder primäre Aminogruppe an oder nahe einem Ende des Reagenz-Grundgerüstes sowie eine oder mehr primäre Aminogruppen an oder nahe dem anderen Ende des Reagenzes. Enthält das Reagenz eine funktionelle Hydroxyl- oder Thiolgruppe, ist es möglicherweise vorzuziehen, die primäre(n) Aminogruppe(n) im Reagenz zu blokkieren, damit die Hydroxyl- oder die Thiolgruppe selektiv mit dem funktionalisierten festen Trägermaterial reagieren kann. Wenn nötig, können primäre Aminogruppen unter Verwendung herkömmlicher Schutz- oder Blockierungsgruppen geschützt werden, z. B. Cbz, t-Boc usw., die dem Fachmann bekannt sind.
- Eine erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Gruppe der Verbindungsreagenzien sind Alkylendiamine der Formel H&sub2;N- R&sup9;-NH&sub2;, wobei R&sup9; eine Alkylengruppe mit 2 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen ist. Beispiele für Alkylendiamine sind u. a. 1,4-Diaminobutan (n-Butylendiamin), 1,5-Diaminopentan, 1,6-Diaminohexan, 1,8-Diaminooctan und dgl. Besonders bevorzugte Alkylendiamine sind 1,4-Diaminobutan und 1,6- Diaminohexan.
- Eine weitere bevorzugte Gruppe der Verbindungsreagenzien sind Polyoxyalkylendiamine der Formel H&sub2;N-(R¹&sup0;O) p,R¹&sup0;- NH&sub2;, wobei R¹&sup0; eine Alkylengruppe mit 2 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen ist und p' eine ganze Zahl von 1 bis etwa 50 ist. Bevorzugte Polyoxyalkylendiamine sind u. a. 1,8- Diamino-3,6-dioxaoctan und 1,11-Diamin-3,6,9-trioxaundecan.
- Eine weitere bevorzugte Gruppe der Verbindungsreagenzien sind Polyalkylenpolyamine der Formel H&sub2;N-(R¹¹NH)p"-H, wobei Rll einen Alkylengruppe mit 2 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen ist und p" eine ganze Zahl von 2 bis etwa 20 ist. Beispiele für geeignete Polyalkylenpolyamine sind u. a. Diethylentriamin, Dipropylentriamin, Diisopropylentriamin, Dibutylentriamin, Triethylentetraamin, Tetraethylenpentaamin und dgl. Besonders bevorzugte Polyalkylenpolyamine sind Di-, Tri- und Tetraethylenamine.
- Das wie oben beschrieben hergestellte aminofunktionalisierte feste Trägermaterial wird dann an ein toxinbindendes reduzierendes Oligosaccharid gekuppelt, sodass eine oligosaccharidhaltige feste Trägermatrix hergestellt wird der Formel:
- worin SS, W, X, X', Y, Z, R¹, R², n und p wie oben definiert sind.
- Diese Umsetzung erfolgt vorzugsweise durch Zusammenbringen des aminofunktionalisierten festen Trägermaterials mit etwa 1 bis etwa 1000 Moläquivalenten (bevorzugt 74), bezogen auf die primären Aminogruppen des Verbindungsarms, des toxinbindenden reduzierenden Oligosaccharids unter Bedingungen wie von Blomberg et al. beschrieben12,13. Vorzugsweise wird bei der Umsetzung eine katalytisch wirkende Menge Essigsäure oder einer ähnlichen Säure eingesetzt.
- Die Umsetzung erfolgt bevorzugt in einem inerten Verdünnungsmittel, wie Methanol, Ethanol und dgl., bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 100ºC. Die Umsetzung ist gewöhnlich nach etwa 12 bis etwa 72 Stunden beendet. Nach Beendigung der Umsetzung wird das Produkt mit herkömmlichen Verfahren gewonnen, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation usw.
- Die erfindungsgemäß eingesetzten toxinbindenden reduzierenden Oligosaccharide sind entweder kommerziell erhältliche Zucker (z. B. Lactose) oder lassen sich durch übliche Verfahren herstellen, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel lassen sich die Oligosaccharide durch enzymatische Verfahren oder chemische Totalsynthese unter Verwendung bekannter Verfahren herstellen. Siehe beispielsweise Ratcliffe et al. ¹&sup5;.
- Wahlweise kann unter Verwendung der von Blomberg et al. 12,13 beschriebenen Verfahrens die Glycosylaminbindung, die das Oligosaccharid und den Verbindungsarm verbindet, unter Bildung einer Glycosylamidbindung acyliert werden.
- Bei der Umsetzung bevorzugt verwendete Acylierungsmittel haben die Formel R¹²C(O)-L', wobei R¹² eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 0 (d. h. Formiat) bis etwa 8 Kohlenstoffatomen ist und L' eine geeignete Abgangsgruppe ist. Üblicherweise ist die Abgangsgruppe L' ein Halogenid, z. B. Chlorid oder Bromid, oder eine Carboxylatgruppe der Formel -OC(O)R¹², wobei R¹² wie oben definiert ist. Ersatzweise können auch N-Hydroxysuccinimidester und andere im Fachgebiet bekannte aktivierte Ester verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Acylierungsmittel sind u. a., sind aber nicht beschränkt auf Acetylchlorid, Essigsäureanhyrid, Propionylchlorid, Propionylanhydrid, Butanoylchlorid und dgl. Wird bei der Umsetzung ein Acylhalogenid eingesetzt, wird vorzugsweise mindesten 1 Moläquivalent, bezogen auf das Acylhalogenid, eines tertiären Amins, wie Diisopropylethylamin, Triethylamin, Pyridin und dgl., zum Abfangen der bei der Umsetzung gebildeten Säure eingesetzt.
- Die Acylierungsreaktion erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von etwa -70ºC bis etwa 70ºC in einem Verdünnungsmittel, das unter Reaktionsbedingungen im Wesentlichen wasserfrei inert ist, wie Methanol, Ethanol, Chloroform, Toluol und dgl. Die Umsetzung ist gewöhnlich nach etwa 0,5 bis etwa 24 Stunden beendet. Die oligosaccharidhaltige feste Trägermatrix wird von einem Überschuss Acylierungsmittel üblicherweise durch herkömmliche Verfahren abgetrennt, wie Filtration, Zentrifugation und dgl. Die Matrix wird bevorzugt ein- oder mehrmals in einem geeigneten Verdünnungsmittel gewaschen, zum Beispiel in Wasser, Methanol, Ethanol und dgl., und unter Vakuum getrocknet.
- Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine erfindungsgemäße oligosaccharidhaltige feste Trägermatrix und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die Zusammensetzung aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen eignen sich zur Behandlung in vivo von toxinvermittelten Erkrankungen.
- Bei Verwendung zur oralen Verabreichung, die bevorzugt ist, können die Zusammensetzungen auf mehrere Weisen formuliert werden. Vorzugsweise haben sie flüssige oder halbfeste Form. Für die orale Verabreichung kommen Zusammensetzungen in Betracht, die einen inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, wie Wasser. Es lassen sich auch andere pharmazeutisch verträgliche Flüssigkeiten oder Halbfeststoffe einsetzen. Die Verwendung der Flüssigkeiten und Halbfeststoffen ist dem Fachmann bekannt.
- Zudem sind Zusammensetzungen bevorzugt, die sich mit halbfesten Nahrungsmitteln mischen lassen, wie Apfelsauce, Eiskrem oder Pudding. Es sind Formulierungen ohne unangenehmen Geschmack oder Nachgeschmack bevorzugt. Auch ein Nasen-Magen-Schlauch zur direkten Verabreichung der Zusammensetzungen in den Magen lässt sich einsetzen.
- Es lassen sich auch feste Zusammensetzungen verwenden. Diese setzt man wahlweise und üblicherweise in Formulierungen mit einem pharmazeutisch inerten Träger ein, einschließlich üblichen festen Trägern, wie Lactose, Stärke, Dextrin oder Magnesiumstearat, und die üblicherweise in Tabletten- oder Kapselform dargereicht werden. Die oligosaccharidhaltige feste Trägermatrix lässt sich, besonders in Kapselform, auch ohne Zugabe inerter pharmazeutischer Träger verwenden.
- Die Dosen werden so gewählt, dass das Toxin neutralisiert und aus dem Darm des betroffenen Patienten entfernt wird. Bevorzugte Dosen sind etwa 0,25 bis 1,25 Mikromol Oligosaccharid/kg Körpergewicht/Tag, stärker bevorzugt etwa 0,5 bis 1,0 Mikromol Oligosaccharid/kg Körpergewicht/Tag. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen oligosaccharidhaltigen Matrices bedeutet dies etwa 0,25 bis 1,0 Gramm Matrix/kg Körpergewicht/Tag, was eine Matrixkonzentration im Darm von etwa 20 mg/ml ergibt. Verabreicht wird wahrscheinlich 3- bis 4mal täglich für einen Zeitraum von einer Woche, bis die klinischen Symptome abgeklungen sind. Die Dosishöhe und das Verabreichungsschema können je nach dem absorbierten Toxin, der bestimmten verwendeten Oligosaccharidstruktur und Faktoren, wie Alter und Zustand des Individuums, variieren. Die optimale Dauer zur vollständigen Beseitigung der Toxinwirkung ist etwa 1 Stunde bei 37ºC unter Verwendung einer Matrixkonzentration von 20 mg in 1 ml Probe.
- Wie oben erwähnt, ist die orale Verabreichung bevorzugt. Es werden aber auch Formulierungen für andere Verabreichungsweisen in Betracht gezogen, beispielsweise per rectum. Die Verwendbarkeit der Formulierungen hängen von der besonderen verwendeten Zusammensetzung und der bestimmten Person ab, welche die Behandlung erhält. Diese Formulierungen können einen flüssigen Träger enthalten, der ölig, wässrig, emulgiert sein oder bestimmte, für die Verabreichungsweise geeignete Lösungsmittel enthalten kann.
- Die Zusammensetzungen können in Einheitsdosisform oder in mehrfachen oder geteilten Dosen formuliert werden. Für die oben genannten erwarteten Dosen enthalten die oral verabreichten flüssigen Zusammensetzungen vorzugsweise etwa 1 uMol Oligosaccharid/ml.
- Die erfindungsgemäßen oligosaccharidhaltigen festen Trägermatrices eignen sich zum Neutralisieren von Toxinen krankheitsverursachender Mikroorganismen im Magendarmtrakt eines Säugers sowie bei Diagnoseverfahren zur Bestimmung des Vorliegens der Toxine in biologischen Proben.
- Die oligosaccharidhaltigen festen Trägermatrices lassen sich beispielsweise zur Neutralisierung von Toxin A im Magendarmtrakt eines Säugers gemäß den im U.S.-Patent 5 484 773&sup4; beschriebenen Verfahren einsetzen. Bei dieser Ausführungsform wird das an den festen Träger gebundene Oligosaccharid anhand seiner Fähigkeit zur Bindung von Toxin A ausgewählt. Die Neutralisierung wird zum Beispiel durch orale Verabreichung einer wirksamen Menge der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung erreicht.
- Die erfindungsgemäß bereitgestellten Matrices lassen sich ebenso zur Neutralisierung von SLTs, die von enterohämorrhagischen E. coli exprimiert werden, gemäß den in Armstrong et al. 8,9 beschriebenen Verfahren einsetzen. Bei dieser Ausführungsform wird das an den festen Träger gebundene Oligosaccharid anhand seiner Fähigkeit zur Bindung von SLTs ausgewählt. Die Neutralisierung wird wiederum zum Beispiel durch orale Verabreichung einer wirksamen Menge der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung erreicht.
- Andere Toxine, die auf die oben beschriebene Weise neutralisiert werden können, sind u. a. Choleratoxin, hitzelabiles Toxin und dgl.
- Die erfindungsgemäßen oligosaccharidhaltigen festen Trägermatrices lassen sich zudem zur Entfernung von Toxinen aus dem Blut eines Säugers mittels extrakorporaler Perfusion des Blutes über eine Säule, welche die festen Träger umfasst, und erneutes Einleiten des Blutes in den Säuger verwenden.
- Die erfindungsgemäßen oligosaccharidhaltigen festen Trägermatrices eignen sich zudem zur schnellen, effizienten Bindung physiologischer Konzentrationen von Toxinen, die in biologischen Proben zugegen sind, sodass das Vorliegen und/oder die Menge der Toxine in den Proben untersucht werden kann. Üblicherweise ist die biologische Probe eine Stuhlprobe. Die Probe kann unter Verwendung von Standardverfahren extrahiert und vorbereitet werden. Die Probe oder der Extrakt wird dann mit der oligosaccharidhaltigen festen Trägermatrix unter Bedingungen zusammengebracht, unter denen alle Toxine in der Probe adsorbiert werden.
- Das Toxin kann direkt auf der Oberfläche der oligosaccharidhaltigen festen Trägermatrix gemessen werden, wobei jedes geeignete Nachweissystem eingesetzt wird. Zum Beispiel lassen sich zur Bestimmung der an den Träger gebundenen Toxinmenge radioaktive, biotinylierte oder fluoreszenzmarkierte monoklonale oder polyklonale Antikörper verwenden, die für das Toxin spezifisch sind. Es ist im Fachgebiet ein großes Spektrum an Protokollen analog zu Standardimmuntest-Verfahren bekannt, mit denen die Bildung spezifischer Bindungskomplexe nachgewiesen werden kann.
- Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der beanspruchten Erfindung vorgestellt und sollen diese nicht beschränken. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Temperaturen Grad Celsius. Wenn im folgenden nicht anderweitig definiert, haben zudem die in diesen Beispielen eingesetzten Abkürzungen die allgemein bekannte Bedeutung:
- CT = Choleratoxin
- d = Dublett
- g = Gramm
- Hz = Hertz
- 1 = Liter
- LT = hitzelabiles Enterotoxin
- M = molar
- mg = Milligramm
- MHz = Megahertz
- ml = Milliliter
- mM = Millimolar
- ug = Mikrogramm
- ul = Mikroliter
- uM = Mikromolar
- mmol = Millimol
- PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung
- um = Mikrometer (Mikron)
- umol = Mikromol
- mE = Millieinheiten
- DC = Dünnschichtchromatographie
- UDP = Uridindiphosphat
- Chromosorb PTM, kommerziell von Manville Corp., Denver, Colorado, erhältlich, wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan gemäß dem in Weetal et al. ¹&sup6; beschriebenen Verfahren silylaminiert.
- Zu dem silylaminierten Chromosorb P (20 g) und p- Nitrophenylchlorformiat (15 g, 75 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (80 ml) und wasserfreiem Dichlormethan (80 ml) wurde Diisopropylethylamin (13,1 ml, 75 mmol) gegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang gelegentlich geschüttelt. Das erhaltene Harz wurde abfiltriert, mit Dichlormethan/Tetrahydrofuran (1 : 1, 5 · 100 ml) gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Zu dem erhaltenen Harz wurde 1,6-Diaminohexan (8,7 g, 75 mmol) in wasserfreiem Dimethylformamid (200 ml) hinzugefügt, das Triethylamin (10,5 ml, 75 mmol) enthielt. Man ließ die Umsetzung 90 Minuten unter gelegentlichem Schütteln ablaufen. Das Harz wurde dann durch Filtration entnommen, nacheinander mit Wasser (3 · 300 ml), Dimethylformamid (3 · 300 ml) und Dichlormethan/Tetrahydrofuran (1 : 1, 5 · 100 ml) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Es wurden 22 g Harz erhalten.
- Ein Teil des Harzes (2,0 g) wurde mit Lactose (27,4 mg, 80 ul) in wasserfreiem Methanol (6,5 ml) in einem verschlossenen Gefäß 47 Stunden bei 60ºC erhitzt. Das Gemisch wurde dann auf Eis (~ 5ºC) abgekühlt. Essigsäureanhydrid (2,1 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 12 Stunden lang gelegentlich geschüttelt, mittels Filtration entnommen und dann mit Wasser (3 · 50 ml) und Methanol (3 · 50 ml) gewaschen. Die Feinteilchen wurden entfernt, indem das Harz in Methanol suspendiert und der Überstand dekantiert wurde, bis er klar war. Trocknen des Harzes unter Vakuum ergab 1,95 g lactosehaltige feste Trägermatrix. Die Analyse des Produktes unter Verwendung des in Dubois et al. ¹&sup7; beschriebenen Phenol-Schwefelsäure-Tests ergab einen Oligosaccharid-Einbau von 1,24 umol/g Harz.
- Unter Verwendung der obigen Verfahren wurden die in Tabelle I dargestellten festen Trägermatrices aus dem angegebenen Alkylendiamin und Oligosaccharid hergestellt. Die chemischen Strukturen dieser Matrices sind in Fig. 1 gezeigt. Tabelle I Feste Trägermatrices
- 1 1,6-DAH = 1,6-Diaminohexan; 1,4-DAB = 1,4-Diaminobutan; 1,2-EDA = 1,2-Ethylendiamin
- 2 umol pro Gramm feste Trägermatrix.
- 3 Bei Vergleichsbeispiel A wurde kein Alkylendiamin eingesetzt. Das Oligosaccharid wurde unter Verwendung der von Blomberg et al.12,13 beschriebenen Verfahren direkt an silylaminiertes Chromosorb P gekuppelt.
- In Fig. 11 dargestelltes SYNSORB 16 umfasst eine herkömmliche Verbindung -O(CH&sub2;)&sub8;C(O)-. Das Produkt hatte einen Oligosaccharid-Einbau von 0,97 umol/g.
- In Fig. 12 dargestelltes SYNSORB 89 umfasst eine herkömmliche Verbindung -O(CH&sub2;)&sub8;C(O)-. Das Produkt hatte einen Oligosaccharid-Einbau von 1,0 umol/g.
- In Fig. 13 dargestelltes SYNSORB Cd umfasst eine herkömmliche Verbindung -O(CH&sub2;)&sub8;C(O)-. Das Produkt hatte einen Oligosaccharid-Einbau von 1,2 umol/g.
- α(1-3)-Galactosyltransferase wurde aus Thymusdrüsen vom Kalb (von Pel-Freeze Biologicals erhalten) mittels Extraktion und Chromatographie über eine UDP-Hexanolamin- Sepharose-Säule isoliert, wie von Blanken und von de Eijnden beschrieben, wobei Natriumcacodylatpuffer anstelle von Tris-Maleat-Puffer verwendet wurde. Nach der Chromatographie wurde das Enzym mittels Ultrafiltration konzentriert, gegen 30 mM Natriumcacodylatpuffer, pH 6,5, mit 20 mM MnCl&sub2; und 0,1% Triton X-100 dialysiert und bei 4ºC aufbewahrt. Die Galactosyltransferase-Aktivität wurde durch Inkubation mit 540 uM Galβ(1,4)GlcNacβ-O- (CH&sub2;)&sub8;COOOCH&sub3;, 1 mM UDP-Gal, 35000 dpm UDP-[³H]-Gal, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,8% Triton X-100, 50 mM MnCl&sub2; und 100 mM Natriumcacodylantpuffer, pH 6,1, in einem Gesamtvolumen von 20 ul überprüft. Nach Umsetzung für 30 Minuten bei 37ºC wurden die Produkte über eine Umkehrphasen-C18- Kartusche isoliert, wie zuvor von M. M. Palcic et al. ¹&sup9; beschrieben.
- Ein Reaktionsgemisch mit Lactose (50 mg), UDP-Gal (20 mg), α(1-3)-Galactosyltransferase (60 mE), alkalischer Phosphatase (20 E), 20 mM MnCl&sub2; und 0,1% Triton X-100 in 50 mM Natriumcacodylatpuffer (3 ml) mit pH 6,5 wurde bei 37ºC inkubiert. Weitere UDP-Gal wurde nach 24 Stunden (20 mg) und 48 Stunden (50 mg) zum Gemisch gegeben. Nach 120 Stunden wurde frische α(1-3)-Galactosyltransferase (20 mE) und UDP-Gal (10 mg) zum Gemisch gegeben, das weitere 72 Stunden inkubiert wurde. Es wurde eine etwa 95%ige Umwandlung in das Produkt erhalten. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein 0,2-um-Nalgene-Nylonfilter filtriert. Das Filtrat wurde auf eine Bio-Rad-AG-1X8-Säule (C&sub1;-Form, 2,5 · 20 cm, 0,6 ml/min) gegeben, die mit Wasser eluiert wurde. Saccharidfraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Der trockene Rückstand wurde in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst. β-Galactosidase (150 mE) wurde zum Gemisch gegeben, sodass nicht umgesetzte Lactose zerstört wurde. Die Probe wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur (24ºC) belassen. Das Gemisch wurde dann 2 Minuten gekocht, durch ein 0,2-um-Filter filtriert und in drei Portionen aufgeteilt. Diese wurden jeweils auf eine C-18- Silicagelsäule (20 g) gegeben. Die Säulen wurden mit Wasser (200 ml) eluiert. Die wässrigen Eluate wurden unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser (5 ml) gelöst und auf eine Bio-Gel- P-2-Säule (2,5 · 100 cm, H&sub2;O, 0,2 ml/min) aufgetragen. Fraktionen, die das Trisaccharid enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei 10,5 mg αGal(1-3)βGal(1- 4)Glc erhalten wurden. ¹H-NMR-Daten (500 MHz, D20): δ = 5,22 (d, 0,36H, J 3,6 Hz, H-lα), 5,14 (d, 1H, J 3,0 Hz, H- 1"), 4,66 (d, 0,64H, J 8,0 Hz, H-1β), 4,51 (d, 1H, J 8,0 Hz, H-1').
- Eine Lösung mit gereinigtem CT oder LT (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA, 2 ug in 1 ml PBS) wurde zu verschiedenen festen Trägermatrices (20 mg) in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und 1 Stunde auf einem Überkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert.
- Nach der Inkubation ließ man die Matrix sich am Boden der Röhrchen absetzen. Die Überstände wurden vorsichtig entnommen. Serielle Fünffachverdünnungen der Überstände wurden hergestellt. Der cytotoxische Endpunkt wurde wie im folgenden Beispiel 11 beschrieben bestimmt.
- Das Ausmaß, in dem der Endpunkt in Anwesenheit der festen Trägermatrix verringert wurde, wurde durch Vergleich des Endpunktes in Anwesenheit der Matrix mit Kontrollen ohne zugegebene Matrix bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Prozentuale Neutralisierung von LT oder CT
- 1 Hergestellt wie in der angegebenen Beispiel-Nr.
- 2 Unmodifiziertes Chromosorb P
- Die Daten in Tabelle 2 zeigen, dass die Länge des Verbindungsarms entscheidend ist, damit CT und LT effizient aus der Lösung gebunden werden. Insbesondere bei Verbindungsarmen mit Längen von 6 oder weniger Atomen war die in Lösung verbleibende Menge LT-Toxin etwa doppelt so hoch wie die in Lösung verbleibende Toxinmenge bei einer Matrix mit einem Verbindungsarm mit 8 Atomen. Bei Verbindungsarmen mit Längen von 6 oder weniger Atomen war ebenso die in Lösung verbleibende Menge CT-Toxin etwa viermal so hoch wie die in Lösung verbleibende Toxinmenge bei einer Matrix mit einem Verbindungsarm mit 8 Atomen.
- Die Daten in Tabelle 2 zeigen zudem, dass die festen Trägermatrices der Beispiele 1-5 hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die LT- oder CT-Wirkung zu neutralisieren, vergleichbar mit den Vergleichsbeispielen C und D waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Unterschiede der Verbindungsarme zwischen den Beispielen 1-5 und den Vergleichsbeispielen C und D keine signifikante Wirkung auf die Toxinbindung haben. Von Interesse ist, dass alle Verbindungsarme eine Länge von mindestens 8 Atomen hatten.
- Die cytotoxische Wirkung von CT und LT wurde unter Verwendung von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) gemessen, die in Hams F12-Medium, angereichert mit 10% fetalem Kälberserum (FBS), in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; bei 37ºC gezüchtet wurden. Die zu testenden Toxinproben wurden 1 : 5 in Hams-Medium verdünnt und durch ein 0,22-um- Spritzenfilter sterilisiert. Die zu testenden Proben wurden seriell 5-fach in Medium verdünnt. Es wurden 100 ul jeder Verdünnung in Vertiefungen mit konfluenten Einzelschichten der CHO-Zellen gegeben und 24 Stunden bei 37ºC/5% CO&sub2; inkubiert. Von jeder Probe wurde eine Doppelprobe analysiert.
- Nach einer 24stündigen Inkubation waren die cytotoxischen Wirkungen leicht ersichtlich, wenn die Vertiefungen mit Kontrollen verglichen wurden, die kein Toxin enthielten. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 95% Methanol fixiert und mittels Giemsa-Färbung angefärbt. Toxinhaltige Proben aus den Neutralisierungsexperimenten wurden auf analoge Weisen behandelt. Die prozentuale Neutralisierung wurde aber durch Vergleich der Endpunktverdünnungen von Proben mit und ohne feste Trägermatrix ermittelt.
- Der Zweck dieses Beispiels ist, die Unterschiede zwischen der Bindung von Toxin A an eine erfindungsgemäße Matrix (Beispiel 2) und eine herkömmliche Matrix mit einem Verbindungsarm -O(CH&sub2;)&sub8;C(O)- (Vergleichsbeispiel D) zu veranschaulichen.
- Toxin A wurde aus einem toxinproduzierenden C. difficile-Stamm (ATCC 43255, VPI-Stamm 10463) wie in Heerze et al. ³ beschrieben gereinigt. Eine Lösung mit dem gereinigten Toxin A (1 ml) wurde zu 20-mg-Proben verschiedener fester Trägermatrices in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden dann 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Nach der Inkubation ließ man die feste Trägermatrix sich am Boden der Röhrchen absetzen. Die Überstände wurden vorsichtig entnommen. Serielle Zweifachverdünnungen der Überstände wurden hergestellt. Das Ausmaß der Toxin-A-Wirkung wurde bestimmt, indem der Hämagglutinierungsendpunkt unter Verwendung des im folgenden Beispiel 13 beschriebenen Verfahrens gemessen wurde.
- Das Ausmaß, in dem der Endpunkt in Anwesenheit der festen Trägermatrix verringert wurde, wurde durch Vergleich des Endpunktes mit demjenigen von Kontrollen ohne zugegebene Matrix bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt. Die dargestellten Daten zeigen, dass die feste Trägermatrix des Beispiels 2 in ihrer Fähigkeit, die Toxin-A-Wirkung zu neutralisieren, mit Vergleichsbeispiel D vergleichbar war.
- Frische Kaninchenerythrozyten wurden einmal in PBS gewaschen und in einer Konzentration von 2% (Vol./Vol.) in kaltem PBS resuspendiert. Serielle Zweifachverdünnungen (50 ul) von Toxin-A-haltigen Lösungen wurden in kaltem PBS in Mikrotitervertiefungen mit U-Boden hergestellt. Ein gleiches Volumen (50 ul) Kaninchenerythrozyten wurde dann in jede Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde leicht gemischt. Nach Inkubation der Platte für 4 Std. bei 4ºC wurde der Hämagglutinierungstiter visuell bestimmt. Alle Tests wurden mit Doppelproben durchgeführt.
Claims (10)
1. Feste Trägermatrix der Formel
worin ist:
SS der feste Träger;
R¹ ausgewählt aus der Gruppe kovalente Bindung und
divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 1 bis etwa 20
Kohlenstoffatomen;
R² divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 2 bis 20
Kohlenstoffatomen;
X' jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe -O-
und > NR&sup4;, wobei R&sup4; jeweils unabhängig ausgewählt
ist aus Wasserstoff, R²NH&sub2; oder R²NR³Z, worin R² wie
oben definiert ist;
R³ ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff und -C(O)R&sup5;,
worin R&sup5; Hydrocarbyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen
ist;
W ausgewählt aus Sauerstoff oder Schwefel;
X ausgewählt aus der Gruppe -NH-, -O- und -S-;
Y ausgewählt aus der Gruppe -NH-, -O- und -S-;
Z ein toxinbindendes Oligosaccharid;
p eine ganze Zahl von 0 bis 50 und
n eine ganze Zahl, dass die Matrix einen Beladungsgrad
mit toxinbindendem Oligosaccharid von etwa 0,001
bis etwa 2000 Mikromol pro Gramm fester Träger
besitzt,
wobei die Zahl der Atome zwischen dem festen Träger
und dem toxinbindenden Oligosaccharid insgesamt mindestens
8 ist.
2. Feste Trägermatrix nach Anspruch 1, wobei X und Y -NH-
sind und W gleich Sauerstoff ist.
3. Feste Trägermatrix nach Anspruch 2, wobei p gleich 0
ist.
4. Feste Trägermatrix nach Anspruch 3, wobei R³ ausgewählt
ist aus Wasserstoff und -C(O)CH&sub3;.
5. Feste Trägermatrix der Formel:
worin ist:
SS ein fester Träger;
R¹ ausgewählt aus der Gruppe kovalente Bindung und
divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 1 bis etwa 20
Kohlenstoffatomen;
R³ ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff und -C(O)R&sup5;,
worin R&sup5; Hydrocarbyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen
ist;
R&sup6; eine Alkylengruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen;
Z ein toxinbindendes Oligosaccharid; und
n eine ganze Zahl, dass die Matrix einen Beladungsgrad
mit toxinbindendem Oligosaccharid von etwa 0,001
bis etwa 2000 Mikromol pro Gramm fester Träger
besitzt;
wobei die Zahl der Atome zwischen dem festen Träger
und dem toxinbindenden Oligosaccharid insgesamt mindestens
8 ist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung in vivo
einer toxin-vermittelten Krankheit in einem Säugetier,
umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger für
eine orale Verabreichung sowie eine feste Trägermatrix
der Formel:
worin ist:
SS ein fester Träger;
R¹ ausgewählt aus der Gruppe kovalente Bindungen und
divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 1 bis etwa 20
Kohlenstoffatomen;
R² divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 2 bis 20
Kohlenstoffatomen;
X' jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe -O-
und > NR&sup4;, wobei R&sup4; jeweils unabhängig ausgewählt
ist aus Wasserstoff, R²NH&sub2; oder R²NR³Z, worin R² wie
oben definiert ist;
R³ ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff und -C (O) R&sup5;,
wobei R&sup5; ein Hydrocarbyl mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen ist;
W ausgewählt aus Sauerstoff oder Schwefel;
X ausgewählt aus der Gruppe -NH-, -O- und -S-;
Y ausgewählt aus der Gruppe -NH-, -O- und -S-;
Z ein toxinbindendes Oligosaccharid;
p eine ganze Zahl von 0 bis 50; und
n eine ganze Zahl, dass die Matrix einen Beladungsgrad
mit toxinbindendem Oligosaccharid von etwa 0,001
bis etwa 2000 Mikromol pro Gramm festen Träger
besitzt, wobei
die Zahl der Atome zwischen dem festen Träger und
dem toxinbindenden Oligosaccharid insgesamt mindestens
8 ist und
die Zusammensetzung vom Magendarmtrakt ausgeschieden
werden kann.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei
X und Y gleich -NH- sind und W gleich Sauerstoff ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei
p gleich 0 ist.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei
R³ aus Wasserstoff und -C(O)CH&sub3; ausgewählt ist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung in vivo
einer toxin-vermittelten Krankheit in einem Säugetier,
umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger für
eine orale Verabreichung sowie eine feste Trägermatrix
der Formel:
worin ist:
SS ein fester Träger ist;
R¹ ausgewählt aus der Gruppe kovalente Bindung und
divalente Hydrocarbylen-Gruppe mit 1 bis etwa 20
Kohlenstoffatomen;
ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff und -C(O)R&sup5;,
wobei R&sup5; ein Hydrocarbyl mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen ist;
R&sup6; eine Alkylengruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen,
Z ein toxinbindendes Oligosaccharid; und
n eine ganze Zahl, dass die Matrix einen Beladungsgrad
mit toxinbindendem Oligosaccharid von etwa 0,001
bis etwa 2000 Mikromol pro Gramm fester Träger
besitzt, wobei
die Zahl der Atome zwischen dem festen Träger und
dem toxinbindenden Oligosccharid insgesamt mindestens
8 ist und
die Zusammensetzung vom Magendarmtrakt ausgeschieden
werden kann.
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