CN115887689A - β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物、制备方法及重塑肿瘤微环境和免疫抗肿瘤的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种β‑葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物、制备方法及其在抗肿瘤、重塑肿瘤微环境和增强免疫中的应用。本发明是通过首先对β‑葡聚糖还原端进行氨基修饰，然后再将氨基与末端带有马来酰亚胺的NHS活泼酯反应形成酰胺键，最终利用马来酰亚胺与M2型巨噬细胞靶向肽末端巯基的高效Click反应共价偶联得到。本发明反应效率高、产物结构特征明确、反应位点专一及无副产物，得到的糖肽偶联物既能发挥M2靶向肽的靶向作用，又能发挥β‑葡聚糖的免疫调节作用，可以将肿瘤微环境中免疫抑制状态的M2型巨噬细胞复极化成发挥促炎免疫调节作用的M1巨噬细胞。本发明可以用于制备抗肿瘤药物、免疫调节剂、保健品以及特殊医学用途配方食品。
Description
技术领域
本发明属于化学合成医药技术领域，一种β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物、制备方法及其在抗肿瘤、重塑肿瘤微环境和增强免疫中的应用。
背景技术
β-葡聚糖是一类由葡萄糖残基通过β-糖苷键以不同连接方式组成的多糖，β- 葡聚糖类化合物在自然界中广泛存在，天然来源的β-葡聚糖主要存在于各种真菌、细菌与海藻中，且不同结构的β-葡聚糖有不同的生物活性。β-葡聚糖被广泛报道可以通过激活巨噬细胞、树突细胞等发挥免疫调节、抗炎、抗病毒及抗肿瘤等作用。
巨噬细胞源自免疫系统中单核细胞，几乎存在于所有组织中。巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下，表现出明显的功能差异。根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为经典活化的M1型巨噬细胞，和替代性活化的M2型巨噬细胞。M1巨噬细胞表型由IFN-γ或LPS诱导，呈促炎和杀微生物功能表型。相反，M2巨噬细胞被IL-4和IL-13 激活，在缓解炎症和组织重塑中发挥作用。
目前大多数癌症疗法都集中在杀死恶性细胞上，但这些细胞通常在遗传上不稳定，并且可以对化疗产生抗药性。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过促进血管生成和肿瘤细胞生长以及抑制适应性免疫反应来促进疾病进展，肿瘤微环境中的 TAM已被证明为免疫抑制的M2样表型。因此，TAM是辅助抗癌治疗的潜在靶点。2013年，研究报道了一种独特的肽序列(M2pep,YEQDPWGVKWWY)，该肽优先与小鼠M2巨噬细胞/TAM结合，对其他表型巨噬细胞的亲和力低。尾静脉注射具有促凋亡肽的M2pep融合肽可延缓小鼠死亡率并选择性地减少M2样TAM群体。
现有技术存在的技术问题为：目前没有现有技术研发出β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物，并在重塑肿瘤微环境中、制备免疫增强剂、抗肿瘤药物、保健品以及特殊医学用途配方食品应用的先例。
解决以上问题及缺陷的意义为：(1)首次制备出一种β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物，制备方法具有反应效率高、产物结构特征明确、反应位点专一及无副产物等特点，可大规模产业化。(2)利用具有靶向M2巨噬细胞功能的肽序列，通过与具有免疫调节作用的β-葡聚糖共价偶联得到糖肽偶联物(BG-MP)。基于该策略得到的糖肽偶联物既能发挥M2pep的靶向作用，又能发挥β-葡聚糖的免疫调节作用，可以将肿瘤微环境中免疫抑制状态的M2型巨噬细胞复极化成发挥促炎免疫调节作用的M1巨噬细胞，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用 M2型巨噬细胞靶向肽以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物显著，起到“1+1>2”的效果。该发明重塑肿瘤微环境中、制备免疫增强剂、抗肿瘤药物、保健品以及特殊医学用途配方食品有重要应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物、制备方法及其在重塑肿瘤微环境中的应用。
一种β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的结构如下：
其中所述糖肽偶联物结构式中n＝1～30，m＝1-50。
本发明的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备方法，
(1)首先对β-葡聚糖还原端进行氨基修饰，将末端带有胺基的二酰肼、二酰胺等连接臂通过还原胺化反应，连接到β-葡聚糖还原末端，得到末端胺基的β- 葡聚糖衍生物(BG-R-NH2)；
(2)然后再将末端带有马来酰亚胺的NHS活泼酯通过酰胺反应，与末端胺基的β-葡聚糖衍生物反应形成酰胺键，得到末端马来酰亚胺的β-葡聚糖衍生物 (BG-Mal)；
(3)最终利用M2型巨噬细胞靶向肽末端巯基通过高效Click反应与末端马来酰亚胺的β-葡聚糖衍生物共价偶联，得到β-葡聚糖还原末端与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联的糖肽偶联物(BG-MP)。
所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的具体制备步骤如下：
步骤一、将β-葡聚糖(BG,1e.q.)与连接臂己二酸二酰肼(ADH)溶解于二甲亚砜/乙酸混合反应溶剂(83:17，v/v)中，氮气保护下，于60℃水浴中反应 1小时，随后加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN，50e.q.)，继续反应48小时，反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，混匀，加入4倍体积无水乙醇醇沉，离心 10分钟，沉淀再次加氯化钠溶液至刚好溶解沉淀，继续醇沉，反复3次后收集沉淀，透析48小时后经减压浓缩后经冷冻干燥即可得β-葡聚糖还原末端带有氨基的β-葡聚糖衍生物(BG-ADH)。
步骤二、将上述得到的β-葡聚糖衍生物(BG-ADH，1e.q.)与末端带有马来酰亚胺的NHS活泼酯(sulfo-SMCC，1.25e.q.)溶解在PBS缓冲溶液中，氮气保护下，于40℃水浴中反应3小时，反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，反复醇沉3次后收集沉淀，透析后经浓缩、冻干即可得β-葡聚糖还原末端马来酰亚胺基团的β-葡聚糖衍生物(BG-SMCC)。
步骤三、将上述得到的β-葡聚糖衍生物(BG-SMCC，1e.q.)与M2型巨噬细胞靶向肽(M2pep，1.25e.q.)溶解于DMSO/DMF混合溶剂中，氮气保护下，于40℃水浴中反应4小时，反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，反复醇沉3 次后收集沉淀，透析后经浓缩、冻干即可得β-葡聚糖还原末端与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联的糖肽偶联物(BG-MP)。
优选地，β-葡聚糖分子量为0.18kDa～100kDa，单糖组成以葡萄糖为主比例在95％以上，其连接方式为主链由葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接而成，同时在主链上具有β-1,6分支，分支度为1％～60％。
优选地，所选肽为M2型巨噬细胞靶向肽(M2pep)和含有M2型巨噬细胞靶向肽活性片段(YWWKVGWPDQWY)的其他肽类药物类似物。
优选地，所述β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽中间的连接链特征为链两端为氨基、酰肼基，中间有2个碳到12个碳的长度，包括二酰肼类、二胺类化合物。
优选地,所述β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽中间的连接链特征为链一端为NHS活泼酯，另一端为带马来酰亚胺，中间有2个碳到12个碳的长度，包括 N-羟基琥珀酰亚胺-R-马来酰亚胺(Mal-R-NHS)类。
β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的合成路线为：
进一步，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物在抗肿瘤的药物、保健品以及特殊医学用途配方食品中的用途；在重塑肿瘤微环境中的用途。所述药物、保健品以及特殊医学用配方食品为射剂、粉针剂、口服液、片剂、胶囊、软胶囊以及散剂形式。
进一步，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物在免疫增强剂、免疫增强的药物、保健品以及特殊医学用途配方食品中的用途，所述药物、保健品以及特殊医学用配方食品为射剂、粉针剂、口服液、片剂、胶囊、软胶囊以及散剂形式。
进一步，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物(BG-MP)具有免疫增强功能具体为：所述糖肽偶联物(BG-MP)对小鼠成熟巨噬细胞系RAW264.7 和骨髓原代巨噬细胞BMDM无细胞毒性，能显著促进其吞噬能力，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物显著；表现出对RAW264.7和BMDM巨噬细胞促进TNF-α、 IL-1β、NO和CD86等M1型巨噬细胞标记物释放，以及减少IL-10、Arg-1和CD206等M2型巨噬细胞标记物释放。
进一步，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物(BG-MP)具有免疫增强功能具体为：对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型具有显著改善作用，包括缓解模型小鼠体重减轻及恢复外周血免疫细胞计数等，恢复模型小鼠的免疫功能。
进一步，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物(BG-MP)具有免疫增强及抗肿瘤功能具体为：对4T1、A549及B16F10等肿瘤细胞具有显著抑制生长作用。
为了验证β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的技术效果，发明人做了如下实验：
技术效果一：β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物具有免疫调节作用，表现出对小鼠成熟巨噬细胞系RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞BMDM无细胞毒性，并且可随剂量依赖性促进巨噬细胞增殖能力，其效果与单独使用β-葡聚糖、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物呈相反趋势，表明表明糖肽偶联物(BG-MP)具有较强促进巨噬细胞增殖作用。
实验验证步骤如下：
步骤一、将培养一定数量的RAW264.7巨噬细胞用完全培养基重悬之后，按 5×104/孔数量接种于96孔板中，加入不同浓度的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物刺激24小时；通过CCK8法检测细胞增殖活力，结果显示单独使用β- 葡聚糖(BG)、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽(MP)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP)表现出微弱抑制细胞增殖作用，糖肽偶联物BG-MP表现出相反趋势，可随剂量增大可促进细胞增殖活力。
步骤二、脱颈椎处死小鼠，将小鼠后肢的皮毛剥置足部，剪下后腿，用剪刀剔除肌肉分离股骨和胫骨；用注射器吸取无血清的RPMI-1640培养基反复冲洗骨髓至骨髓变白，将骨髓冲洗液加入到50mL离心管中，1000rpm离心5min。将离心得到的骨髓细胞用10mL含M-CSF(50ng/mL)和血清的RPMI-1640培养基重悬，置于37℃和5％ CO2气体浓度适度的培养箱中培养7天，即可得到骨髓来源巨噬细胞BMDM。
步骤三、将分离得到的骨髓原代巨噬细胞BMDM用完全培养基重悬之后，按5×104/孔数量接种于96孔板中，加入不同浓度的糖肽偶联物刺激24小时；通过CCK8法检测细胞增殖活力，结果显示糖肽偶联物BG-MP可随剂量增大显著性促进细胞增殖活力，单独使用β-葡聚糖(BG)、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽(MP)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP)则表现出低剂量促进、高剂量无影响的作用效果。
技术效果二：β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物有将M2型巨噬细胞复极化成M1型巨噬细胞能力，表现出对RAW264.7和BMDM巨噬细胞随剂量增大显著促进M1型巨噬细胞标记物以及减少M2型巨噬细胞标记物表达的作用。
步骤四、通过Elisa试剂盒检测M1型和M2型巨噬细胞细胞因子表达情况，结果表明糖肽偶联物可促进TNF-α、IL-1β、NO等M1型巨噬细胞细胞因子以及减少IL-10和Arg-1等M2型巨噬细胞细胞因子释放，其作用效果与单独使用 M2型巨噬细胞靶向肽(MP)相反，较单独使用β-葡聚糖(BG)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP)效果显著。
步骤五、用流式细胞术检测M1型和M2型巨噬细胞标记的标记物变化情况，结果表明糖肽偶联物(BG-MP)可显著增加M1型巨噬细胞标记物CD86表达，减少M2型巨噬细胞标记物CD206表达，其作用效果与单独使用M2型巨噬细胞靶向肽(MP)相反，较单独使用β-葡聚糖(BG)效果显著。
技术效果三、β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物具有抗肿瘤作用，表现出对4T1、A549及B16F10等肿瘤细胞具有显著抑制生长作用。
步骤六、通过CCK8法检测细胞增殖活力，结果表明糖肽偶联物(BG-MP) 可随剂量依赖性显著抑制B16F10、A549及4T1等肿瘤细胞的增殖，其效果较单独使用β-葡聚糖(BG)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP) 效果显著。
本发明的有益技术效果：(1)本发明制备的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物既能发挥M2pep的靶向作用，又能发挥β-葡聚糖的免疫调节作用，可以将肿瘤微环境中免疫抑制状态的M2型巨噬细胞复极化成发挥促炎免疫调节作用的M1巨噬细胞，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物显著，起到“1+1>2”的效果。 (2)本发明的方法具有反应效率高、产物结构特征明确、反应位点专一及无副产物等特点，适用于不同单糖种类、不同分子量及不同结构特征的糖类化合物与不同功能及药效的肽类药物共价偶联物的合成。(3)本发明制备的β-葡聚糖与 M2巨噬细胞靶向肽偶联物可以用于制备免疫增强剂、抗肿瘤药物、保健品以及特殊医学用途配方食品。
附图说明
图1糖肽偶联物(BG-MP)合成路线图
图2糖肽偶联物(BG-MP)核磁氢谱图
图3糖肽偶联物(BG-MP)红外波谱图
图4糖肽偶联物(BG-MP)紫外全波长扫描图
图5糖肽偶联物(BG-MP)高分辨质谱图
图6糖肽偶联物(BG-MP)对巨噬细胞活力影响
图7糖肽偶联物(BG-MP)对巨噬细胞复极化作用细胞因子的影响
图8糖肽偶联物(BG-MP)对巨噬细胞复极化作用细胞标记物的影响
图9糖肽偶联物(BG-MP)对免疫低下小鼠免疫恢复能力
图10糖肽偶联物(BG-MP)对肿瘤细胞抑制作用
实施例
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
实施例1
β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备步骤如下，如图1所示。
步骤1：将β-葡聚糖BG(100mg,0.02mM,1e.q.)与乙二酸二酰肼ADH(34.8 mg,0.2mM,10e.q.)溶解于二甲亚砜/乙酸混合反应溶剂(83:17，v/v)中，氮气保护下，于60℃水浴中反应1小时，将氰基硼氢化钠(31.4mg,0.5mM,25e.q.) 溶于水中，加入上述反应溶液，继续反应24小时；再次加入氰基硼氢化钠(31.4 mg,0.5mM,25e.q.)固体粉末，继续反应24小时。反应结束后，加入2mL 16％氯化钠溶液，混匀，加入4～5倍体积无水乙醇醇沉，离心10分钟，沉淀再次加 2mL氯化钠溶液溶解，继续醇沉，反复3次后收集沉淀，透析48小时后经减压浓缩后经冷冻干燥即可得β-葡聚糖还原末端带有氨基的β-葡聚糖衍生物 (BG-ADH)。
步骤2：将上述得到的β-葡聚糖衍生物BG-ADH(100mg,0.02mM,1e.q.) 与末端带有马来酰亚胺的NHS活泼酯的sulfo-SMCC(11mg,0.025mM,1.25e.q.) 溶解在PBS缓冲溶液中，氮气保护下，于40℃水浴中反应3小时。反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，加入4～5倍体积无水乙醇反复醇沉3次后收集沉淀，透析后经浓缩、冻干即可得β-葡聚糖还原末端马来酰亚胺基团的β-葡聚糖衍生物(BG-SMCC)。
步骤3：将上述得到的β-葡聚糖衍生物BG-SMCC(110mg,0.02mM,1e.q.) 与M2型巨噬细胞靶向肽M2pep(50mg,0.025mM,1.25e.q.)溶解于DMSO/DMF 混合溶剂中，氮气保护下，于40℃水浴中反应4小时。反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，加入4～5倍体积无水乙醇反复醇沉3次后收集沉淀，透析后经浓缩、冻干即可得β-葡聚糖还原末端与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联的糖肽偶联物(BG-MP)。
实施例2
β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的结构表征具体包括以下步骤：
(1)核磁氢谱表征：取5mgβ-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物(BG-MP)，加入500μL重水，冻干，重复进行3次重水交换，加入500μL重水并转移到核磁管中，以氘代丙酮为内标，在25℃进行核磁共振谱分析。结果如图2所示，在6.7～7.5ppm处出现M2型巨噬细胞靶向肽特征信号，表明糖肽偶联物(BG-MP) 是由β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联而成。
(2)红外波谱表征：取适量β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物(BG-MP) 通过KBr压片法进行红外波谱表征。结果如图3所示，在1500处出现M2型巨噬细胞靶向肽特征信号，表明糖肽偶联物(BG-MP)是由β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联而成。
(3)紫外全波长扫描表征：取适量β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物 (BG-MP)通过200-600nm紫外全波长扫描，结果如图4所示，在225和280nm 处出现M2型巨噬细胞靶向肽特征信号，表明糖肽偶联物(BG-MP)是由β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联而成。
(4)高分辨质谱表征：取适β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物(BG-MP) 进行高分辨质谱表征，结果如图5所示，图中1302.42～1915.69范围内出现z＝4 的1510.55及1551.06等碎片离子，皆为不同聚合度的β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联的离子碎片。
实施例3
糖肽偶联物(BG-MP)具有免疫调节作用，结果如图6所示，表现出对小鼠成熟巨噬细胞系RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞BMDM无细胞毒性，并且可随剂量依赖性促进巨噬细胞增殖，其效果与单独使用β-葡聚糖(BG)、单独使用 M2型巨噬细胞靶向肽(MP)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物 (BG+MP)呈相反趋势，表明糖肽偶联物(BG-MP)具有较强促进巨噬细胞增殖作用。具体验证实验为：
步骤一：将培养一定数量的RAW264.7巨噬细胞用完全培养基重悬之后，按 5×104/孔数量接种于96孔板中，加入终浓度为2μM、6μM、18μM、54μM、162μM 的糖肽偶联物刺激24小时；通过CCK8法检测细胞增殖活力，结果显示单独使用β-葡聚糖(BG)、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽(MP)以及β-葡聚糖与M2 型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP)表现出微弱抑制细胞增殖作用，糖肽偶联物BG-MP表现出相反趋势，可随剂量增大可促进细胞增殖活力。
步骤二：脱颈椎处死小鼠，将小鼠后肢的皮毛剥置足部，剪下后腿，用剪刀剔除肌肉分离股骨和胫骨；用注射器吸取无血清的RPMI-1640培养基反复冲洗骨髓至骨髓变白，将骨髓冲洗液加入到50mL离心管中，1000rpm离心5min。将离心得到的骨髓细胞用10mL含M-CSF(50ng/mL)和血清的RPMI-1640培养基重悬，置于37℃和5％ CO2气体浓度适度的培养箱中培养7天，即可得到骨髓来源巨噬细胞BMDM。
步骤三：将分离得到的骨髓原代巨噬细胞BMDM用完全培养基重悬之后，按5×104/孔数量接种于96孔板中，加入不同浓度的糖肽偶联物刺激24小时；通过CCK8法检测细胞增殖活力，结果显示糖肽偶联物BG-MP可随剂量增大显著性促进细胞增殖活力，单独使用β-葡聚糖(BG)、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽(MP)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP)则表现出低剂量促进高剂量无影响的作用效果。
实施例4
糖肽偶联物(BG-MP)具有将M2型巨噬细胞复极化成M1型巨噬细胞能力，提示其在抗肿瘤药物用于重塑肿瘤微环境中的应用价值。
承接实施例3实验步骤，通过Elisa试剂盒检测TNF-α、IL-1β、NO等M1 型巨噬细胞细胞因子以及IL-10和Arg-1等M2型巨噬细胞细胞因子释放，结果如图7所示，表现出对RAW264.7和BMDM巨噬细胞随剂量增大显著促进TNF-α、 IL-1β、NO等M1型巨噬细胞细胞因子释放，以及减少IL-10和Arg-1等M2型巨噬细胞细胞因子释放，其作用效果与单独使用M2型巨噬细胞靶向肽(MP) 相反，较单独使用β-葡聚糖(BG)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP)效果显著。具体验证实验如下：
承接实施例3实验步骤，通过流式细胞术检测M1型巨噬细胞标记CD86， M2型巨噬细胞标记物CD206的变化情况。结果如图8所示，糖肽偶联物(BG-MP) 可显著增加M1型巨噬细胞标记物CD86表达，减少M2型巨噬细胞标记物CD206 表达，其作用效果与单独使用M2型巨噬细胞靶向肽(MP)相反，较单独使用β- 葡聚糖(BG)效果显著。
实施例5
糖肽偶联物(BG-MP)具有对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型具有显著改善作用，提示其在保健食品中用于提高免疫力的应用价值。
承接实施例3实验步骤，通过验证糖肽偶联物(BG-MP)对免疫低下小鼠模型具有免疫增强功能具体为：对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型具有显著改善作用，包括缓解模型小鼠体重减轻及恢复外周血免疫细胞计数等，恢复模型小鼠的免疫功能。结果如图9所示，高剂量的BG-MP能够缓解由环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型的体重减轻情况，并且可以提高模型小鼠的白细胞计数，缓解免疫抑制状态，从而表明糖肽偶联物对免疫低下小鼠具有免疫增强的作用。
实施例6
糖肽偶联物(BG-MP)具有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用，提示其在抗肿瘤药物中的应用价值。具体验证实验如下：
承接实施例4实验步骤，通过CCK8法检测细胞增殖活力。结果如图10所示，糖肽偶联物(BG-MP)可随剂量依赖性显著抑制B16F10、A549及4T1等肿瘤细胞的增殖，表明其具有显著抑制肿瘤细胞生长作用，其效果较单独使用β- 葡聚糖(BG)以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物(BG+MP)效果显著。
综上，本发明是通过首先对β-葡聚糖还原端进行氨基修饰，然后再将氨基与末端带有马来酰亚胺的NHS活泼酯反应形成酰胺键，最终利用马来酰亚胺与 M2型巨噬细胞靶向肽末端巯基的高效Click反应共价偶联得到。本发明的方法具有反应效率高、产物结构特征明确、反应位点专一及无副产物等特点。基于该策略得到的糖肽偶联物既能发挥M2的靶向作用，又能发挥β-葡聚糖的免疫调节作用，可以将肿瘤微环境中免疫抑制状态的M2型巨噬细胞复极化成发挥促炎免疫调节作用的M1巨噬细胞，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物显著，起到“1+1>2”的效果。该糖肽偶联物对小鼠成熟巨噬细胞系RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞 BMDM无细胞毒性且可显著促进其吞噬能力；对RAW264.7和BMDM诱导的 M2型巨噬细胞具有复极化成M1型巨噬细胞的能力；对4T1、A549及B16F10 等肿瘤细胞具有显著抑制生长作用。该糖肽偶联物可以用于制备抗肿瘤药物、免疫调节剂、保健品以及特殊医学用途配方食品。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (11)
1.一种β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物，其特征在于，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的结构如下：
其中所述糖肽偶联物结构式中n＝1～50，m＝1-10。
2.一种如权利要求1所述的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备方法，其特征在于：
(1)首先对β-葡聚糖还原端进行氨基修饰，将末端带有胺基的二酰肼、二酰胺等连接臂通过还原胺化反应，连接到β-葡聚糖还原末端，得到末端胺基的β-葡聚糖衍生物(BG-R-NH2)；
(2)然后再将末端带有马来酰亚胺的NHS活泼酯通过酰胺反应，与末端胺基的β-葡聚糖衍生物反应形成酰胺键，得到末端马来酰亚胺的β-葡聚糖衍生物(BG-Mal)；
(3)最终利用M2型巨噬细胞靶向肽末端巯基通过高效Click反应与末端马来酰亚胺的β-葡聚糖衍生物共价偶联，得到β-葡聚糖还原末端与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联的糖肽偶联物(BG-MP)。
3.根据权利要求2所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备方法，其特征在于，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的具体制备步骤如下：
(1)将β-葡聚糖(BG)与连接臂己二酸二酰肼(ADH)溶解于二甲亚砜/乙酸混合反应溶剂中，氮气保护下，于60℃水浴中反应1小时，随后加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，继续反应48小时，反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，混匀，加入4倍体积无水乙醇醇沉，离心10分钟，沉淀再次加氯化钠溶液只刚好溶解沉淀，继续醇沉，反复3次后收集沉淀，透析48小时后经减压浓缩后经冷冻干燥即可得β-葡聚糖还原末端带有氨基的β-葡聚糖衍生物(BG-ADH)。
(2)将上述得到的β-葡聚糖衍生物(BG-ADH)与末端带有马来酰亚胺的NHS活泼酯(sulfo-SMCC)溶解在PBS缓冲溶液中，氮气保护下，于40℃水浴中反应3小时，反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，反复醇沉3次后收集沉淀，透析后经浓缩、冻干即可得β-葡聚糖还原末端马来酰亚胺基团的β-葡聚糖衍生物(BG-SMCC)。
(3)将上述得到的β-葡聚糖衍生物(BG-SMCC)与M2型巨噬细胞靶向肽(M2pep)溶解于DMSO/DMF混合溶剂中，氮气保护下，于40℃水浴中反应4小时，反应结束后，加入等体积氯化钠盐溶液，反复醇沉3次后收集沉淀，透析后经浓缩、冻干即可得β-葡聚糖还原末端与M2型巨噬细胞靶向肽共价偶联的糖肽偶联物(BG-MP)。
4.根据权利要求3所述的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备方法，其特征在于：β-葡聚糖分子量为0.1kDa～100kDa，单糖组成以葡萄糖为主比例在95％以上，其连接方式为主链由葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接而成，同时在主链上具有β-1,6分支，分支度为1％～60％。
5.根据权利要求3所述的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备方法，其特征在于：所选肽为M2型巨噬细胞靶向肽(M2pep)和含有M2型巨噬细胞靶向肽活性片段(YWWKVGWPDQWY)的其他肽类药物类似物。
6.根据权利要求3所述的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备方法，其特征在于：所述β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽中间的连接链特征为链两端为氨基、酰肼基，中间有2个碳到12个碳的长度，包括二酰肼类、二胺类化合物。
7.根据权利要求3所述的β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物的制备方法，其特征在于：所述β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽中间的连接链特征为链一端为NHS活泼酯，另一端为带马来酰亚胺，中间有2个碳到12个碳的长度，包括N-羟基琥珀酰亚胺-R-马来酰亚胺(Mal-R-NHS)类。
8.如权利要求1-7任意一项所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物在抗肿瘤的药物、保健品以及特殊医学用途配方食品中的用途；在重塑肿瘤微环境中的用途。
9.如权利要求1-7任意一项所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物在免疫增强剂、免疫增强的药物、保健品以及特殊医学用配方食品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物在免疫增强剂、免疫增强的药物、保健品以及特殊医学用配方食品中的用途，具体表现为：第一，所述糖肽偶联物(BG-MP)对小鼠成熟巨噬细胞系RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞BMDM无细胞毒性，能显著促进其吞噬能力，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用M2型巨噬细胞靶向肽以及β-葡聚糖与M2型巨噬细胞靶向肽的混合物显著；表现出对RAW264.7和BMDM巨噬细胞促进TNF-α、IL-1β、NO等M1型巨噬细胞细胞因子释放，以及减少IL-10和Arg-1等M2型巨噬细胞细胞因子释放；第二，对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型具有显著改善作用，包括缓解模型小鼠体重减轻及恢复外周血免疫细胞计数等，恢复模型小鼠的免疫功能；所述药物、保健品以及特殊医学用配方食品为射剂、粉针剂、口服液、片剂、胶囊、软胶囊以及散剂形式。
11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述β-葡聚糖与M2巨噬细胞靶向肽偶联物在抗肿瘤的药物、保健品以及特殊医学用配方食品中的用途、在重塑肿瘤微环境中的用途，具体表现为：对4T1、A549及B16F10等肿瘤细胞具有显著抑制生长作用；所述药物、保健品以及特殊医学用配方食品为射剂、粉针剂、口服液、片剂、胶囊、软胶囊以及散剂形式。
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