MXPA00003108A - Polisacaridos formadores de iminas, preparacion de los mismos y el uso como adyuvantes e inmunoestimulan - Google Patents

Polisacaridos formadores de iminas, preparacion de los mismos y el uso como adyuvantes e inmunoestimulan

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Abstract

La presente invención se refiere a conjugados de polisacáridos que comprenden:un polisacárido que se enlaza a los receptores superficiales presentes en las Células que Presentan Antígenos, se conjuga a uno o más compuestos que tienen grupos carbinilo estables enlazados covalentemente, ya sea directamente o por vía de un enlazador bifuncional. Los conjugados sonútiles como inmuno-estimulantes y adyuvant

Description

Polisacáridos Formadores de Iminas , Preparación de los Mismos y el Uso como Adyuvantes e Inmunoes timulantes Antecedentes de la Invención Campo de l a In ven ci ón La presente invención se refiere a nuevos derivados de polisacáridos, su preparación y su uso en vacunas y composiciones inmunoe s t imulant e s . Los adyuvantes son derivados de polisacáridos reconocidos por células que presentan antígenos (APCs) .
Ar t e Re l a ci on a do Los adyuvantes tiene utilidad en la activación del sistema inmune para aumentar la eficiencia de las vacunas preventivas y terapéuticas. Los inmunoadyuvant es tienen aplicaciones en: (1) la estimulación no específica de la resistencia del huésped contra infección y cáncer, (2) la potencialización de la inmunogenicidad de la vacuna preventiva y (3) la potencialización de la inmunogenicidad de la vacuna preventiva. Estos adyuvantes podrían mejorar preferentemente las respuestas inmunes mediadas por células (respuestas de células T, REF.: 33047 hipe rs ens ibi 1 idad retrasada), respuestas humorales (respuestas de células B, producción de anticuerpos), o ambas. La estimulación de la inmunidad humoral es importante para la prevención de infecciones bacterianas, algunas infecciones virales, así como en terapia para la circulación de cánceres. La inmunidad celular es de principal importancia para la terapia de cáncer de tumores sólidos y algunas enfermedades virales.
Después de una estimulación inicial por un agente o antígeno extraño (tal como virus, bacterias o parásitos), el sistema inmune usualmente reconoce y reacciona al agente con una respuesta acelerada sobre la reexposición. Esta respuesta mejorada forma la base para el enorme éxito de la vacunación para la prevención de enfermedades. Sin embargo, la respuesta inmune inicial a un antígeno extraño requiere de varios días para la respuesta total, lo cual es suficiente para la protección contra las infecciones por organismos altamente virulentos. Una manera para lograr una respuesta inmune protectora más rápida es mediante la vacunación o inmunización con un patógeno, que usualmente se disminuye o muere. Sin embargo, en muchos casos la inmunización con microorganismo muertos o con antígenos puros produce una respuesta inmune de período corto pobre con inmunidad débil o no mediada por células. En muchos casos esta pobre respuesta inmune puede modificarse mediante la adición de adyuvantes a la preparación del antígeno. Varios polisacáridos (polímeros de carbohidratos) de mañosa (e.g. mananos), ß(l,3) glucosa (e.g. glucanos), mañosa ß ( 1 , 4 ) acet ilada ( acemananos ) , ß ( 1 , ) N-ace t i 1 -glucosamina (quitinas) y he t eropol i sacar idos , tal como r amnoga lact uronanos (pectinas), se ha mostrado que estimulan el sistema inmune. Las células que presentan antígenos (APCs) tienen receptores superficiales celulares específicos que reconocen y enlazan los radicales de azúcares de estos y otros polisacáridos. Las células que presentan antígenos (APCs), tal como células dendríticas y algunos macrofagos, son responsables para tomar los antígenos y procesarlos a péptidos más pequeños en endol i sosoma s . Los antígenos procesados se expresan en la superficie de las APCs en conjunto con MHC de clase II. Específicamente, las células T reactivas reconocen el antígeno y MHC de clase II simultáneamente, produciendo respuestas inmunes que son MHC clase II restringida. Estos receptores superficiales de APC (tal como el receptor del mañosa del macrofago y su receptor homólogo DEC-205 de las células dendríticas) son proteínas de t rans -membrana que regulan la endocitosis y aparentemente juegan un papel en el proceso de la presentación del antígeno (Stahl, P.D., Cu rren t Opi n i ón i n Imm un o l o gy 4: 9 (1992) ; Jiang, W. et a l . , Na t u re 375:151 (1995)) . El enlazamiento de estos polisacáridos a tales receptores induce aparentemente la inmunoes t imulación como se muestra por el aumento en la fagocitosis, respuestas prol i f erat i vas , liberación de citocinas y otras actividades del sistema inmune. Debido a esta actividad inmunoe s t imuladora , estos polisacáridos se han propuesto como adyuvantes de vacunas.
Los adyuvantes de polisacáridos ejercen un efecto inmunomodulador modificando la producción de citocina, tal como sobre regulando IL-1, y causando una respuesta Thl moderada. La respuesta inmune producida por el subgrupo Thl de células CD4+T induce los anticuerpos de fijación complementaria así como las reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado, fuerte (DTH) asociadas con ?-IFN, IL-2 y IL-12. Los efectos de los polisacáridos sobre la conformación de la proteína nativa son moderados, preservando los epítopes conformacionales necesarios para producir una respuesta de anticuerpo neut rali zador . Sin embargo, debido a que estos adyuvantes no pueden permitir que los antígenos exógenos se procesen por vía de la ruta endógena, no inducen una respuesta de linfocito T citotóxica (CTL) . Debido a que las APCs Z^k^ ^lt^ tienen receptores superficiales celulares específicos para ciertos radicales de carbohidratos, puede mejorarse significativamente el blanco y liberación de estas células de los antígenos asociados con estos radicales de azúcares. Aparentemente, el papel de los radicales de azúcares en el blanco de la liberación del antígeno, no se limita a los adyuvantes de polisacáridos. Por ejemplo, la modificación de cadenas laterales de carbohidratos de qui la j as aponina mediante la oxidación acida periódica resulta en una pérdida en su adyuvant icidad . probablemente, esto resulta debido a la pérdida de su capacidad de blanco.
Aunque las propiedades de los adyuvantes de ciertos polisacáridos se han conocido durante algún tiempo, su uso se ha limitado ampliamente a las aplicaciones de investigación. Por ejemplo, se ha mostrado que los glucanos pueden inducir una respuesta anti-tumor en ratones, y tienen un efecto preventivo en la sepsis aguda. Estos efectos son dependientes del peso molecular de los glucanos y su grado de ramificación. Los mananos son otros polisacáridos con actividad adyuvante que probablemente ejercen su efecto después del enlazamiento al receptor de superficie celular de mañosa del raacrofago. Recientemente, se ha mostrado que la conjugación de un antígeno de proteína a mañano ba o condiciones oxidantes resultó en una respuesta inmune mediada por células ( Apos t olopoulos , V. et al Vaccine 14: 930 (1996) ) . Sin embargo, los antígenos de proteínas conjugados a mananos bajo condiciones no oxidantes, i.e. sin formación de aldehidos, produjo sólo inmunidad humoral (Okawa, Y. et al. , J. Immunol. Meth. 142: 121 (1992) ) y ( Apostolopoulos V. et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 92:10128 (1995)) . La estimulación de la inmunidad de las células T también se ha logrado mediante la generación con galactosa oxidasa bajo condiciones experimentales, aldehidos en los residuos de galactosilo de polisacáridos de superficie celular (Zeng, B. et al. , Science 256: 1560 (1992) ) . Sin embargo, esta mmunoe s t imulaci ón no fue reproducible (Rhodes, J. Immunol. Today 11: 436 (1996)) . Estos resultados enfatizan los problemas asociados con la inestabilidad del aldehido y/o la producción ineficiente de aldehidos por la oxidación enzimática.
Es clínica y económicamente importante para la industria de las vacunas tener adyuvantes nuevos y efectivos. El desarrollo de nuevos adyuvantes que dirigen las células que presentan antígenos y proporcionan señales co-es t imuladore s para estimular la inmunidad de células T es el asunto de la presente descripción de patente .
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a conjugados químicos (referidos aquí como conjugados de polisacáridos) que comprenden (i) un polisacárido capaz de enlazarse a la superficie celular de las Células que Presentan Antígenos (APCs) y (ii) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (i.e. un grupo aldehido o cetona que es capaz de reaccionar con grupos amino para formar una imina o base de Schiff) en donde las moléculas (ii) se unen al polisacárido (i) por medio de (iii) un enlace covalente directo o covalentemente por vía de un enlazador bifuncional de una manera que mantiene el grupo carbonilo estable intacto. Las moléculas que tienen un grupo carbonilo formador fr imina pueden ser un compuesto cíclico aromático o no aromático, heterocíclico o no cíclico aromático o no aromático. Preferentemente, las cetonas y aldehidos aromáticos o heteroaromáticos se emplean como moléculas (ii) .
En un segundo aspecto de la invención una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (i.e. un grupo aldehido o cetona que es capaz de reaccionar con los grupos amino para formar una imina o base de Schiff) se enlazan convalent emente , ya sea directamente o por vía de una molécula enlazadora bifuncional, a antígenos de carbohidratos no adyuvantes para proporcionar la adyuvant icidad intrínseca a antígenos de carbohidratos no adyuvantes. La conjugación de una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable a los antígenos de carbohidratos resulta en un producto que tiene eficiencia aumentada de las vacunas preventivas comparado con los. antígenos de carbohidratos no conjugados.
La presente invención se refiere al mejoramiento de la potencialización de una respuesta inmune en un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de un conjugado de polisacárido de la presente invención para mejorar la respuesta inmune de un mamífero a uno o más ant í genos .
La presente invención también se refiere a un método de vacunación, que comprende administrar uno o más antígenos y un conjugado de polisacárido de la presente invención .
La presente invención también se refiere las composiciones farmacéuticas y veterinarias que comprenden uno o más de los conjugados de polisacáridos de la presente invención, y uno o más diluyentes, vehículo o excipientes farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones podrían emplearse como inmunopot enciador es en animales y humanos.
La presente invención también se refiere a vacunas que comprenden uno o más antígenos y un conjugado de polisacárido de la presente invención.
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas La presente invención se refiere a conjugados de polisacáridos, que comprenden: (i) un polisacárido capaz de enlazarse a la superficie de las células que presentan antígenos (APCs) ; y (ii) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (i.e. un grupo aldehido o cetona que es capaz de reaccionar con grupos amino para formar una imina o base de Schiff, también referido como un "compuesto formador de imina"); en donde el polisacárido (i) se enlaza (íi) por medio de un enlace covalente directo, o covalentemente por vía del residuo de un enlazador bifuncional a una o más moléculas (ii) . Los compuestos que tienen el grupo formador de imina pueden ser compuestos cíclicos aromáticos o no aromáticos, heterocíclicos o no cíclicos aromáticos o no aromáticos. Preferentemente, las cetonas y aldehidos aromáticos o heteroaromáticos se emplean como (ii) • Para explicar más claramente este aspecto de la presente invención, los conjugados de polisacáridos pueden representarse por la Fórmula J: P-(L-I) o las sales farmacéuticamente aceptables de la misma, en donde P es un polisacárido que es capaz de enlazarse a la superficie celular de una célula que presenta antígeno; cada L es independientemente un enlace covalente, o el residuo de una molécula enlazadora bifuncional; cada I es una molécula formadora de imina. Las moléculas formadoras de iminas preferidas son residuos de compuestos aromáticos o heteroaromáticos que tienen (a) una funcionalidad de cetona o aldehido; y (b) un segundo grupo funcional que es capaz de reaccionar con un grupo funcional complementario presente en el polisacárido o la molécula enlazadora bifuncional, si está presente; y x es mayor de o igual a uno. El valor de x se determinará por el número de grupos reactivos que se modifican covalentemente en el polisacárido. Un número de factores y estrategias influenciarán el valor de x, como se detallará más completamente aquí. En general, x será una función del número de grupos hidroxilo, hemiacetal de extremo terminal, carbonilo y/o amina que están presentes en el polisacárido. Debido a que la diversa distribución de peso molecular de los polisacáridos usados (P) , el grado de modificación como se expresa por x se expresa como el número de grupos formadores de imina introducidos por ciento de residuos glucosilo. Usando esta convención, el valor de x puede variar desde 1 hasta más de 100, con un intervalo preferido de aproximadamente 50 grupos formadores de imina por 100 residuos glucosilo.
La relación de las moléculas formadoras de imina varía ampliamente dependiendo de la estrategia de conjugación empleada. El control de esta relación se describe adicionalmente aquí.
Un grupo hidroxilo libre, hemiacetal de extremo terminal, ácido carboxílico o amina del polisacárido se emplea para enlazar covalentemente el polisacárido (P) ya sea a (L) o (I) . Uno o más de estos grupos reactivos que están presentes en el polisacárido pueden primero "activarse" (como se describirá más completamente) para aumentar la reactividad de estos grupos, o el polisacárido puede hacerse reaccionar con un compuesto formador de imina que tiene un grupo funcional "activado" .
Un aspecto adicional de la invención se refiere a conjugados que comprenden uno o más compuestos que tienen un grupo carbonilo, en donde estos compuestos se enlazan covalentemente, ya sea directamente o por vía de residuo de una molécula enlazadora bifuncional, a antígenos de carbohidratos no adyuvantes para proporcionar la adyuvan t i c idad intrínseca a los antígenos de carbohidratos no adyuvantes. La conjugación de una molécula formadora de imina al antígeno de carbohidrato resulta en un producto que tiene eficiencia aumentada de vacunaciones preventivas comparado con el antígeno de carbohidrato sólo. Los antígenos de carbohidratos incluyen polisacáridos, que incluyen 1 ipopol i s acáridos y pept idogl i canos de s t r ept ococci , s t aphylococci y otras bacterias que se usan como antígenos de vacunas.
Pol i sa cári dos Los polisacáridos que pueden emplearse para formar los conjugados de la presente invención incluyen cualquier polisacárido, natural o químicamente modificado, que se enlaza a los receptores de superficie celular en las APCs. Para propósitos de la presente invención, los polisacáridos usados comprenden un mínimo de dos sacáridos, preferentemente siete o más sacáridos, y son ramificados o no ramificados, y pueden tener un peso molecular de aproximadamente 1000 a varios millones de Daltons. Los polisacáridos preferidos tienen un peso molecular de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 500,000. Los polisacáridos podrían poseer modificaciones químicas como se describe aquí.
El término "Células que presentan Antígenos" o la abreviación "APCs" para propósito de la presente invención significan células dendríticas y macrofagos que son responsables para tomar antígenos, procesarlos a péptidos más pequeños y expresarlos en su superficie en conjunto con MHC de clase II para la presentación a células T y B .
Durante la evolución los macrofagos y las células dendríticas han desarrollado los receptores de superficie celular que reconocen los radicales de carbohidratos de diferentes microorganismos. Estos receptores juegan un papel crítico en la fagocitosis así como en la pmocitosis, dos procesos que están involucrados en la presentación del antígeno. Los polisacáridos reconocidos por estos receptores de superficie celular serían apropiados para la construcción de estos adyuvantes, debido a que tales polisacáridos proporcionan un mecanismo efectivo para el blanco de la APC. En algunos casos, las secuencias de carbohidratos de bacterias, hongos, y orígenes animales se comparten por los polisacáridos de plantas. De esta manera, los polisacáridos de plantas pueden proporcionar una fuente práctica de materiales iniciadores en algunos casos. Aunque estos adyuvantes pueden prepararse con polisacáridos solubles o insolubles, se prefieren las formas solubles.
Las aplicaciones de ll' resente descripción no se limitan a pol i sacar idos de plantas. Estos pueden extenderse a otros compuestos que contienen carbohidratos de diferentes fuentes que se reconocen por los receptores superficiales de las APCs.
Ejemplos de estos otros polisacáridos son quitinas y dextranos que son de origen animal y bacteriano respectivamente. Ejemplos de los compuestos que contienen carbohidratos apropiados son ácidos teicóicos bacterianos y sus derivados, 1 ipopol i sacar idos bacterianos, lípido A y sus derivados .
Finalmente, la conjugación de compuestos que portan grupos carbonilo formadores de imina a productos que contienen carbohidratos no adyuvantes se contempla que es usado para proporcionar la adyuvan t icidad intrínseca a estos productos y para aumentar la eficiencia de inmunizaciones preventivas. Ejemplos de estos productos son polisacáridos de s t reptococci , s t aphylococci y otras bacterias que se usan como antígenos de vacunas.
Entre los polisacáridos preferidos que se usan en la presente invención están: ß-glucanos; mananos; pectinas y 2-acetamido glucanos. También se usan derivados, incluyendo derivados solutles en agua, de estos polisacáridos. Ver la Solicitud Provisional No. 60/083,106 que se incorpora aquí completamente por referencia. Los polisacáridos preferidos se describen más completamente adelante. ß -Glucanos : Los ß-glucanos tienen una cadena estructural de unidades de ß - D-glucopi ranos i 1 o enlazadas (1-3) que tienen las unidades ß - D-glucopi ranos i lo enlazadas por enlaces (1-6) . Se encuentran en varias fuentes, tal como levadura, hongos, algas y cereales. Tienen un amplio rango de pesos moleculares, i.e. entre 5,000 a >500,000, lo cual influencia sus propiedades inmunomoduladoras . En general, los ß-glucanos de alto peso molecular que son relativamente insolubles en agua tienen mayor actividad biológica. Sin embargo, esta carencia de solubilidad ha excluido la administración sistémica de glucanos. La modificación de estos polisacáridos por la introducción de grupos aniónicos, tal como fosfato, sulfato, carboxilo y otros, ha producido formas solubles que aparentemente retienen sus actividades biológicas. Los glucanos solubles pueden prepararse mediante uno de los siguientes procedimientos: i) aislamiento de extractos de levadura (Hahn & Albersheim, 1978, Pl a n t Ph i s i o l . 66 : 1 0 1 ) , li) sonicación ¿ mmmm de partículas de glucano (Januz et al. 1986, J. Immunol, 137: 321, y iii) introducción de grupos aniónicos a glucanos insolubles por sul foni lación , fosforilación, carboximetilación o sufación ( (Bohn & BrMiller, 1995, Carbohydr. Polym. 28:3) , (Di Luzío, Patente U.S. 4,739,046, 4/1988)) . En los ß-glucanos el único residuo de glucosilo reductor (enlazado en la posición 3) se localiza en el término de la cadena estructural de los residuos de ß -D-glucos i lo enlazados por (1-3) . Los residuos glucosilo enlazados por enlaces (1-6) a la cadena estructural no tienen un grupo reductor libre. El fragmento más pequeño que se enlaza al receptor de glucano del monocito es un ß-glucanohept asacar ido enlazado (1-3) . Sin embargo, este ol igosacár ido no tiene actividad inmunoes t imulant e .
Mananos: Los mananos son polisacáridos ramificados o lineales formados exclusivamente de mañosa. Los mananos se encuentran en plantas, moho, bacterias y otros organismos. En ciertas plantas, los mananos lineales consisten de residuos de manosilo enlazados por ß-(l-4), mientras que en algunos levaduras, los residuos de manosilo se enlazan por medio de enlaces a-(l-2) y a- (1-6) . En los mananos ramificados de Saccharomyces cerivisiae (levadura de pan) el mañano consiste de una ?^»ls%-..*i-'-í*"# estructura de manopiranoí lo enlazada por ce- (1-6) sustituida en 2 átomos de 0 por cadenas laterales de oc-D-manopiranosilo, a-D-manopiranosilo-a- (1-2) -ot-D-manopi r anos i lo y - D-manopi r anos i lo <x-(l-3)-a-D-manopi ranos i lo-a- ( 1- 2 ) -a- D-manopi ranos i lo . Además, el mañano S. cerivisiae también puede estar fosforilado ( Bar re t o-Ber gt er and P.A. Gorin, Adv . Carbobydr. Chem. Biochem. 41:67 (1983), Vinogradov, E., et al. , Carbohydr. Res. 307:177 (1998)) . Aunque la capacidad de los mananos S. cerivisiae para estimular la inmunidad mediante células es cuestionable, estos mejoran la acción de los lipopoli sacáridos al estimular las respuestas de las células T (Ohta, M., et al. , Immunology 60:503 (1987)) . Parece que los mananos pueden ejercer sus efectos inmunoe s t imulat or ios al enlazarse a los receptores de superficie celular que se enlazan a mañosa de macrofagos. Un derivado de ß-mananos, la polimanosa ß-(l-4) acilatada, parece estimular el sistema inmune de manera similar a los mananos.
Polisacáridos Pécticos: Varios polisacáridos pécticos son ant i -complementar ios y estos pueden tener diferentes grados de actividad de inmunopo tenci al i zación (Yamada, H., et al. , Planta Medica 56:182 (1990)) . La oxidación de estos polisacáridos con ácido periódico origina una pérdida de actividad ant i -compl ementar ia en la ruta clásica, pero aumenta la actividad en la ruta alternativa (Yamada, H., and Kiyohara, H., Abs t ra c t o f Ch i n e s e Medi ci n e 3(1) :104 (1989)) . Los polisacáridos muestran algo de actividad de inmunopo t ene ía 1 i z ación y por lo tanto, se reconoce por los receptores de superficie celular que pueden agruparse ampliamente en homoga lact uronanos , r amnogalac t uronanos , arábanos, galactanos y arabinogalac taños . Sin embargo, no todos estos compuestos podrían tener actividad biológica. En varios casos, la actividad sería dependiente de la estructura, el peso molecular, el estado de agregación y otros parámetros. En general, los pol i sacar idos pécticos son un grupo de polímeros de azúcar asociados con residuos del ácido -D-galact osilurónico enlazados 1,4. Estos polisacáridos pueden tener varios oligosacáridos ramificados enlazados a los residuos del ácido galact os ílurónico de la estructura. A partir de estudios previos con saponinos y otros polisacáridos, los oligosacáridos ramificados parecen ser relevantes para la adyuvanticidad.
Glucanos de 2 -acet amido : qui tina , mure i na y sus derivados : La quitina es un polímero de N-acetil-D-glucosamina lineal (NAG) enlazado por enlaces ß-(l-4) que tiene aproximadamente 16 pos- ciento de sus residuos NAG desaci lat ados . Se distribuye ampliamente en la naturaleza: se ha encontrado en el exoesqueleto de artrópodos y paredes celulares de hongos. Este polisacárido tiene cadenas que forman enlaces de hidrógeno intermoleculares extensivos que lo hacen insoluble en agua y en diferentes disolventes orgánicos. La remoción de los grupos N-acetilo de quitina mediante el tratamiento alcalino fuerte produce quitosano, una policación soluble en agua de poli-D-glucosamina ß-(l-4) . El quitosano con 70% de sus grupos N-acetilo removidos (quitina de s a ce t i 1 ada ) , muestra una actividad inmunoe s t imulant e s significativa (Azuma, I., Vaccine 10:1000 (1992)) . Para evitar las limitaciones impuestas por su insolubilidad, se han desarrollado varios derivados de quitina que son más solubles en agua, tal como glicol quitina (Senzyu, K., et al. , J Japan, Agri. Chem. Soc. , 23:432 (1950)) y carboximetil quitina que también podría tener propiedades es t imulat or ias inmunes. Las qui todext riñas insolubles en alcohol solubles en agua compuestas de heptámeros de oligosacáridos NAG superiores se han preparado mediante hidrólisis acida limitada (Berger, L. R., et al., Biochim. Biophys . Acta 29:522 (1958) ) . La mureína, el principal componente de las paredes bacterianas, es un polisacárido hecho de ß-(l-4) enlazado a NAG, con una de ¡a s unidades NAG sustituidas en C-3 con un grupo de ácido O-láctico mediante un enlace de éter para producir el ácido N-acet il-D-muránico (NAM)que forma de la secuencia de repetición NAG-NAM. Debido a esto las mureínas aisladas, residuos de ácido láctico, son solubles en agua. En la pared celular bacteriana, la mureína se une a ciertos péptidos para formar un pépt ido-glicano de enlace cruzado. Debido a sus s imi 1 aridade s estructurales, la quitina y la mureína se reconocen por la enzima lisozima, y aparentemente también por los receptores en la superficie celular del macrofago. Estas s imi laridades estructurales, que también están presentes en glicol quitina, podrían explicar las propiedades inmunoes t imulant es de la quitina y algunos de sus derivados .
Moléculas que tienen un Grupo Carbonilo Es table (Moléculas Formadoras de Imina) El segundo elemento de los conjugados de la presente invención es uno o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (i.e. un grupo aldehido o cetona) que es capaz de reaccionar con los grupos amino para formar una imina o base de Schiff. Las moléculas que tienen el grupo carbonilo formador de imina pueden ser un compuesto aromático o no aromático - (saturado o parcialmente insaturado) carbociclo, aromático o no aromático (saturado o parcialmente insaturado) heterociclo o no cíclico, alifático que podría tener uno o más enlaces insaturados .
Existe evidencia de que ciertos compuestos aromáticos con los grupos carbonilo son muy efectivos en la formación de iminas o bases de Schiff, debido a la reacción con grupos amino en ciertos receptores de superficie celular Th. Debido a que los grupos carbonilo enlazados a los compuestos aromáticos son más estables (mientras que los aldehidos alifáticos son en general inestables), sus derivados tienen típicamente una mayor vida de anaquel. Además, el carácter hidrofóbico de los compuestos cíclicos que portan los grupos carbonilo reforzará las interacciones entre los receptores de superficie celular y los conjugados de polisacáridos. Consecuentemente, los compuestos que se van a usar para modificar los polisacáridos son preferentemente aldehidos o cetonas de arilo o heteroarilo. Para facilitar el acceso de estos compuestos a los grupos amino en las células T, es más preferido que también tengan algunas características hidrofílicas.
Los compuestos que representan algún grado de todas las propiedades anteriormente mencionadas son los agentes preferidos para modificar los polisacáridos. Los compuestos preferidos incluyen ar i la ldehí dos C6_10 mono y di-sus t i t uidos y arilo C6.10 alqui laldehí dos ( C 1. ) , los compuestos que comprenden un grupo arilo, tal como fenilo o naftilo e incluyen un sustituyente formilo o formilo(C1. 4)alquilo. Preferentemente, estos compuestos además incluyen uno o dos sustituyentes adicionales tal como halo, hidroxilo, alquilo C:_4, hidroxialquilo C l.i , alcoxi C 1.i , t r i f luorome t i lo o benciloxi. Los valores apropiados incluyen benzaldehído y naf t aldehido , sustituidos por uno o dos de hidroxilo o halo. Ejemplos incluyen 2,3-, 2,4-, 2,5- y 3 , 4 - d i h i dr o x i b e n z a 1 de h i do , 5-cloro-2-h i dr ox iben z a 1 deh i do , vanilina, etil vanilina, naringenina, 3- y -hidroxibenzaldehí do y 4-hidroxi fenilacet aldehido . Un segundo grupo preferido son alquil cetonas (C6_10) arilo C1-4 sustituidas por hidroxilo, tal como 2-, 3- y 4 -hidroxiac t ofenona , y aril cetonas sustituidas por hidroxilo tal como 6-hidroxi - 1 , 2 -naft oquinona . Un tercer grupo preferido incluye heteroaril aldehidos y heteroaril cetonas. Los grupos heteroarilo usados son tiofeno, furano, ben zo t iofeno , benzofurano, piridina, quinolina, piridazina, pirimidina, pirazol, imidazol, 1 , 2 , 3 - 1 r ia zol , 1,2,4- triazol, isoxazol y ox a^wl , cada uno tiene un sustituyente ceto, formilo o alquil formilo (C1-() , y preferentemente incluye un sustituyente halo o hidroxilo adicional, si estos pueden acomodarse por los átomos de carbono del anillo disponible. Preferentemente, los aldehidos y cetonas de furanilo, piridilo e indolilo son útiles como centros de heteroarilo. Ejemplos de aldehidos y cetonas de heteroarilo incluyen piridoxal, 2- t iof encarboxaldehí do y 3 - 1 iofencarboxa ldehí do . 10 Otro grupo relativamente estable de compuestos cíclicos que contienen grupos carbonilo formadores de imina son t ri t erpenoides y esferoides que tienen la sustitución ceto, formilo o formi 1 alqui lo . Ejemplos 15 incluyen andros t erona , f ormi ldienolona , proge s t erona , prednisolona y otros derivados.
Enlazadores Bifuncionales 20 Los enlazadores bifuncionales son bien conocidos en el arte para varias aplicaciones (Hermanson, G.T., Bi o conj u ga t e Te chn i qu e s , Academic Press 1996) . Un número de enlazadores bifuncionales pueden emplearse para formar un enlace entre un polisacárido apropiado y un compuesto 25 formador de imina apropiado. "Residuo de un enlazador MJffiír -7717111111-bifuncional" se refiere a la estructura que enlaza un compuesto carbonilo estable al polisacárido después de que los extremos terminales del enlazador bifuncional se han enlazado covalentemente al compuesto y el polisacárido.
Ejemplos no limitantes de los grupos enlazadores que pueden usarse para enlazar el carbonilo estable que contiene el compuesto al polisacárido, son alquilen diaminas ( NH2- ( CH2) n-NH2) , en donde n es de 2 a 12; aminoalcoholes (H0-(CH2)r-NH2), en donde r es de 2 a 12; aminotioles ( HS- ( CH2) r-NH2) , en donde r es de 2 a 12; y aminoácidos que son opcionalmente carboxi protegidos; etilen y polietilen glicoles ( H- ( 0-CH2-CH2 ) -OH en donde n es 1-4) . Los compuestos de diamina bifuncionales apropiados incluyen etilendiamina, 1 , 3 -propandi amina , 1,4-butandiamina, espermidina, ácido 2,4-diaminobut i rico , lisina, 3 , 3 ' -diaminodipropi lamina , ácido d i ami n op r o p i o n i c o , N - ( 2 - a i n o e t i 1 ) - 1 , 3 -propandiamina , 2 - ( 4 - amino feni 1 ) e 111 amina y los compuestos similares.
Cuando un grupo carboxilo del polisacárido se emplea con el grupo conjugado, pueden emplearse uno o más aminoácidos como la molécula enlazadora bifuncional. De esta manera, un aminoácido tal como ß-alanina o ácido y-aminobut i r ico , o un oligopéptido tal como di- o tri-alanina pueden emplearse como una molécula enlazadora apropiada .
Los grupos enlazadores bifuncionales preferidos incluyen -NH- (CH2) r-NH-, en donde r es de 2-5, -O- (CH2) r-NH-, en donde r es de 2-5, -NH-CH2-C (O) -, -0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-, -NH-NH-C (O) -CH2-, -NH-C (CH3) 2-C (O) -, -S- (CH2) r-C (O) -, en donde r es de 1-5, -S- (CH2) r-NH-, en donde r es de 2-5, -S- ( CH2) r-0- , en donde r es de 1-5, -S-(CH2)-CH(NH2)-C(0)-, -S-(CH2)-CH (COOH) -NH-, -0-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH (C02H) -NH-, -0-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH(NH2)-C(0)-, -0-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH2-CH2-NH-, -S-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-, y -NH-0-C(0)-CH2-CH2-0-P(02H)-.
Las combinaciones preferidas del polisacárido, compuesto formador de imina, enlazadores y relaciones para cada uno, podrían incluir, pero no limitarse a: (*) Las relaciones I/P y L/P se expresan como las moléculas I o L incorporadas por 100 residuos de carbohidratos n = 1 a Preparación de los Adyuvantes de Polisacáridos Formadores de Imina La presente invención también se refiere a procesos para la preparación de conjugados de polisacáridos de la presente invención. Los estudios de la estructura/función de los polisacáridos y saponinas adyuvantes, han mostrado que la integridad de las estructuras de las cadenas de carbohidratos no críticas para su adyuvanticidad. Aparentemente, el reconocimiento de los radicales de carbohidratos por los receptores superficiales de las APCs es esencial para el blanco de células así como para ejercer sus efectos inmunoestimulantes . La actividad adyuvante de las saponinas de triterpeno también requiere un grupo aldehido en el radical triterpenoide . Se ha mostrado recientemente que las moléculas orgánicas pequeñas capaces de formar iminas o bases de Schiff pueden proporcionar una señal co-estimulante a las células T, de esta manera la necesidad para su estimulación por el receptor B7-1 presente en las APCs (Rhodes, J., et a l . , Na t ure 3 77 : 1 1 (1995)). La adición de (i) un compuesto aromático cíclico o heterocíclico, o compuestos cíclicos que tienen grupos carbonilo formadores de imina, a (ii) ciertos polisacáridos reconocidos y enlazados por las APCs resultará en productos con propiedades adyuvantes superiores. Estas moléculas adyuvantes poseerán propiedades inmunomoduladoras y de blanco.
A. Adición de compuestos formadores de imina a los residuos de glicosilo reductores térmicos .
Un método para enlazar covalentemente los compuestos formadores de imina a los residuos glicosilo de reducción térmica de ß-glucanos y ß-mananos se describe aquí con referencia al Esquema 1. í*»w fS p Esquema 1 Adición de compuestos formadores de imina a ß-glucanos por vía del hemiacetal de extremo terminal (5) r $ ^ ,<^ Debido a que los ß-glucanos y ß-mananos están comprendidos de residuos de glucosilo o manosilo, los grupos funcionales disponibles para las modificaciones químicas son grupos hidroxilo superiores (-0H) con reactividad limitada. Además, existe un residuo de glicosilo reductor térmico por cadena de polímero. En general, los grupos hidroxilo primarios de los residuos de glicosilo son más reactivos que los grupos hidroxilo secundarios. Sin embargo, es posible que la estructura de un polisacárido particular podría imponer ciertos restricciones (esféricas o no electrónicas) sobre la reactividad de los grupos hidroxilo. Esto creará una jerarquía de los grupos hidroxilo que podría favorecer la producción de ciertos productos dominantes bajo las condiciones de reacción limitantes.
El número restringido de los azúcares reductores térmicos en glucanos y mananos proporciona un sitio altamente específico para la introducción de nuevos grupos químicos. Esta especificidad hace de los hemiacetales de glicosilo de terminales un grupo preferido para la producción comercial de adyuvantes de polisacárido modificados de la presente invención .
Las modificaciones químicas descritas aquí pueden usarse con glucanos solubles o insolubles de diferentes organismos.
Sin embargo, se proporcionándolo como ejemp?oÍ* no como limitaciones de los procedimientos de síntesis disponibles. Debido a que el papel de los radicales de carbohidratos en estos nuevos adyuvantes es el blanco de las APCs, el rango de peso molecular usado puede variar ampliamente, i.e. desde aproximadamente mil a varios millones. En la presente invención, se prefieren los oligo- y polisacáridos solubles de pesos moleculares en el rango de aproximadamente 1,000 a varios cientos de miles.
El término reductor de oligosacáridos proporciona un sitio selectivo y conveniente para el enlace covalente directo de moléculas con grupos amino, tal como compuestos de diamina bifuncionales. El proceso de aminación reductora involucra los residuos de glicosilo reductores térmicos en el oligosacárido o polisacárido con un compuesto que porta uno o más grupos amino primarios en presencia de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) . El anión de cianoborohidruro reduce selectivamente la imina o base de Schiff formada por un aldehido o cetona y una amina. Debido a que sólo un pequeño porcentaje de tiempo, los hemiacetales de glucosilo terminales están en so forma de formilo o abierta, la reacción podría proceder a velocidad muy baja. Debido a que la presencia de aminas primarias y carbonilos formadores de imina en una molécula resultaría ampliamente en la producción de productos indeseables, la adición se lleva a cabo en un procedimiento de dos etapas, resumido como sigue: Etapa 1 . Los oligosacáridos o polisacáridos de glucano/manano (1) se suspenden en un disolvente apropiado, tal como acetonitrilo acuoso, dimetilformamida (DMF), piridina o amortiguadores acuosos que contienen una amortiguador de amina terciario pH 9.0, y un compuesto de diamina apropiado (2), en donde n es de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, preferentemente, 2 a 4, se adiciona en el mismo disolvente con el pH ajustado a 9.0. [Los compuestos de diamina bifuncionales apropiados son etilendiamina, 1,4-butandiamina, espermidina, ácido 2 , 4 -diaminobut irico , lisina, 3 , 3 ' -diaminodipropilamina, ácido diaminopropiónico, N-(2-aminoetil ) -1 , 3-propandiamina, 2- ( 4-aminofenil ) etilamina y los compuestos similares ]. El compuesto de diamina que se adiciona debería ser de aproximadamente 5 a 10 veces el exceso comparado con el equivalente molar de los grupos aldehido libres en el carbohidrato (i.e. un aldehido libre por polímero de carbohidrato disuelto en 50% de acetonitrilo se adiciona a la mezcla de reacción, y la reacción se deja proceder a 25°C con agitación suave durante varios días. La cantidad del compuesto de amina incorporado en el polisacárido depende de las condiciones de reacción así como la preparación del glucano. Por lo tanto, la cantidad del compuesto de diamina incorporada se determina diariamente para establecer el tiempo de reacción necesitado para alcanzar el nivel requerido de la incorporación de la diamina. El glucano/manano aminado modificado (3), que contiene 1 mol del espaciador de diamina por cadena de polisacárido) se recupera por precipitación con 6 volúmenes de etanol u otro disolvente apropiado, durante 8 horas a 4°C. El precipitado se redisuelve en agua, se filtra y se re-precipita con 5 volúmenes de etanol durante 24 horas a 4°C. El material se disuelve en agua y se liofiliza.
Etapa 2. Los compuestos aromáticos cíclicos o heterocíclicos con un grupo carbonilo formador de imina (4), y uno o más grupos hidroxilo, tal como 4-hidroxibenzaldehído, 2 , 4 -hidroxibenzaldehído, vanilina, vanilina de etilo, naringenina y otros compuestos similares se prefieren para la adición a los polisacáridos aminados. Sin embargo, también pueden usarse otros compuestos que tienen los grupos carbonilo tal como derivados de esferoides y triterpenoides . Alícuotas pequeñas de 10 mmol de 4 -hidroxibenzaldehído (1.2 g) , vanilina (1.5 g) o 5-cloro-2-hidroxibenzaldehído (1.6 g) se disueltas en 10 mi de dioxano o acetona se adicionan a 10 mmol 1.6 g) de 1 , 1 ' -carbonildiimidazol (carbonildiimidazol o CDI) o N, N' -carbonildiimidazol disuelto en 10 mi de dioxano o acetona anhidra. La mezcla se hace reaccionar durante 6-8 horas a temperatura ambiente con mezclado mientras que se protege de la humedad atmosférica. Los productos de reacción son un carbamato de imidazol intermediario altamente reactivo (5) que se forma con el hidroxilo de los derivados de aldehidos aromáticos, más imidazol.
Etapa 3 . La mezcla de reacción puede adicionarse a los polisacáridos aminados sin aislamiento previo del carbamato de imidazol del intermediario. El carbamato se acopla con los grupos amino de los polisacáridos modificados para producir los enlaces de carbamato. (Los derivados de carbamato de imidazol pueden aislarse por cromatografía, extracciones diferenciales u otros procedimientos) . Para minimizar las reacciones de los grupos hidroxilo de los polisacáridos con el carbamato de imidazol intermediario, la reacción de acoplamiento debería llevarse a cabo en presencia de cantidades equimolares de los grupos amino y carbamato de imidazol. La cantidad de los grupos amino en el polisacáridos aminado se determina con ácido trinitrobencensulfónico (TNBS), o se estima de su contenido de C, N, H y O como se determinó por el análisis elemental. El glucano o mañano aminado se suspende en un disolvente orgánico anhidro apropiado, tal como DMF, dioxano o piridina y el pH se ajusta a aproximadamente 9.5-10 con trietilamina. Se adiciona una alícuota del intermediario de carbamato que contiene una cantidad equivalente a los grupos amíno de la préf?Éíftción del polisacárido, y la reacción se deja que proceda durante 12 a 18 horas a temperatura ambiente protegida de la humedad. Aproximadamente 6-8 volúmenes de etanol frío se adicionan a la reacción para precipitar el conjugado del aldehido aromático del polisacárido (6), que se colecta por filtración. El polisacárido conjugado se re-disuelve en agua, y se re-precipita nuevamente con 6-8 volúmenes de etanol u otro disolvente apropiado. La eficiencia del acoplamiento se determina mediante uno de los siguientes métodos: i) medir los grupos amino residuales en la preparación con TNBS, ii) determinar espectrofotométricamente la cantidad del compuesto aromático presente en la preparación, o iii) mediante examinación directa de los grupos aldehido ya sea con el reactivo de Schiff o espectrofotométricamente con N-metil benzotiozolona hidrazona (MBTH) (Paz, M.A., e t a l . , Archi v . Bi ochem . Bi ophys . 1 09 : 54 8 (1965)). El conjugado del aldehido aromático de polisacárido se disuelve en agua y se liofiliza.
También es posible crear nuevos grupos aldehidos en la cadena de polisacárido por oxidación moderada con ácido periódico. Después de la oxidación, el polisacárido con los grupos aldehido adicionales se precipita con alcohol y se somete a aminación reductora como se describió anteriormente.
B . Adición de compuestos formadores de imina por vía de los grupos hidroxilo de polisacárido Otro método para preparar el conjugado de glucano o mañano a compuestos que portan carbonilo es usar los grupos hidroxilo del polisacárido para la formación del conjugado. Este método se ilustra con referencia al Esquema 2. Debido al número de grupos hidroxilo por residuo de glicosilo, este método permite la preparación de los conjugados con densidades mayores de los grupos carbonilo. Se pueden activar los grupos de hidroxilo del polisacárido y dejarse reaccionar con la molécula que porta el carbonilo.
Es uema 2 25 La conjugación de los Compuestos que portan los grupos carbonilo a Xofa grupos hidroxilo de los polisacáridos puede hacerse con carbonato de N,N'- disuccinimidilo (DSC) . Los grupos hidroxilo que se 5 activan con DSC reaccionan casi exclusivamente con las aminas primarias, evitando el enlazamiento cruzado de las cadenas del polisacárido por vía de sus grupos OH. Los grupos hidroxilo de ß - 1 , 3 -glucanos se activan con DSC, y subsecuentemente reaccionan con etilendiamina para 10 introducir los grupos amino en el glucano. Estos grupos amino después pueden reaccionar con uno de los siguientes esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) : ácido 3- o 5- formi 1 salicílico , ácido 4 -formi 1 cinámico y 3- o 4- carboxiben za ldehí do para formar un conjugado de aldehído- 15 glucano aromático. El escleroglucano (7), un ß-1,3 glucano con ramificaciones de D-glucosa enlazado por ß- 1,6 en cada tercera unidad de glucosa y con un peso molecular de aproximadamente 130,000, se disuelve en agua (solución al 2-5%), y se liofiliza para producir un 20 producto de polvo fácilmente suspendido en los disolventes orgánicos. Dos g del escleroglucano liofilizado (12 mmoles de residuos de glucosilo) se suspenden en 40 mi de DMF que contiene 0.8 g de DSC (3 mmoles) . A esta suspensión se adiciona en una hora 20 mi 25 de piridina seca que contiene 0.75 mi de trietilamina %¡ ^j |^gfa anhidra (5.5 mmoles) y se ?a reaccionar durante un adicional de 4 horas a temperatura ambiente. Se adiciona un volumen de acetona a esta reacción, y el carbonato de succinimidi lo del escleroglucano activado insoluble (8) se colecta y se enjuaga por filtración. El escleroglucano activado, disuelto y suspendido en 20 mi de agua, se adiciona lentamente con agitación a 100 mi de bicarbonato de potasio 0.2M que contiene 2 mi de etilendiamina (30 mmoles o lOx de exceso sobre los grupos -OH activados del polisacárido máximo) y se ajusta a pH 8.5. Después de 4 horas a temperatura ambiente, la reacción se concentra y se dializa contra agua para remover el exceso de los reactivos del derivado de escleroglucano aminado (9) y se liofiliza. El polisacárido aminado después se hace reaccionar con éster del ácido succinimidil-3-formil salicílico.
El éster del ácido succinimidi 1 - 3 - formi 1 sal icí 1 ico se prepara como sigue: a 0.49 g de ácido 3-formi lsalicí lico (3 mmoles) y 0.42 g de NHS (3.5 mmoles) disuelto en 10-15 mi de DMF, 1.28 g de CMC o p-toluensul fonato de 1 -ciclohexí 1 -3- ( 2-morfolinoet il ) carbodiimida (3 mmoles) se adicionan y se dejan reaccionar durante 5 horas a temperatura ambiente protegido de la humedad. A esta mezcla de reacción se adiciona 2.1 mi de 2 -mer capt oet anol (30 mmoles) para apagar el CMC que no reacciona, se mezcla y se hace reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente y se usa el éster del ácido succinimidi 1 - 3 - formi 1 sal i cí 1 i co (10) inmediatamente. (El ácido 3 - f ormi 1 s al i cí 1 i co puede reemplazarse por una cantidad equimolar de ácido 5- formilsal icí lico , ácido 4 - formi 1 fenoxiacét i co o 3-carboxiben zaldehí do ) .
Al escleroglucano aminado (aproximadamente 2 g) disuelto en 25 mi de amortiguador MOBS 0.1M (ácido 4-[N-morf olino ] but ansul fónico ) , pH 7.6, se adiciona con agitación DMF que contiene el éster del ácido succinimidil 3 - f ormi 1 sal i cí 1 ico y el mercapt oet anol , y se deja reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 4-6 horas. El derivado de escleroglucano del ácido 3 - formi 1 sal icí 1 ico (11) se precipita con 6-8 volúmenes de etanol, y se colecta y se lava con etanol para remover el exceso de reactivos. El derivado de escleroglucano precipitado se disuelve en 50 mi de agua, se dializa contra agua y se liofiliza. El contenido del ácido 3-f ormilsalicí lico del derivado de escleroglucano puede determinarse a partir de su composición elemental de H, C, N y O. El contenido de los residuos del aldehido aromático en el derivado del escleroglucano también pueden determinarse espectrofotomét ricament e'^o?© sigue: se disuelve 5-8 mg del derivado de escleroglucano en 4 mi de KOH 0.05M y se lee el espectro UV entre 220 y 320 nm usando como un modelo una solución "de concentración igual de escleroglucano no modificado en KOH 0.05M. Se calcula el ácido 3 - formilsalicí lico incorporado usando el coeficiente de extinción para este compuesto determinado en KOH 0.5M. El contenido de aldehido también puede determinarse ya sea colorimétricamente con el reactivo de 0 Schiff o espectrofotométricamente con MBTH.
La conjugación de los compuestos que portan los grupos carbonilo e hidroxilo a los polisacáridos, tal como mananos, puede llevarse a cabo activando los grupos hidroxilo del polisacárido con cloruro de p- toluensulf onilo (tosilo) (Nilsson, K., et al. , Acta Chem. Sean. 35: 19 (1981); Nilsson, K., et al . , Methods Enzymol . 104: 56-69 (1984)) . Ver el Esquema 3-a.
Esquema 3-a Adición de compuestos formadores de imina al mañano Debido a que varios de los grupos hidroxilo primarios en el mañano de ce re v i s%a e se fosforilan o se enlazan a los f os foes teres , y no están disponibles para la tosilación, es necesario remover el fosfato mediante hidrólisis alcalina bajo condiciones reductoras. El mañano de la levadura de pan, 4-5 g, se disuelve en 200 mi de KOH 1.5M que contiene borohidrato de sodio al 1% y se somete a reflujo a 100°C durante 2 horas con agitación constante. Después de 2 horas a 100°C se enfría la solución a aproximadamente 50°C y se neutraliza con aproximadamente 18 mi de ácido acético. La solución del mañano neutralizada se adiciona con agitación a 1.5 litros de etanol enfriado y la mezcla se deja estática durante 4 horas para que precipite el mañano. El mañano precipitado se colecta por filtración, se disuelve en agua, se dializa contra agua para remover las sales y se liofiliza .
Un g del mañano liofilizado (12) (~6 mmoles de mañosa), se seca por suspensión en piridina y el azeótropo se remueve, se resuspende en 15 mi de DMF, y se mezcla con 2.5 g de cloruro de tosilo (2.15 mmoles) disuelto en 5 mi de DMF. A esta mezcla se adiciona 5 mi de piridina y se hace reaccionar con agitación durante 18 horas a temperatura ambiente, para producir un mañano «•í -í si tosilado (13) que tiene 1 grupo tosilo por cada 20-25 residuos de manosilo. El grado de tosilación se determina en una muestra del mañano activado que se ha precipitado y se lava con alcohol como sigue. Se disuelven 8 mg del mañano precipitado en 4 mi de KOH 0.1N y se mide su espectro de absorción UV (220 a 360 nm) contra un modelo de mañano no modificado (8 mg en 4 mi de KOH 0.1N) . Se determina el contenido de los grupos tosilo usando un coeficiente de extinción para el tosilo de 480 M"1 cm"1 a 261 nm. A la preparación del mañano tosilado (13) (-0.9 g) se re-suspende en 20 mi de bicarbonato de potasio 0.5M, se adiciona 2 g de 2-cis teamina , HCl (18 mmoles) y se ajusta el pH con KOH ÍN a 9.5-10. Se deja reaccionar durante 24 horas a 40°C con agitación y bajo una atmósfera de nitrógeno para introducir aproximadamente 1 residuo de cisteamina por -OH tosilado. Se dializan las reacciones contra agua para remover el exceso de reactivos y sales, y se liofiliza el derivado de manan-cisteamina (14) . La cantidad de la cisteamina enlazada al mañano tosilado puede determinarse a partir de la composición elemental de H, C, S, O y N del derivado. La incorporación de cisteamina también puede estimarse mezclando 10 mi de amortiguador de carbonato de potasio 0.05M pH 9.5 que contiene 2 mg del mañano aminado con 1 mi de un TNBS acuoso (7.2 mg/ml) y se hace reaccionar durante 2 horas a 40°C. Se mide la absorbancia a 363 nm contra un modelo de amortiguador más TNBS y se determina el -NH2 incorporado usando un .-coeficiente de extinción molar de 11,000 M"1 cm'1.
Esquema 3-b Adi ción de los compues tos formadores de imina a mañano El Esquema 3-b ilustra* el enlazamiento de un compuesto formador de imina al manan-ci s t eami na . Se suspende la manan-cis t eamina liofilizada (0.8-0.9 g) en 20 mi de piridina, se remßtve el azeótropo a presión reducida para eliminar el agua, y se re-suspende el residuo de manan-ci steamma (14) en 40 mi de piridina : tetrahidrofurano (10:1) . A esta suspensión se adiciona 0.37 g de DCC ( dici clohexi 1 carbodi imida ) (1.8 mmol), 0.3 g de p-carboxibenzaldehí do y 0.21 g de NHS (1.8 mmol) para formar i n s i t u el intermediario del éster de p-carboxibenzaldehído-NHS (10) . Se deja que la reacción que proceda durante 24 horas con agitación a temperatura ambiente. Se detiene la reacción adicionando 100 mi de agua a la mezcla para acelerar la formación de DCU . Después de 30 minutos, se adiciona un adicional de 400 mi de agua para disolver el derivado de mañano de p-carboxibenzaldehí do (15) . Después de 6 horas de agitación a temperatura ambiente, se deja que la diciclohexil urea (DCU) sedimente durante toda la noche y se remueve por decantación. Se filtra el sobrenadante, se concentra a presión reducida, se dializa contra agua y se liofiliza el derivado mañano de p-carboxibenzaldehí do (15) . El aldehido aromático incorporado al mañano puede determinarse espec t rofot orné tri camente como sigue. Se disuelve 5-8 mg del derivado de mañano en 4 mi de KOH 0.05M y se lee el espectro UV entre 220 y 320 usando como modelo una solución de concentración igual de mañano sin modificar en KOH 0.05M. Para calcular la concentración de p-carboxiben zaldehí do se usa su coeficiente de extinción determinado en KOH 0.05M. El contenido de aldehido también puede determinarse ya sea col or imét r i cament e con el reactivo de Schiff o espect rofot ornét ri cament e con MNTH.
C . Adición de los compues tos formadores de imina a los grupos carboxi de los polisacáridos péc ticos Los grupos carboxílicos de los polisacáridos pécticos, ( homoga 1 at uronanos , ramnogalact uronanos , arabinogalact anos , arábanos o galactanos) , tal como ácido galacturónico , glucorónico, acerico, Kdo o 3-desoxi-D-mano-oct ulosónico y otros ácidos, son grupos reactivos que pueden usarse para acoplar las pectinas a los compuestos que potan carbonilos (formador de imina) . Los grupos carboxílicos pueden acoplarse específicamente a las aminas usando diciclohexi lcarbodi imida (DCC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) . Ver el Esquema 4.
Esquema 4 Adición de compuestos formadores de imina a los polisacáridos pécticos (20) Esta reacción puede llevarse a cabo el disolventes orgánicos tal como dioxano, DMF, piridina, acetonitrilo o mezclas de los mismos. La reacción de acoplamiento también puede llevarse a cabo en medio acuoso o semi- acuoso usando una de las carbodi imidas solubles en agua tal como 1 -e t i 1 - 3 - ( 3 -dime t i laminopr opi 1 ) carbodi imida (EDC) o CMC, en conjunto con N-hidroxi sul fosuccinimida (sulfo-NHS) o NHS) . El número de grupos amina por residuo de glicosilo puede seleccionarse mediante el uso de una cantidad limitante de CMC en presencia de un exceso de ligando diamina. Este método se ilustra en el Esquema 4. En un ejemplo, a 2.0-2.2 g de pectinato de Na* de metoxilo inferior (<11 mmoles de ácido galact urónico ) disuelto en 50 mi de agua caliente, 15 mi de resina de poliestiren sulfónico de intercambiador catiónico fuerte sedimentado en la forma de H+ (Dowex, 50-X8) se adicionan y se agitan durante 2 horas. La suspensión se filtra para remover la resina, y la resina se lava con 20 mi de agua caliente. La solución de pectina (forma H+) se reduce en volumen por liofilización parcial, evaporación rotatoria a baja presión, u osmosis inversa, a aproximadamente 40 mi. A la solución de pectina (forma H+) se adiciona piridina ara llevar el pH a -7.6. A esta solución de 1 g de CMC (2.35 mmoles) y 0.41 g de NHS (3.4 mmoles) disueltos en 10 mi de piridina y 2 mi de etilendiamina (30 mmoles) se adicionan con agitación, y la mezcla s'k deja reaccionar durante toda la noche a temperatura ambiente con agitación constante. La separación del polisacárido aminado (17) de los otros reactivos se real i3*^ por precipitación con 6-8 volúmenes de etanol. La pectina aminada, precipitada, lavada con etanol, se disuelve en agua, se dializa y se hidroliza para producir un producto de polvo disuelto fácilmente en agua, y su contenido de grupo amino se determina con TNBS. La pectina aminada después se hace reaccionar con éster del ácido succinimidi 1 - 3 -formi lsal icí lico preparado como sigue: A 0.49 g de ácido 3-for il salicílico (3 mmoles) y 0.42 g de NHS (3.5 mmoles) disueltos en 10-15 mi de DMF, 1.28 g de CMC (3 mmoles) se adicionan y se dejan reaccionar durante 5 horas a temperatura ambiente protegido de la humedad. A esta mezcla de reacción se adicionan 2.1 mi de 2-mercapt oet anol (30 mmoles) para apagar el CMC sin reaccionar, y después de 10 minutos a temperatura ambiente, se usa inmediatamente el éster del ácido succinimidi 1 - 3 - formi 1 sal icí 1 i co (10) . (El ácido 3-formilsalicí lico puede reemplazarse por una cantidad equimolar de 3-carboxibenzaldehí do , ácido 4-formil-f enoxiacé t ico o ácido 4 , 5 -dioxohept anoico ) .
A 2 g de la pectina aminada, disuelta en 30 mi de amortiguador MOBS 0. 1M, ácido ( 4 - [ N - morfolino ] but ansul fónico, pH 7.6, se adiciona la mezcla de reacción en DMF que contiene el éster del ácido succinimidi 1 - 3 - formi 1 salicí 1 i co y el mer capt oet anol , y se 5 deja reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 6 horas. El derivado de pectina del ácido 3- formi 1 s a 1 icí 1 i co (18) se precipita con 6-8 volúmenes de etanol, y después se colecta y se lava con etanol para remover el exceso de reactivos. El derivado de pectina 10 precipitado se disuelve en un volumen mínimo de agua, se dializa contra agua y se liofiliza. La pectina aminada también puede hacerse reaccionar con un intermediario de carbonato de succinimidi lo de un compuesto que contiene carbonilo , hidroxilado , tal como 4 - 15 hidroxi fenilacet aldehido , 6-hidroxi -2 -na f t oquinona , 4- hidroxibenzaldehído, 2, 4-hidroxibenzaldehído, f o r m i 1 d i e n o 1 o n a , p r o g e s t e r o n a , a n d r o s t e r o n a , prednisolona o piridoxal. Después de mezclar la reacción con 6 volúmenes del derivado de polisacárido péctico que 20 contiene aldehido, después se recupera por filtración, se disuelve en agua, se dializa contra agua y se liofiliza.
Alternativamente, la pectina aminada (17) puede hacerse reaccionar con un compuesto que contiene un grupo 25 aldehido libre o protegido, como tereft aldehido monodiet i lacet al . La pectina aminada después se hace reaccionar con el grupo aldehido libre para formar un enlace estable, y subsecuentemente el aldehido protegido se libera por hidrólisis acida suave, como se describió aquí. A 2 g de la pectina aminada suspendida en 30 mi de tetrahidrofurano acuoso u otro disolvente apropiado, se adiciona 0.43 g de tereft aldehido monodiet ilacet al (2 mmoles), 0.18 g de cianoborohidrat o de sodio (3 mmoles) y se deja reaccionar durante toda la noche con agitación a 40°C para producir el derivado de tereft aldehido monodiet i lacet al de pectina (19) . El derivado de pectína se precipita con 6 volúmenes de etanol, se colecta, y se lava por filtración con más etanol. El derivado de pectina de tereft aldehido monodiet ilacet al se disuelve en un volumen mínimo de HCl 0.05M y se calienta a 100°C durante 15-20 minutos para convertir el acetal a la forma de aldehido. Después de la hidrólisis, la solución del derivado de pectina de fenilacetaldehído (20) se lleva a la neutralidad con NaOH, se dializa contra agua y se liofiliza. El contenido de aldehido aromático de los derivados de pect ina se det e rmina espectrofotométricamente como sigue: se disuelve 5-8 mg del conjugado de pectina en 3 mi de NaOH 0.05N y se explora el espectro UV entre 220 y 320 nm contra una solución modelo que contiene la misma cantidad de la pectina no modificada. La concentración del aldehido aromático del derivado de pectina se calcula usando el coeficiente de extinción del aldehido aromático libre como se determinó en NaOH 0.05M. El contenido de aldehido también puede determinarse espect rofot ornét r i cament e con MBTH o colorimétricamente con el reactivo de Schiff.
Alternativamente, la introducción de los compuestos que contienen carbonilo a los polisacáridos pécticos puede llevarse a cabo en disolvente orgánicos. En un ejemplo, CMC, NHS y un exceso de 10 veces de una diamina con respecto a CMC, se adicionan a la pectina liofilizada anhidra (forma de H+) suspendida en DMF-piridina (6:4, v/v) y la mezcla se deja reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante toda la noche. El número de grupos amina por residuo de glicosilo puede seleccionarse usando una cantidad limitante de CMC en presencia de un exceso del ligando de diamina. La separación del polisacárido aminado de los otros reactivos se realiza precipitándolo con 6-8 volúmenes de etanol. La pectina aminada, precipitada, lavada con etanol, se disuelve en agua y se liofiliza para producir un producto de polvo fácilmente para re-suspenderse en DMF-piridina. La pectina aminada se hace reaccionar en DMF-piridina con (i) un éster de succinimidi lo de un compuesto que contiene carbonilo carboxilado, tal como á<eddo 4,5-dioxohept anoico , ácido 3. O 5- formi ls al icí 1 i co , ácido 4-formilcinnámico o 3- o 4 -carboxiben za ldehído o (ii) los intermediarios de carbonato de succinimidi 1 o de un compuesto que contiene carbonilo, hidroxilado, tal como 2 , -hidroxiben zaldehí do , 4 -hidroxibenzaldehí do , 4-hidroxi feni lacet aldehido , 4 ' -hidroxiaceto fenona , 6-hidroxi -2 -naftoquinona , formi ldienolona , proge s t erona , androst erona , prednisolona, piridoxal. El derivado de polisacárido péctico que contiene aldehido, después se recupera por filtración después de mezclar la reacción con 6 volúmenes de etanol, se disuelve en agua, se dializa contra agua y se liofiliza.
D . Adi ción de compues tos formadores de imina a los grupos amino de los derivados de qui tina .
La insolubilidad de la quitina en la mayoría de los disolventes dificulta la adición de los compuestos formadores de imina a esta. Sin embargo, la introducción de los compuestos portadores de carbonilo en quitosano soluble en agua produce geles insolubles en agua, que son presumiblemente el resultado del enlazamiento cruzado por las bases se Schiff entre los grupos amina de glucosamina y los grupos carbonilo de diferentes cadenas de polisacáridos. Estos o,b s t á cuÍ<<á s se evitan median%*e el uso de derivados de quiti ra - solubles en agua en los cuales aproximadamente 85% de los grupos amina son N-ace t i lados , tal como glicol quitina ( 6 -o-Mdroxipropi 1 quitina o 6-o- hidroxietil quitina) en las que los hidroxilos primarios de la glucosamina son hidroxiet i lados . El Esquema 5 ilustra este procedimiento. 10 15 20 25 squema 5 Adición de compuestos formadores de imina a glicol qui tina En una modalidad, la glicol quitina se prepara como sigue. A 5 g de quitina finamente triturada (22) (igual a 21.25 mmoles de N-acetil glucosamina y 3.75 mmoles de glucosamina) se suspende en 30 mi de NaOH al 42% durante 2 horas a temperatura ambiente, se adiciona con agitación 70 mi de una mezcla de agua fría para producir una dispersión altamente viscosa de la quitina alcalina. A esta dispersión, se adicionan 5 g de óxido de etileno (114 mmoles) burbujeando en la solución mientras se agita durante 1-2 horas a 30-35°C. La glicol quitina (23) después se precipita con 6 volúmenes de etanol al 80%, se lava en papel filtro de vidrio con etanol al 80%, se disuelve en agua, se dializa contra agua, se liofiliza y el contenido de los grupos amina libres se determinan colorimétricamente con TNBS. A 1.7-2 g de la glicol quitina liofilizada (aproximadamente 1.5 mmoles de glucosamina) di suelta / suspendida en 40 mi de agua se adicionan 40 mi de piridina que contiene 1.60 g de tereft aldehido monodiet ilacet al (7.5 mmoles), 0.4 g de cianoborohidrat o de sodio (6 mmoles) y se deja reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente. Se precipita el derivado de tereft aldehido monodiet i lacetal de glicol quitina (24) con 4-6 volúmenes de etanol, se re-suspende el precipitado y se lava con 80% de etanol para remover el exceso de reactivos. Se disuelve el derivado de glicol quitina (24) en 40-50 mi de HCl 0.05M y se calienta a 100°C durante 20-30 minutos para liberar los grupos aldehidos para producir el derivado de benzaldehído de glicol quitina (25) . El contenido de benzaldehído del derivado de glicol quitina se determina espect rofotométricamente como sigue: se disuelve 5-8 mg del derivado de glicol quitina en 4 mi de KOH 0.05M y se lee el espectro UV entre 220 y 320 nm usando como un modelo una solución de igual concentración de glicol 10 quitina en KOH 0.05M. Se calcula el benzaldehído incorporado usando el coeficiente de extinción para este compuesto determinado en KOH 0.05M. El contenido de aldehido también puede determinarse ya sea espect rof otométricamente con MBTH o colorimétricamente 15 con el reactivo de Schiff.
En otra modalidad, descrita en el Esquema 6, la glicol quitina (23), formada como se describió anteriormente, se hace reaccionar con el éster del ácido 20 succinimidi 1 -5-formilsal icí 1 ico (10) , que se prepara como sigue: A 0.5 g de ácido 3 - f ormi 1 sal i cí 1 i co (3 mmoles) y 0.42 g de NHS (3.5 mmoles) disueltos en 10-15 mi de DMF, se adiciona 1.28 g de CMC (3 mmoles), y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 5-6 horas 25 protegido de la humedad. A esta mezcla de reacción se adiciona 2.1 mi de p-mer cap oet anol (30 mmoles) para apagar el CMC sin reaccionar, mezclar y hacer reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente y usar el éster del ácido succinimidil-5-formilsalicílico inmediatamente. El ácido 5 - f ormi 1 sa 1 ic í 1 ico puede reemplazarse por una cantidad equimolar de otro compuesto que contiene carbonilo carboxilado, tal como ácido 4,5-d i o x o h e p t a n o i c o , ácido 4 - f o rmi 1 c i n ám i c o , 3-carboxibenzaldehí do o ácido 4 - f ormil f enoxiacé t ico ) . A la glicol quitina (1.7-2 g) disueltos en 40 mi de amortiguador MOBS 0.1M, pH 7.6, se adiciona con agitación la DMG que contiene el éster del ácido succinimidi 1 - 5 -formi 1 sal i cí 1 i co y se deja reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 4-6 horas. El derivado del ácido 3-formil sal icí lico de glicol quitina (26) se precipita con 6 volúmenes de etanol y se lava con etanol al 80% para remover el exceso de los reactivos. El derivado de glicol quitina precipitado se disuelve en 50-60 mi de agua, se dializa contra agua, y se liofiliza. El contenido de ácido 3-formilsalicí lico del derivado de glicol quitina se determina e spect rofotomét r i cament e como sigue: se disuelve 5-8 mg del derivado de glicol quitina en 4 mi de KOH 0.05M y se lee el espectro UV entre 220 y 320 nm usando como modelo una solución de igual concentración del glicol quitina no modificado en KOH 0.05M. Se calcula el 3- f ormí 1 sal íci la t o incorporado usando el coeficiente de extinción para este compuesto como se determino en KOH 0.05M. El contenido de aldehido también puede determinarse ya sea color ímét ri cament e con el reactivo de Schiff o espect rof otóme t ricamente con MBTH. 10 15 20 25 ^ f >. Esquema 6 Adición de compuestos formadores de imina a glicol quitina Además de los procedimientos descritos aquí, pueden usarse otros métodos, tal como el uso de éteres de glicidilo, halógenos activados y otros, para conjugar los compuestos que contienen cajrbonilo a los residuos de glicosilo de los pol i s acáridos . Ver, por ejemplo, Marón et al. , Biochim. Biophys. Acta 278: 243 (1972) and Erlanger et al. , J. Biol. Chem. 228: 713 (1957) .
Otros compuestos que contienen carbohidratos útiles que se reconocen por los receptores superficiales de las APCs incluyen quitinas y dextranos que son de origen animal o bacteriano respectivamente. Ejemplos de los compuestos que contienen carbohidratos apropiados son ácidos teicóicos bacterianos y sus derivados, lipopoli sacáridos bacterianos, lípido A y sus derivados.
La conjugación de los compuestos de portan los grupos carbonilo formadores de imina a productos que contienen carbohidratos no adyuvantes se contempla que es útil para proporcionar la adyuvant icidad intrínseca para estos productos y para aumentar la eficiencia de las inmunizaciones preventivas. Ejemplos de estos productos son polisacáridos de s t rept ococci , s t aphylococci y otras bacterias que se usan como antígenos de vacunas. ? üí?sí: " i"1"'* -",€É^-íi^v,*-& Composi ciones Farmacéuticas y Ve terinarias*fc y>**_,.tíé todo para Usarlas En un aspecto adicional, un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, podría usarse para el tratamiento de enfermedades en donde existe un defecto en el sistema inmune y/o un mecanismo de defensa de huésped inefectivo, o para mejorar la actividad al sistema inmune por encima de los niveles normales.
Un compuesto de la invención o las sales fisiológicamente aceptables del mismo, podrían administrarse para el tratamiento o profilaxis de mamíferos inmunode f icient es sólo o en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, con otros agentes antivirales o con otros agentes anticánceres.
Un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I y las sales fisiológicamente aceptables del mismo podrían administrarse para el tratamiento o profilaxis de mamíferos inmunode f i cient es solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, con otros agentes antivirales, o con otros agentes anticánceres.
Los adyuvantes inmunes son compuestos qu©/4 cuando se administran a un individuo o se prueban i n vi t ro , aumentan la respuesta inmune a un antígeno en un sujeto o en un sistema de prueba al cual el antígeno se admini s t r a .
Por una "cantidad efectiva" se entiende una cantidad de un conjugado de la presente invención que restablecerá la función inmune a los niveles sustancialmente normales, o aumentará la función inmune por encima de los niveles normales para eliminar la infección.
Por potenciación de una respuesta inmune se entiende el restablecimiento de una función inmune depresiva, el mejoramiento de una función inmune normal, o ambas. La función inmune se define como el desarrollo y la expresión de la inmunidad humoral (mediado por anticuerpo), inmunidad celular (mediada por células T), o resistencia mediada por macrofago y granulocito.
En esta especificación el término "paciente inmunodef iciente" se emplea para describir pacientes con un sistema inmune deficiente o defectuoso. Un paciente inmunodef iciente puede caracterizarse por medio de una prueba de proliferación de linfocitos T. Usando esta prueba, los pacientes iniuunsflef icientes se caracterizan por una capacidad reducida de células T para responder a la estimulación por los mitógenos. Un ejemplo de un mitógeno comúnmente usado en esta prueba es f it ohemaglut inina (PHA) .
La inmunodeficiencia y la inmunosupresión se piensa que se presenta en muchas situaciones clínicas en donde existen lesiones en la señalización a linfocitos, particularmente células T que arreglar la respuesta inmune. Las células T requieren dos señales para iniciar una respuesta inmune efectiva: i) ocupación del receptor de células T para el antígeno, y (ü) estimulación por medio de receptores coestimulantes En ausencia de la señal (ii) , las células T fallan al responder y también podrían llegar a ser crónicamente paralizadas o anérgicas. Las infecciones virales o bacterianas persistentes y la enfermedad neoplásica puede producir hiporrespue s t a de células T interfiriendo en varias maneras con la liberación de señales secundarias ,,.ß*..J¡!-.-r *:r y de esta manera evaden respuesta inifirtine. Los conjugados de la pre s ela?fc ßr invención parece que trabajan para sustituir o de otra manera compensar las señales co-estimulantes a las células T. , Los estudios recientes (Rhodes, J . Imm un o l o gy Toda y 27:436 (1996) ) han mostrado que los compuestos formadores de la base de Schiff exógenos pueden sustituir los donadores naturales de los grupos carbonilo y proporcionan una señal co-estimulante a las células auxiliares CD4 T (Th) . En un estudio relacionado (Zheng, B. e t a l . , S c i en c e 25 6 : 15 60 (1992)), el tratamiento de las APCs con galactosa oxidasa para formar nuevos grupos aldehido resultó en un efecto adyuvante cuando se administró con un antígeno a ratones.
Estos descubrimientos enfatizan el papel de los compuestos formadores de la base de Schiff como estimulantes del sistema inmune. Durante la interacción entre una APC y células Th existe una formación transitoria de una base de Schiff entre un grupo carbonilo de APC especializado y los grupos amino de células Th localizados en receptores superficiales de células aún indefinidas. Las consecuencias de la formación de la base de Schiff son: la parcialidad del sistema inmune hacia una respuesta de tipo Thl con un aumento en la producci* de IL-2 y IFN-? en las células Th, y el mejoramiento de la respuesta CTL. Los compuestos formadores de la base Schiff parece que trabajan recirculando la ruta co-e s t imulant e s que involucra el receptor CD-28 en las células Th y el receptor B7-1 presente en las APCs.
Existe una variedad de circunstancias en las cuales el sistema inmune podría ser defectuoso o deficiente. Por ejemplo la deficiencia en el sistema inmune es común en los niños inmaduros o prematuros (neonatos) . También podría resultar de la supresión por ciertos fármacos que podrían ser deliberados e.g. como un efecto colateral de la quimioterapia del cáncer. El crecimiento desordenado de una o más partes constituyentes del sistema inmune, e.g. como en ciertas formas de cáncer, también podría resultar en la inmunodeficiencia. La deficiencia inmune también puede ser causada por infecciones virales, que incluyen el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) .
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para tratar a pacientes inmunode f iciente s , que comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I, o una sal fisiológicamente aceptable del mi smo .
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo para el tratamiento y/o profilaxis de infecciones virales agudas y crónicas.
Ejemplos de virus agudos contra los cuales la terapia inmunopot enciali zadora con un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, podría usarse, preferentemente en conjunción con un agente antiviral, son : Virus de herpes, virus de la influenza, virus de la par a in f luen z a , adenovirus, virus Coxsackie, picornavi rus , rotavirus, virus de hepatitis A, virus de parotiditis, virus de rubéola, virus de sarampión, poxvirus, virus sincitiales respiratorios, virus de papiloma y enterov^rus, arenavirus, rinovirus, poliovirus, virus de la ííSi^.^^*» enfermedad de Newcas l^í virus de la rabia y arbovirus .
Ejemplos de enfermedades^ví ra le s crónicas contra las Sß* cuales podría usarse la terapia inmunopotencia 1 i zadora con los conjugados de la presente invención son infecciones de virus de herpes persistentes, infección de virus de Epst ein-Barr , infecciones de rubéola persistentes, infecciones de papilomavirus, infecciones de virus de hepatitis e infecciones de virus de inmunodef iciencia humana.
Los conjugados de la invención pueden emplearse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de las infecciones o condiciones anteriores. Las terapias de combinación de acuerdo a la presente invención comprenden la administración de al menos un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo y al menos otro ingrediente farmacéuticamente activo. Los ingredientes y los compuestos farmacéuticamente activos de la presente invención podrían administrarse juntos o separadamente y, cuando se administran separadamente esto podría presentarse simultánea o secuencialmente en cualquier orden. Las entes y los compuestos la presente invención y los tiempos de administración relacionados se seleccionarán para lograr el ß?jfecto terapéutico combinado deseado. Preferentemente, la terapia de combinación involucra la administración de un compuesto de la presente invención y uno de los agentes mencionados aquí posteriormente .
Ejemplos de tales agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes que son efectivos para el tratamiento de infecciones de VIH o condiciones asociadas tal como 31-azido-3 ' desoxit imidina ( zidovudina ) , otros 2', 3'-desoxinucleósidos tal como 2 ' , 3 ' -didesoxici t idina , 2 ' , 3 ' -dide s oxi adenos ina y 2 ' , 3 ' - di de s ox i i n o s i na , carbovir, nucleósidos acíclicos (por ejemplo, aciclovir) , 2 ' , 3 ' -dideshidrot imidina , inhibidores de proteasa tal como N-ter-butil-decahidro-2- [2- (R) -hidroxi -4- fenil-3 (S) - [ [N-2-quinolilcarbonil) -L-asparginil] butil] -( 4aS, 8aS ) - i s oquino 1 in- 3 (S) -carboxamida (Ro31-8959), análogos de oxatiolan nucleósido tal como cis-l-(2-hidroximetil )- 1 , 3-oxat iolan-5-il ) -citocina o cis-l-(2-(hidroximetil) -1, 3-oxatiolan-5-il) -5-f luoro-citocina, 3 ' -desoxi-3 ' -fluorotimidina, 2 ' , 3 ' -didesoxi-5-etinil-3 ' -fluorouridina , 5-cloro-2 ' , 3 ' -didesoxi - 3 ' - f luorouridina , Ribavirina, 9 hidroximetil) but-1-il]guanina (H2G), tal como 7 -cl or o- 5 - ( 2 - pirril ) -3H-1 , 4 -ben zodia zepan- 2 (H) -ona (Ro5-3335) o 7-cloro-1, 3-dihidro-5- ( l rpí r rol-2 - i 1 ) -3H-1, 4 -benzodia zepan-2 -amina (Ro24-7429) interferones tal como a- int e r f erón , inhibidores de excreción renal tal como probenecid, inhibidores del transporte de nucleósido tal como dipiridamol; pent oxi f i 1 ina , N- acet i 1 ci s teína , precesión, a-t ricosant ina , ácido fos fonofórmico , así como inmunomoduladores tal como interleucina II, factores de estimulación de colonia del macrofago granulocito, er i t ropoye t ina , derivados diseñados genéticamente y CD4 solubles de los mismos. Ejemplos de tales agentes terapéuticos adicionales que son efectivos para el tratamiento de infecciones HBV incluyen carbovir, análogos de oxatiolan nucleósido tal como cis-l-(2-hidroximet i 1 )- 1 , 3-oxat iolan-5-il ) citocina o cis-l-(2-(hidroximetil) -1, 3-oxatiolan-5-il) -5-fluorocitocina, 2 ' , 3 ' -didesoxi-5-etinil-3 ' -fluorouridina, 5-cloro-2 ' , 3 ' -didesoxi- 3 '- fluorouridina , 1- ( ß-D-arabinofuranosi 1 ) -5-propilniluraci 1 , aciclovir e interferones, tal como a-int er ferón .
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la fórmula t* f' una sal f isi i^a^-^c-amente aceptable del mismo,, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de infecciones por Pn e um o cys t i s¿ ca ri n i i en mamíferos.
En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo para tratar las condiciones que resultan de las deficiencias de las células T relativas tal como Síndrome de DiGeorge, infecciones por hongos, infecciones de micoplasma, tuberculosis, leprosia y lupus eritematoso sistémico.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de cáncer en mamíferos.
Ejemplos de las formas de cánceres particularmente apropiadas para el tratamiento con los compuestos de la presente invención son: melanoma, cáncer de mama, cáncer de colón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer renal, cáncer laringeal, cáncer rectal y linfoma de no Hodgkms. Los canee ¡r que expresan antigenos de tumores específicos o antlgenos raramente expresados a baja densidad en células normales, son probablemente blancos terapéuticos. Los cánceres que contienen células T citotóxicas específicas de tumores que son anérgicos o de otra manera inefectivos son probablemente blancos para terapia. Los tumores resecados quirúrgicamente en donde existe un alto riesgo de recurrencia también son apropiados para la terapia con los compuestos de la presente invención.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso, como un adyuvante de vacuna, de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo. Una vacuna, por lo tanto, podría prepararse formulando un componente antigénico con un conjugado de la presente invención.
Los compuestos de la presente invención podrían administrarse a un destinatario humano mediante una ruta seleccionada de oral, parenteral (incluyendo subcutánea, int radérmica , intramuscular, e intravenosa), rectal e inhalación. El tamaño de una dosificación efectiva de un Ét£tes£s!?! ^y^sár-^irM^ ^^ compuesto dependerá de un nú-fcßafo de factores que incluyen la identidad del^destinatario, el tipo de inmunopot enciali zación involucrado, la severidad de la condición a ser tratada y lasruta de administración, y ¿¿a?*** , . finalmente estará en la discreción del medico que a t iende .
La dosificación efectiva estará en general en el intervalo de 0.03 a 250 mg por individuo, y más 10 preferentemente entre aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 mg por dosificación. Los estimulantes inmunes se administran preferentemente sólo una o dos veces en una semana, y en algunos casos, menos frecuentemente. La frecuencia y la duración del 15 tratamiento varían entre las especies y los individuos.
Mientras que es posible para los compuestos de la presente invención que se administren como el químico bruto, es preferible que se presenten como una 20 preparación de formulación farmacéutica. Las formulaciones de la presente invención comprenden un compuesto de la presente invención, junto con uno o más vehículos aceptables, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Los vehículos deben ser aceptables en el 25 sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser para el destinatario mi smo .
Los adyuvantes inmunes son compuestos que, cuando se administran a un individuo o se prueban m vi t ro , aumentan la respuesta inmune a un antígeno en un sujeto o en un sistema de prueba al cual el antígeno se administra. Algunos antígenos son débilmente inmunogénicos cuando se administran solos o son tóxicos para un sujeto a concentraciones que sugieren respuestas inmunes útiles en un sujeto. Un adyuvante inmune puede mejorar la respuesta inmune del sujeto para el antígeno haciendo el antígeno más fuertemente inmunogénico. El efecto del adyuvante también puede resultar en la capacidad para administrar una dosificación inferior de antígeno para lograr una respuesta inmune útil en un sujeto.
La actividad inducida por el inmunógeno de los compuestos y composiciones de la presente invención pueden determinarse mediante un número de métodos conocidos. El aumento en la titulación del anticuerpo contra un antígeno particular en la administración de una composición de la presente invención, puede usarse para medir la actividad inmunogénica. (Dalsgaard, K., A c t a Ve t eri n i a Sca n di n a vi ca 69 ?í - 4 0 (1978)). Un método requiere inyectar a rttones CD-1 int radermicament e con una composición de prueba que incluye uno o más antígenos exógenos. El suero se cosecha de los ratones dos semanas después y se prueba por ELISA para el anticuerpo anti-inmunógeno .
Las composiciones de la invención son útiles como vacunas para inducir la inmunidad activa contra los antígenos en los sujetos. Podría tratarse cualquier animal que pueda experimentar los efectos benéficos de las composiciones de la presente invención dentro del alcance de los sujetos. Los sujetos son preferentemente mamíferos; y más preferentemente humanos.
Los conjugados de la presente invención pueden emplearse como un sólo adyuvante, o alternativamente, pueden administrarse junto con otros adyuvantes. Tales adyuvantes usados con la presente invención incluyen adyuvantes de aceite (por ejemplo, completo e incompleto de Freund), saponinas, saponinas modificadas, liposomas, sales minerales (por ejemplo, A1K(S04)2, AlNa(S04)2, A1NH4(S04), sílice, alúmina, Al(OH)2, Ca3(P04)2, caolín y carbón), polinucleótidos (por ejemplo, poli IC y poli AU ácidos) y ciertas sustancias naturales (por ejemplo, cera D de Mycobacterium tubercñ^^^is, así como sustancias encontradas en Cory eba cterium parvum, Bordetella pertussis y miembros del gen Brucella) , albúmina de suero de bovino, toxoide de difteria, toxoide de tétanos, edestina, hematocianina de lapa de cerradura, Toxina A de Pseudomonal, coleragenoide , toxina de cólera, toxina de pertussis, proteínas virales y proteínas eucarióticas tal como interferones, int erleucinas , o factor de necrosis tumoral. Tales proteínas podrían obtenerse de fuentes naturales o recombinantes de acuerdo a los métodos conocidos para los expertos en el arte. Cuando se obtienen de fuentes recombinantes, el adyuvante de no saponina podría comprender un fragmento de proteína que comprende al menos la porción inmunogénica de la molécula. Otras macromoléculas inmunogénica s conocidas que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a, polisacáridos, ARNt, polímeros sintéticos me t abo 1 i z ab 1 e s tal como polivinilamina , ácido polimetacrílico , polivinilpirrolidona, pol i condensados mezclados (con relativamente alto peso molecular), ácido 4',4-diaminof eni 1 -me t ano- 3 , 3 ' -dicarboxí 1 ico y ácido 4-nitro-2-aminobenzoico (Ver Sela, M., Science 166: 1365-1314 (1969) o glicolípidos , lípidos o carbohidratos. -•" .*l Los conjugados de invención exhiben efectos adyuvantes afeando se administran durante un amplio rango de dosificaciones y un amplio rango de relaciones a uno o más antigenos particulares que se admini s t ran .
Los conjugados pueden administrarse ya sea individualmente o mezclarse con otros adyuvantes sustancialmente puros para lograr un mejoramiento de la 10 respuesta inmune a un antígeno.
Los conjugados de la presente invención pueden utilizarse para mejorar la respuesta inmune con respecto a uno o más antígenos. Los antígenos típicos apropiados 15 para la respuesta inmune que provocan las composiciones de la presente invención incluyen antígenos derivados de cualquiera de los siguientes: virus, tal como influenza, virus de leucemia felino, virus de inmunode fi ciencia felino, VIH-1, VIH-2, rabia, sarampión, hepatitis B, o 20 fiebre aftosa; bacterias, tal como ántrax, difteria, enfermedad de Lyme, o tuberculosis; o proto zoarios , tal como Babe o s í s bo vi s o Pl a sm odi um . El antígeno pueden ser proteínas, péptidos, polisacáridos o mezclas de los mismos. Las proteínas y péptidos podrían purificarse de 25 una fuente natural, sintetizarse por medio de síntesis de &tf^¿ £~¿2¿l~J1??2&¡* f a s e s ó l i da , o podr í a n °b e Po r me di o d|_,gené t ica re c omb i nant e .
Los conjugados de la presente invención también pueden administrarse solos para potencial i zar el sistema inmune para el tratamiento de enfermedades infecciosas crónicas, especialmente en pacientes expuestos inmunes. Ejemplos de enfermedades infecciosas para las cuales los conjugados de la presente invención pueden emplearse para el tratamiento terapéutico o profiláctico, se describen en la Patente U.S. No. 5,508,310. La potencialización del sistema inmune por los conjugados de saponina también pueden usarse como una medida preventiva para limitar los riesgos de las infecciones nosocomiales y/o pos t-cirugí a .
La administración de los compuestos usados en el método de la presente invención podría ser por medio parenteral, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intranasal o cualquier otro medio apropiado. La dosificación administrada podría ser dependiente de la edad, el peso, el tipo de tratamiento actual, etcétera, y la naturaleza del antígeno administrado. En general, los conjugados de saponina/ant í geno podrían administrarse sobre un amplio rango de dosificaciones y un amplio rango .. de relaciones con al antígeno que va a administrarse. La dosificación inicial podría ser seguida de una dosificación fomentadora después de un período de aproximadamente cuatro semanas para mejorar la respuesta inmunogénica. Además, también podrían administrarse dosificaciones fomentadoras.
Los conjugados de la presente invención podrían emplearse en tales formas como cápsulas, soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones o elíxires para la administración oral, o formas líquidas estériles tal como soluciones, emulsiones o suspensiones. Se usa preferentemente cualquier vehículo inerte, tal como solución salina o solución salina amortiguada con fosfato, o cualquier otro vehículo en el cual los compuestos usados en el método de la presente invención tienen propiedades de solubilidad apropiadas para el uso en los métodos de la presente invención.
Habiendo ahora descrito completamente esta invención, se entenderá para los expertos en el arte que puede realizarse lo mismo dentro de un amplio rango y rango equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin afectar el alcance de la invención o cualquier modalidad de la misma. Todas las patentes y publicaciones cita t e por referencia en s Se hace constar que con |.slac?ón esta fecha, el mejor método conocido por para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. mi»á& ^^

Claims (27)

1. Un conjugado de polisacárido, caracterizado porque comprende ; (i) un polisacárido capaz de enlazarse a la superficie de las células que presentan antígenos (APCs); y (li) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo; 10 en donde una o más moléculas se seleccionan del grupo que consiste de aldehidos aromáticos, cetonas aromáticas, cicloalquil aldehidos, cicloalquil cetonas, cicloalquenil aldehidos, cicloalquenil cetonas, aldehidos heterocíclicos , cetonas heterocíclicas, cetonas heteroaromáticas, aldehidos 15 heteroaromáticos, alquil aldehido, alquil cetonas, alquenil aldehidos y alquenil cetonas, y en donde el polisacárido (i) se enlaza a las moléculas (ii) hasta (iii) un enlace covalente directo o covalentemente 20 por vía de un enlazador bifuncional de la manera que mantiene el grupo carbonilo estable intacto.
2. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo 25 carbonilo estable se enlazan al polisacárido por vía de un enlace covalente directo»
3= El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable se enlazan al polisacárido por vía de una molécula enlazadora bifuncional.
4. El conjugado de polisacárído de la reivindicación 1, caracterizado porque el polisacárido comprende un mínimo de dos sacáridos.
5. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de S-glucanos; mananos; polisacáridos pécticos; y polisacáridos de 2 -acet amido glucano.
6. El conjugado de polisacárido de la rei indicación 1 , caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable se seleccionan del grupo que consiste de arilaldehídos C6_10, arilo C6_10 alquilaldehí dos (Cx_4), mono- y di - sus t i t uidos y mezclas de los mismos.
7. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable son fenilo o naftilo sustituido por un -**. sustituyente de formilo ^áMP" "for i lo ( C1-4 ) alquilo , y opcionalmente incluyan uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste de halo, hidroxilo, alquilo C1-4, alcoxi C1-4, trifluorometilo y benciloxi.
8. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable son benzaldehído y naft aldehido , sustituidas por uno o dos de hidroxilo y halo.
9. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable son 2,3-, 2,4-, 2,5- y 3,4-dihidroxibenzaldehído, 5- cloro- 2 -hidroxibenzaldehído, vanilina, etil vanilina, naringenina, 3- y 4-hidroxibenzaldehí do o 4 -hidroxifenilacet aldehido .
10. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable se seleccionan del grupo que consiste de alquilo C 1.4 { C 6.10) aríl cetonas sustituidas por hidroxilo y aril cetonas sustituidas por hidroxilo.
11. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque lasjßéculas que tienen un grupo carbonilo estable se seleccionan del grupo que consiste de 2-hidroxiacet of enona , 3 -hidroxiace t of enona , 4-hidroxiacet o fenona y 6-hidroxi - 1 , 2 -naft oquinona .
12. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable se seleccionan del grupo que consiste de heteroaril aldehidos y heteroaril cetonas.
13. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1 , caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable son tiofeno, furano, benzot iof eno , benzofurano, piridina, quinolina, piridazina, pirimidina, pirazol, imidazol, 1,2, 3-triazol, 1,2,4-triazol, isoxazol u oxazol, cada uno tiene un sustituyente ceto, formilo o formilo ( C 1.i ) > Y preferentemente incluye un sustituyente halo o hidroxilo adicional, si estos pueden acomodarse por los átomos de carbono del anillo disponible.
14. El conjugado de polisacárido de la reivindicación 1 , caracterizado porque las moléculas que tienen un grupo carbonilo estable es uno de piridoxal, 2-t io fencarboxaldehí do y 3 - 1 iofencarboxaldehí do . iSt.....as*,;, ?. =fel
15. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque el residuo de una molécula enlazadora bifuncional se selecciona del grupo que consiste de : -NH- (CH2) r-NH-, en donde r es de 2 a 12; HO- (CH2) r-NH2, en donde r es de 2 a 12; HS- (CH2) r-NH2, en donde r es de 2 a 12; aminoácidos que son opcionalmente carboxi protegidos; y H- (0-CH2-CH2) n-OH, en donde n es 1-4.
16. El conjugado de la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula enlazadora bifuncional se selecciona del grupo que consiste de etilendiamina, 1 , 4 - b u t a n d i am i n a , espermidina, ácido 2, 4-diaminobut í r ico , lisina, p-alanina, ácido ?-aminobutirico, dialanina, trialanina, 3,3'-diaminodipropilamí na , ácido diaminopr opióni co , N-(2-aminoetil ) -1 , 3 -propandiamina y 2 - ( 4 -amino fenil) etilamina.
17. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula enlazadora bifuncional se selecciona del grupo que consiste de: -NH- (CH2) r-NH- , en donde r es de 2-5 -O- ( CH2) r-NH- , en donde r es de 2-5, -NH-CH2-C (O) -, -0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-, -NH-NH-C (O) -CH2-, -NH-C (CH, ,-C (O) - -S- (CH,) r-C (O en donde r es de 1-5 -S- (CH2) r-NH-, en donde r es de 2-5 -S- ( CH2) r-0- , en donde r es de 1-5, -S- (CH2) -CH(NH2) -C (O) -, -S- (CH2) -CH(COOH) -NH-, -0-CH2-CH(0H)-CH2-S-CH (C02H) -NH-, -0-CH2-CH(0H)-CH2-S-CH(NH2)-C(0)-, -0-CH2-CH(0H)-CH2-S-CH2-CH2-NH-, -S-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-, y -NH-0-C(0)-CH2-CH2-0-P (02H) -.
18. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de: ß-glucanos; mananos; polisacáridos pécticos; quitina y sus derivados; mureína; fructanos bacterianos; xantanos; heteropolisacáridos bacterianos; pululano fungióos; y esteres, sulfonatos, sulfatos, fosfatos; éteres y derivados de enlace cruzado de los i s os .
19. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque el polisacárido es un ß -glucano que tiene una cadena estructural de unidades de S-D- glucopir anos i lo enlazadas (1-3) y que tiene las unidades ß-D-glucopiranos ilo enlazadas por enlaces (1-6), y un peso molecular de entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 500,000 y en donde el ß-glucano se modifica opcionalmente mediante la adición de uno o más grupos aniónicos, catiónicos o no iónicos.
20. Los conjugados de la reivindicación 1, caracterizados porque el polisacárido es un ß-manano que comprende polimanosa (1-4) que tiene un residuo de manosilo de término reductor, o el producto de la acetilación del mismo.
21. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque el polisacárido es un polisacárido péctico seleccionado del grupo que consiste de homoga 1 act uronanos , ramnoga lac t uronanos , arábanos, galactanos y arabinogalact anos y en donde el polisacárido péctico posee actividad inmunopot enciali zadora .
22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un conjugado de polisacárído de la reivindicación 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable
23. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, caracterizada porque además comprende un antígeno en mezcla con el conjugado de polisacárido.
24. Una vacuna, caracterizada porque comprende: un conjugado de polisacárido de la reivindicación 1 b) una cantidad mmunológi cament e efectiva de un antígeno; y (c) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable .
25. Un método para mejorar una respuesta inmune en un animal, caracterizado porque comprende administrar a un animal en necesidad de tal mejoramiento una composición de la reivindicación 23 en una cantidad efectiva para mejorar la respuesta inmune del animal.
26. Un método para potencial izar una respuesta inmune a un antígeno en un animal, caracterizado porque comprende administrar una composición de la rei indicación 25 en una cantidad efectiva para potencial i zar la respuesta inmune del animal al antígeno.
27. Un método para vacunar un animal, caracterizado porque comprende administrar una composición de la reivindicación 25 al animal.
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